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INVESTIGACIÓN

Acceso Abierto
La progesterona en la leche inmunoenzimática se ensaya como una herramienta para investigar la
ciclicidad ovárica en búfalos de agua en relación a la calificación de la condición corporal y la producción
de leche
Abstracto
Antecedentes: La aplicación de tecnologías de reproducción asistida en búfalos se limita en cierta medida
por la incapacidad de los agricultores para detectar el celo debido a su pobre expresión. l estudio tuvo
como ob!etivo investigar la fiabilidad de un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas de
progesterona en leche "L#$A% para evaluar la ciclicidad ovárica durante el post&parto' celo y cría post&
períodos en los búfalos de agua.
()todos: Las concentraciones de progesterona se midieron por L#$A en leche de *+ búfalos reci)n
paridos en relación al celo' el embarazo' la puntuación de la condición corporal ",-$% y la producción de
leche. .os muestras de leche fueron tomadas a intervalos de /0 días de cada mes a partir del día +0 y
continuó hasta /10 días despu)s del parto. La ,-$ y la producción de leche fueron registradas durante la
recogida de la muestra. Las muestras de leche de búfalas criadas se recogieron en el día 0 "día de la cría%'
días /0&/* y días **&*2. Leche desgrasada se conservó a &30 4 - hasta su análisis. l embarazo fue
confirmado por palpación por el recto en los días 50&60.
7esultados: .iecisiete búfalos tuvieron 25 ciclos ovulatorios' de uno a cuatro en cada uno' /+ fueron
detectadas en celo una vez "*38 tasa de detección del celo%. -oncentración de 9rogesterona : / ng ; ml en
una de las dos muestras de leche en intervalos de /0 días refle!an la ovulación y la formación del cuerpo
lúteo. Los intervalos entre el parto hasta la primer actividad luteal y al primer celo detectado varió desde
2/ hasta /*+ días "n < /5% y 3+ a /+1 días "n < /+%' respectivamente. =cho eran los búfalos criados en el
curso del estudio' y siete se encontraron embarazados. stos búfalos tenían un perfil ba!o de progesterona
">/ ng ; ml%' alto ": / ng ; ml% y alto ": / ng ; ml% en el .ía 0' días /0&/* y días **&*2' respectivamente.
l ciclismo de los búfalos más adelante en el período post&parto habían perdido el celo menos (P >0'01%.
,úfalos con un ,-$ superior tuvieron un corto intervalo entre parto&celo y produ!eron más leche (P
>0'01%.
-onclusiones: L#$A con progesterona de leche es una herramienta fiable para el seguimiento de la
ciclicidad ovárica y un buen ,-$ puede indicar la reanudación de la ciclicidad en búfalos de agua.
9alabras clave: Leche' progesterona' L#$A' ciclicidad' condición corporal' ,úfalo
stro< -elo
?ondo
l mane!o reproductivo de los búfalos es una de las principales preocupaciones debido a las dificultades
en la detección del celo y es asociado con importantes p)rdidas económicas. $hah et al.@/A reportaron una
incidencia de B&5+8 de celos silenciosos o sub celo en los búfalos. sto garantiza el desarrollo y la
aplicación de tecnologías para identificar celo silencioso en búfalos. Cambi)n es importante para los
agricultores para comprender la importancia de la puntuación de la condición corporal ",-$% y su
asociación con la ciclicidad ovárica y pedir servicios veterinarios cuando los búfalos no presentan
comportamiento de celo.
