You are on page 1of 10

ACARA IV

AMPLIFIKASI DNA MENGGUNAKAN PCR

A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Keragaman genetik tanaman merupakan salah satu kegiatan penting
untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi
melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA, yang sering
disebut sebagai penanda molekuler. Penanda molekuler berperan penting
dalam konservasi dan pengelolaan sumber daya genetik tanaman.
Salah satu cara untuk mendapatkan untaian pita DNA adalah dengan
metode PCR. Reaksi berantai polimerase atau Polymerase Chain Reaction
(PCR) merupakan suatu metode enzimatis untuk mengamplifikasi secara
eksponensial suatu urutan nukleotida tertentu secara in vitro. Proses PCR
untuk mengamplifikasi DNA membutuhkan DNA cetakan yang
mengandung urutan DNA target yang akan diamplifikasi, sepasang primer,
enzim DNA polimerase, buffer, dan campuran monomer nukleosida
trifosfat (dNTP). PCR melibatkan serangkaian siklus suhu yang berulang
dan masing-masing siklus terdiri atas 3 tahapan : denaturasi pada suhu 94-
960C, penempelan primer pada suhu 45-600C (annealing) dan
perpanjangan primer pada suhu 72
o
C (Ratnayani K 2009).
Pada praktikum kali ini prosedur amplifikasi dijelaskan melalui video
dan tayangan slide dikarenakan fasilitas yang masih kurang lengkap.
Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengetahui proses amplifikasi
dengan menggunakan PCR. Diharapkan mahasiswa mampu memahami dan
melakukan prosedur dalam proses amplifikasi DNA dengan menggunakan
PCR, dan tertarik untuk melakukan penelitian lebih lanjut dalam bidang ini.
2. Tujuan Praktikum
Tujuan pada praktikum amplifikasi DNA menggunakan PCR adalah
untuk mengetahui prosedur amplifikasi DNA menggunakan PCR.

37
38

3. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum acara amplifikasi DNA dengan PCR dilaksanakan pada
tanggal 20 Maret 2014 betempat di laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan
Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas maret Surakarta.
B. Tinjauan Pustaka
Reaksi berantai polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR)
merupakan suatu metode enzimatis untuk mengamplifikasi secara
eksponensial suatu urutan nukleotida tertentu secara in vitro. Proses PCR
untuk mengamplifikasi DNA membutuhkan DNA cetakan yang mengandung
urutan DNA target yang akan diamplifikasi, sepasang primer, enzim DNA
polimerase, buffer, dan campuranmonomer nukleosida trifosfat (dNTP). PCR
melibatkan serangkaian siklus suhu yang berulang dan masing-masing siklus
terdiri atas 3 tahapan : denaturasi pada suhu 94-96
0
C, penempelan primer pada
suhu 45-60
0
C (annealing) dan perpanjangan primer pada suhu 72
0
C. Metode
ini sekarang telah banyak diaplikasikan dalam bidang riset yang menunjang
ilmu dasar dan untuk aplikasi di bidang kriminologi, antropologi, dan
kedokteran karena metode PCR sangat sensitif dan dapat mengamplifikasi
segmen DNA hanya dengan menggunakan sejumlah kecil sampel biologis
(Ratnayani 2009).
Suhu penempelan primer merupakan peubah kunci dalam menentukan
kekhasan reaksi PCR. Penggunaan suhu penempelan primer yang sesuai,
memungkinkan masingmasing primer dapat menempel pada kedua ujung
DNA cetakan. Suhu penempelan primer dapat dihitung berdasarkan urutan
nukleotida primer yang digunakan. Umumnya suhu penempelan primer
optimum berkisar ± 50C dari suhu perhitungan penempelan primer. Jika suhu
penempelan primer terlalu tinggi dari suhu optimum, menyebabkan primer
tidak menempel dengan DNA cetakan. Sedangkan, jika suhu penempelan
primer terlalu rendah dari suhu penempelan primer optimum menyebabkan
mispriming, yaitu penempelan primer pada tempat yang salah pada DNA
cetakan sehingga dihasilkan produk non spesifik. Oleh karena itu dilakukan
optimasi terhadap suhu penempelan primer (Yuwono 2006).
39

