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BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS

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PRÁCTICA Nº03:

1.- TITULO:

2.- INTRODUCCION:

Las curvas de crecimiento comprenden varias fases. Fase de latencia: Es la primera
parte de la curva, en la que el número de ufc permanece constante aproximadamente,
es una fase de adaptación al medio. Aunque no tiene lugar división alguna, se da una
considerable actividad bioquímica, especialmente síntesis de proteína y de ARN.
La duración de la fase lag depende de varios factores, principalmente de la temperatura
de incubación, la composición del medio de crecimiento, su pH y potencial redox y del
estado fisiológico del inóculo. Fase logarítmica o exponencial: Es cuando la
multiplicación de las células de los microorganismos se da a velocidad óptima, el log de
los números de ufc frente al tiempo muestra una relación en línea recta, la velocidad de
crecimiento durante esta fase se puede calcular a partir de la pendiente de la curva de
crecimiento y un modelo matemático. Fase estacionaria: Las ufc permanecen
aproximadamente constantes durante un tiempo variable. No hay reproducción o el
ritmo de multiplicación y el ritmo de muerte son más o menos iguales. Fase de muerte:
la muerte de las células va seguida de autolisis.
Esta libera de nuevo al medio diversos componentes celulares que proporcionan
nutrientes para que otras células viables se multipliquen. Disminución paulatina de
células vivas.

3.- OBJETIVOS:

- Estudiar las fases de crecimiento de las levaduras en un mosto de fruta bajo
condiciones óptimas de desarrollo.
- Obtener las curva de crecimiento para una determinada cepa e interpretar los
resultados aplicando los conocimientos de cinética de crecimiento de los
microorganismos.

4.- FUNDAMENTO TEORICO:

A) FORMULACIÓN DE MEDIOS DE FERMENTACIÓN

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa
fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Donde los componentes de
los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan
un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del
crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis
de metabolitos y para el mantenimiento celular.
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No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los
nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las siguientes
categorías de componentes:

a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que están
representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca,
Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por
litro.
c) Factores de crecimiento, que están constituídos generalmente por componentes
orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni
metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función
metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no
saturados, etc.
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los
componentes, en:

Medios sintéticos o medios químicamente definidos.
Medios complejos, en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o
vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc.
que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son químicamente
indefinidas y de composición variable

B) CRECIMIENTO CELULAR

Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque es
necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir consumiéndose
el substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una fermentación. Sin conocer
estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por
ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qué va a pasar,
cuándo va a completarse el crecimiento, cómo se va a acumular el producto, etc.

Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van
utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que
pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto han
podido duplicar su masa y su material genético. El tiempo que tarda una célula en hacer.
Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el número de células se duplica,
siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

Si llamamos N0 al número de células inicial, y g al número de generaciones
transcurridas, el número de células final (N) será:

Llamando T al tiempo de generación y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuación
anterior puede transformarse en la siguiente:

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Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello es
mejor transformarlas en algo más simple, como puede ser una recta.
Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los dos
términos y resulta:

Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón de
una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generación T es muy grande, el crecimiento
tendrá poca pendiente (será lento) y si T es pequeño el crecimiento será rápido.Esto es:
el incremento en el número de células, en la biomasa de cultivo y en la acumulación de
metabolitos primarios, proteínas, ácidos nucleicos etc., es paralelo.
Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de
células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describe
la cinética es la siguiente:

Esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es
proporcional al número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de
proporcionalidad (μ) se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo así
como la probabilidad de que una célula se divida en un tiempo determinado la
transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente:

Esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el
tiempo siendo la constante de proporcionalidad μ. Comparando esta ecuación con la
similar presentada más arriba, podemos concluir que μ = ln2/T y, por consiguiente, que
T = ln2/μ. Es decir, que hay una correlación inversa entre el valor de la tasa de
crecimiento (μ) y el tiempo de generación.

Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular,
etc. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos μ; o bien, poder calcular la
tasa de crecimiento μ a partir de medidas experimentales del incremento en el número
de células, biomasa, etc.