La concentración de progesterona en la leche es un buen predictor de determinar el estado funcional del
cuerpo lúteo y actividad ovárica en los rumiantes dom)sticos @*A. 9resicce et al. @+A utilizaron una
medición de la concentración de progesterona plasmática !unto con la ecografía para controlar dinámica
folicular ovárica en búfalos mediterráneos italianos y en un estudio reciente utilizaron la medición de la
concentración plasmática de progesterona !unto con la palpación rectal' 108 de búfalos sospechosos de
anestro Due tenían en realidad sub estro @2A. La leche se prefiere sobre plasma para la determinación de
concentración de progesterona en condiciones de campo' porDue la leche es fácil de recoger y en última
instancia asegurar el cumplimiento de los agricultores. (uchos de los estudios anteriores midieron la
progesterona en la leche mediante radio inmunoensayo o inmunoensayo enzimático. 9ero el uso de un
ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas de progesterona en leche "L#$A% con una programa
apropiado de muestreo y su aplicación en el campo para supervisar el estado cíclico de los ovario en los
búfalos aún no se ha dilucidado. l monitoreo de concentración de progesterona en la leche proporciona
información práctica para me!orar la reproducción y para detectar trastornos reproductivos asociados con
disfunción ovárica @1'BA. La palpación rectal se puede utilizar para detectar algunos trastornos ováricos en
búfalos pero los resultados no siempre se correlacionan con la actividad ovárica @5AE las conclusiones es
Due puedan deberse a cuerpos lúteos Due están incrustados en el estroma ovárico particularmente durante
el período posparto temprano en vacas búfalo @3A. La ecografía podría ser una opción para resolver este
problema' pero su uso en peDueFas explotaciones agrícolas está limitado por el coste. 9or lo tanto' la
L#$A en progesterona de leche con un muestreo adecuado sigue siendo una de las herramientas más
pertinentes de evaluación del estado cíclico de los ovarios en los búfalos en condiciones de campo.
la ,-$ es un indicador útil del estado nutricional y la buena ,-$ refle!a un balance energ)tico positivo
Due conduce a la anterior reanudación de la ciclicidad ovárica posparto en vacas @6'/0A.9or lo tanto' es
importante investigar la relación de la ,-$ con el reinicio de la ciclicidad ovárica y la producción de
leche en búfalas lecheras en ,angladesh. sto ayudara a educar a los agricultores en la predicción de la
ciclicidad ovárica y la planificación de la cría de búfalos post&parto.
l presente estudio tuvo como ob!etivo investigar el ciclicidad ovárica con la L#$A de progesterona en
leche en búfalos de agua durante los períodos de post&parto' celo y apareamiento posteriores y para
relacionar los niveles de progesterona con la ,-$' la producción de leche y diagnóstico de preFez por
palpación por el recto.
()todos
Geintitr)s búfalos provenientes de *+ fincas ubicadas en seis pueblos del distrito de (ymensingh'
,angladesh fueron seleccionados. l estudio se llevó a cabo durante el período de !unio *00B a marzo de
*005. -ada familia poseía una o * búfalas del tipo de río autóctono. l rango de edad fue 2 a /1 aFos y de
paridad varió entre 0 y 5. Los búfalos fueron alimentados con pa!a de arroz' c)sped cortado y acarreado y
0'1 a /'1 Hg de molienda de subproductos como concentrado "arroz pulido y ; o acopio torta de aceite% con
limitado pastoreo en carretera y tierras comunitarias. Los búfalos fueron seleccionados en base a la
alimentación similar y patrón de gestión. Los animales se controlaron regularmente para asegurar Due no
estaban estresadas limitando así la variación de circulación de los niveles hormonales @//A.
9untuación de la condición corporal
Los búfalos se registraron dos meses antes del parto y la edad' la raza' la paridad y la información de
gestión de la alimentación se registró. La condición corporal de los búfalos se anotó mediante el uso de
una escala de /&1 "/ < delgadas y obesas 1 <% @/*'/+A. Las fotografías fueron tomadas desde el punto de
vista lateral y parte trasera de cada búfalo' para determinar retrospectivamente el ,-$. In eDuipo de
cuatro miembros evaluó las fotografías y anotaron la ,-$. Las ,-$s se anotaron a los ocho meses de
gestación' en el parto y en el momento de cada recolección de muestras de leche.
