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GA
MICCA
PROBLEMAS T6 (Clase)
MTODOS ISOTPICOS

6.1.- Una muestra que contiene
35
S (t
1/2
=87,1 das) exhibe una actividad de 10
mCi. Cul ser su actividad, expresada en dpm, despus de 174 das?
S: 5.5510
9
dpm.

6.2.- El
14
C posee un t
1/2
=5570 aos. Calcular a) la fraccin de tomos de
14
C que
se desintegra anualmente y b) la actividad especfica mxima del
14
C.
S: a) 0,02%; b) 1,421014 dpm/mol.

6.3.- A cuntos g de fsforo equivale 1 Ci de
32
P? (t
1/2
=14,28 das).
S: 3,5 pg

6.4.- Calcular la masa de 1 Ci de
14
C (t
1/2
=5570 aos).
S: 0,22 g

6.5.- Calcular la mxima radiactividad especfica terica que se puede conseguir
para el
11
C.
Dato: periodo de vida media del istopo= 20,3 min; 1Ci= 3.710
10
dps
S: 2,0610
22
dpm/mol= 9,2610
9
Ci/mol = 1,8610
21
dpm/g= 838,610
6
Ci/g.

6.6.- Un investigador recibe 5 mCi de
131
I el mircoles a las 8 de la tarde. El
experimento est programado para comenzar el siguiente lunes a las 8 de la
maana. Indicar la actividad de
131
I que dispondr el investigador para realizar el
experimento (t
1/2
=8,04 das).
S: 3,4 mCi

6.7.- Una muestra de AMP marcada con
14
C y
32
P exhibe una actividad especfica
de S= 9500 cpm/mol. El 70% de la radioactividad inicial procede del
32
P y el
resto del
14
C. Calcular la actividad especfica a los 7, 14 y 28 das.
Datos:
32
P= 5,6510
-7
s
-1
;
14
C = 1,4410
-8
horas
-1

S: 7 das 7586 cpm; 14 das 6208 cpm; 28 das 4546 cpm.

6.8.- Describe la preparacin de 1 mL de solucin [-
32
P]ATP 10 mM con
actividad especfica 1,510
5
dpm/mol. Para ello se dispone de las soluciones
madre de ATP 0,1 M (frio) y [-
32
P]ATP con actividad especfica 30
mCi/mmol y concentracin 1mCi/mL.
S: 99,77 L ATP 0,1 M (es decir: 9,977 moles) frio + 0,675 L [-
32
P]ATP (es decir:
6,7510
-7
Ci =1,510
6
dpm y 0,0225moles) completando hasta 1 mL con agua o solucin
tampn.

6.9.- Un estudiante quiere determinar la cantidad de fsforo que absorbe un
cultivo de tomates en un medio hidropnico. El experimento se realiza aadiendo
una cantidad conocida de fosfato marcado con 1 Ci de
32
P a la solucin
hidropnica donde crecern las plantas. Despus de un periodo de 7 das de
crecimiento se determina una actividad de
32
P en las plantas de 6,7810
4
dpm.
Qu porcentaje de fosfatos ha asimilado el cultivo de tomates a los 7 das de
experimentacin? (t
1/2
= 14,28 das).
S: 4,3 %

6.10.- En una experiencia de doble marcaje con
3
H y
14
C se introdujo 0,2 g de
muestra en un contador discriminador de altura de pulso de dos canales A y B.
En las mismas condiciones se determin la radiactividad de patrones de
3
H y
14
C
en ambos canales. Una vez restado el ruido de fondo a todas las medidas se
obtuvieron los siguientes datos:
cpm

3
H
14
C Muestra
Canal A 175 80 120
Canal B 75 320 160

Sabiendo que la eficiencia es del 16 % para el
3
H y del 80 % para el
14
C,
calcula la radiactividad especfica de la muestra para cada uno de los
radioistopos en Ci/g. Datos: 1 Ci= 3,710
10
dps
S:
3
H 1,8 nCi/g;
14
C 0,43 nCi/g

6.11.- A una serie de 6 muestras de patrones estndar cuya radiactividad es de
1250 dpm se les aade 5 cantidades crecientes de un extintor y se miden en un
contador discriminador de altura de pulso dividido en dos canales A y B junto
con un control sin extintor. Una muestra que tambin contiene el radioistopo y
de la que se sabe que tiene extintores se mide en el mismo contador. Los
resultados obtenidos son los siguientes:

cpm
Control 1 2 3 4 5 Muestra
Canal A 500 478 445 410 379 332 1822
Canal B 500 425 354 290 227 170 1211