Figura 1. Crecimiento celular

El gráfico representa la variación de la biomasa (o número de células, etc.) de un cultivo
(línea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya
concentración (línea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa.

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C) CINÉTICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA

Una fermentación aeróbica tipo batch o discontinua puede ser considerada como un
sistema cerrado. En el tiempo inicial el medio de cultivo estéril dentro del fermentador se
inocula con microorganismos y la incubación se da bajo condiciones fisiológicas óptimas.
En el transcurso de toda la fermentación, solo se adiciona oxígeno (en forma de aire), un
agente antiespumante, y un ácido o base para el control del pH, con el fin de garantizar
las condiciones óptimas de operación que permitan obtener una alta concentración
celular. La composición del medio de cultivo, la concentración de biomasa, y la
concentración del metabolito cambia constantemente como resultado del metabolismo
celular. En el transcurso de la fermentación hay 4 fases de crecimiento, por las cuales
pasa el microorganismo a través el tiempo, como se muestra en la figura 4: fase lag, fase
exponencial, fase estacionaria y fase de muerte (Sánchez, 2003).


Figura 2. Curva de crecimiento de los microorganismos.

Fase Lag o de adaptación: también llamada fase de latencia. Cuando las células son
transferidas de un medio a otro, no hay inicialmente un incremento en el número de
células. Durante esta fase los microorganismos se toman un tiempo para adaptarse a su
nuevo ambiente fisicoquímico y en ocasiones se sintetizan nuevas enzimas o
componentes estructurales (Sánchez, 2003; Duarte, 1998). La duración de esta fase
puede variar dependiendo del crecimiento de las células en el inóculo, el cual debe tener
una edad tal que la mayor parte de las células que contiene deben encontrarse en fase
exponencial y metabólicamente activas (Barrera, 2004). Es recomendable utilizar
inóculos entre aproximadamente 5 y 10% del volumen total del reactor con el fin de
reducir el tiempo de latencia (Soto, 2004).

Fase Exponencial o log: Al finalizar la fase lag, las células se han adaptado a las
nuevas condiciones de crecimiento. En este punto las células se reproducen sin
limitación de sustancias nutritivas a velocidad máxima. El crecimiento de las células se
puede describir cuantitativamente como la duplicación del número de células o biomasa
por unidad de tiempo. A través de esta fase las células alteran el medio constantemente
tomando los sustratos y excretando los productos metabolizados. El crecimiento
permanece constante durante esta fase. La velocidad de crecimiento es independiente
de la concentración de sustrato mientras exista sustrato en el medio y se correlaciona
con la velocidad de crecimiento específico μ y la concentración de células x [células/ mL]
según la ecuación número 1.
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La velocidad de crecimiento específico μ, es generalmente una función de tres
parámetros: la concentración del sustrato limitante S , la tasa de crecimiento máxima
max μ , y la constante especifica de sustrato s K , en cuya concentración se obtiene la
mitad de la máxima velocidad específica de crecimiento (μ = 0.5 máx. μ ). Esta relación
puede ser expresada por medio de la ecuación de Monod (2):

La velocidad máxima de crecimiento específico max μ es de considerable importancia a
nivel industrial, debido a que es en este punto donde se obtiene el valor máximo de μ a
niveles de saturación de sustrato, relacionando la dependencia de los microorganismos
con las condiciones del fermentador, donde a medida que aumenta la densidad de
población decrece la concentración del sustrato limitante del crecimiento, causando un
descenso de μ . Fase estacionaria: ocurre cuando se agota una sustancia nutritiva y el
sustrato se ha metabolizado, cuando se han formado sustancias tóxicas o ha ocurrido un
cambio de condiciones como pH, temperatura y concentración de oxígeno disuelto. El
crecimiento celular desciende lentamente o para completamente y en el caso en el que
aun pueda estar ocurriendo crecimiento, este se contrarresta por la rapidez de muerte o
lisis celular. La biomasa incrementa sólo gradualmente o permanece constante durante
la fase estacionaria, aunque la composición de las células puede cambiar (Sánchez,
2003; Duarte, 1998).

