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Como requisito parcial para obtener el ttulo profesional de

BILOGA



Morelia, Michoacn, Noviembre de 2010


UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN
NICOLS DE HIDALGO

FACULTAD DE BIOLOGA
ENTEROBACTERIASDELAGUADELMEANDRODELROLERMAEN
LAPIEDAD,MICHOACNYSANTAANAPACUECO,GUANAJUATO
Tesis
Quepresenta

CONSUELO VARGAS JUREZ


DIRECTOR
DR. MIGUEL MARTNEZ TRUJILLO
Firmado digitalmente por
AUTOMATIZACION
Nombre de reconocimiento (DN):
cn=AUTOMATIZACION,
o=UMSNH, ou=DGB,
email=soporte@biblioteca.dgb.
umich.mx, c=MX
Fecha: 2011.03.09 08:28:05 -06'00'
2




EL PRESENTE TRABAJ O SE REALIZ EN EL LABORATORIO DE
GENTICA Y MICROBIOLOGA PERTENECIENTE A LA FACULTAD
DE BIOLOGA DE LA UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN
NICOLS DE HIDALGO, BAJ O LA ASESORA DEL DR. MIGUEL
MARTNEZ TRUJ ILLO, CON EL APOYO DEL PROYECTO GENERAL
SANEAMIENTO DEL CAUCE NATURAL (MEANDRO) DEL RO
LERMA E INTEGRACIN DEL MISMO A LA DINMICA URBANA DE
LA PIEDAD, MICHOACN DE FONDOS MIXTOS DEL GOBIERNO
DEL ESTADO DE MICHOACN.













3

RESUMEN
El presente trabajo consisti en un estudio de las bacterias del agua del ro Lerma,
en el tramo que corresponde al Meandro, de las ciudades de La Piedad,
Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato. Form parte de un estudio ms
general financiado por el gobierno estatal y federal, que se enfoc a dar
propuestas de solucin al saneamiento de la zona y a su incorporacin a la zona
urbana. Se establecieron 8 sitios de muestreo y se realizaron colectas en 4
ocasiones durante el ao 2009. Las muestras de agua se procesaron para la
obtencin de colonias puras, las cuales fueron analizadas mediante pruebas
bioqumicas con el sistema de galeras API20E. Con este sistema se identificaron
12 especies de la familia Enterobacteriaceae, entre las que se encuentran
patgenas como Klebsiella pneumoniae y algunas patgenas oportunistas.
Escherichia coli siempre estuvo presente en los sitios de muestreo, lo que refleja
la contaminacin constante de origen fecal. Con los resultados obtenidos se
recomendar a la poblacin de las ciudades que rodean la zona estudiada, a
travs de las autoridades municipales, a que no establezcan contacto directo con
el agua y que cuando se utilice el agua para riego de plantas que se consumen de
manera fresca, que se tomen las medidas sanitarias convenientes.


4
CONTENIDO

1. INTRODUCCIN.8

2. ANTECEDENTES.....10

3. OBJETIVOS...16

4. DESCRIPCIN DEL REA DE ESTUDIO...17

5. MATERIAL Y MTODOS18

6. RESULTADOS..34

7. DISCUSIN...59

8. CONCLUSIONES.61

9. REFERENCIAS.62






5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ubicacin del municipio de La Piedad, Michoacn.18
Figura 2. Fotografa area del ro Lerma en su tramo que atraviesa las ciudades
de La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato..20
Figura 3. Produccin de indol..26
Figura 4. Internalizacin y rompimiento de la lactosa a glucosa y galactosa..28
Figura 5. Prueba de Vogues-Proskauer.29
Figura 6. Ejemplo de las coloraciones obtenidas para cada una de las pruebas
cuando son positivas (parte superior) o negativas (parte inferior).32
Figura 7. Inoculacin de las galeras API20E...33
Figura 8. Ejemplos de tinciones de Gram de colonias puras. Gram negativas y
Gram positivas...35
Figuras 9,10,11. Aspecto de las galeras API20E despus de ser inoculadas por
colonias puras aisladas en agar nutritivo, gram negativas, oxidasa
negativas...36-38
Figura 12. Resultados de la prueba de oxidasa para dos colonias puras.
..39
Figura 13. Captura de los resultados de las pruebas bioqumicas en el Software
ApiWeb40
Figura 14. Parmetros fsicoqumicos en los 8 sitios durante el muestreo 1.
.....50
Figura 15. Parmetros fsicoqumicos en los 8 sitios durante el muestreo 2.
.....51
Figura 16. Parmetros fsicoqumicos en los 8 sitios durante el muestreo 3.
......52
6
Figura 17. Parmetros fsicoqumicos en los 8 sitios durante el muestreo 4.
..53




















7
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Pruebas de azcares de las galeras API20E......25
Tabla 2. Componentes de cada una de las celdas de laspruebas bioqumicas y su
interpretacin...............................................................................................31
Tabla 3. Resultados de las pruebas bioqumicas realizadas a las colonias puras
obtenidas en el muestreo 1....42

Tabla 4. Resultados de las pruebas bioqumicas realizadas a las colonias puras
obtenidas en el muestreo 244

Tabla 5. Resultados de las pruebas bioqumicas realizadas a las colonias puras
obtenidas en el muestreo 345

Tabla 6. Resultados de las pruebas bioqumicas realizadas a las colonias puras
obtenidas en el muestreo 446

Tabla 7. Sitios de muestreo de donde se aislaron las colonias puras para la
identificacin...47
Tabla 8. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 1.48
Tabla 9. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 2.49
Tabla 10. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 3...49
Tabla 11. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 4...50
Tabla 3A. Interpretacin de los resultados de las galeras API20E para la
identificacin de las bacterias....65







8
1. INTRODUCCIN
Una de las cuencas ms afectadas por la contaminacin de desechos
orgnicos es la del ro Lerma, en el tramo de Abasolo, Guanajuato, a La Piedad,
Michoacn. En sta se cuentan 300 granjas con casi 1.5 millones de cerdos que
generan 3000 toneladas de estircol diarias yque equivalen a la contaminacin
producida por 3.7 millones de habitantes (Domnguez, 1993). En esta rea una
gran cantidad de agua es contaminada diariamente (entre 40 y 400 l/hab/da, en el
consumo humano diario y entre uno y diez litros de agua por producto fabricado en
el medio industrial); estas aguas residuales han sido, en su mayor parte, vertidas
en el cauce del Ro Lerma sin ningn tratamiento (CIIDIR, 2004) y en su conjunto
los desechos tienen como destino final los suelos y los cuerpos de agua.
En la zona existen dos plantas de tratamiento de aguas residuales
municipales,una correspondiente al municipio de La Piedad, Michoacn, la cual se
encuentra en operacin y segn datos del propio municipio est operando con un
90% de eficiencia. En cambio la segunda, correspondiente a la poblacin de Santa
Ana Pacueco, Municipio de Pnjamo, Guanajuato, se encuentra fuera de
operacin y carente de mantenimiento, segn se pudo constatar en la visita de
prospeccin realizada por el equipo de trabajo de la UMSNH el 7 de agosto de
2007.
Existe una gran variedad de factores que contribuyen a la contaminacin de
frutas y hortalizas por microorganismos causantes de enfermedades en humanos.
Algunos de los factores que pudieran considerase de riesgo en la calidad
microbiolgica de los productos frescos incluyen: el uso de agua de riego
contaminada con heces fecales de humanos y animales; procesos inadecuados en
los campos de cultivo; prcticas deficientes de desinfeccin; condiciones
inapropiadas durante empaque; higiene deficiente de los trabajadores; y el mal
manejo durante almacenamiento y transporte. Aunado a esto, una vez que ocurre
la contaminacin, muchos microorganismos patgenos poseen la capacidad de
sobrevivir por largos periodos de tiempo en frutas y hortalizas frescas. (Badaway
et al., 1985).
9
Son por estas razones que los estudios bacteriolgicos del agua son de
gran importancia. Desde el punto de vista microbiolgico, el examen de la calidad
sanitaria del agua tiene por objetivo determinar la presencia de ciertos grupos de
bacterias, que revelen una contaminacin reciente por el material fecal o por
materia orgnicaas como las condiciones ideales para la proliferacin bacteriana.
Parrill et al. (1989)
En el presente estudio se hicieron determinaciones de las poblaciones de
bacterias y se identificaron los principales gneros y especies de la familia
Enterobacteriaceae presentes en el agua del ro y dren que pasa por las
poblaciones de La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato. Entre
las especies de bacterias incluidas en esta familia se encuentran algunas
patgenas de animales y humanos, lo que permiti determinar el riesgo de
potenciales enfermedades para la poblacin y establecer medidas de seguridad
para evitarlas. El estudio forma parte del proyecto Saneamiento del cauce natural
(meandro) del ro Lerma e integracin del mismo a la dinmica urbana de La
Piedad, Michoacn, que realizan la Universidad Michoacana y la Universidad de
Guanajuato, del que se estn generando proyectos para sanear e integrar la zona
del ro Lerma a la dinmica urbana de las ciudades.
10
2. ANTECEDENTES