Cul es la eficiencia en la medida de la muestra? Cul es la radiactividad
real de la muestra?
S: i) 53 %; ii) 5723 dpm
6.12.- Un cultivo de fagos est marcado con una media de 42 tomos de
32
P por
fago. La eficiencia de deteccin del istopo en una emulsin gruesa es del 90 %.
Cunto tiempo debe exponerse para tener una media de 9 brazos por estrella?
Datos: t

32
P= 14.2 das
S: 5,57 das

6.13.- Con objeto de estudiar el recambio de Na
+
en la sangre se inyecta
24
NaCl
en el torrente circulatorio de un animal, se toman muestras de sangre
peridicamente y se mide su radiactividad:

Tiempo (h) 1 2 5 10 16 24
cpm/mL 3604 2928 2376 1412 756 329

Cul es el tiempo de recambio del in Na
+
en la sangre? (t

24
Na= 15 h)
S: 17 h

6.14.- Para estudiar la relacin entre iniciacin y elongacin de cadenas de RNA
producto de la actividad de una RNA-polimerasa se incuba dicha enzima con
rNTPs marcados con
14
C en la ribosa (radiactividad especfica 100 cpm/mmol) y
con
32
P en el fosfato (radiactividad especfica (5000 cpm/mmol) y en presencia
de molde y de los cofactores necesarios para la sntesis. Transcurridos 3 min, la
reaccin se detiene por precipitacin con cido tricloroactico (TCA). La
radiactividad incorporada en el precipitado se mide con un contador analizador
de altura de pulso con dos canales A y B y se obtienen los siguientes resultados:

cpm

32
P
14
C Muestra
Canal A 215 455 407
Canal B 645 245 325

Calcula la longitud media, en nmero de nucletidos, de las cadenas
sintetizadas por la RNA-polimerasa as como el nmero de cadenas.
S: i) 165 N/cadena; ii) 2,0910
19
cadenas.

6.15.- Una muestra de 10 g de protena fue hidrolizada en sus aminocidos. A
esta muestra se le aadieron 3 mg de treonina marcada con
14
C de radiactividad
especfica 1000 cpm/mg. Posteriormente se aislaron los aminocidos mediante
cromatografa de intercambio inico, obtenindose 60 mg de treonina pura con
una radiactividad especfica 20 cpm/mg Cul es el porcentaje de Thr en la
protena?
S: 1,47 %

PROBLEMAS T7 (Clase)
CROMATOGRAFA

7.1.- Las sustancias A, B, C y D presentan los siguientes Rfs en cromatografa en
papel con cada uno de los 4 eluyentes siguientes:

Butanol-
H
2
0
Isopropanol-
HCl
Benceno-
. actico
Cloroformo-
metanol
A 0,23 0,31 0,42 0,09
B 0,24 0,20 0,51 0,62
C 0,38 0,58 0,40 0,64
D 0,41 0,56 0,53 0,10

Qu procedimiento dara mejores resultados para separar las cuatro sustancias?
(asumir desarrollo de 10 cm y resolucin de manchas cuando sus centros distan
al menos 1 cm).
En una cromatografa en capa fina bidireccional varia la resolucin si se invierte
el orden de los eluyentes empleados?

7.2.- En un sistema cromatogrfico, un soluto tiene un tiempo de retencin de
407 s y una anchura en la base de 13 s en una columna de 12,2 cm de longitud.
Calcular el nmero de platos tericos.
S: 15680 platos tericos

7.3.- En un sistema cromatogrfico, un soluto tiene un tiempo de retencin de
407 s y una anchura en la base de 13 s. Un pico vecino es eludo a 424 s y tiene
una anchura en la base de 16 s. Calcular la resolucin de la columna para estos
dos componentes.
S: Rs =1,17

7.4.- Tres solutos A, B y C son eludos de una columna de cromatografa
(reparto, fase reversa) con volmenes de elucin de 36, 35 y 12 mL
respectivamente. Se sabe que C no sufre ningn retraso en esta cromatografa ya
que no interacciona en absoluto con la fase estacionaria. Cul es el nmero
mnimo de platos tericos de la columna necesario para resolver completamente
A y B?
S: N= 20164; pero N= 8800 si se utilizan volmenes de elucin ajustados

