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24 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 27- julho/agosto 2002

Produção de etanol por
Escherichia coli KO11
Pesquisa
Produção de etanol a partir de resíduos agrícolas por Escherichia coli geneticamente modificada
Figura 1: Fermentação de hidrolisado de sabugo de milho por E. coli KO11
I. INTRODUÇÃO
PROÁLCOOL foi implanta-
do no Brasil, em meados da
década de 70, em decorrên-
cia da chamada “crise de energia”,
quando os preços do petróleo sofre-
ramchoques mundiais, refletindoime-
diatamente na balança econômica do
país. Atualmente, o futuro do progra-
ma no Brasil é incerto, pois a fonte
primária de energia no mundo conti-
nua sendo o petróleo, o qual recebe
grandes investimentos, quegerameco-
nomia deescala queotorna altamente
competitivo. Oetanol, alémdepossuir
propriedades desejáveis como com-
bustível, tambémtraz benefícios com
respeitoà qualidadedoar urbanoedo
clima global. Dessa forma, existe um
grande interesse no seu uso, tanto na
formapuracomomisturadoàgasolina
(LYND et al, 1991). A geração de
empregos, a fixação do homem no
campoe a utilizaçãodosolosãoparâ-
metros difíceis demedir, mas suficien-
temente importantes para não serem
desprezados ouminimizados.
Embora o etanol seja atualmente
produzido a partir da cana-de-açúcar
noBrasil, eapartir domilhoedeoutros
amiláceos nos Estados Unidos, outras
fontes também podem servir como
matéria-primabarataerenovável. Tec-
nologias paraaconversãodemateriais
lignocelulósicos em etanol já estão
disponíveis, embora a umcustoainda
nãocompetitivocomopreçoda gaso-
lina nomercadomundial. Basicamen-
te, oprocessode conversãodas fibras
hemicelulósicas e celulósicas de bio-
massa vegetal em etanol consiste em
tratar omaterial comácidodiluído, de
forma que a maior parte da hemicelu-
Katia Gianni de Carvalho Lima,
Doutoranda em Ciências dos Alimentos
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Laboratório de Microbiologia de Alimentos
Universidade de São Paulo
gianni@usp.br
Caroline Maki Takahashi
Mestre em Biotecnologia,
Departamento de Microbiologia
Instituto de Ciências Biomédicas
Universidade de São Paulo
Flavio Alterthum, Dr.
Departamento de Microbiologia
Instituto de Ciências Biomédicas
Universidade de São Paulo
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- julho/agosto 2002 25
lose e uma pequena porçãoda celulo-
sesejamconvertidasemaçúcares. Após
esse passo, as fibras celulósicas são
hidrolisadas por enzimas eohidrolisa-
dopodeser entãofermentadoaetanol
(VON SIVERS et al., 1994).
Asoluçãodeaçúcares resultanteda
hidrólise da hemicelulose consiste em
uma mistura de pentoses e hexoses. A
utilização eficiente de pentoses, prin-
cipalmente xilose, é umpasso impor-
tante para o desenvolvimento de pro-
cessos economicamente viáveis de
produçãodeetanol apartir debiomas-
sa vegetal.
Saccharomyces cerevisiae, o mi-
crorganismomais freqüentementeuti-
lizado na produção de etanol, não é
capaz de fermentar pentoses. Dessa
forma, duranteos últimos anos, tem-se
procuradomicrorganismos que sejam
capazes de fermentar eficientemente
uma ampla variedade de açúcares.
Escherichiacoli é ummicrorganis-
mo potencialmente interessante para
ser usadoemprocessos industriais por
ser amplamente estudado, tanto do
ponto de vista fisiológico como gené-
tico. É capaz de fermentar eficiente-
mente uma grande variedade de açú-
cares constituintes da biomassa ligno-
celulósica, mas produzumamisturade
produtos de fermentaçãode pequeno
valor agregado.
Foramconstruídos recombinantes
de E. coli que carregam os genes pdc
e adh de Zimomonas mobilis, permi-
tindo que o metabolismo do piruvato
durante a fermentaçãofosse desviado
da síntese de uma mistura de ácidos
orgânicos para a produção de etanol
comeficiênciadeconversãosuperior a
95% do rendimento teórico máximo
(INGRAM et al, 1991).
Vários trabalhos mostraramacapa-
cidade de E. coli recombinante de
fermentar uma ampla variedade de
açúcares paraetanol comrendimentos
próximos aos teóricos. Lactose, glico-
se, frutose, galactose, manose, xilosee
arabinose foramutilizados pelas dife-
rentes linhagens testadas quanto à to-
lerânciaambiental, estabilidadedoplas-
mídio, expressão das enzimas de Z.
mobilis e produçãode etanol (ALTER-
THUM & INGRAM, 1989). As melho-
res linhagens foramATCC9637, 15224
e 11303 contendo o plasmídio pLOI
297, sendoque a última alcançouuma
produção de etanol de 5,2 % (v/v) a
partir de 8% de xilose.