La leche recogida de muestra y conservación
Las muestras de leche fueron recolectadas directamente de las ubres de cada búfalo en medio del ordeFo
de la maFana en un tubo de plástico con tapón de rosca Due contenía *&bromo&*&nitro&/' +&propanodiol
",ronopol 3 mg ml tableta ; 20 de leche' . J ? -ontrol $ystems #nc. .ublin' -A' .II.%. l muestreo
de leche se inició +0 días despu)s del parto y dos muestras a intervalos de /0 días se recogieron por mes
hasta /10 días despu)s del parto si el estro no fue detectado. A los agricultores se les preguntó si veían
signos de estro es decir. #nDuietud' bramando' hinchazón vulvar' secreción mucosa' micción frecuente de
peDueFas cantidades de orina. n cada gran!a de visita para el muestreo de leche' la producción de leche y
signos de estro anteriores' es decir' el flu!o vaginal seco o fresco adherido al perineo o de la cola' se
registraron. Ina vez detectado en calor' los animales fueron criados por apareamiento natural. A partir de
entonces tres muestras adicionales de leche fueron recogidas. La primera fue en el día 0 "día de la
reproducción% mientras Due las muestras segunda y tercera se recogieron en los días /0&/* y **&*2'
respectivamente. Las muestras de leche entera se almacenaron a 2 4 - durante un máximo de dos días. Las
muestras se desgrasaron por centrifugación a /100 g durante +0 min a 2 4 -' las porciones de leche sin
grasa se recogieron y se conservaron a &30 4 - hasta Due se analizaron por L#$A.
9reparación de las normas de progesterona para L#$A
.os litros de leche fresca de vaca del búfalo en celo fueron recogidos y desgrasados. l carbón activado
"$igma Aldrich' $t. Louis' (=' .II.% fue aFadido "0'*18 K ; v% y la leche se agitó una hora a
temperatura ambiente "Alrededor de ** 4 -% y luego se conservó durante la noche a 2 4 -. La leche con
carbón se centrifugó durante /1 min a /100 g a 2 4 -' se recogió el sobrenadante y el residuo de carbón se
filtró con papel de filtro. La centrifugación repetida y la filtración se realizan para eliminar carbón vegetal
completamente. ntonces se aFade ,ronopol como conservante "3 mg;20 ml de leche%. Las soluciones
estándar de leche desgrasada Due contiene /00' /0' 1' *'1' /'*1' 0'B+' 0'+/ y 0'/B ng ; ml de progesterona
se prepararon utilizando progesterona comercialmente disponible "-albiochem' ,iociencias #nc. -A'
.II.%. ste procedimiento se realizó inmediatamente antes de la adición de las muestras y estándares
en la placa de microtitulación.
L#$A de progesterona en leche
La concentración de progesterona en la leche se determinó a trav)s de un L#$A competitivo siguiendo el
protocolo propuesto por 7asmussen et al. @/2A con modificaciones menores. ,revemente' una 9laca de 6B
pocillos "Lunc #mmuno 9late' 7osHilde' .inamarca% se recubrió y se incubó durante la noche a 2 4 - con
/00 Ml de un * Ml;ml anticuerpo secundario "anticuerpos de cabra anti&ratón' -albiochem% en tampón de
revestimiento "0'01 ( tampón de carbonato&bicarbonato' pN 6'B%. A continuación' la placa se lavó cuatro
veces con tampón de lavado "0'02 ( + & @L&morfolinoA propanosulfónico ácido con 0'018 de CKeen*0
"polisorbato *0%' pN 5'*%. -ien Ml de solución de anticuerpo monoclonal anti&progesterona "/:20'000
dilución' =#A' Giena' Austria% en tampón de ensayo "0'02 ( + & @L&morfolinoA propanosulfónico' 0'/*
( cloruro de sodio' 0'0/ ( .CA' 0'018 de CKeen*0' 0'0018 digluconato chlorohexidinedigluconate' y
0'/8 de gelatinaE pN 5'2% se aFadió a cada pocillo de la placa' excepto pozos inespecíficos de unión y se
incubaron con agitación durante /'1 h a temperatura ambiente. 9osteriormente' la placa se lavó cuatro
veces con tampón de lavado' y /00 Ml de muestras de control de calidad estándares "1 progesterona ng ; ml
de leche desnatada y tratada con leche con carbón vegetal% y a las muestras de leche a ensayar se
aFadieron a la placa y se incubaron con agitación durante /'1 h a temperatura ambiente. -incuenta Ml de
peroxidasa de rábano picante "N79% con!ugado "/:*000 en tampón de ensayoE progesterona&+& N79
produce a partir de la progesterona&+&-(=' $teraloids #nc.' LeKport' 7hode #sland' .II.% se aFadió.