7.5.- En un laboratorio de control de calidad se quiere poner a punto un mtodo
de anlisis por HPLC en fase inversa de una mezcla de dos compuestos A y B. Se
sabe que, en columna de octadecil-slice de 25 cm de longitud y utilizando una
fase mvil de metanol-agua, los tiempos de retencin son 6,25 y 7,10 min
respectivamente, el tiempo muerto es 1,4 min y la resolucin es 1,05.
a) Cul debe ser la longitud de la columna para conseguir una resolucin de
1,5?
b) Calcular los factores de retencin de A y B. Sern diferentes en la nueva
columna?
S: a) 51 cm, b) K
A
= 3,46; K
B
= 4,07, iguales

7.6.- En una columna de 10 cm de longitud, se lleva a cabo la separacin
cromatogrfica de dos sustancias A y B, obtenindose factores de capacidad de
0,8 y 1,0 respectivamente.
a) Si se considera una resolucin de 1 para ambos picos, calcular la altura
equivalente de plato terico.
b) Si el tiempo de retencin de la sustancia no retenida es de un minuto,
calcular los anchos de banda en la base de los analitos A y B.
S: a) 0,0692 mm, b) W
A
= 0,189 min; W
B
= 0,210 min

7.7.- Qu procedimiento cromatogrfico podra emplearse para separar las
histonas (protenas muy bsicas, con un pI en torno a 10) de un extracto proteico
crudo?

7.8.- La reaccin catalizada por el enzima E, el cual requiere Mg
2+
como
cofactor, es:
A + B C + D
Se pretende averiguar si esta reaccin es ordenada o al azar. Hay algn indicio
previo de que el orden podra ser: Mg
2+
, A, B. Cmo se podra investigar esta
cuestin mediante procedimientos cromatogrficos? (sugiere ms de una forma).

7.9.- La glutamato-deshidrogenasa (GDH) es un enzima que cataliza la siguiente
reaccin:

Glutamato + NAD
+
+ H
2
O o-oxoglutarato + NH
4
+
+ NADH + H
+


El aspartato acta como inhibidor competitivo de esta reaccin. El GDP es
un activador alostrico (unin a un sitio distinto al de los sustratos) de la
reaccin. Para comprobar estas propiedades se realiza una cromatografa de
afinidad en columna de agarosa a la que se ha unido el aspartato (-CO-CHNH
2
-
CH
2
-COOH) como ligando. Se aplica entonces a la columna una fraccin
purificada del enzima GDH, en forma de varias alcuotas en diferentes medios de
elucin:
1) Tampn pH=7.0
2) Tampn + NAD
+
2 mM
3) Tampn + GDP 5 mM
4) Tampn + NAD
+
2 mM + GDP 5 mM
5) Tampn + NAD
+
2 mM + Glutamato 0,1 M
elu
rep
res
asp
inh
glu
ser
pue
del
(se
rea
GD

7.1
sim
sep
hid
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Si
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Los
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V
e

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7.12.- Qu ocurre si se representa V
e
frente a log MM en lugar de K
av
frente a
log MM? Servira tambin para la obtencin de la masa molecular de una
protena problema?

7.13.- Cules son los valores lmite tericos de K
av
? Qu indicara si se obtiene
para una protena una K
av
> 1? Sera correcta la deduccin de la masa molecular
para esa protena? Por qu? Cmo podra evitarse el fenmeno que origina
valores de K
av
> 1?

7.14.- Se pretende determinar la constante de disociacin del triptfano a la
seroalbmina humana y para ello se emplea una columna cromatogrfica rellena
de Sephadex G-25 y equilibrada con un tampn conteniendo triptfano a
concentracin conocida. Se aplica en la columna 20 mg de la protena disueltos
en 1 mL de la disolucin de equilibrado y se eluye con la misma disolucin. La
elucin cromatogrfica es registrada continuamente midiendo la A
280
. La
experiencia se repiti empleando 5 concentraciones diferentes de Trp en la
disolucin tampn de equilibrado. Se determin en todos los casos el rea del
pico vacante (Tabla)

[Trp], M
(en tampn de equilibrado)
rea pico vacante
(A
280
x mL)
3,4 0,42
5,8 0,62
8,1 0,72
10,4 0,84
14,7 0,97

