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“UNIVERSIDAD PERUANA LOS

ANDES”
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE OBSTETRICIA

PRESENTADO A LA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGIA Y


PARASITOLOGIA

PRACTICA Nº 03 - 04

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y TECNICAS DE SIEMBRA

INTEGRANTES :
PATILLA MACHA MILAGROS LOURDES
QUINCHO MACHA YOLIZA KARINA
CRISOSTOMO PAZ ISAMAR

DOCENTE DE PRÁCTICA :
Mblgo. Jaime Wester Campos

SEMESTRE :

III

TURNO :

MAÑANA

HUANCAYO – PERÚ
-2009-
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE SIEMBRA

INTRODUCCION

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en


concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten
el crecimiento de los microorganismos.
Estos medios son realizados en el Laboratorio de Microbiología por lo
que el control de su fabricación, preparación, conservación y uso,
asegura la exactitud, confiabilidad y reproductibilidad de los resultados
obtenidos.
En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de
medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida, sólida o
semisólido.
Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido
al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la
sílicagel.
La práctica se desarrollo para adquirir conocimientos de cómo se
prepara un medio de cultivo y aplicación de técnicas de siembra para la
distribución de colonias de microorganismos.
MATERIALES Y MÉTODO

A. MATERIAL
➢ Placa Petri
➢ Tubos de ensayo 13 x 100; es decir de
3.5 ml
➢ Matraz
➢ Estufa
➢ Varilla
➢ Balanza
➢ Pipeta
➢ Hornilla
➢ Probeta
➢ Pizeta
➢ Gradilla
➢ Espátula
➢ Asas bacteriológicas(en orquilla y punta)

A. MEDIOS DE CULTIVO
➢ Agar BHI
➢ Caldo nutritivo
A. OTROS
➢ Pabilo
➢ Papel Kraft
➢ Algodón
PROCEDIMIENTO
Se ha de considerar el procedimiento dependiendo del estado en el que
se encuentra el medio de cultivo, ya que es fundamental saber el estado

SOLIDOS ( AGARES) LIQUIDOS


ACTIVIDAD (CALDOS)
Placas Tubos Tubos
Esterilizar placas / - -
Pesar el medio de / / /
cultivo
Medir el agua / / /
destilada
Mezclar en... Matraz Matraz Balón
Calentar en / / -
hornilla
Disolver al medio - - /
ambiente
Repartir en tubos - / /
Auto clavar el / / /
medio de cultivo
Servir cultivos / - -
Acondicionar - / -
medios
para relacionar con que material a de trabajarse.

Para la preparación de medios de cultivo (AGAR BHI)


Nos ubicaremos en la tabla que procedimientos seguir, para ello
describimos a continuación:

Primero esterilizar las placas ya que


necesita estar exento de microorganismos
ambientales.
Calcular el peso del medio de cultivo, para ello hacemos la sgte
operación:
Formula de hidratación: 37 gr/l
Capacidad de la placa: 17 ml
Para esta práctica utilizamos tres placas para ello se necesita
exactamente:
(Capacidad de la placa) (N° de placas) = ( 17 ml )( 3 )= 51 ml
Para la elaboración del medio de cultivo se redondea a la decena más
próxima, en este caso 50 ml.
Calculo de la cantidad del AGAR a utilizar en las tres placas:
37 gr 1000 ml
Por lo tanto: necesitaremos 1.85gr
3.7 gr 100 ml de AGAR para 50 ml de agua
destilada.
1.85gr 50 ml

Medimos la cantidad a necesitar (1.85) de


AGAR.

Medir el agua destilada. (50ml)

Mezclar en matraz.
Calentar en hornilla, constantemente moviendo con
la varilla.
Autoclavar

Servir los medios de cultivo en las placas esteriles


y con la ayuda del mechero mantener su
esterilidad.

Para la preparación de caldo nutritivo

Calcular el peso del medio de cultivo, para ello hacemos la sgte


operación:
Formula de hidratación: 8 gr/l
Capacidad del tubo: 8 ml
Para esta práctica utilizamos seis tubos de ensayo para ello se necesita
exactamente:
(Capacidad del tubo) (N° de tubos) = ( 8 ml )( 6 )= 48 ml
Para la elaboración del medio de cultivo se redondea a la decena más
próxima, en este caso 50 ml.
Pesar el medio de cultivo para el cual realizamos la siguiente operación:
8 gr 1000 ml
Por lo tanto: necesitaremos 0.4 gr
0.8 gr 100 ml de CALDO NUTRITIVO para 50
ml de agua destilada.
0.4gr 50 ml
Pesando el medio de cultivo
(CALDO)
0.4 gr

Medir el agua destilada a utilizar

Mezclar en balón y disolver


al medio ambiente.

