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VI Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniería

Habana 2005
ISBN 959-212-158-3, Copyright 2005, Sociedad Cubana de Bioingeniería, artículo T073


PRODUCCIÓN DE LA ENZIMA LACASA POR EL HONGO
Cladosporium cladosporioides EN PRESENCIA DE FENANTRENO

C. Chávez-López, J. F. Esparza-García, Ma. E. Hidalgo-Lara, O. Loera-Corral, R. Rodríguez-Vázquez

Departamento de Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-Zacatenco
Av. Instituto Politécnico Nacional 2508, Col. Zacatenco, México D.F., C.P. 07360. Claudiurix_7@yahoo.com.mx




RESUMEN
El hongo deuteromiceto Cladosporium cladosporioides
tuvo la capacidad de producir la enzima lacasa
(EC:1.10.3.2, benzenodiol: oxígeno reductasa) en medio
líquido sin y con fenantreno (172 mg/l). Éste hongo, sin
fenantreno, mostró una actividad enzimática de lacasa
máxima a los 3.5 días de incubación (1.01 U/g biomasa en
peso seco), y con fenantreno la máxima actividad fue al día
3 de incubación (3.09 U/g biomasa en peso seco). La
presencia de fenantreno fue significativa (p>0.01) para la
actividad específica de la enzima lacasa y presentó una
correlación positiva (p>0.01), es decir la presencia del
fenantreno aumentó la actividad específica de la enzima.
Hubo una remoción máxima de fenantreno de 54 % en el
día 4 de incubación (de 172 a 125 mg/l), sin embargo
ninguna de las variables dependientes e independientes
tuvo un efecto significativo en la remoción del fenantreno
en el medio de cultivo.


Palabras clave: Cladosporium cladosporioides, lacasa,
fenantreno.

1. INTRODUCCIÓN
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) se
encuentran en suelo, aire y agua; son de origen natural y
antropogénico [1], Por sus efectos negativos a la salud
humana, la Environmental Protection Agency en Estados
Unidos de Norteamérica (EPA), ha considerado a 16 de
ellos de alta importancia, entre los que se encuentra el
fenantreno, ya que son tóxicos y/o cancerígenos [2]. Los
hongos de la división basidiomicota (Pleurotus ostreatus,
Trametes versicolor, entre otros) pueden degradar tales
compuestos [3], [4]. Lo anterior se debe a su producción de
enzimas ligninolíticas, las cuales son extracelulares y poco
específicas [5]. Dentro de dichas enzimas se encuentra la
lacasa (EC:1.10.3.2, benzenodiol:oxígeno reductasa) quien
reduce el oxígeno molecular a agua [6]. Sin embargo
existen hongos deuteromicetos que pueden biotransformar
HAP, como Cladosporium cladosporioides, quien degradó
sustancias húmicas en agua y una de las enzimas que
estuvo involucrada fue la lacasa [7]. Una cepa de C.
cladosporioides encontrada en suelo de humedales,
contaminado con fluoranteno, fue inoculada en medio
líquido sintético, y observaron que hubo una reducción del
26% de antraceno (de 0.01 a 0.0023 g/l) y 78% de
fluorantreno (de 0.01 a 0.0078 g/l) [8]. En medio sólido de
agar C. cladosporioides, aislado de suelo contaminado con
hidrocarburos, tuvo la capacidad de producir la enzima
lacasa [9], [10].
Existen pocos estudios sobre la intervención de la
enzima lacasa en la degradación de HAP por el hongo C.
cladosporioides, en medio líquido. El objetivo de éste
trabajo fue medir la actividad de la enzima lacasa producida
por C. cladosporioides, en presencia (172 mg/l) y ausencia
de fenantreno, en medio líquido.

2. METODOLOGÍA
Microorganismo: La cepa del hongo Cladosporium
cladosporioides pertenece al laboratorio de Xenobióticos
del Depto. de Biotecnología y Bioingeniería,
CINVESTAV-Zacatenco, Ciudad de México. Fue aislada
de suelo con hidrocarburos y bagacillo de caña. El hongo se
creció en medio sólido agar-papa-dextrosa (DIFCO,
México) a 28ºC por 6 días antes de ser transferido al medio
Wunder modificado.
Medio de cultivo: Composición del medio líquido de
cultivo Wunder modificado para crecer el inóculo: Glucosa
10.0 g/l, extracto de malta 1.0 g/l, NaNO
3
1.33 g/l, MgSO
4