Determina la constante de disociacin (K
d
).
Datos:
280
Trp= 5560 M
-1
cm
-1
; MM albmina humana= 69000. Asumir un solo
sitio de unin para el Trp, dado que la protena es monomrica. La funcin de
saturacin para este caso es: v = [Trp]/(K
d
+ [Trp])
S: n= 1; K
d
= 9,72 M, K
a
= 0,103 M
-1


7.15.- Se desea concentrar una disolucin de una protena que se halla disuelta a
0,24 mg/mL en tampn Tris 20 mM pH 8,1 (pK
a
= 8,1). La masa molecular de la
protena es de 24000 y su pI=6,0. Describe al menos dos procedimientos
cromatogrficos que permitan concentrar esta protena. Describe los detalles de
los procedimientos.

7.16.- Se hidroliz, por tratamiento con HCl 6 M (30 horas), una cierta cantidad
de una protena y el hidrolizado resultante se pas a travs de un analizador
automtico de aminocidos obteniendo los resultados de la Tabla.

mols Mr
Ala 0,147 89
Arg 0,105 174
Lys 0,126 146
Gly 0,168 75
Met 0,042 149
Ser 0,252 105

El tratamiento de la misma protena con tripsina dio lugar a una serie de pptidos
ms cortos cuyo nmero no pudo determinarse con exactitud (por solapamiento
de manchas en cromatografa en capa fina bidimensional), pero se estim en
torno a 10.
Determina la masa molecular de la protena.


PROBLEMAS T8 (Clase)
ELECTROFORESIS

8.1.- En unas determinadas condiciones de electroforesis, la velocidad de
movimiento de la Gly a pH 9,5 es de 2 cm/h. Cul ser la velocidad a pH 8,1 y a
pH 5,5? Cul sera la velocidad mxima que puede alcanzar la Gly y a qu pH
se producira?
Datos: Gly: pK
1(COOH)
= 2,4; pK
2(NH3+)
= 9,8
S: pH= 8,1; 0,12 cm/h hacia el nodo; pH=5,5; 4,5 10
-3
cm/h hacia el ctodo.

8.2.- Una mezcla de tres tripptidos se intenta separar por electroforesis en papel.
Qu pH es el ms adecuado para obtener una buena separacin?
A: His-Glu-Ser
B: Lys-Asp-Arg
C: Val-Glu-Arg

8.3.- Los dipptidos -aspartilhistidina y -aspartilhistidina poseen las siguientes
caractersticas de disociacin:

Determinar la relacin entre las movilidades electroforticas de ambos
pptidos en disolucin a pH 1,90. Cul sera la tcnica ms apropiada para su
separacin: electroforesis de zona o electroenfoque?
S:
o
/
|
= 1,19

8.4.- El gel de poliacrilamida se emplea tanto en cromatografa de exclusin
molecular como en electroforesis. En cromatografa las molculas ms grandes
eluyen antes, sin embargo en electroforesis quedan ms retardadas. A qu se
debe esta diferencia de comportamiento?

8.5.- Haz un esquema del resultado de una electroforesis en acetato de celulosa
(pH 7,0) de las siguientes protenas (el punto de aplicacin de la muestra es el
centro de la tira). Comntalo brevemente.

MM pI
Protena A 60000 7,0
Protena B 20000 8,0
Protena C 60000 5,0

pK
1
pK
2
pK
3
pK
4

-Asp-His 2,45 3,03 6,82 7,98
-Asp-His 1,90 2,95 6,90 8,72
8.6.- Interpreta las siguientes representaciones de Ferguson. Indica las relaciones
relativas, en cuanto a carga, masa y densidad de carga, entre las protenas
representadas en cada grfica.



8.7.- Se ha determinado la movilidad electrofortica relativa del enzima lactato-
deshidrogenasa y de varias protenas patrn en electroforesis en gel de
poliacrilamida al 7.5 % en presencia de SDS, obtenindose los valores de la
Tabla:

Muestra Patrones
protena
Lactato-
deshidr.
BSA Catalasa
Glutamato-
deshidr.
Glicerald-
3-P-
deshidr.
Tripsina Mioglob
MM (kDa) ? 68 60 53 36 23.3 17.2
Rm 0,455 0,18 0,22 0,29 0,40 0,60 0,74

Calcula la masa molecular de la lactato deshidrogenasa.
S: MM 33,9 kDa.