Repartir en tubos en forma


equitativa.

Preparación para
autoclavar.
NOTA: Para lo cual se utilizara una lata para su protección.
Rotular, es decir poner datos para identificar nuestro medio de cultivo.

SIEMBRA DE CULTIVO

Preparar el área de trabajo,


haciendo una desinfección con
fenol.

Preparación del INOCULO:

Para la preparación del inoculo (conjunto de microorganismo)


utilizaremos los microbios de la tierra.

En un vaso de precipitación (100ml) someter a


ebullición a la muestra y 50ml de agua, ello se
realiza con constantes movimientos con la
varilla. Y así disminuir la sobrecarga de
microorganismos.

Tipos de siembra:

A. EN PLACAS

Técnica: estría simple


Es la ejecución de líneas, con la ayuda de una asa bacteriológica
en orquilla introduciendo esta al inoculo preparado, en la
superficie del medio de cultivo (AGAR) para obtener colonias
aisladas.
a. Esterilizar la asa bacteriológica elevando a T
° haciendo un conteo mental hasta 15.
b. Introducir la asa bacteriológica al inoculo
preparado.

c. Hacer dos puntos al extremo del


medio de cultivo y homogenizar
esa zona y proceder a ejecutar las
estrías.
d. Mantener un mechero encendido al
momento de realizar la técnica,
para impedir la entrada de
microorganismos ambientales.

A. En TUBOS:

TECNICAS: Picadura profunda (aplicada con Asa B. en punta)


Homogenización (aplicada con Asa B. en orquilla)

En los tubos con medio de cultivo SIM se aplico la técnica de


picadura profunda para lo cual se realizo los mismos
procedimientos anteriores(a-b-d) con asa bacteriológica en punta.
La técnica se hace introduciendo el asa con firmeza hasta lo
profundo del tubo de ensayo.

En los tubos con CALDO NUTRITIVO se aplico la técnica de


homogenización para lo cual se realizo los mismos procedimientos
anteriores (a-b-d) con asa bacteriológica en orquilla.

Se introduce con firmeza la asa


bacteriológica y se hace un leve
agitamiento para que el inoculo
quede en ella.
Seguidamente luego del sembrío en tubos se procede a tapar con
un tapón de algodón.
Agitar entre las manos con movimientos rotatorios.

Preparar para llevarlo a la estufa,


para que los microorganismos se
desarrollen; pero para evitar la
confusión de intercambio inconciente
de materiales se apuntara en ella:

Nombre del cultivo-carrera- semestre-


cátedra-fecha

Introducir los cultivos a la estufa a


una temperatura de temperatura de 37°C por 24 horas.

RESULTADOS

✔ Es de vital importancia realizar un pequeño calculo considerando


la formula de hidratación del medio de cultivo y capacidad de los
materiales a utilizar, para hallar medios propicios en la cual se
sembrara.
✔ La esterilización de los materiales y manejo de ellos juega un
papel importante, de ello depende el buen desarrollo de los
microorganismos a cultivar.
✔ Al elevar la temperatura del inoculo preparado se hace con la
finalidad de reducir la sobrecarga de microorganismos.
✔ La aplicación de una técnica de cultivo dependerá del medio de
cultivo.
✔ El objetivo de las técnicas de siembra es obtener colonias aisladas.

COMENTARIOS

✔ Contar siempre con los medios de protección posible


(guardapolvo, guantes, gorro, etc.).
✔ Mantener la limpieza del ambiente (uso de mechero) donde se
realizar la técnica de siembra y también de nuestras manos para
reducir la probabilidad de ingreso de microorganismos del
ambiente.
✔ Poner en la posición correcta la placa cuando esta va a ingresar a
la estufa.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Apuntes tomados en clase de práctica


http://images.google.com.pe/imgres?imgurl
http://mail.fq.edu.uy/~microbio/MGral/practico/siembra.html

ANEXOS
Medios de cultivo

Definición
Son nutrientes que vienen en polvo, granulaciones para ser hidratados,
cuya finalidad es hacer posible el crecimiento de microorganismos.