7H
2
O 0.66 g/l, FeSO
4
0.013 g/l, CuSO
4
0.005 g/l, MnSO
4

0.667 g/l, CaCl
2
2H
2
O 0.1334 g/l, NaCl 0.1334 g/l,
K
2
HPO
4
0.1667 g/l, KH
2
PO
4
1.159 g/l. La composición del
medio líquido de cultivo Wunder modificado para realizar
la cinética varió en la cantidad de glucosa (6 g/l) sin
embargo la composición de macro y micro nutrientes es la
misma.
Químico: Fenantreno Aldrich P11425-1006. Se
disolvió en acetona HPLC, cat. 010-4, Burdick & Jackson.
Condiciones de cultivo: 8 fragmentos (0.8mm Ø) del
hongo crecido en agar-papa-dextrosa se colocaron en
matraces Erlenmeyer de 250 ml con 80 ml de medio de
cultivo líquido Wunder modificado a 28ºC, 125 rpm
durante 4 días. Del hongo que creció se tomaron 0.4g en
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base húmeda y se agregaron a matraces Erlenmeyer de 125
ml con 40 ml de medio Wunder modificado, a 28ºC, 125
rpm durante 4 días. Se manejaron dos condiciones sin y con
200mg/l de fenantreno. A los matraces se les adicionó el
fenantreno disuelto en acetona, y se dejó que esta se
evaporara, antes de adicionar el medio de cultivo y el
inóculo. Se manejaron controles negativos (sin inóculo)
para las dos condiciones.
Filtración y pH: La biomasa de cada matraz se separó por
filtración con vacío. El medio filtrado (40 ml) se concentró
hasta obtener 5 ml del medio, se usó un ultrafiltro Amicon
8050 con una membrana de 10 kDa a 55psi (3.9 kg/cm
2
) de
presión. El pH del medio de cultivo filtrado se midió en un
potenciómetro Jenway 3020 pH Meter.
Actividad de la enzima lacasa (U/l): Para determinar la
actividad de la enzima lacasa, en un volumen de reacción
de un mililitro, se agregó la muestra, 2,2’azino-3-etil
benzatalino-6-sulfonato (ABTS) 1mM, y solución
amortiguadora de acetato de sodio 0.1M, pH 5. Se leyó a
420 nm en un espectrofotómetro Lambda 3A UV-VIS. El
coeficiente de extinción (ξ) fue de 36 000 l/mol • cm [11].
Actividad específica de la enzima lacasa (U/g): La
actividad específica se calculó obteniendo el cociente de la
actividad enzimática de la lacasa (U) y la biomasa en base
seca (g) [12].
Azúcares reductores: Para determinar los azúcares
reductores del medio se utilizó 1 ml de muestra y 3 ml de
reactivo ác. 3,5 dinitrosalicílico (DNS), se colocaron en
baño maría por 5 min. Después de enfriarse se les
agregaron 16 ml de agua destilada. Se leyó a 550 nm en un
espectrofotómetro Lambda 3A UV-VIS [13].
Fenantreno residual: A un matraz de separación se le
agregaron 40 ml del medio de cultivo filtrado y 30 ml de
diclorometano HPLC (Burdick & Jackson), agitándose por
3 min purgando 5 veces. El embudo se dejó reposar para
que se separaran las fases, y se recuperó la fase inferior en
un frasco ámbar de 60 ml. Lo anterior se repitió 3 veces. A
los extractos se les evaporó el diclorometano, el precipitado
fue resuspendido en 10 ml de acetona HPLC, y se filtró con
membrana de nylon Gl de 0.2 µm. El fenantreno se
cuantificó por Cromatografía de Líquidos de Alta
Resolución (HPLC) marca Varian 9050 con una columna
Waters Spherisorb S5ODS2 4.6 × 250 mm Analytical
Cartridge Part No. PSS 839540, utilizando como fases
acetonitrilo:agua (75:25), con una velocidad de flujo de 1.0
mL/min, a 254 nm.

Análisis estadístico: Los resultados se analizaron
empleando un programa de análisis estadístico Disegn
Expert 6.06.

3. RESULTADOS
3.1 Producción de biomasa
La biomasa del hongo creció en forma de “pellets”, siendo
más grandes sin fenantreno (7-9 mm ∅) y más pequeños
con fenantreno (3-5 mm ∅). El tiempo de incubación tuvo
un efecto altamente significativo en la producción de la
biomasa de C. cladosporioides (p>0.01) y una correlación
positiva (p>0.01), lo cual nos indica que al aumentar el
tiempo de incubación la producción de la biomasa se
comporta de igual manera. La concentración de fenantreno
presentó un efecto significativo (p<0.01) figura 1.














Figura 1 Producción de biomasa del hongo C. cladosporioides en
presencia y ausencia de fenantreno durante el tiempo de incubación

El incremento en la producción de biomasa provocó que la
concentración de azúcares del medio de cultivo
disminuyera, ya que éstas dos variables se correlacionaron
negativamente (p>0.01) (figura 2).













Figura 2 Producción de biomasa del hongo C. cladosporioides y
concentración de azúcares reductores en el medio de cultivo, en ausencia y
presencia de fenantreno

3.2 pH
En el pH del medio de cultivo el tiempo de incubación tuvo
un efecto altamente significativo (p>0.01), y una
correlación positiva (p>0.001) ya que al aumentar el tiempo
de incubación el pH del medio se comportó de la misma
manera, figura 3. El pH del medio de cultivo se
correlacionó negativamente (p>0.01) con la concentración
de azúcares en el medio, es decir al aumentar el pH del
medio la concentración de azúcares del medio disminuyó.