2.1. Microorganismos indicadores
La SARH (1979) determin que las propiedades de un indicador
bacteriolgico de una contaminacin de tipo fecal son las siguientes:
a. Debe ser de origen animal (aparato digestivo).
b. Estar presente en el agua cuando los patgenos estn presentes.
c. No reproducirse en el agua.
d. Su densidad debe tener relacin directa con el grado de
contaminacin fecal.
e. Mayor supervivencia en el agua que los patgenos entricos.
f. Desaparicin rpida posterior a los patgenos.
g. Ausentes en aguas bacteriolgicamente seguras.
h. Requerir de tcnicas sencillas para su identificacin.

Varias especies de bacterias han sido estudiadas para evaluar su idoneidad
como organismos indicadores. Entre los organismos estudiados, Escherichia coli
y otras bacterias coliformes cumplen casi en su totalidad los requerimientos de un
organismo indicador ideal y se consideran como los indicadores de ms confianza
de una contaminacin fecal (Leclerc et al., 2001).

2.2. Coliformes
Las coliformes pertenecen al grupo de bacterias Enterobacteriaceae lacto-
positivas o grupo coli-aerogenes, caracterizadas por su capacidad para fermentar
la lactosa con produccin de cido y gas ms o menos rpidamente, en un periodo
de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida entre 30 y 37
0
C.
Son bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados.
Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros
ambientes: suelo, plantas, cscaras de huevo, etc. Del grupo coliforme forman
11
parte entre otros los siguientes gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y
Citrobacter (Pascual, 1992).

2.3. Familia Enterobacteriaceae
En 1923, David Bergey public una clasificacin de bacterias (Bergeys
Manual of Determinative Bacteriology) que pudo ser usada para la identificacin
de bacterias. Actualmente este manual se encuentra en la novena edicin. La
clasificacin en la primera edicin se bas slo en caractersticas fenotpicas
(fentica). Posteriormente, en 1984, se public The Bergeyss Manual of
Systematic Bacteriology, que contena la descripcin de todas las especies de
procariontes identificadas hasta ese momento. Posteriormente, en la segunda
edicin de este manual en 2001, con la secuenciacin de ADN ribosomal y de
protenas se present un anlisis filogentico. Aunque las propiedades de tincin
de Gram son consideradas generalmente como fenticas, stas juegan un papel
importante en la clasificacin de las bacterias. En esta segunda edicin las
bacterias son agrupadas en 24 Phyla. (Willey et al., 2008).

El Phylum Proteobacteria es un grupo grande y altamente complejo que
actualmente contiene ms de 2000 especies en 538 gneros, entre los que se
encuentran Escherichia, Vibrio, Salmonella y Rhizobium. Aunque los grupos se
encuentran relacionados, ste es muy diverso en fisiologa, morfologa y estilos de
vida. El Phylum es dividido en cinco clases de acuerdo a los datos de ADN
ribosomal: Alphaproteobacteria, Betaprotobacteria, Gammaproteobacteria,
Deltaproteobacteria y Epsilonproteobacteria. Las Gamaproteobacterias es un
grupo grande y complejo de 14 rdenes y 28 familias, entre las cuales existen
nutriciones quimio-organotrficas, anaerobias facultativas y fermentativas y un
metabolismo muy diverso. Algunas familias importantes como
Enterobacteriaceae, Vibrionaceae y Pasteurellaceae utilizan la va de Embden-
Meyerhof y la va de las pentosas fosfato para metabolizar carbohidratos. (Willey
et al., 2008).
La familia Enterobacteriaceae o bacterias entricas son Gram negativas,
12
anaerobias facultativas, con forma de bacilos rectos. Esta familia contiene 44
gneros y contiene algunos de los patgenos ms devastadores de animales y
humanos, incluyendo Escherichia coli, Salmonella enterica y especies de los
gneros Yersinia y Shigella. Aunque el nombre de la familia sugiere que son
bacterias asociadas exclusivamente con animales, sin embargo, incluyen varios
patgenos de plantas (Ian et al., 2006). La familia puede ser dividida en dos
grupos con base en sus productos de fermentacin: la mayora como
Escherichia,Proteus, Salmonella y Shigella, llevan a cabo fermentacin mixta y el
cido pirvico puede producir principalmente lactato, acetato, succinato, formato y
etanol. En contraste, Enterobacter, Serratia, Erwinia y Klebsiella son
fermentadores de butanodiol, cuyos productos principales de fermentacin son
butanodiol, etanol y bixido de carbono. Otros gneros de la Familia
Enterobacteriaceae son los siguientes: Arsenophonus, Budvicia, Buttiauxella,
Cedecea, Citrobacter, Edwardsiella, Ewingella, Hafnia, Kluyvera, Leclercia,
Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pragia,
Providencia, Rahnella, Tatumella, Xenorhabdus, Yersinia yYokenella.
En la Familia relacionada, Vibrionaceae se reportan entre otros los
gnerosAeromonas, Enhydrobacter, Photobacterium, Plesiomona y Vibrio. En la
Familia Pasteurellaceae se reportan los gneros Actinobacillus, Haemophilus y
Pasteurella.


2.4. Identificacin de las Enterobacteriaceae y Familias relacionadas
La identificacin de algunos grupos de bacterias, entre ellas las especies de
la Familia Enterobacteriaceae, se ha simplificado mediante sistemas de
identificacin estandarizada, de los cuales el ms conocido es el API, que consiste
en un sistema de galeras, con generalmente 20 pruebas bioqumicas
miniaturizadas relacionadas con una amplia base de datos, a travs de la cual se
obtiene la identificacin del microorganismo estudiado. La realizacin de la
identificacin de microorganismos es sencilla, rpida y fcil. Se requiere el
adecuado aislamiento de una colonia por el mtodo tradicional y a partir de esto se
realiza una suspensin bacteriana en solucin salina o agua bidestilada. Se
13
procede a la inoculacin de cada una de las pruebas bioqumicas de la galera,
para incubarse durante 18 a 24 horas con una temperatura de 37
0
C. La
interpretacin de los resultados genera 7 dgitos que permiten la identificacin final
en gnero y especie, al ser comparado con la base de datos a travs de un
software en lnea.
API maneja un tipo de galera para cada grupo o familia bacterianos con
pruebas bioqumicas especiales para cada uno de ellos, lo que hace que el
sistema sea muy especfico en la identificacin en gnero y especie.
Galeras y familias:
API 20 E: Enterobacterias (108 especies)
API 20 NE: No enterobacterias (64 especies)
API STAPH: Estafilococos, micrococos (22 especies)
API STREP: Estreptococos y gneros relacionados (47 especies)
API 20 A: Anaerobios (67 especies)
API 20 C Aux: Levaduras (43 especies)
API CORYNE: Corynebacterinas (33 especies)
API LYSTERIA: Listerina (6 especies)
API CAMPY: Campylobacter (19 especies)
API ZYM: Investigacin enzimtica
API 50 CH: Metabolismo hidratos de carbono: bacillus, lactobacillus.