La placa se agitó de nuevo durante /'1 h y se lavó con tampón de lavado cuatro veces. 7eci)n preparados
/*1 Ml de +' + O' 1' 1O& se aFadió sustrato de tetrametilbencidina y se agitó durante /1 min a +5 4 - en la
oscuridad para cuantificar la actividad de N79. La reacción se detuvo mediante la adición de 10 Ml
solución de interrupción "0'1 ( de ácido sulfúrico% y leído por un lector de microplacas automático
"espectrofotómetro de microplacas' .ispositivo (olecular' $unnyvale' -A' .II.% en a!uste
predefinido "longitud de onda primaria 210 nm' referencia longitud de onda de B00 nm' punto final%. La
densidad óptica "=.% valores Due fueron analizados por una ho!a de ($ xcel *00* pre&elaborada para
determinar la concentración de progesterona @/1A. l intra&ensayo coeficiente de variaciones oscilaban
desde *'*8 a 6'18 "2 pozos% y el coeficiente de variación entre ensayos de fue del 6'58 "1 ensayos%.
diagnóstico de gestación
Los órganos genitales de los búfalos fueron examinados por el recto para diagnóstico de preFez entre el
día 50 y el día 60 despu)s del apareamiento natural.

l análisis estadístico
Los datos sobre la concentración de progesterona en leche' la producción de leche la ,-$ y en contra de
meses y días de muestreo se presentaron gráficamente mediante el uso de (icrosoft xcel. Los gráficos se
prepararon con los datos de progesterona en leche concentración' la producción de leche y la ,-$ contra
mes y días de muestreo. Ina concentración de progesterona de : /'0 ng ; ml de leche desnatada se refiere
como una progesterona aumento' debido a un corpus funcional lúteo @6'/B&/6A. -uando un aumento de
progesterona por encima de / ng ; ml fue detectada en una o ambas muestras recogidas en /0 intervalo de
días' Due era consideró Due el búfalo había ovulado desapercibido el agricultor "perdidas celo%. Ina
concentración de progesterona de menos de /'0 ng ; ml fue considerado como un nivel ba!o' Due indiDue
la ausencia de un cuerpo funcional corpus @*0A.
La tasa de detección del estro ".7' por sus siglas en ingles% se calculó mediante la siguiente la ecuación
@*/A:
Los intervalos entre el parto y los primeros estros detectados' el parto y el primer pico de progesterona
detectado "un indicador antes de la ovulación% y el parto y la concepción fueron calculados. Los
porcenta!es de los búfalos sin celo detectado y búfalos no cíclicos durante el período de estudio se
calcularon. l análisis de regresión se realizó para .eterminar la relación de la ,-$ al momento del parto
y del celo con el parto hasta el primer intervalo del estro y con producción de leche @**A.
7esultados
La ,-$ de búfalos estudiados varió de /'1 a +'1 en el momento de la detección del celo. Las figuras /A&-
muestran los datos sobre la ,-$' las concentraciones de progesterona en la leche y la producción de leche
de tres búfalas Due son representativas de las vacas Due muestra la actividad luteal en los días +0&50' 5/&
60 y 6/&/+0 del posparto' respectivamente.
?igura /. muestra los datos típicos para las búfalas Due Duedaron acíclicas /10 días despu)s del parto.
Codos los búfalos mostraron una tendencia de ba!ar la ,-$ con la progresión del período post&parto. La
mayoría de los búfalos redu!eron gradualmente la producción de leche con la p)rdida de la ,-$. Ina
significativa "9 >0'00/% la relación lineal existente entre la ,-$ despu)s del parto y la producción de
leche "?igura *% con mayor producción de leche se asocia con mayor ,-$.
n los búfalos' los intervalos entre partos de primera actividad luteal y primer estro detectados fueron de
2/ a /*+ "n < /5% y 3+ a /+1 "n < /+% días' respectivamente.