Aestabilidade das linhagens gene-
ticamente modificadas foi melhorada
pelainserçãodos genes quecodificam
pdc e adh de Z. mobilis no cromosso-
mode E. coli, eliminandoa necessida-
de de plasmídios e aumentando a
estabilidade do microrganismo para
aplicações comerciais (OHTA et al,
1991). Os genes da etanologênese
originados deZ. mobilis foramintegra-
dos nocromossomodeE. coli pertodo
locus da piruvato formato liase, (pfl)
originandoE. coli KO11. Aintegração
resultou em maior estabilidade dos
genes deZ. mobilis na bactéria recom-
binante e E. coli KO11 mostrou-se
capaz de produzir etanol na ausência
de genes presentes em vetores plas-
midiais (OHTA et al, 1991).
Aclonagembemsucedida dos ge-
nes de Z. mobilis emE. coli represen-
ta um modelo simples de como as
atuais ferramentas da genética e da
biologia molecular podemser utiliza-
das para criação ou transferência de
vias metabólicas deummicrorganismo
paraoutronãotaxonomicamenterela-
cionados.
Processos industriais de produção
de etanol a partir de cana-de-açúcar,
milho e beterraba já são amplamente
estabelecidos. Vários microrganismos
têm-se mostrado capazes de fermen-
tar açúcares presentes emhidrolisados
lignocelulósicos, convertendo-os em
etanol. Num recente estudo compa-
rando o desempenho de diferentes
microrganismos emumhidrolisadode
sabugo de milho rico em pentoses, a
bactéria recombinanteE. coli KO11foi
considerada a melhor fermentadora
(HAHN-HÄGERDAL et al., 1994).
LINDSAYet al., (1995) verificaram
a viabilidade de um processo de fer-
mentaçãoseqüencial: noprimeiropas-
so, umamisturadehexoses epentoses
foi fermentadapor E. coli recombinan-
te; no segundo, glicose e levedura
foramadicionadas aomeio. Aconver-
são total da glicose em etanol, na
segunda etapa, indicouque a fermen-
tação prévia por E. coli recombinante
não impediu a atividade da levedura.
Tal processo pode combinar, em um
único tanque de fermentação, os atri-
butos de E. coli recombinante, capa-
zes de fermentar eficientemente pen-
toses ou misturas de açúcares, com a
alta tolerância ao etanol de leveduras
convencionais. Dessaforma, afermen-
tação de açúcares derivados de bio-
massa lignocelulósica por E. coli re-
combinantepoderia ser incorporada a
usinas jáexistentes baseadas nautiliza-
çãodemilhooudecana-de-açúcar por
leveduras convencionais.
Estudos têm sido realizados para
avaliar a fisiologia e odesempenhode
E. coli KO11 emprocessos de fermen-
taçãoalcoólica, comvistas à utilização
dessabactérianaconversãoderesídu-
os que não podem ser aproveitados
nos processos tradicionais de produ-
ção de etanol por S. cerevisiae, ofere-
cendo potencial para a expansão co-
mercial da produçãode álcool a partir
de fontes de matéria-prima alternati-
vas.
Foi observado que E. coli KO11
pode eficientemente metabolizar mis-
turas complexas deaçúcares derivadas
dahidróliseácidademateriais lignoce-
lulósicos, tais como bagaço de cana-
de-açúcar, sabugo de milho, palha de
milho, Pinus spemadeira de carvalho
(BARBOSAet al., 1992; OLSSONet al.,
1995; ASGHARI et al., 1996).
BARBOSAet al., (1992) avaliaramo
desempenho de E.coli KO11 em hi-
drolisado hemicelulósico de Pinus sp
tratado com hidróxido de cálcio ou
óxido de cálcio e sulfito de sódio,
suplementado com triptona e extrato
de levedura. Eficiência de conversão
de 91%foi obtida, excedendoorendi-
mento e a produtividade obtidos em
fermentações análogas utilizando le-
veduras. A mesma bactéria foi capaz
de fermentar os açúcares presentes
em hidrolisados hemicelulósicos de
palha e sabugode milho, comeficiên-
cia de conversão de 100% (BEALL &
INGRAM, 1992).