2.5. Algunos estudios bacteriolgicos realizados en el estado de Michoacn
Valads en 1993, hace un estudio de la calidad del agua residual del distrito
020 en el Valle Morelia-Querndaro para uso de riego, encontrando que en los
meses de Septiembre a Noviembre se registraron los valores ms bajos de
coliformes totales como fecales y en los meses de enero a marzo se presentan los
valores ms altos, lo cual es un indicador de que la precipitacin es un factor muy
importante en la dilucin de contaminantes del agua.
14
Beltrn en 1993, realiza un estudio de contaminacin fecal de la subcuenca
este del lago de Cuitzeo, donde encontr que el mayor promedio de fecales se
localizaban en la orilla del lago.
Martnez en 1994, hace una evaluacin fsico-qumica y bacteriolgica (del
grupo coliforme) del tratamiento de aguas residuales en las lagunas aireadas de
INPAMEX, en Uruapan, Mich., en donde los valores obtenidos inicialmente son
muy elevados, dadas las condiciones primarias del tratamiento en lagunas
aireadas.
Santos en 1995, reporta que las caractersticas fsico-qumicas, as como
los anlisis bacteriolgicos, demuestran que el lago de Zirahun no presenta una
importante contaminacin de origen orgnico, excepto slo en ciertos meses y en
algunas estaciones de muestreo que se encuentran cerca de los poblados ms
grandes, mostrando con esto que el lago tiene capacidad de depuracin.
Ferreira (1995) hace un estudio en la presa la Mintzita y el Ro Grande de
Morelia, donde observa claramente cmo la contaminacin de origen fecal del ro
en la parte cercana de su nacimiento es menor, siendo ms severa al recibir la
descarga de CEPAMISA y las descargas de aguas residuales de otras industrias,
as como el material fecal que proviene de la ciudad de Morelia.
Miranda (1995)realiz un estudio la Laguna de Naranja de Tapia, en el
municipio de Zacapu, Michoacn, donde se cuantificaron las bacterias coliformes
totales y fecales. Esta laguna se encontr en buenas condiciones y no presentaba
gran contaminacin de origen orgnico.
Corts (1996) realiza un estudio en la laguna de Zacapu, en donde los
anlisis bacteriolgicos muestran que la mayor cantidad de bacterias totales
coinciden en zonas cercanas a descargas de aguas residuales y materia orgnica,
debido al aporte de nutrientes que stas proporcionan. Los valores ms altos de
bacterias totales para los sitios de muestreo se observ durante primavera y
verano, concordando con los valores reportados para temperatura, cuyos rangos
ms altos se registran en este mismo periodo.
15
Servn (1996) estudi la contaminacin de origen fecal de la presa
Sabaneta, la cual presentaba un mnimo de contaminacin, debido a que se
considera un cuerpo de agua joven, que est ubicado en la cuenca alta o
cabecera de la subcuenca del ro Tuxpan.
Armenta-Medina (2007) hace un anlisis del agua de riego de los cultivos
de la poblacin de Urutaro, Michoacn y determina los usos que se le debe dar al
agua de riego.




















16
3. OBJETIVO GENERAL

Identificar los principales gneros y especies de bacterias de la familia
Enterobacteriaceae presentes en el agua del ro Lerma en la Piedad, Michoacn y
Santa Ana Pacueco, Guanajuato.


3.1. OBJETIVOS ESPECFICOS

a) Identificar los gneros y especies principales de enterobacterias presentes
en el agua del ro Lerma a lo largo de un ciclo anual.
b) Determinar los riesgos potenciales de enfermedades causadas por las
bacterias del agua.
c) Proponer medidas de prevencin para minimizar los riesgos de contraer
enfermedades causadas por las bacterias del agua del ro.
17
4. DESCRIPCIN DEL REA DE ESTUDIO


El municipio de La Piedad Michoacn se localiza al norte del Estado, en las
coordenadas 2021 de latitud norte y 10202 de longitud oeste, a una altura de
1,680 metros sobre el nivel del mar. Limita al norte con los Estados de J alisco y
Guanajuato, al este con Numarn, al sur con Zinparo, Churintzio y Ecuandureo, y
al oeste con Yurcuaro. Su distancia a la capital del Estado es de 183 kms.
(Figura 1).
Tiene una superficie es de 284.11 Km2 y representa un 0.48 por ciento del
total del Estado. Su relieve lo constituyen la depresin del Lerma, el sistema
volcnico transversal y los cerros Grande, Zaragoza, Zapote y Del Huerto. Su
hidrografa se constituye principalmente por el ro Lerma; arroyos: Domingo Prieto,
Prieto y Canapro; manantiales de agua fra: el Algodonal y el Capricho, Adems
de las presas Avia, Paredones e Ingeniero Antonio Rodrguez.
Su clima preponderante es semiclido subhmedo, con lluvias en verano.
Tiene una precipitacin pluvial anual del 700 milmetros y temperaturas que
oscilan de 3.0 a 38.5 centgrados.
En el municipio domina la pradera, con nopal, cardonal, pastizal y
matorrales diversos. La fauna la conforman la liebre, el zorrillo, la comadreja, la
ardilla, el coyote, la tuza, el tordo, el torcaz, el bagre y la carpa. Se aprovecha el
caudal del Ro Lerma en un lugar conocido como El Salto para la generacin de
energa elctrica.
Los suelos del municipio datan de los periodos cenozoico, terciario inferior y
mioceno; corresponden principalmente a los del tipo chernozem. Su uso es
primordialmente ganadero y en menor proporcin agrcola.








Figuura 1. Ubic

cacin dell municipi
18
o de La Piedad, Mic



choacn.

19
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1. Materiales
Autoclave
Campana de flujo laminar
Balanza granataria
Bao de agua con control de la temperatura
Estufa incubadora con regulador de temperatura
Refrigerador
Potencimetro
Termmetro de mercurio
Gradillas
Tubos tipo Falcn estriles
Tubos de ensayo
Matraces Erlen-Meyer de 250, 500 y 1000 ml.
Cajas de Petri desechables
Micro pipeta de 1000 l
Asas bacteriolgicas.
Portaobjetos y cubreobjetos.

5.2. Medios de cultivo
Agar Nutritivo
Galeras Biomereux API20E

5.3. MTODOS
El presente estudio se llev a cabo en el laboratorio de Gentica y
Microbiologa ubicado en el edificio B4 del Campus de Ciudad Universitaria,
perteneciente a la Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo. Se
establecieron los sitios de muestreo en el tramo del ro Lerma (meandro) y en el
20
Dren artificial, que atraviesa las ciudades de La Piedad, Michoacn y Santa Ana
Pacueco, Guanajuato, mediante un recorrido inicial por la zona (Figura 2).

Figura 2. Fotografa area del ro Lerma en su tramo que atraviesa las ciudades
de La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato. Tomada de
Googleearth. Los sitios de muestreo se representan con tringulos amarillos.

21
Se realizaron cuatro muestreos para cubrir las diferentes condiciones del
ao. Las muestras de agua se tomaron en frascos de vidrio estriles de 100 ml, a
una profundidad de 10 cm y posteriormente fueron colocados en hielo para evitar
el crecimiento bacteriano. Se trasladaron las muestras al laboratorio para su
anlisis.

Temperatura y pH del agua
La temperatura se determin con un termmetro de mercurio marca
Brennan, con precisin de 1
0
C. Para determinar el pH se tom la muestra de
agua (50 ml) y se coloc en hielo, para trasladarse al laboratorio, donde se utiliz
un potencimetro Conductronic pH20. Las concentraciones de oxgeno disuelto
fueron solicitadas al subproyecto de Calidad del Agua.

Aislamiento de colonias en Agar Nutritivo
Las muestrascon diferentes diluciones del agua se dispersaron sobre cajas
de Agar Nutritivo slido utilizando una varilla de vidrio estril, pasada por alcohol y
flameada. Las cajas se incubaron a 37C por 24 h y las colonias bacterianas
diferentes en morfologa y color fueron resembradas en cajas individuales del
mismo medio.