$uponiendo Due cada aumento de progesterona por encima de / ng ; ml en la leche seguido una ovulación
y un ciclo normal' 25 ciclos ocurrieron en /5 búfalos. l celo fue detectado visualmente en /+ vacas
mientras Due B búfalos Duedaron acíclicos /10 días despu)s del parto. sto conduce a una tasa de
detección del estro de un *38. Los agricultores en promedio perdieron /'3 estros por búfalo. l número
medio perdidas del estro en el día +0&50 despu)s del parto del búfalo "*'11% fue significativamente "9
>0'01% mayor Due los días 5/&60 "/'++% y los día 6/&/+0 "0'B1% despu)s del parto del búfalo. -uando los
agricultores perdieron más ciclos estrales' la duración del período post&parto "parto a el primer estro
detectado% aumentó "Cabla /%.
Los búfalos con mayor ,-$ en el momento de la detección del estro tenían un intervalo más corto entre
parto y el primer estro detectado Due aDuellos con menor ,-$ "?igura +E 9 >0'01%. $in embargo' el ,-$
anotado durante el período de gestación y el parto no mostraron ningún efecto significativo en los
intervalos entre el parto y el primer aumento de progesterona en la leche y entre el parto y el primer estro
detectado.
$ólo 3 búfalos fueron criados durante el período de estudio. $iete búfalos tenían un perfil de progesterona
ba!os ">/ ng ; ml%' alto ": / ng ; ml% y alto ": / ng ; ml% en el día 0' los días /0&/* y días **&*2'
respectivamente. stos búfalos se encontraron embarazados con palpación rectal del tracto genital entre el
día 50 y el día 60. l búfalo con perfiles de progesterona ba!os' altos y ba!os en 0 día' los días /0&/* y días
**&*2' respectivamente' volvió al estro. n búfalas embarazadas' la concentración de progesterona en la
leche "media P $(% en los días **&*2 "2'3 P 0'2 ng ; ml% fue significativamente "9 >0'00/% mayor de Due
en los días /0 a /* "*'0 P 0'2 ng ; ml%.
.iscusión
l protocolo y el r)gimen de muestreo para la leche L#$A detectó una gran proporción "528% de los
búfalos Due reanudaron la ciclicidad ovárica en el día /10 postparto pero la tasa de detección de los
agricultores del estro fue ba!a ba!o el supuesto Due observaron un aumento de la progesterona en la leche
seguido de una ovulación y un ciclo normal. de acuerdo con estos hallazgos' ,arHaKi et al. @*+A mostró
Due aproximadamente el 608 de los búfalos reanudaron su ciclo ovulatorio dentro de los B0 días despu)s
del parto. Las razones para el estro perdido podrían ser debidas a la ovulación silenciosa o a la
luteinización de los folículos anovulatorios durante el período posparto temprano @*2&*BA. $in embargo'
las diferencias entre el sistema producción y la cria de los animales podría tener como resultado la
variación en la actividad ovarina post partum entre los estudios publicados. Ismani et al. @*5A encontró
Due el 3B8 de los búfalos Lili&7avi mostraron al menos una breve fase lútea 3 a /+ días antes del primer
estro. 9or consiguiente' los datos del presente estudio indican un número más alto de estros perdidos en
búfalos Due reanudaron la actividad luteal entre el día +0 y el día 50 Due los Due reanudaron la actividad
lúteal entre el día 5/ y el día /+0. Queda por investigar Due la extensión de la primera ovulación posparto
se asocia con signos de estro en algunos búfalos. xtensión programas de educación de los agricultores en
el comportamiento de estro y la detección de calor basada en signos secundarios' por e!emplo' secreción
vulvar e hinchazón vaginal' puede ayudar a aumentar la tasa de detección del estro @*3A.
In pobre ,-$ puede tener un impacto
negativo sobre la actividad ovárica en
búfalos ya Due los búfalos anoestrales
tienen menor ,-$ Due los búfalos Due
tienen ciclos estrales @2A. Luestro estudio
muestra Due la ,-$ no está asociada
únicamente con el intervalo desde parto al
primer estro' sino tambi)n con la
producción de leche' demostrado
previamente @*6'+0A. n el área de estudio'
las oportunidades de alimentación para los
búfalos de pastoreo están limitadas desde
diciembre hasta marzo. La mayoría de los
búfalos ya han parido desde octubre hasta diciembre. s probable Due la falta de disponibilidad de forra!e
durante el período de post&parto pudiera haber causado una reducción de la ,$- y la producción de leche.