Proses amplifikasi melalui PCR dimulai dari denaturasi, yaitu pada
tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94
o
C yang mnyebabkan
terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai
DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan
dibuat. Proses selanjutnya adalah annealing (penempelan) yaitu Enzim Taq
polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada
seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10
sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah
terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat
menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar
55
0
C selama 30-60 detik. Proses terakhir adalah elongation (pemanjangan)
yaitu enzim DNA polymerase akan memanjangkan sekaligus membentuk
DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida
(Kusuma 2010).
Macam macam metode PCR adalah Real-Time PCR adalah suatu
metode analisa yang dikembangkandari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal
sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR, dimana
teknik ini digunakanuntuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus
menghitung(kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi
tersebut. Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal dengan
kineticpolymerase chain reaction. RT-PCR merupakan modifikasi dari
PCR,dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Pada metode PCR
biasasumber sampel yang digunakan adalah DNA yang diekstrak dari sel
atau jaringan. Pada RT-PCRsampel yang digunakan bukan DNA melainkan
RNA. Sebagaimana kita ketahui, RNA merupakan asam ribonukleat
rantaitunggal, sedangkan DNA adalah asam ribonuleat rantai ganda. Nested
PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNAmenggunakan
bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk
mengamplifikasi fragmen. Multiplex PCR merupakan beberapa set primer
dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai
ukuran yangspesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. PCR-ELISA merupakan
40

metode yang digunakan untuk menangkapasam nukleat yang meniru prinsip
dari enzim linked immunosorbant yang terkait, dimana dalam sebuah
pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini
(Shanda 2012).
DNA Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40
pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target.
Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi
polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan
primer, yaitu panjang primer : 15-30 pb, kandungan GC sekitar 50%,
temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda, urutan nukleotida
yang sama harus dihindari, tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau
hairpin (Jawets 2006).
C. Alat, Bahan, dan Cara Kerja
1. Alat
a. Mikrotube
b. Mikropipet
c. PCR
2. Bahan
a. Taq DNA polymerase
b. MgCl
2

c. DNA cetakan
d. DNTPS
3. Cara Kerja
a. Mencampur komponen buffer PCR, stok d NTP, Primer 1, Primer 2
masing-masing 5μl, dan Taq DNA polymerase 2,5 μl secara berurutan
dan ditambah air hingga mencapai volume total 50μl.
b. Menambahkan 50μl lisat sel dan mencampurkan sampai homogen,
kemudian ditambah 50μl minyak paraffin ke atas campuran PCR.
c. Melakukan amplifikasi secara manual atau dengan menggunakan
thermlcycler otomatis yaitu dengan menginkubasikan pada suhu 95
o
C
41

selama 1 menit, suhu 55
o
C selama 1 menit, dan suhu 72
o
C selama 1
menit.
d. Mengulangi langkah 3a-3c sampai 35 siklus.
e. Setelah siklus 35, menginikubasi tabung pada suhu 72
o
C selama 5
menit.
f. Mengambil 2μl sampel DNA hasil amplifikasi kemudian melakukan
elektroforesis pada gel agarose untuk mengetahui hasilnya.
























42

D. Hasil dan Pembahasan
1. Hasil





















PCR Mix

Primer mix

DNA
template

Aquadest

PCR Mix

1. Menyiapkan 4 bahan utama yang disebut PCR primer
yang terdiri dari taq DNA polymerase, Mgcl2, DNTPS
dan buffer ekstruksi sebanyak 10 µl yang dimasukkan ke
dalam microtube
10 µl

7 µl Aquadest

2. Menambahakan aquades 7 µl Cold H
2
O CH clumer
Primer

DNA template

3. Menambahkan primer sesuai yang diinginkan sebesar 1
µl
4. Memasukkan microtube ke dalam PCR di dalam PCR
akan terjadi 3 proses yaitu denaturasi annealing dan
extension.
5. Hasil Amplifikasi DNA diperoleh
43

2. Pembahasan
PCR merupakan salah satu metode yang digunakan untuk amplifikasi
DNA. Yaitu menggandakan pita DNA secara eksponensial pada suhu
tertentu. PCR melalui 3 tahapan seperti yang dijelaskan oleh Ratnayani
(2009) denaturasi pada suhu 94-96
0
C, penempelan primer pada suhu 45-
60
0
C (annealing) dan perpanjangan primer pada suhu 72
0
C.
Proses amplifikasi DNA yaitu dimulai dari proses denaturasi pada suhu
tinggi (94-96
o
C), dimana rangkaian DNA double helix menjadi rantai
tunggal, rantai ini berfungsi sebagai cetakan. Proses yang kedua yaitu
annealing (penempelan) pada suhu yang agak rendah daripada proses
denaturasi (45-60
0
C), dimana DNA cetakan menempel pada DNA tunggal
yang telah memisah pada proses sebelumnya. Proses yang terakhir yaitu
elongasi (pemanjangan) pada suhu yang lebih tinggi daripada proses
penempelan (72
0
C), dimana cetakan DNA yang telah menempel pada DNA
primer akan diperpanjang sesuai cetakan DNA yang telah ada. Proses
tersebut dilakukan berulang-ulang hingga mencapai panjang DNA yang
diinginkan.
Bahan yang digunakan yaitu taq DNA Polimerase, MgCl
2
, DNTPS,
buffer retruksi, dan DNA template. Menurut Kusuma (2010) bahan-bahan
tersebut memiliki fungsi yang spesifik pada proses amplifikasi DNA
menggunakan PCR. Taq DNA polymerase merupakan enzim yang stabil
dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase
(Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA
walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air. Buffer
atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang
mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. dNTPS atau
deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang
berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa
dengan nukleotida dari DNA target. DNA template adalah DNA yang
digunakan sebagai cetakan.
44