Emrecentes comparações usando
leveduras e bactérias para fermentar
hidrolisados contendohexoses epen-
toses, mostrou-se que E. coli KO11 foi
superior a outros microrganismos em
produtividadeerendimentodeetanol,
alémdeser resistentea produtos inibi-
dores produzidos durante a hidrólise
(HAHN-HÄGERDAL et al., 1994). Me-
lhorias, tantonapartetécnicacomono
desempenho do microrganismo, são
necessárias para reduzir os custos do
processo. Fermentação contínua, oti-
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mização da etapa de destoxificação,
utilização de fontes alternativas de
nutrientes e aproveitamento de sub-
produtos podemcontribuir para oba-
rateamentodoprocesso.
A utilização de E. coli KO11 atual-
mente está restrita a umgrupopeque-
nodepesquisadores, pois asuapaten-
te está protegida. Porém, a partir de
2004, esse processo será de domínio
públicoe, portanto, poderá ser utiliza-
do em qualquer lugar do mundo, em
particular aqui noBrasil, queéricoem
resíduos agrícolas (INGRAM et al.,
1991).
II. MATERIAIS E MÉTODOS
II.1. Microrganismo
O microrganismo utilizado foi Es-
cherichia coli KO11 contendo os ge-
nes que codificam para as enzimas
piruvato descarboxilase (pdc), álcool
desidrogenase B (adh) da bactéria
Zymomonas mobilis epara resistência
a cloranfenicol, integrados aoseucro-
mossomo. E. coli KO11 foi semeada
em placas contendo meio LB sólido
contendo20,00 g/L de xilose e cloran-
fenicol, mantidas a 30°C, repicadas
diariamente(TAKAHASHI et al, 2000).
II.2. Preparação do inóculo e
experimentos de fermentação
E. coli KO11 foi cultivada emmeio
LB sólido suplementado com 20,0 g/l
de xilose e incubada a 30
o
C por 24 h.
Colôniasisoladasforamtransferidaspara
erlenmeyers contendo 50 mL de LB
líquido suplementado com 40 g/L de
xilose e cultivado a 30
o
C por 6 horas,
numagitador rotatório. Culturas resul-
tantes foram diluídas dez vezes em
balões volumétricos contendohidroli-
sado neutralizado e suplementado
(TAKAHASHI et al, 2000).
II.3. Hidrólise do sabugo
de milho
Osabugodemilhofoi inicialmente
moído para, então, ser embebido em
ácido sulfúrico 1% (100,00 g de sabu-
go/600 mL H
2
SO
4
). Após cerca de 24
horas, foi retirado o excesso de ácido
(300 mL) e iniciada a hidrólise em
autoclave a 120
o
C por 40 minutos.
Através de pressão mecânica, o sabu-
gofoi espremido, ohidrolisadoretira-
do, aquecidoa80°C, adicionandoCaO
até pH 10,0 e suplementado com 1,0
g/L de sulfitode sódio. Após oresfria-
mento a temperatura ambiente, o hi-
drolisadofoi centrifugadoeosobrena-
dante foi ajustado a pH7,0 comácido
sulfúricoconcentrado. Para os experi-
mentos de fermentação, ohidrolisado
foi suplementado com 10 g/L de trip-
tona e 5,0 g/L de extrato de levedura
(TAKAHASHI et al, 2000).
II.4. Análise dos parâmetros
de fermentação
Oconsumode açúcares e a produ-
çãodeetanol foramdeterminadosusan-
doHPLC, comodescritoTAKAHASHI
et al., 2000. Forammedidos os seguin-
tes parâmetros: Tempo (h); Concen-
tração de açúcar consumido (g/L);
Concentração de etanol (g/L); Rendi-
mento (g de etanol produzido/ g de
açúcar consumido).
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Segundo ZALDIVAR et al. (1999),
componentes alcoólicos, aldeídos e
ácidos orgânicos produzidos durantea
hidrólise inibema produçãode etanol
por inibiremo crescimento microbia-
no. Porém, hidrolisados hemicelulósi-
cos de bagaçode cana e de sabugode
milho podem ser fermentados por E.
coli KO11 depois de serem diluídos e
neutralizados (ZALDIVARet al, 1999).
Alguns estudos sugerem que E. coli
KO11 é mais tolerante a ácido acético
que outros microrganismos (LULI &
STROHL, 1990).
Oprocessodecalagemcomhidró-
xido ou óxido cálcio é conhecido por
aumentar a fermentabilidade dos hi-
drolisados ricos em carboidratos, po-
dendo estar relacionado com a varia-
çãodeácidos orgânicos, inorgânicos e
comoutros produtos solúveis (RANA-
TUNGA et al, 2000). O efeito mais
significativo desse tratamento é um
grandeaumentonaquantidadedeíons
de cálcio, que está relacionado coma
melhora da fermentação. A adição de
carbonatodecálcionohidrolisadoau-
xiliananeutralizaçãodoácidoproduzi-
do, além de atuar como tampão e a
estabilizar o pH do meio durante a
fermentação. Esse tamponamentoau-
menta a utilizaçãode glicose e, subse-
qüentemente, a produção de etanol,
sugerindo que o cálcio pode ter um
efeito indireto para a produção de
etanol.