Prueba de Gram
Esta tincin clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram
negativas. La tcnica incluye tincin primaria, decoloracin y tincin de contraste:
a) Se tie el espcimen con el primer colorante, cristal violeta.
b) Se aade el mordiente, yodo.
22
c) Se aplica el agente decolorante, normalmente una solucin de alcohol-acetona.
En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tincin violeta, pero las
Gram positivas retienen el colorante.
e) Se adiciona safranina durante un minuto.
f) Se retira el colorante con agua destilada y se observa al microscopio

Prueba de oxidasa (citocromooxidasa)
La prueba de citocromo oxidasa permite detectar la enzima citocromo
oxidasa de la cadena transportadora de electrones y por consiguiente descartas a
las Enterobacterias que son todas oxidasas negativas, de otros Gram negativos,
principalmente no fermentadoras
Se segui el protocolo de placa directa:

a) Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda
la placa y no invertirla.

b) Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se
produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es
dentro de los 10-30 minutos.

Preparacin de la solucin salina 0.85% para suspensin bacteriana de API
20 E
a) Pesar 8.5 gr de NaCl.
b) Aforar a un litro con agua destilada o de preferencia tridestilada
c) Colocar en tubos de 7 ml con tapn de rosca, muestras de 4 ml.
d) Esterilizar a 120
0
C por 20 minutos
23
Identificacin de gneros y especies de bacterias de la familia
Enterobacteriaceae
La galera API20E consta de 20 microtubos que contienen medios
deshidratados. Las galeras se inocularon con una suspensin bacteriana; el
metabolismo de los microorganismos produce cambios de color en el medio, ya
sea directamente o tras adicin de reactivos. Tras 18-24 horas a 35-37 C se hizo
la lectura de la galera segn la tabla de lectura.
Las galeras tienen diferentes pruebas que se describen a continuacin:
ONPG, Es produccin de -galactosidasa, el sustrato utilizado es o-nitrofenil--D-
galactsido. El medio es incoloro; pero si la reaccin resultara positiva cambiar a
amarillo.
ADH, Es la produccin de arginina dihidrolasa, el sustrato que se utiliza es
arginina. Posterior a las 24 horas de incubacin se le aade una gota de reactivo
TDA (3.4g percloruro frrico +100ml de agua destilada). El medio es de color
amarillo y una reaccin positiva lo har cambiar a marrn.
LDC, Es produccin de lisina decarboxilasa, se utiliza lisina como sustrato. El
medio, de color amarillo vira al naranja cuando la prueba es positiva.
ODC, Produccin de ornitina decarboxilasa utilizando como sustrato ornitina. El
medio es amarillo; una reaccin positiva lo hace virar hacia el naranja-rojo.
CIT, Utilizacin de citrato. Cuando la prueba resulta positiva el medio vira del
amarillo al verde.
H
2
S, Produccin de sulfuro de dihidrgeno utilizando como sustrato tiosulfato de
sodio. El medio es incoloro-grisceo, cuando la prueba es positiva se forma un
depsito negro.
URE, Produccin de ureasa. El sustrato es urea, y si la reaccin es positiva el
medio, de color amarillo, vira al naranja-rojo.
24
TDA, Produccin de triptfano desaminasa utilizando como sustrato triptfano. El
medio es amarillo; cuando la prueba es positiva se puede apreciar un viraje al
marrn.
IND, El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido
triptfano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y
desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La
produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de
muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la
formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del
p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs
y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
VP, Prueba de Voges Proskauer. En sta se determina la va de fermentacin del
butanodiol descrita en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o
acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio
alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. ste se
revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.
GEL, Produccin de proteasas El medio contiene gelatina y tinta china. Si la
bacteria estudiada produce proteasas capaces de hidrolizar el sustrato, la tinta
china difunde, obtenindose una prueba positiva. En caso contrario la reaccin es
negativa.
Se cre una anaerobiosis con aceite de parafina en los ensayos: ADH,
LDC, ODC, H2S, URE.
Fermentacin de azcares. Los medios son de color azul verdoso; una
reaccin positiva viene dada por una coloracin amarilla. Ls pruebas especficas
se describen en la tabla 1.

25


Tabla 1. Pruebas de azcares de las galeras API20E


GLU

fermentacin/oxidacin de glucosa

MAN

fermentacin/oxidacin de manosa

INO:

Fermentacin/oxidacin de inositol

SOR

Fermentacin/oxidacin de sorbitol

RHA

Fermentacin/oxidacin de ramnosa

SAC

Fermentacin/oxidacin de sacarosa

MEL

Fermentacin/oxidacin de melobiosa

AMY

Fermentacin/oxidacin de amigdalina

ARA

Fermentacin/oxidacin de arabinosa

Descripcin de la produccin de indol
El indol es el producto final de la desaminacion del triptfano por bacterias
que presentan triptofanasa, con produccin de piruvato y amoniaco que se
detectan al agregar el P-dimetil aminobenzaldehido (Reactivo de Ehrlich o Kovac)
generando una capa de color rojo en el medio por ejemplo: MIO (movilidad indol
ornitina). (Figura 3).
26



Figura 3. Produccin de indol.
Descripcin de la prueba de descarboxilacin de aminocidos: arginina,
ornitina y lisina
Las Enterobacterias presentan descarboxilasas, enzimas capaces de
reaccionar con aminocidos especficos en el medio de prueba, con lo cualse
liberan aminas de reaccin alcalina y dixido de carbono y se leen con un
indicador de pH que se encuentra en el medio de prueba. La conversin de
arginina a citrulina es una dihidrolasa mas que descarboxilasa, en el cual el grupo
NH
2
es removido de la arginina como primer paso, luego la citrulina es convertida
en ornitina, la que es descarboxiada para formar putrescina:
Lisina cadaverina +CO
2
Ornitina putrescina +CO
2
Arginina citrulina +CO
2
27

Prueba de orntonitrofenil beta- d-galactsido
Las bacterias que fermentan lactosa poseen lactosa permeasa (beta-
galactsido permeasa)y beta galactosidasa, dos enzimas necesarias para la
produccin de cidos en la fermentacin de lactosa. La permeasa es necesaria
para que la molcula de lactosa ingrese en la celula bacteriana donde la beta-
galactosidasa puede romper la unin galactsido, produciendo glucosa y
galactosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa no poseen estas dos
enzimas, algunas carecen de lactosa permeasa y son fermentadores tardos de
lactosa.El ortonitrofenil beta D-galactsido (ONPG), es estructuralmente similar a
la lactosa, excepto en que la glucosa ha sido sustituida por ortonitrofenilo. En
fermentadores rpidos el ortonitrofenilo es liberado por accin de la beta-
galactosidasa formando ortonitrofenol, ste es un cromoforo que al ser liberado da
una coloracin amarilla.Resultados positivos nos dan un cambio de claro a
amarillo. Figura 4.

28


Figura 4. Internalizacin y rompimiento de la lactosa a glucosa y galactosa.

Descripcin de la prueba de Vogues-Proskauer
Se basa en la conversin de acetil metil carbinol (acetona) en diacetil a
travs de la accin de KOH y oxgeno atmosfrico. El diacetil es convertido en un
complejo rojo por la accin cataltica de alfa naftol y creatina y se determina en
bacterias que utilizan la via alternativa de acetona y butilenglicol en el
metabolismo del cido pirvico. Figura 5.
29


Figura 5. Prueba de Vogues-Proskauer.