Características
A) Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese
microorganismo.
Como fuentes de energía tenemos:
a. Fuente de carbono: otras azucares simples y complejos, otros
gas carbónico, hidrocarburos o incluso hidrocarbonados diferentes.
b. Fuente de nitrógeno: Esta fuente de energía la van a formar las
proteínas, péptidos o aminoácidos.
Otros requerimientos no energéticos de los m.o son:
a. Fuentes de azufre: Lo hacen mayoritariamente en forma de
sulfatos.
b. Fuente de fósforo: En forma de fosfatos
c. Iones metálicos: A concentraciones muy bajas (cinc, manganeso,
cobre, cobalto, molibdeno)
d. Factores de crecimiento: Corresponden a algún tipo de
aminoácido (cisteína), factores específicos (F. X o F. V) o incluso
vitaminas o bases púricas, pirimídicas,…
e. Factores de arranque: Son sustancias que van a permitir a la
bacteria salir de su fase de latencia. Esto se consigue con glucosa o
iones que estimulen su crecimiento.
f. Factores inhibidores: Son componentes que van a impedir el
crecimiento como la azida sódica (gran-), los antibióticos, la eosina azul
de metileno (gram +)
B) Condiciones físico-químicas apropiadas:
a. Temperatura óptima: Hay tres tipos de bacterias dependiendo
del grado de temperatura a las que crezcan:
* Psicrófilas: < 20ºC
* Mesófilas: 18-45ºC
* Termófilas: > 45ºC
b. Grado de humedad: La cantidad de agua que va a necesitar el
m.o para su desarrollo. La liofilización o cualquier método de
deshidratación es un buen medio de conservación.
c. pH: Los buffers o tampones son los encargados de estabilizar el
pH del medio a un pH cercano a la neutralidad que es el pH óptimo,
aunque hay m.o que crecen mejor en pH ácidos (tiobacilos) o pH
alcalinos (Proteus o Vibrio cholerae)
d. Presión osmótica: En condiciones de isotonía (300
miliosmoles), aunque hay bacterias halófilas en las cuales su
crecimiento se produce en concentraciones muy altas de cloruro sódico
(10%) como el Género Staphylococcus; o en condiciones osmófilas en
las que requieren un 70% de azúcar.
e. Presencia o ausencia de oxígeno
Composición de medios de cultivo utilizados

*Agar nutritivo:
Su composición es: extracto de carne 1 gr/l, extracto de levadura 2gr/l,
peptonas 5gr/l, cloruro sódico 5gr/l y agar 15gr/l.

*Caldo nutritivo:
Su composición es: extracto de carne 1 gr/l, extracto de levadura 2gr/l,
peptonas 5gr/l y cloruro de sódico 5gr/l.
Condiciones generales
Disponibilidad de nutrientes adecuados: debe de contener C-N-S-k y
sales inorgánicos. También es necesario ciertas vitaminas y sustancias
conductoras del crecimiento.y añadirotras sustancias dependiendo del
microorganismo a cultivar.
Tipos

* Por su estado:

Solido.- Agar (1.5% agar) Este da solidez al medio de cultivo y a


temperatura del ambiente es sólido; sus componentes son algas
marinas, carbohidratos. Se prepara en placas petri o tubos de ensayo.
Liquido.-Caldo (0% agar) No contiene agar es por eso que su estado es
liquido. Se prepara en tubos de ensayo.
Semi solido.- Medio o Agar (<0.5% agar) no son líquidos ni sólidos por la
cantidad de agar presente .Se prepara en tubos de ensayo.

*Por su composición:

-Simples.-S u composición es simple, es decir están presentes los


nutrientes básicos.
-Enriquecidos.- Combinación compleja de nutrientes.
-Selectivos.- Su composición restringe el crecimiento.
-Diferenciables.- Distinguir a los microorganismos.
-Bioquímica.- Analiza las capacidades bioquímicas y de metabolismo.
-Antibiograma.- Permite el crecimiento de cualquier microorganismo

SIEMBRA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra


(inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo
microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.
La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido,
utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estéril.

AISLAR

Es separar un tipo de microorganismo a partir de un población que los


contiene de varios tipos. En habitats naturales, raramente encontramos
a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo),
por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para
separar e identificar los distintos tipos de m.o. presentes.
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:
a) Aislamiento por estrías

A: Consiste en cargar el ansa con la


muestra y hacer estrías paralelas en la
cuarta parte de la superficie de la placa;
se quema el ansa, se enfría, se gira la
placa 90º y se vuelve a estriar tocando 3
o 4 veces el área sembrada inicialmente y
cubriendo otro cuarto de placa. Por
último, sin quemar el ansa, se estría el
resto de la superficie sin sembrar.

B: Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías;


se quema el ansa, se hacen 3 o 4 estrías
perpendiculares a las anteriores, se quema el
ansa y se repite el procedimiento hasta agotar
la superficie de la placa.

b) Aislamiento por dilución

Se emplean tanto el método de siembra incorporada como el de siembra


en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se puede
preparar las diluciones decimales en condiciones asépticas usando suero
fisiológico o algún otro diluyente.
También se pueden preparar las diluciones directamente en tubos de
agar fundido y termostatizado (20 mL) se agita por rotación entre las
manos y se vierte en placas de Petri estériles.