8.8.- Una electroforesis
discontinua de protenas se lleva a
cabo en las siguientes condiciones:

Tampn de electroforesis: cido
actico/alanina pH 5,0
Gel concentrador: 5 %
acrilamida; tampn cido
actico/acetato sdico pH 5,0
Gel separador: 14 % acrilamida;
tampn cido actico/ acetato
sdico pH 4,0
Indicad cul es el in gua
(leading ion), y el in de rastreo
(trailing ion). Enumerar las discontinuidades introducidas.
5% acrilamida
tampn cido actico/
acetato sdico, pH 5.0
14% acrilamida
tampn cido actico/
acetato sdico, pH 4.0
tampn electroforesis cido actico/
alanina, pH 5.0
+
-
Log Rm
% acrilamida
A
B
Log Rm
% acrilamida
A
B
C
D
1
2
8.9.- La electroforesis de un enzima, previamente tratado con SDS y 2-
mercaptoetanol, en gel de poliacrilamida conteniendo SDS genera dos bandas
con movilidades relativas de 0,51 y 0,56. La masa molecular del enzima activo,
determinada por cromatografa de exclusin molecular sobre Sephacryl S-200
HR (confirmada por ultracentrifugacin) es de 130000.
Indica la posible estructura cuaternaria del enzima as como la masa
molecular de sus subunidades. La movilidad relativa de protenas patrn
sometidas a electroforesis en presencia de SDS en iguales condiciones se muestra
en la siguiente Tabla:

Protena
Masa
molecular
Movilidad
relativa
Mioglobina 17800 0,75
Tripsina 23600 0,60
G3PDH 36000 0,40
Ovoalbmina 43500 0,16

S: MM= 26000 y 28000.

8.10.- Una protena oligomrica se somete a electroforesis en gel de
poliacrilamida en presencia de SDS bajo dos condiciones diferentes:
1) La protena, en estado nativo, se trata durante un tiempo limitado con un
agente entrecruzador (ello lleva a la unin covalente, parcial, de las cadenas
polipeptdicas que estn en contacto en la estructura nativa). Tras la
electroforesis SDS-PAGE se obtienen 4 bandas con Rm 0,10; 0,30; 0,52 y
0,70.
2) La protena, sin tratamiento previo, se somete a SDS-PAGE y se obtienen 2
bandas de Rm 0,52 y 0,70. El densitometrado del gel proporciona unos
valores de 33690 y 12578 unidades arbitrarias respectivamente para estas
dos bandas.
Por otro lado se someten a electroforesis en las mismas condiciones 4 protenas
patrn de masas moleculares 15, 40, 60 y 90 kDa las cuales generan 4 bandas con
Rm de 0,82; 0,40; 0,22 y 0,04 respectivamente.
Cul es la masa molecular de la protena en estado nativo?
Qu conclusiones se pueden deducir respecto a la estructura cuaternaria de la
protena?
S: MM nativo 80 kDa

8.11.- La siguiente Tabla muestra el comportamiento de una protena X,
comparada con patrones de masa molecular conocida, en SDS-PAGE y en geles
en gradiente de poliacrilamida (PAGGE).

SDS-PAGE PAGGE

Rm (relativa al
azul de bromofenol)
Distancia
recorrida (mm)
Protena X 0,47 51

Patrn 15 kDa 0,86 81
Patrn 28 kDa 0,58 66
Patrn 40 kDa 0,43 59
Patrn 65 kDa 0,26 52
Patrn 89 kDa 0,14 49
Patrn 118 kDa 0,04 46

Determina la masa molecular de la protena X. Se obtiene informacin
adicional por haber realizado dos tipos distintos de electroforesis? Se puede
determinar Rm, respecto a un marcador (por ejemplo azul de bromofenol) en
PAGGE?
S: MM SDS-PAGE, 38 kDa; MM PAGGE, 76 kDa

8.12.- La migracin de RNA en geles de poliacrilamida es inversamente
dependiente de su masa molecular. Se ha realizado la electroforesis de RNA del
fago T5 de E. coli, en un gel de poliacrilamida del 10 %, empleando como
patrones RNAs de masa conocida, obtenindose los siguientes resultados:


distancia (cm) 8 6 1,8
masa molecular 2,610
4
3,810
4
8,510
4


Calcula la masa molecular de los dos tipos de RNA del fago, sabiendo que
migran 4,3 y 2,4 cm en las mismas condiciones que los patrones anteriores.
S: MM
D4.3
= 5,310
4
; MM
D2.4
= 7,.610
4



8.13.- Un fragmento de DNA con extremos XbaI-KpnI se introduce en el sitio de
clonacin mltiple (EcoRI-XbaI-PstI-KpnI-BamHI-HindIII) de un vector pBS
(4,2 kpb). El plsmido circular obtenido se somete a digestin por diversos
enzimas de restriccin y los productos se desarrollan en electroforesis en gel de
agarosa (0,8 %) junto con patrones de tamao conocido (fragmentos de DNA
lineales). Un esquema del gel tras la electroforesis, teido con bromuro de etidio
y expuesto a luz ultravioleta se muestra en la figura.