30
Componentes, reactivos adicionales e interpretacin de las pruebas
bioqumicas de las galeras API20E
Las pruebas bioqumicas de las galeras API20E consisten en
reaccionesque se interpretan por coloraciones. En la tabla 2 se describen los
componentes de cada una de las pruebas y su interpretacin. En la figura 6 se
presentan los casos ms claros de las pruebas positivas y negativas, pero cabe
aclarar que no siempre se obtienen las coloraciones de esa manera y que
depende de la experiencia la interpretacin que se puede dar a cada una de las
pruebas, principalmente las de azcares.
Para la prueba de TDA: Se agrega una gota de TDA (FeCl
3
10%) un color
marrn-rojizo indic una reaccin positiva.
Para la prueba de IND: Se agrega una gota del reactivo J AMES un color
rosado que se difumina en la cpula indica una reaccin positiva.
Prueba VP (Vogues Proskauer): Se agreg el reactivo VP1 (KOH) y VP2
(alfa naftol y creatina) y se ley la reaccin antes de 10 min. Una coloracin rosa
o roja en ese margen de tiempo indic una reaccin positiva. Despus se
consider negativa.
Se ley la galera anotando las reacciones en la hoja de resultados, para
buscar los posibles gneros y especies de las cepas encontradas. Debido a que
las combinaciones posibles de las pruebas para ubicar los gneros y las especies
son muy diversas (Tablas A y B de anexos), se utiliz el software para corroborar
el acierto de las especies encontradas, de igual manera s busc informacin ms
detallada acerca de las descripciones de las especies que permitieran asegurar lo
encontrado.



31
Tabla 2. Componentes de cada una de las celdas de las
pruebas bioqumicas y su interpretacin
PRUEBA COMPONENTES
ACTIVOS
miligramos REACCIONES-
ENZIMAS
NEGATIVO POSITIVO
ONPG 2 nitrofenil beta D
galactopiransido
0.223 Beta
galactosidasa
incolora Amarillo
ADH L-arginina 1.9 Arginina
dihidrolasa
amarillo Rojo/
anaranjado
LDC L-lisina 1.9 Lisina
descarboxilasa
amarillo Rojo/
anaranjado
ODC L-ornitina 0.756 Ornitina
descarboxilasa
amarillo Rojo/
anaranjado
CIT Citrato trisdico 0.075 Utilizacin del
citrato
Verde Azul
H
2
S Tiosulfato sdico 0.76 Produccin de
H
2
S
Incoloro Negro
URE Urea 0.38 Ureasa Amarillo Rosa/rojo
TDA L-triftfano 0.19 Triptfano
desaminasa
Amarillo Marrn
rojizo
IND L-triftfano 0.6 Produccin de
indol
Incoloro Rosa
VP Piruvato sdico 1.9 Produccin de
acetoina
Incoloro Rosa/rojo
GEL Gelatina (origen
bovino)
1.9 Gelatinasa No difusin Difusin
GLUC D-glucosa 1.9 O/F glucosa Azul Amarillo
MAN D-manitol 1.9 O/F D-manitol Azul Amarillo
INO Inositol 1.9 O/F Inositol Azul Amarillo
SOR D-sorbitol 1.9 O/F D-sorbitol Azul Amarillo
RHAM L-ramnosa 1.9 O/F L-ramnosa Azul Amarillo
SAC D-sacarosa 1.9 O/F D-sacarosa Azul Amarillo
MEL D-melibiosa 1.9 O/F D-melibiosa Azul Amarillo
AMY Amigdalina 0.57 O/F Amigdalina Azul Amarillo
ARA L-arabinosa 1.9 O/F L-arabinosa Azul Amarillo
OXI P-
aminodimetilanilina
1.9 Citocromo
axidasa
Incoloro Azul
purpura


32


Figura 6. Ejemplo de las coloraciones obtenidas para cada una de las pruebas
cuando son positivas (parte superior) o negativas (parte inferior).


Procedimiento de inoculacin de galeras API 20 E
Se realiza en condiciones de esterilidad, resuspendiendo la colonia fresca
en la solucin salina y posteriormente inoculndola en cada uno de los tubos. Las
condiciones de esterilidad se hacen mediante parafina lquida. (Figura 7).
33


Figura 7. Inoculacin de las galeras API20E.

34
6. RESULTADOS

En este estudio se llev acabo el estudio microbiolgico del meandro del


Rio Lerma en La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato, utilizando
como indicadoras de contaminacina las Enterobacterias, ya que en estas
localidades algunas de sus zonas agrcolas utilizan el ro como sistema de riego
para sus plantas, que son utilizadas tanto para alimento humano como para el
ganado. Adems, parte de la poblacin urbana se encuentra en contacto directo
con el ro.
El anlisis se realiz en 4 muestreos de los sitios determinados. Las fechas
de los muestreos fueron:
Muestreo 1: 3 de febrero de 2009
Muestreo 2: 19 de mayo de 2009
Muestreo 3: 18 de agosto de 2009
Muestreo 4: 24 de noviembre de 2009

6.1. Identificacin de las Enterobacterias
Las pruebas que permitieron identificar a las especies de
Enterobacteriaceae fueron el aislamiento en medio EMB, la tincin de Gram, para
aislar a las Gram negativas y las pruebas bioqumicas mediante el Sistema de
galeras de API20E. Las bacterias cuales fueron aislados en cajas de petri y
verificadas para comprobar que estaban puras en sus dos modalidades cocos y
bacilos, as como en la tincin de Gram. En la figura 8 se presentan ejemplos de
las bacterias aisladas como colonias puras.


35



Figura 8. Ejemplos de tinciones de Gram de colonias puras. Gram negativas
(izquierda) y Gram positivas (derecha).

Se realizaron las pruebas bioqumicas para cada una de las colonias puras
Gram negativas recuperadas. En las figuras 9, 10 y 11 se presentan ejemplos de
las coloraciones obtenidas con las pruebas realizadas.





36



Figura 9. Aspecto de las galeras API20E despus de ser inoculadas por colonias
puras aisladas en agar nutritivo, gram negativas, oxidasa negativas.

37




Figura 10. Aspecto de las galeras API20E despus de ser inoculadas por
colonias puras aisladas en agar nutritivo, gram negativas, oxidasa negativas.
38


Figura 11. Aspecto de las galeras API20E despus de ser inoculadas por
colonias puras aisladas en agar nutritivo, gram negativas, oxidasa negativas.
39

Las colonias puras fueron analizadas por separado para la prueba de la
oxidasa. Slo una colonia fue oxidasa positiva y fue descartada. El resto fueron
negativas. En la figura 12 se presenta el resultado de la prueba para el anlisis de
dos colonias diferentes.



Figura 12. Resultados de la prueba de oxidasa para dos colonias puras. En la
parte superior la prueba es positiva, en la inferior es negativa.



40


Los resultados obtenidos de las coloraciones de las galeria API20E y la prueba de
oxidasa fueroncapturados en el software ApiWeb, mediante las instrucciones de la
figura 13.

Figura 13. Captura de los resultados de las pruebas bioqumicas en el Software ApiWeb.
El principio de codificacin es condensar la informacin binaria (+, -) en un perfil numrico.
Para ello, las pruebas de la galera se separan en grupos de tres y se da a cada reaccin
positiva un valor igual a 1, 2 4 dependiendo de la posicin de la prueba en su grupo, 1,
2, 3 respectivamente. La suma de los 3 valores obtenidos (0 para reacciones negativas)
dan una cifra entre 0 y 7 para cada grupo. Colocar el cursor en el campo que usted desee
rellenar. Es posible introducir directamente : "+", "-" o "?" en los campos superiores de la
galera. A) Las cifras correspondientes se visualizarn en los campos inferiores. B) Las
cifras (0-7) en los campos inferiores

41

Los resultados de las pruebas bioqumicas encontradas en cada una una de
las colonias puras aisladas para los diferentes muestreos se presentan en las
tablas 4, 5, 6 y 7.En la tabla 8 se resumen las especies encontradas por sitio de
muestreo, pero debe resaltarse que aunque las especies identificadas
corresponden a colonias de un sitio de muestreo, no necesariamente se
encontraban slo en ese lugar, ya que previamente por morfologa se
seleccionaba una colonia de cada tipo, aunque estuviera representada en varias
estaciones. Por lo anterior se asume que la distribucin de las especies de
enterobacterias fue ms amplia para las diferentes estaciones de muestreo.
