Faktor yang mempengaruhi saat proses PCR antara lain menurut
Agitya (2008) adalah konsentrasi DNA sebesar 0,01-0,1 µg setiap µl
larutan template sudah cukup baik untuk PCR namun yang paling penting
adalah DNA harus bebas dari pengotor seperti protein atau bahan-bahan
yang tersisa saat purifikasi seperti fenol atau alkohol. Purifikasi dapat
dilakukan dengan menggunakan GFX DNA Column. Ukuran dan
komposisi primer sangat mempengaruhi temperatur penempelan primer
terhadap untaian DNA target. Umumnya primer sebesar 17-30 basa
nukleotida dengan komposisi GC lebih dari 50%.Konsentrasi MgCl
2
sangat
mempengaruhi aktivitas serta kekhususan kerja enzim, penguatan primer
mencapai suhu optimumnya (primer annealing) dan penguatan fungsi
primer dalam sintesis pemanjangan rantai nukleotida. Konsentrasi
optimumnya 1,5-4,0 mM. Namun, apabila preparasi DNA banyak
menggunakan EDTA untuk pengawetnya maka MgCl
2
akan lebih tinggi
dari keadaan normal. Konsentrasi Enzim Polimerase yang digunakan
sangat tergantung dari jenis enzim. Pada umumnya konsentrasi optimum
berkisar antara 1,0-2,5 unit enzim setiap volume reaksi 50 µl. Sebaiknya
pemakaian enzim tidak melebihi 2,5 unit karena malah justru akan
menurunkan spesifitasnya. Kualitas primer sangat tergantung pada kualitas
oligoprimer dan OD (optical density). Namun demikian, konsentrasi primer
sekitar 20 pmol sudah cukup memadai untuk amplifikasi PCR. .Jumlah
Siklus PCR terkait dengan konsentrasi awal DNA target dan konsentrasi
akhir yang diharapkan. Siklus yang terlalu banyak justru akan
meningkatkan konsentrasi produk yang tidak spesifik, sedangkan siklus
yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan.
Deoksinukleotida triphosphate (dNTP). Konsentrasi dNTP mix yang
menghasilkan keseimbangan optimal terdiri atas dATP, dCTP, dGTP,
dTTP sebesar 10-20 µM.



45

E. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum amplifikasi DNA menggunakan PCR
adalah prosedur amplifikasi DNA menggunakan PCR melalui 3 tahap
pemisahan, penempelan, dan pemanjangan.
2. Saran
Saran untuk praktikum selanjutnya mahasiswa akan lebih paham
prosedur amplifikasi DNA menggunakan PCR dengan praktikum secara
langsung.






















46

DAFTAR PUSTAKA

Agitya 2008. Faktor yang menentukan keberhasilan pcr.
http://bioinside.blogspot.com/2008/09/faktor-yang-menentukan-
keberhasilan-pcr.html
Ardiana D W 2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk
dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB. Buletin Teknik Pertanian
14 (1) : 12-16)
Jawetz E., J. L. Melnick dan E. A. Adelberg, 2006, Mikrobiologi Kedokteran,
Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran, EGC, Jakarta, h. 211-217, 249-251
Kusuma S A F 2010. PCR. Makalah. Universitas Padjajaran Fakultas Farmasi.
Mitokondria dan Kedokteran Forensik,dalam Mithocondrial Medicine, Lembaga
Biologi molekuler Eijkman, Jakarta, p. 53-56
Ratnayani K, Sagung C Y, dan Liangky S S 2009. Amplifikasi Fragmen 0,4 KB
Daerah D-Loop DNA Mitokondria Lima Individu Suku Bali Tanpa
Hubungan Kekerabatan dengan Metode Polymerase Chain Reaction
(PCR). J. Kimia 3 (1) : 14-20
Santoso, P.J. 2010. Modified CTAB-based DNA isolation procedure for fruit
crops. Jurnal Stigma XIV(1): 1-4.
Shanda Farras 2012. Teknik Isolasi Molekuler. Universitas Brawijaya. Fakultas
Kedokteran.
Suryadi, H., Malik, S. G., Gustiananda, M., Sudoyo, H., 2003, Polimorfisme DNA
Yuwono, T., 2006, Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction, Penerbit Andi,
Yogyakarta, p. 1-3; 18-21