Realiza el mapa de los puntos de corte de los enzimas de restriccin
utilizados.


















Aminocido Abreviatura pK
a1
pK
a2
pK
aR
Mr
cido asprtico Asp D 2,09 9,82 3,86 113
cido glutmico Glu E 2,19 9,67 4,25 147
Alanina Ala A 2,34 9,69 - 89
Arginina Arg R 2,17 9,04 12,48 174
Asparragina Asn N 2,02 8,80 - 132
Cistena Cys C 1,71 10,78 8,33 121
Fenilalanina Phe F 1,83 9,13 - 165
Glicina Gly G 2,34 9,60 - 75
Glutamina Gln Q 2,17 9,13 - 146
Histidina His H 1,82 9,17 6,00 155
Isoleucina Ile I 2,36 9,68 - 131
Leucina Leu L 2,36 9,60 - 131
Lisina Lys K 2,18 8,95 10,53 149
Metionina Met M 2,30 9,20 - 131
Prolina Pro P 1,99 10,60 - 115
Serina Ser S 2,21 9,15 - 105
Tirosina Tyr Y 2,20 9,11 10,07 181
Treonina Thr T 2,63 10,43 - 119
Triptfano Trp W 2,38 9,39 - 204
Valina Val V 2,32 9,62 - 117


PROBLEMAS T9 (Clase)
CENTRIFUGACIN

9.1.- Calcula la velocidad angular a partir de las siguientes velocidades de
rotacin.
a) 2400 rpm
b) 1000 rps
Si una partcula situada a 12,5 cm del eje de giro se encuentra girando a las
velocidades anteriores, Cul es el campo centrfugo relativo al que se encuentra
sometida?
S: a) 251,33 rad/s; b) 6283,2 rad/s; a- 806g; b- 503554g

9.2.- Un procedimiento de ultracentrifugacin requiere centrifugar durante 10
horas en un rotor cuyo campo centrfugo relativo mximo es de 150000g. Si el
fondo del tubo est situado a 9,8 cm del eje, Qu velocidad debe emplearse? Si
debido a un deterioro del rotor este slo puede emplearse a una velocidad
mxima de 30000 rpm, Cul puede servir como procedimiento alternativo de
ultracentrifugacin bajo esta limitacin?
S: 37000 rpm; teniendo en cuenta que
2
1
t
1
=
2
2
t
2
15,2 horas

9.3.- Una suspensin de material biolgico contiene cuatro clases de partculas
subcelulares con las siguientes caractersticas:

Partcula s
20, w
(Svedberg)
Densidad
(g/mL)
P1 5,310
7
1,405
P2 4,410
5
1,410
P3 1,110
4
1,292
P4 9,810
3
1,102

Disea un esquema de separacin que permita aislar las partculas con un
grado de contaminacin mnimo.
S: La cuatro tienen s diferentes se podran separan por centrifugacin diferencial, pero no
es posible el aislamiento completo. Si por centrifugacin zonal: P3 y P4 por isopcnica (p.e.
sacarosa 10 %- 1,04 g/mL, 50 % 1,23 g/mL). P1 y P2 por centrifugacin zonal de velocidad
de sedimentacin en gradiente de densidad.