Tabla 3. Resultados de las pruebas bioqumicas realizadas a las colonias puras
obtenidas en el muestreo 1


MICRO
ORGANISMO
O
N
P
G

A
D
H

L
D
S

O
D
C

C
I
T

H
2
S

U
R
E

T
D
A

I
N
D

V
P

G
E
L

G
L
U

M
A
N

I
N
O

S
O
R

R
H
A

S
A
C

M
E
L

A
M
Y

A
R
A

O
X
Y

Klebsiella
pneumoniae ssp.
ozaenae
+
+
-
+ - - - - - - + - + + - + + - + + + -
Serratia
liquefaciens
+ + + + - - - - - + + + + + + + + + + - -
Pseudomonas
oryzihabitans
- - - - + - - - - + + - - - - - - - - - -
Pseudomonas
luteola
+ - - - + - - - - + + - - - - - - - - + -
Serratia rubidaea
- - - - + - - - - + + - + - - - + - + + -
Enterobacter
aerogenes
+ - + + + - - - - + - + + - + + + + - + -
Serratia
plymuthica
+ - - - + - - - - + - + + - + - + - + + -
















43

Tabla 4. Resultados de las pruebas bioqumicas realizadas a las colonias puras
obtenidas en el muestreo 2


MICRO
ORGANISMO
O
N
P
G

A
D
H

L
D
S

O
E
D
S

C
I
T

H
2
S

U
R
E

T
D
A

I
N
D

V
P

G
E
L

G
L
U

M
A
N

I
N
O

S
O
R

R
H
A

S
A
C

M
E
L

A
M
Y

A
R
A

O
X
Y

Serratia
liquefaciens
+ + + + - - - - - + + + + + + + + + + + -
Serratia
plymuthica
+ - - - - - - - - + + + + + + - + - + + -
Serratia
rubidaea
+ - - - + - - - - + + + + - - - + - + + -
Pseudomonas
oryzihabitans
- - - - + - - - - + + - - - - - - - - - -
Pseudomonas
luteola
- + - - + - - - - + + + - - - - - - + - -
Pantoea spp
3
+ - - - - - - - - + + + + - - - + - - + -
Ewingella
americana
+ - - - + - - + - + + + + - - - - - + - -







44


Tabla 5. Resultados de las pruebas bioqumicas realizadas a las colonias puras
obtenidas en el muestreo 3


MICRO ORGANISMO
O
N
P
G

A
D
H

L
D
S

O
E
D
S

C
I
T

H
2
S

U
R
E

T
D
A

I
N
D

V
P

G
E
L

G
L
U

M
A
N

I
N
O

S
O
R

R
H
A

S
A
C

M
E
L

A
M
Y

A
R
A

O
X
Y

Serratia plymuthica
+ - - - - - - - - + + + - - - - + - + + -
Serratia liquefaciens
+ - - + - - - - - + + + + + + + + + + +- -
Serratia rubidaea
+ - - - + - - - - + + + + - - - + - + + -
Serratia marcenscens
+ - - + + - + - - + + - - + - - + - + - -
Serratia marcenscens
+ + + + + - + - - + + - - + - - + - + - -









45



Tabla 6. Resultados de las pruebas bioqumicas realizadas a las colonias puras
obtenidas en el muestreo 4


MICRO ORGANISMO
O
N
P
G

A
D
H

L
D
S

O
E
D
S

C
I
T

H
2
S

U
R
E

T
D
A

I
N
D

V
P

G
E
L

G
L
U

M
A
N

I
N
O

S
O
R

R
H
A

S
A
C

M
E
L

A
M
Y

A
R
A

O
X
Y

Aeromonas
hydrophila/caviea/sobria
2
- + - - + - - - + + + - + - + - + - + -
Stenotrophomonas
maltophilia
+ - - - + - - + - - + - - - - - - - - - +
Ewingella americana
+ - - - + - - + - + - + - - - - - - + - -
Burkhoideria cepacia
- + + - + - - - - - + - - - - - + - + - -
Serratia marcenscens
+ + + + + - + - - + + - - + - - + - + - -
46
Tabla 7. Sitios de muestreo de donde se aislaron las colonias puras para la
identificacin
MUESTREOS ESPECIES SITIOS
Muestreo 1 Serratia liquefaciens Sitio 1
Muestreo 1 Pseudomonas oryzihabitans Sitio 8
Muestreo 1 Pseudomonas luteolas Sitio 7
Muestreo 1 Serratia rubidaea Sitio 3
Muestreo 1 Klebsiella pneumoniae ssp
ozaenae
Sitio 6
Muestreo 1 Pseudomonas oryzihabitans Sitio 7
Muestreo 1 Enterobacter aerogenes Sitio 3
Muestreo 1 Serratia plymuthica Sitio 1
Muestreo 2 Serratia liquefaciens Sitio 5
Muestreo 2 Serratia plymuthica Sitio 6
Muestreo 2 Serratia rubidaea Sitio 6
Muestreo 2 Pseudomonas oryzihabitans Sitio 8
Muestreo 2 Pseudomonas luteolas Sitio 2
Muestreo 2 Pantoea spp 3 Sitio 5
Muestreo 2 Pseudomonas luteola Sitio 4
Muestreo 2 Ewingella americana Sitio 4
Muestreo 3 Serratia plymuthica Sitio 8
Muestreo 3 Serratia liquefaciens Sitio 6
Muestreo 3 Serratia rubidaea Sitio 1
Muestreo 3 Serratia marcenscens Sitio 7
Muestreo 4 Aeromonas
hydrophila/caviea/sobria2
Sitio 8
Muestreo 4 Stenotrophomonas maltophilia Sitio 8
Muestreo 4 Ewingella americana Sitio 4
Muestreo 4 Burkhoideria cepacia Sitio 8
Muestreo 4 Serratia marcenscens Sitio 3
6.2. Parmetros fsico-qumicos de los sitios muestreados
Los parmetros fsico-qumicos que se determinaron fueron temperatura,
pH y oxgeno disuelto. La demanda bioqumica de oxgeno (DBO), nitratos y
nitrgeno amoniacal fueron solicitados al subproyecto de Calidad del Agua. En las
tablas 9, 10, 11 y 12 se presentan los resultados obtenidos. La variacin se
aprecia mejor en las figuras 14, 15, 16 y 17. Las temperaturas ms bajas se
tuvieron en el primer muestreo y las ms altas en el tercer muestreo, aunque no se
observ una correlacin con los otros factores. El pH fue ligeramente alcalino,
entre 7.5 hasta 9.55, pero no se observ un patrn para cada sitio de muestreo. El
oxgenpo disuelto no fue detectable en la estacin 8 en los cuatro muestreos
realizados, aunque no se correlacion con la demanda bioqumica de oxgeno, por
lo que otros factores, de naturaleza no biolgica estn influyendo en el
agotamiento del oxgeno. En el muestreo 2 en las estaciones del Malecn (S7) y el
Puente Grande (S3) los valores de DBO rebasaron las 100 unidades, aunque slo
en el sitio 3 el oxgeno disuelto se encontro con un valor muy bajo, de 1.4 mg/L.