.e hecho' una buena gestión de nutrición en vacas -ebú es importante para mane!ar el balance negativo
de energía debido a la producción de leche @+/A. Nayashi et al. @+*A informaron de Due una disminución
del suministro de nutrientes como resultado de la falta de forra!e conduce al catabolismo de te!ido corporal
y la disminución de la ,-$. La pobre ,-$ de las vacas no sólo aumenta los servicios de intervalo de
primer parto de sino Due tambi)n reduce la tasa de concepción @6'++A.
Los búfalos Anoestrales tenían una concentración de progesterona en la leche sistemáticamente inferior a
los búfalos cíclicos ">/ ng ; ml vsR / ng ; ml%. .e manera similar' en un estudio de /5 períodos de post
parto completo en búfalos (urrah en $ri LanHa' las concentraciones de progesterona de plasma se
mantuvieron ba!as ">0'*1 ng ; ml% durante un período Due oscila desde 6* hasta */0 días @+2A. (c-ool et
al. @+1A informaron de >/ ng ; ml de progesterona en plasma anestro de búfalos de pantano.
Los datos de progesterona en la leche basado en tres muestras "día 0' días /0&/*' y días **&*2% nos ayudó
a hacer una clara distinción entre búfalas embarazadas y no embarazadas y la identificación de ciclicidad
ovárica. Ina búfala no embarazada tenía un perfil de progesterona ba!a' alta y ba!a en el .ía 0' .ía /* y el
.ía **' respectivamente. ISar et al. @+BA reportaron concentraciones de progesterona de 0'65 P 0'2*' 5'66
P *'61 y 3'02 P *'62 ng ; ml en el día 0' día // y día */' respectivamente' de las búfalas de Anatolia
embarazadas. Luestros resultados están de acuerdo con I-A7 et al. @+5A mostrando un perfil ba!o de
progesterona ">/ ng ; ml%' alto ": / ng ; ml% y alta ": / ng ; ml% en el .ía 0' días /0&/* y .ías **&*2'
respectivamente' en las búfalas de agua embarazadas. Nemos demostrado perfil de progesterona ba!a ">/
ng ; ml%' alta ": / ng ; ml% y ba!a ">/ ng ; ml% en el día 0' días /0&/* y los días **&*2' respectivamente' en
los búfalos de agua cíclicos Due está de acuerdo con Qureshi et al. @/3A Due determinaron las
concentraciones de progesterona en la leche desgrasada de búfalas lecheras de 0'+0 P 0'63' /'2+ P 0'31'
+'*6 P 0'32 y 0'33 P 0'/1 ng ; ml en la fase de estro' desarrollando cuerpo lúteo' desarrollado cuerpo lúteo
y regresión del cuerpo lúteo' respectivamente. La medición de progesterona en la leche por L#$A fue 3*&
338 de exactitud para el diagnóstico de embarazo en las vacas @+5A. .e hecho' el nivel de progesterona en
leche los días **&*2 se usó para interpretar los resultados del embarazo con /008 de precisión en el
diagnóstico no gravidez en el ganado y búfalos @+3A. n nuestro laboratorio' el 628 de las vacas
embarazadas fueron detectadas con precisión mediante el uso de L#$A de progesterona en leche y los
/008 de vacas embarazadas se detectaron tanto por la L#$A de progesterona en leche y
radioinmunoensayo @/B'/5A. stos hallazgos sugieren Due un ensayo cuantitativo de progesterona en leche
puede ser usado en el diagnostico temprano del embarazo en búfalos Due se reportaron anteriormente.
-onclusiones
L#$A es un instrumento confiable para determinar progesterona concentración en la leche cuando se
investiga la ciclicidad ovárica posparto en los búfalos de agua. La detección del estro necesita una me!ora
significativa en la capacitación de agricultores para reconocer signos secundarios del estro y midiendo la
concentración de progesterona en dos muestras en un intervalo de /0 días si la búfala no está en estro a los
B0 días despu)s del parto. sto podría ayudar a los agricultores a criar búfalos en el período de post&parto
temprano. La condición nutricional durante el período post&parto fue importante para el inicio temprano
de estro despu)s del parto en búfalos.