9.4.- Demuestra que los ribosomas eucariotas, formados por las subunidades 40S
y 60S originan una unidad 80S. Asume que tanto el ribosoma completo como sus
subunidades son partculas esfricas y que poseen idntico volumen especfico
parcial. Cul sera el s de una partcula formada por un dmero de ribosomas?
(aplica las mismas suposiciones anteriores).
S: Se trata de demostrar la dependencia de s con M. De Svedberg, s=m
p
(1-u
d
)/f. Ponemos
m
p
en funcin de M y n Avogadro: m
p
=M/N
a
; y f= 6tqr (r= radio de esfera, de volumen
Vol
p
=4/3tr
3
y Vol
p
=m
p
/
p
Vol
p
=M/N
a

p
, as u=1/
p
Vol
p
=Mu/N
a
). Sustituyendo
s=M
2/3
{[(4/3)
1/3
(1-u
d
)]/6[N
a
2/3
qu
1/3
t
2/3
]}. Todo entre las llaves son constantes para todas las
partculas (enunciado)s=M
2/3
K. Ecuacin aplicable a cualquiera de las partculas.
s
60
=M
60
2/3
K; s
40
=M
40
2/3
K y s
rib
=(M
60
+M
40
)
2/3
K. Finalmente se llega a:
s
rib
3/2
=s
40
3/2
+s
60
3/2
s
rib
3/2
=40
3/2
+60
3/2
. s
rib
=80,1S.
s
dmero
=[2s
rib
3/2
]
2/3
; s
dmero
=[2(80,1)
3/2
]
2/3
; s
dmero
=127,3S


9.5.- Mediante centrifugacin diferencial de un extracto de tejido se obtuvieron 4
fracciones en las que se determin la actividad de 4 enzimas marcadores y de un
enzima problema (X) cuya localizacin subcelular se deseaba conocer. Los datos
de actividad enzimtica (u.a./mL), junto con los de contenido proteico total en
cada fraccin, se muestran en la siguiente Tabla:

Fraccin
Protena
(mg/mL)
RNA-
polimerasa
Citocromo-
oxidasa
Glucosa-6-
fosfatasa
Lactato-
DH
X
I 0,82 9,43 315,4 266,7 169,3 93,7
II 1,23 0,37 2760,4 505,4 539,7 231,4
III 0,65 0,12 312,6 467,4 352,3 179,7
IV 0,32 0,04 30,8 82,2 446,0 38,7

Cul es la localizacin subcelular ms probable de X?
S: se divide la actividad enzimtica de cada marcador y de X por la concentracin de
protena (actividad especfica).

9.6.- Se centrifugan a 30000 rpm las subunidades 30S y 50S ribosomales y el
tRNA 4S procariotas en un rotor con los radios de giro (x) siguientes: x
min
= 4 cm
y x
mx
=10 cm. Cul es el tiempo necesario de centrifugacin, t
sed
, para
sedimentar completamente la subunidad 50S? Bajo estas condiciones qu % de
las partculas 30S y tRNA 4S han sedimentado tambin?
S: con la forma integrada de la ecuacin de Svedberg5horas 9min.
De nuevo con la misma ecuacin, pero ahora la incgnita el x
mn
en el que sedimentaran las
otras partculas: 30S70 %; tRNA 4S11,83 %.

9.7.- Se pretende separar mitocondrias y cloroplastos desde un homogeneizado
vegetal. Ambas partculas presentan una forma similar que puede ser considerada
esfrica, pero los cloroplastos son ms voluminosos (8,2 10
-3
mm
3
) que las
mitocondrias (5,010
-3
mm
3
). Las densidades tambin son diferentes: 1,22 g/cm
3

para los cloroplastos frente a 1,28 g/cm
3
para las mitocondrias.
car
qu
los
bue
par
cue
iso
S: a
par
es e

clor
clor
Vol
m
c
=
rad
6
(1
1,0

1,0

9.8
mo
ace
ultr
ello
18
ultr
bas
fue
res
HA
Par
ultr
ma
adj
De
qu
las
det
a) Si
racterstic
condici
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s valores
ena sepa
rtculas
enta que
otnica pa
a) densida
metros q
el coeficie
Hay qu
roplastos
roplastos
l=4/3tr
3

= 110
-5
g y
ios: r
m
= 0
1-0,781
d
)
64 g/mL.
b) En
65 y 1,22.
8.- Se p
olecular
etiltransf
racentrifu
o se emp
% (11
racentrifu
sculante
eron des
sultantes
AT me
ralelamen
racentrifu
asas mo
junta se
etermina
u ha sid
protena
terminaci
el hom
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iones sed
n centrifu
extremo
aracin d
sediment
el valor
ara las pa
ad, viscosi
que aparec
ente de sed
e averigu
(s
c
) sean
s
c
=m
c
(1-u
[r= (3V
y tambin
0,0106 cm
)]/6tq0,01
centrifuga
. Las mito
pretende
de
ferasa
fugacin
plearon g
mL), qu
fug 20
SW40T
spus fr
emplead
ediante
nte, en
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oleculares
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la masa
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n iguales:
u
c