Tabla 8. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 1
Temperatura
C
pH Oxgeno
Disuelto
mg/L
Demanda
Bioqumica de
Oxgeno mg/L
Nitratos
mg/L
Nitrgeno
Amoniacal
mg/L
S1
17.9 8.1 3.9 21.16 0.67915 2.2615
S2
19 8.1 5.7 28.6 1.29 2.225
S3
18 7.9 1.7 23.02 5.5825 3.1035
S4
21 8.2 6.3 26.04 0.5175 0.7115
S5
19 8.3 3.9 22.32 1.866 1.546
S6
20 8.3 Medio
hipxico
33.48 0.705 2.8045
S7
20 7.6 8.6 22.32 1.1605 2.688
S8
19.5 8.4 6.2 37.2 nd nd

48


Tabla 9.Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el Muestreo 2

Temperatura
C
pH Oxgeno
Disuelto
mg/L
Demanda
Bioqumica
de Oxgeno
mg/L
Nitratos
mg/L
Nitrgeno
Amoniacal
mg/L
S1 21.6 8.5 2.5 73 1.0833 1.2
S2 23.4 9.2 1.60 48.6 1.76 2.19
S3 22.2 9.35 1.41 105.4 10.56 1.8
S4 26.3 9.55 1.80 20.4 0.66 0.999
S5 26.4 9.08 3.5 28.8 0.933 0.38
S6 27.9 8.98 3.79 34.5 0.77 0.75
S7 28.6 9.27 5.7 101.34 1.6 4.1
S8 28.4 9.22 Nd 61 Nd Nd

Tabla 10. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 3



Temperatura
C
pH Oxgeno
Disuelto
mg/L
Demanda
Bioqumica
de Oxgeno
mg/L
Nitratos
mg/L
Nitrgeno
Amoniacal
mg/L
S1 21.6 8.5 2.5 43.2 1.3 1.13
S2 23.4 9.2 1.60 75 2.35 3.61
S3 22.2 9.35 1.41 37.8 1.025 0.352
S4 26.3 9.55 1.8 10.8 0.375 0.424
S5 26.4 9.08 3.15 32.4 3.1 2.712
S6 27.9 8.98 3.79 43.2 0.85 1.58
S7 28.6 9.27 5.7 75.6 0.725 2.066
S8 28.4 9.22 Nd 64.8 1.3 0.824

49


Tabla 11. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 4


Temperatura
C
pH Oxgeno
Disuelto
mg/L

Demanda
Bioqumica
de Oxgeno
mg/L
Nitratos
mg/L
Nitrgeno
Amoniacal
mg/L

S1 21.5 7.64 0.14 38.98 0.275 3.393
S2 22.3 8.29 4.08 46.6 0.23 2.26
S3 22.6 8.29 0.58 27.2 0.605 4.407
S4 23.1 8.09 1.39 54.6 0.646 2.025
S5 22.5 8.84 1.47 54.4 0.632 1.582
S6 24.1 8.6 3.17 54.36 0.56 4.859
S7 22.0 8.66 0.03 66 0.721 1.276
S8 19.7 9.16 Nd 52.2 0.91 2.52


50

Figura 14. Parmetros fsicoqumicos en los 8 sitios durante el muestreo 1.S1 a
S8 representan los sitios de muestreo.

0 5 10 15 20 25 30 35 40
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
NitrgenoAmoniacalmg/L
Nitratosmg/L
DemandaBioqumicadeOxgeno
mg/L
OxgenoDisueltomg/L
pH
TemperaturaC
51


Figura 15. Parmetros fsicoqumicos en los 8 sitios durante el muestreo 2.S1 a
S8 representan los sitios de muestreo.

0 20 40 60 80 100 120
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
NitrgenoAmoniacalmg/L
Nitratosmg/L
DemandaBioqumicadeOxgenomg/L
OxgenoDisueltomg/L
pH
TemperaturaC
52


Figura 16. Parmetros fsicoqumicos en los 8 sitios durante el muestreo 3.S1 a
S8 representan los sitios de muestreo.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
NitrgenoAmoniacalmg/L
Nitratosmg/L
DemandaBioqumicade
Oxgenomg/L
OxgenoDisueltomg/L
pH
TemperaturaC
53

Figura 17. Parmetros fsicoqumicos en los 8 sitios durante el muestreo 4. S1 a
S8 representan los sitios de muestreo.

0 10 20 30 40 50 60 70
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
NitrgenoAmoniacalmg/L
Nitratosmg/L
DemandaBioqumicadeOxgenomg/L
OxgenoDisueltomg/L
pH
TemperaturaC
54
6.3. Descripcin algunos gneros y especies de Enterobacterias
identificadas

Klebsiella pneumoniae
Es una bacteria Gram negativa, fermentadora de lactosa. Clulas
encapsuladas. Inmviles. Facultativamente anaerobias. Quimioorganotrofas, con
dos tipos de respiracin y con metabolismo fermentativo. La temperatura ptima
esde 37
0
C. La D-Glucosa y otros carbohidratos se catabolizan con la produccin
de cido y gas, pero se producen cepas aerogenas. Oxidasa negativos y
catalizadores positivos de Indol, rojo de metilo, Vogues- Proskauer, citrato de
Simmons. Por lo general positiva para lisina descarboxilasa y ornitina
descarboxilasa negativa. Arginina dehydrolasa negativas. Varias especies
hidrolizan la urea. Crecen en KCN. Produccin de H
2
S. La mayora de las
especies fermentan todos los carbohidratos con frecuencia excepto dulcitol y
eritritol. Se producen en las heces humanas y las muestras clnicas, el suelo, el
agua, granos y verduras. Puede causar bacteriemia, neumona y otras
infecciones en seres humanos.Son causa frecuente de infecciones
nosocomiales en urologa, en la atencin neonatal intensiva y en os pacientes
geritricos.

Ewingella
Facultativamente anaerbicos y quimioorganotrficas, teniendo una
respiracin y metabolismo fermentativo. La temperatura ptima es 37
0
C. La D-
Glucosa y algunos otros hidratos de carbono se catabolizan con la produccin de
cido. Oxidasa negativa, catalasa positiva, Indol negativas. La mayora de las
cepas son rojo de metilo positivo. Voges-Proskauer y citrato de Simmons
positivos, negativos en las pruebas de la lisina y ornitina descarboxilasa, arginina
dihidrolasa, H
2
S, la ureasa, y malonato. Reduce los nitratos. Los hidratos de
carbono fermentados incluyen D-manitol, D-manosa, y la trehalosa.
55
Frecuentemente aisladas de clnicas de humanos, de esputo ms a menudo,
las heridas y la sangre. Es un patgeno oportunista frecuente.
Tipo y nica especie: Ewingella americana.

Enterobacter
Gram negativas. Mviles con flagelos (excepto E. Asburiae).
Facultativamente anaerobias y quimioorganotrficas, teniendo una respiracin y
metabolismo fermentativo. Temperatura ptima de 30 a 37
0
C. La D-Glucosa y
algunos otros hidratos de carbono se catabolizan con la produccin de cido y
gas. Indol negativo. La mayora de las cepas en Voges-Proskauer y citrato de
Simmons dan positivo. Lisina negativas (excepto E. Gergoviae) y ortinina positiva
(excepto E. Agglomerans). El melanoato es usual utilizarlo y la gelatina lquida es
muy lenta (3-14 dias) en muchas cepas. H
2
S. Desoxirribonuleasa. La lipasa no se
produce. Los carbohidratos son fermentados en muchas cepas, inclusive L-
arabinosa, celobiosa, maltosa, D-manitol, D-manosa y tetralosa. Estn
extensamente distribuidas en la naturleza, se presentan en agua fresca, tierra,
aguas residuales, plantas y animales, y en heces fecales humanas. Varias
especies notables sonE. Cloacae, E. Sakazasii, E. Aerogenes, E. Agglomerans, y
E. Gergoviae. Son patgenos oportunistas. Causan infecciones en
quemaduras, heridas, zonas urinarias y ocasionalmente septicemia y
meningitis.

Pantoea
Gram negativas. Mviles con flagelos. Muchas cepas producen un pigmento
amarillo. Facultativamente anaerobias, quimioorganotrficas, teniendo una
respiracin y un metabolismo fermentativo. La temperatura ptima es de 30
0
C. La
D-glucosa y otros carbohidratos se catabolizan con la produccin de cido, pero
no de gas. Oxidasa positiva, catalasa positiva, Indol negativa, Voges-Proskauer y
56
citrato de Simmons positiva, y variable en rojo metilo. Negativo para lisina y
ortinina descarboxilasa y para arginina hidrolasa. Se ha encontrado que el 30% de
P. Agglomeransdan ortinina descarboxilasa positiva; otros estudios previos
reportaron varias cepas negativas). No se produce H
2
S. La urea no se hidroliza.
Varias cepas crecen en KCN. El melanoato es utilizadoen varias especies. Reduce
nitratos. Muchas cepas fermentan carbohidratos inclusive L-arabinosa, D-
galactosa, maltosa, D-manosa, L-rabinosa, sacarosa, tetralosa, y D-xylosa.
Aisladas en la superficies de plantas, semillas, suelo y agua. Tambin aisladas
de animales y humanos, en sangre y orina. Son patgenos oportunistas.