Inoculamos balões volumétricos
contendohidrolisadoneutralizadode
sabugo de milho com E. coli KO11.
Observamos que a fermentação foi
concluída em 69 horas; a xilose foi
totalmente consumida e obtivemos
36,00 g/L de etanol (Figura 01), que
corresponde a umrendimentode 0,50
(g de etanol/ g de açúcar).
E. coli KO11 fermenta arabinose e
glicose rápida e eficientemente, mas
tem mais dificuldade para fermentar
xilose, a qual foi consumida lentamen-
te emhidrolisados (DIENet al., 1999).
Alguns estudos têm mostrado que a
presença de glicose inibe a utilização
de xilose (TAKAHASHI et al, 1994;
ASGHARI et al, 1996, TAKAHASHI et
al, 2000). Esses dados nos sugeremque
a xilose presente no inóculo regula os
genes responsáveis para a fermenta-
çãoalcoólicadehidrolisados deresídu-
osagrícolas. Nossosresultadosdemons-
tram que E. coli KO11 é capaz de
fermentar xiloseeficientementehidro-
lisados deresíduos agrícolas, comosa-
bugode milho, comrendimentos pró-
ximos aos teóricos (0,51 gde etanol/ g
de açúcar), não sendo afetada por ini-
bidores que possam estar presentes
noshidrolisados.
Paraqueumprocessodedestilação
sejaeconomicamenteviável, sãodese-
jáveis concentrações mais elevadas de
etanol do que essas obtidas emhidro-
lisados, que estão em torno de 5% (v/
v de etanol). TAKAHASHI et al. (1997)
estudaram um processo de produção
de etanol emduas etapas: na primeira,
E. coli KO11 fermentou hexoses e
pentoses presentes emhidrolisadohe-
micelulósico de bagaço de cana-de-
açúcar a etanol; emseguida, fermento
de padaria e sacarose foramadiciona-
dos aohidrolisadofermentado. Oeta-
nol acumuladonomeiofoi de100,0g/
L, somatóriadaproduçãopelabactéria
e levedura. A fermentação em duas
etapas pode tornar mais atrativa a pro-
dução de etanol a partir de biomassa
lignocelulósica por E. coli KO11, ape-
nas utilizando recursos (sacarose e le-
vedura) presentes na própria usina .
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- julho/agosto 2002 27
Emnossos experimentos, após 110
horas, acrescentamos 150,00 g/L de
sacarose e 100,00 g/L de levedura
adquirida empadaria emhidrolisados
já fermentados por E. coli KO11. Ob-
servamos, após 8 horas, que houve
produçãomáximadeetanol, alcançan-
do 107,00 g/L de etanol, o que torna o
processodedestilaçãoeconomicamen-
te favorável (dados não apresenta-
dos).
E. coli KO11, embora emmenores
proporções, produz, emcondições de
anaerobiose, ácido acético, láctico e
succínico(OHTAet al., 1991). Aparen-
temente esses ácidos não foram tóxi-
cos à levedura, não interferindo na
produçãode etanol. Esse processode
aumentodeconcentraçãofinal deeta-
nol éimportanteeconomicamentepor
vários aspectos: utilizaçãodehidrolisa-
do de resíduo agrícola já fermentado
por E. coli KO11comomeiodecultura
em usinas; utilização de sacarose e
levedura presente emquantidade nas
usinas; processo de destilação mais
econômico devido a uma maior con-
centração final de etanol; eliminação
da viabilidade de E. coli KO11, visto
que a essas concentrações de etanol a
bactéria nãosobrevive.
IV. CONCLUSÕES
• E. coli KO11 é capaz de fermentar
eficientemente sabugo de milho e
outros resíduos agrícolas comrendi-
mentos próximos aoteórico.
• As leveduras (fermento de padaria)
foram capazes de fermentar efici-
entemente a sacarose, apesar da
presençadeprodutos dometabolis-
mo de E. coli KO11.
• Oacréscimodefermentodepadaria
e de sacarose após a fermentação
por E. coli KO11, aumentou a con-
centração de etanol chegando a
107,00 g/L, tornando viável e mais
atrativa a fermentaçãodohidrolisa-
do de sabugo de milho por E. coli
KO11 apenas utilizando recursos
(sacarose e levedura) presentes em
usinas de álcool e açúcar.
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