0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Tiempo de incubación (días)
B
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o
m
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s
a

(
g
/
l
)
0 mg/l fenantreno
200 mg/l fenantreno 172
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
0.0 1.0 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
Tiempo de incubación (días)
B
i
o
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a

(
g
/
l
)
0
1
2
3
4
5
6
7
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l

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o

(
g
/
l
)
0 mg/l
fenantreno
200 mg/l
fenantreno
Azúcares
sin
fenantreno
Azúcares
con 200
mg/l
fenantreno
172
172
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Figura 3 Cambio de pH en el medio de cultivo durante la cinética, en
ausencia y presencia de fenantreno

3.3 Actividad específica de la enzima lacasa
El hongo C. cladosporioides tuvo una producción basal
máxima de la enzima lacasa a los 3.5 días (1.01 U/g
biomasa en peso seco). La presencia de fenantreno (172
mg/l) fue significativa (p>0.01) para la actividad específica
de la enzima lacasa y presentó una correlación positiva
(p>0.01), es decir que a 172 mg/l de fenantreno hubo un
aumento en la actividad específica de la enzima. Lo anterior
nos muestra que la presencia de fenantreno indujo la
producción de la lacasa, figura 4. La composición del
medio líquido Wunder modificado que se empleó tiene los
macronutrientes, micronutrientes y glucosa necesarios para
el crecimiento del hongo, descartando que en el medio haya
algún compuesto exógeno a parte del fenantreno que
pudiera estar aumentando la actividad de la lacasa. Los
valores de la actividad específica de la lacasa (3.09 U/g
biomasa en peso seco) para este hongo son muy bajos
comparado al reportado para el hongo Trametes versicolor
(28.7 U/g de biomasa en peso seco) [12], ésto se debe a que
en el medio de cultivo le agregaron paja de trigo el cual
sirve como inductor de las enzimas ligninolíticas como la
lacasa.
















Figura 4. Actividad específica de la enzima lacasa, en ausencia y presencia
de fenantreno
El tiempo de incubación presentó una correlación positiva
(p>0.01) con la actividad específica de dicha enzima, al
incrementarse el tiempo de incubación la actividad
específica aumentó, figura 4.

3.4 Fenantreno
El fenantreno residual del medio de cultivo durante el
tiempo de incubación se muestra en la figura 5. Después de
realizar el análisis de varianza y correlación de variables a
los datos, se observó que ninguna de las variables tuvo un
efecto en la disminución del fenantreno en el medio de
cultivo. Se partió de una concentración de 172 mg/l de
fenantreno para el día cero, y se calculó la remoción para el
día 4 de incubación (125 mg/l), la cual fue de 54 %. Es la
primera vez que se reporta la remoción de fenantreno por
C. cladosporioides aunque se sabe que dicho hongo puede
remover otros HAP en medio líquido sintético siendo del
26% para antraceno (de 0.01 a 0.0023 g/l) y del 78% para
el fluorantreno (de 0.01 a 0.0078 g/l) [8].














Figura 5. Fenantreno residual en el medio de cultivo

Aunque hubo una mayor actividad de la enzima lacasa
en presencia de fenantreno (172 mg/l) no se obtuvo alguna
correlación directa con la remoción del fenantreno en el
medio líquido. Lo anterior se ha observado en Pleurotus
ostreatus [5] y en T. versicolor, para éste hongo la
remoción de HAP, como el fenantreno, la lacasa está
involucrada de manera indirecta ya que existe un sistema
mediador para la lacasa (LMS). Los LMS pueden ser
compuestos secretados por los hongos como el ác. 3-
hidroxiantranilico (Pycnoporus cinnabarinus), tirosina o
sus derivados [14].

4. CONCLUSIONES
El hongo deuteromiceto C. cladosporioides tiene una
producción basal de la enzima lacasa en medio líquido
Wunder modificado (1.01 U/g base seca). La presencia de
172 mg/l de fenantreno en medio líquido Wunder
modificado provocó una mayor actividad específica de la
enzima lacasa (3.01 U/g base seca). Hubo una remoción del
54% para el fenantreno en el medio de cultivo (de 172 mg/l
a 125 mg/l). No hubo una correlación entre la actividad de
la enzima lacasa y la remoción del fenantreno en el medio
de cultivo.

0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
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Tiempo de incubación (días)
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200 mg/l fenantreno

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Sin fenantreno
200 mg/l fenantreno 172
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AGRADECIMIENTOS
Agradezco todos los comentarios de la M. en C. Aura
Marina Pedroza de la Universidad Pontificia Javeriana de
Colombia.
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