Pseudomonas
Gram negativas. Aerbicos teniendo estrictamente una respiracin y tipo de
metabolismo con oxgeno con una unidad terminal aceptadora de electrones. En
algunos casos pueden usar el nitrato como sustituto del electrn aceptor, lo que
permite que se les encuentre en condiciones anaerobias. Oxidasa positiva o
negativa. Muchas especies acumulan poli-B-hidroxibutirato como material de
reserva de carbono, que aparece como inclusiones sudanoflicas. Hay formas de
resistencia que se conocen.Mviles por uno o varios flagelos polares. En algunas
hay flagelos laterales y cortos en longitud y tambin en forma. No todas las
especies crecen bajo condiciones cidas (pH 4.5). Varias especies no requieren
de factores orgnicos. Catalasa positiva y quimioorganotrficas. Algunas especies
son facultativamente quimiotrficas. Capaces de usar H
2
o CO como energa. Muy
distribuidas en la naturaleza. Algunas especies son patgenas de humanos,
animales o plantas.

Aeromonas
Gram negativas. Generalmente mviles con flagelos sencillos polares (los
flagelos peritricos forman medios de comunicacin slidos en cultivos jvenes),
facultativamente anaerobias. Quimioorganotrficas teniendo una respiracin y tipo
57
de metabolismo fermentativo. La temperatura ptima es de 22-28
0
C, muchas
especies crecen bien en 37
0
C pero algunas cepas no. La D-glucosa y otros
carbohidratos son catabolizados con la produccin de cidos y a menudo de gas.
Oxidasa positiva y catalasa positiva. Generalmente son arginina hidrolasa positiva
y ortinina descarboxylasa negativa. Las pruebas de ureasa y de fenilalanina
desaminasa son negativas. La Gelatinasa y Dnasa son positivas. Reduce nitratos.
Los carbohidratos son fermentados por casi todas las cepas, inclusive maltosa, D-
galactosa, y trehalosa. Resistente a la agentes vibriostaticos 2,4-diamino-6,7-
diisopropilpteridina (0/129). Se encuentra en agua dulce y semillas. Algunas son
patgenas de ranas, pescados y humanos. Usuales en enfermedades en
humanos, como diarrea o bacteremia.

Escherichia
Con cpsulas y microcpsulas en muchas cepas. Gram negativa. Estados
mviles por flagelos peritricos o bien inmviles. Anaerobias facultativas.
Quimioorgantrofas, teniendo un tipo respiratorio y del metabolismo fermentativo.
La temperatura ptima es de 37C. La D-glucosa y otros hidratos de carbono se
catabolizan con la formacin de cido y gas. Metilo oxidasa negativa, catalasa
positiva, rojo positivo, Voges Proskauer negativa, y por lo general citrato negativa.
Negativas para H
2
S, hidrlisis de la urea y la lipasa. Pueden reducir los nitratos.
Todas o la mayora de las cepas pueden fermentar la maltosa, L-arabinosa, D-
manitol, D-manosa, L-ramnosa, trehalosa, xilosa. 0-nitrofenil-B-D-
galactopiransido positiva. Se producen como flora normal en la parte inferior del
intestino de animales de sangre caliente y en el caso de E. Blattae en las
cucarachas.Hay cepas de E. Coli que contienen enterotoxinas y otros factores de
virulencia, incluyendo los factores de invasin y colonizacin y pueden ser la
causa de enfermedades diarreicas. E. Coli es tambin una especie importante
de las infecciones del tracto urinario e infeccin nosocomial e infecciones
como la septicemia y la meningitis.

58
Stenotrophomanas maltophilia
No fermentadores bacilos, Gram negativos, anteriormente conocido como
Pseudomonas maltophilia y ms tarde Xanthomonas maltophilia. Esta bacteria se
encuentra en varios ambientes, tales como el de agua, suelo, plantas, alimentos y
hospitales. Es cada vez ms comn como una causa importante de
hospitalizacin. Quienesadquirieron la infeccin normalmente estn gravemente
debilitadoso inmunodeprimidos, como los que recibieron a largo plazo la terapia
antimicrobiana y las personas con catteres venosos centrales. Las infecciones
resultantes son amplias, en el tracto respiratorio, tejidos blandos y en la piel, son
las ms frecuentemente implicados. Aunque el patgeno se considera que es una
causa poco frecuente de meningitis, se ha convertido en un foco de inters no slo
debido al aumento de reconocimiento de su potencial patgeno, sino tambin por
su resistencia a los antibiticos.












59
7. DISCUSIN
En este trabajo se llev acabo el estudio microbiolgico del meandro del Rio
Lerma en La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato,para
determinar los gneros y especies de Enterobacterias presentes, para establecer
los posibles riesgos de la poblacin humana de contraer infecciones. En estas
localidades algunas de sus zonas agrcolas utilizan el ro como sistema de riego
para sus plantas, que son utilizadas tanto para alimento humano como para el
ganado. Adems, debido a que parte de la zona urbana se encuentra a un lado del
ro Lerma, existe un contacto directo de los pobladores con el agua y un riesgo
potencial de interaccionar con las bacterias.
El anlisis se realiz en 8 sitios (Figura 2), los cuales se muestrearon en
cuatro ocasiones para cubrir un ciclo anual. Las pruebas que permitieron
identificar a las especies de Enterobacteriaceae fueron el aislamiento en medio
EMB, la tincin de Gram y las pruebas bioqumicas mediante el Sistema de
galeras de API20. Este sistema result ser muy confiable, sin embargo, el costo
de cada muestra no permiti analizar mayor cantidad de muestras, por lo que
primeramente se tomaban las colonias bacterianas con base en su morfologa y
color, para su posterior aislamiento y anlisis. Esto indica que la distribucin de las
especies encontradas en cada uno de los sitios muestreados en cada una de las
temporadas, est subestimado. De manera que si Klebsiella pneumoniae, una
patgena de humanos, se aisl de un sitio, pudo estar presente en otros sitios.
Los resultados obtenidos indican que un alto porcentaje de contaminacin
ya que se encontraron 12 diferentes especies en los sitios muestreados.Entre las
especies de bacterias encontradas existen patgenas de humanos, comunes y
oportunistas.
Con respecto a los riesgos que puede tener la poblacin humana al
exponerse al agua del ro Lerma en el tramo estudiado, si bien en todos los sitios y
pocas del ao hay contaminacin fecal y bacterias patgenas oportunistas, se
debe evitar el contacto directo con el agua, particularmente en los sitios cercanos
a la zona urbana de La Piedad (La Pursima y El Malecn) en las pocas en que el
60
cauce del ro es menor, que usualmente ocurre en los periodos de sequa o
cuando se interrumpe el flujo de agua para desviarla hacia el Dren.


61

8. CONCLUSIONES

1. El sistema API20E es confiable para identificar enterobacterias del agua,
previo aislamiento en agar nutritivo.
2. El sistema de galeras, sin embargo, es costoso y no permite analizar
nmeros grandes de colonias, como es el caso de los estudios ecolgicos.
3. Las especies encontradas, 12 en total, permiten alertar a la poblacin de
evitar contacto directo con el agua del ro.
4. El riego de cultivos con el agua del ro Lerma se realiza de manera normal,
por lo que es conveniente que los productos vegetales sean desinfectados
previamente, como es el caso del consumo de verduras frescas.





62
9. REFERENCIAS


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Microbiology, Sptima edicin. Mc Graw Hill, Boston, 1088 pp.










Tabl
iden



TABLA
la 3A. Inte
ntificacin
AS DE RE
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GA
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65
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