d
)/6tqr
Vol/4t)
1/3
].
n u
m
= 0,78
m y r
c
= 0,0
106 y s
c
=
acin zon
ocondrias s
la esti
un
(HA
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gradiente
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h a 3
Ti (Beckm
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un
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s conoc
ran los
a molecu
ido, respe
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/o de la c
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zonal en
nsidad de
plastos y
s rpida
o de dens
).
velocidad,
ecuacin d
n.
nsidad del
s
m
=s
c
. P
r
c
. Como m
. Calculam
81 cm
3
/g y
0125 cm.
= [110
-5
(
nal un gra
seran ms
imacin
isoenzim
AT)
ente de d
es de sac
aplicar l
38000 rp
man). L
dos y la
analizar
ensayo
cas con
a de 4
cidas. E
resultado
ular del e
ecto a la
ara poder
centrifu
centrifug
as ambos
gradient
el gradien
y mitoco
amente e
sidad del
, distancia
de Svedbe
l medio (
Para mito
m=Vol y
mos la mas
y u
c
= 0,82
Sustituye
(1-0,82
d
)
adiente ad
s rpidas.
de la
ma hi
med
densidad
arosa de
la muest
pm en
Los gradi
as fracc
r la acti
espec
ndiciones
protena
En la f
os obten
enzima H
a estructu
r realizar
uga en u
gacin go
tipos de
te lineal
nte ms
ondrias?
en el gr
l medio d
a al eje (tip
erg: v= se
(
d
) en el
ocondrias,
y u=1/ y
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20 cm
3
/g.
endo todo
)]/6tq0,01
decuado se
masa
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. Para
el 7 al
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rotor
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nidos.
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2
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125. Igua
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1,03 g/c
or), tiempo
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3
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ulta
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0

m
) y
para
fera:
6
g y
r los
10
-

d
=
ntre
Las protenas patrn empleadas fueron: a, catalasa MM 240.000; b, aldolasa
MM 158.000; c, seroalbmina bovina MM 68000 y d, citocromo c MM 12500.
El gradiente fue fraccionado del fondo a la superficie.
S: Aplicando el procedimiento de Martin y Ames (M
2/3
vs Distancia) MM=140000. Por el
procedimiento de Redon y Calcagno (log M vs log Distancia)MM=141000

9.9.- Cul es la composicin de bases aproximada del DNA del fago T1 de E.
coli sabiendo que su densidad de flotacin en cloruro de cesio es de 1,7057
g/mL? S: Existe una relacin emprica que permite deducir: % GC fagoT1= 47,7 %

9.10.- La centrifugacin a 30000 rpm de una determinada partcula en una
ultracentrfuga analtica origina los siguientes resultados:

Tiempo (min) Distancia del frente al eje (cm)
2 6,225
10 6,310
14 6,358
18 6,400
22 6,445
26 6,491

Calcula el coeficiente de sedimentacin de la partcula.
S: 29,2S

9.11.- Una protena de volumen especfico parcial () es 0,72 mL/g se somete a
ultracentrifugacin analtica (60000 rpm) disuelta en un medio de densidad 1,015
g/mL. Repitiendo la ultracentrifugacin con distintas concentraciones de protena
se obtuvieron los siguientes coeficientes de sedimentacin:

Concentracin (mg/mL) s, (Svedbergs)
0,02 9,61
0,05 9,09
0,07 8,77
0,10 8,33

a) Conociendo el coeficiente de difusin de la protena (D= 3,310
-7
cm
2
/s) y
la temperatura de 27C, calcular la masa molecular de la protena.
b) Si la viscosidad del medio (q
27,d
) eran 1,160 centipoises (cP) calculad el
coeficiente de sedimentacin estndar de la protena (s
20,w
)

Datos:R (cte gases)= 8,3 J/molK= 8,310
7
erg/molK (1 erg=1gcm
2
/s
2
).
1 Poise (1 P)= 1 g/cms; 1 cP= 0,01 g/cms; q
20,w
= 1,009 cP;
20,w
= 0,998 g/mL
S: a) s
0
= 10S. MM= 280000, hay que tener en cuenta la ley de Fick que relaciona el
coeficiente de difusin, D, con el coeficiente de friccin, f; b) s
0
20,w
= 12S.