Fase de muerte: también llamada fase de decaimiento. En esta fase la reserva de
energía de las células se ha acabado, debido a condiciones de inanición o como
consecuencia del metabolismo de mantenimiento de algunas células. El tiempo entre la
fase estacionaria y la fase de muerte depende del microorganismo y el proceso utilizado
(Sánchez, 2003; Duarte, 1998).

D) CONSUMO DE SUBSTRATOS LA LEVADURA Sacchharomyces cerevisiae

La levadura Sacchharomyces cerevisiae es capaz de asimilar una gran variedad de
monosacáridos. También puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos mayores,
como la sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece de las enzimas
necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidón. Estos últimos substratos deben
ser desdoblados previamente, ya sea por hidrólisis ácida y calor (pH 2.5), o por la
actividad de enzimas exógenas de origen microbiano o vegetal: lactasa, glucanasa, a y
b-amilasas o glucoamilasa. En los mostos de procesos industriales, las concentraciones
de carbohidratos fermentables fluctúan generalmente entre 6-12% (p/v).

Los carbohidratos asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a través
del ciclo de la Glucólisis (o vía Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura aprovecha la
energía liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de ATP y los usa en la
etapa anabólica. El ciclo se estabiliza al reducir finalmente dos moles de NAD+, mientras
forma los productos de la fermentación.

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Además de la fuente de carbono, la levadura requiere que el medio de cultivo tenga
fuentes apropiadas y suficientes de otros macronutrientes: N, O, H, S y P; de
micronutrientes: Na, K, Ca, Mg, Mn y Fe; de elementos traza y de vitaminas. Se ha
observado un mejor aprovechamiento del nitrógeno cuando sus fuentes son aminoácidos
libres o péptidos pequeños, en comparación con las proteínas, porque las proteasas de
la levadura tienen actividad limitada.

La velocidad de consumo de substrato limitante (fuente de carbono) está ligada
directamente a la velocidad de crecimiento de la levadura. Al entrar en la célula, el
substrato tiene tres destinos: para funciones de mantenimiento, para crecimiento
microbiano y para la formación de productos excretados. En un cultivo sumergido
discontinuo (cinética) la cinética de consumo de substrato limitante se representa así:

Dónde:

- qs: Velocidad específica de consumo de substrato
- m: Tasa de mantenimiento

Velocidad de consumo de substrato para el crecimiento microbiano:

Velocidad de consumo de substrato para la formación de los productos ligados al
crecimiento microbiano:


5.- MATERIALES, METODOS Y PROCEDIMIENTOS

MATERIALES.

- Refractómetro, Mosto acondicionado, cepa de Saccharomyces cereviseae.
Termómetro, pH-metro, densímetro 0,9 a 1,1 gr/ml, equipo para medir acidez
titulable.
- Balón de 4 litros, probeta de 250ml.
- Placas petri, pipetas de 10, 5, 2 mL, tubos de ensayo, 3 matraces Erlenmeyer de
litro y de 250 ml.
- Agua peptonada. 200 ml de agar patata glucosa, o OGA o agar suero naranja.

PROCEDIMIENTOS:

 Preparar el mosto adecuando la temperatura, °Brix, pH, acidez.
 Pasteurizar. Enfriar. Inocular la cepa. Iniciar el proceso de fermentación
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.
 Controlar diariamente la temperatura, pH, Y densidad. Airear el mosto. Realizar la
numeración de levaduras por recuento en placa.

 Realizar cuidadosamente las siembras bajo condiciones asépticas, la incubación y
las lecturas de las placas.

 Anotar. Construir la curva de crecimiento de la levadura. Hallar el tiempo de duración
de las fases lag, logarítmica, estacionaria. Hallar el tiempo de duplicación.
 A partir del segundo día de incubación de levaduras se harán controles de: densidad,
conteo de levaduras utilizando la cámara de neubauer, temperatura, °Bx.


Diariamente se hace siembras en
placas petri para tener el recuento de
levaduras que se produce cada día en
la fermentación.
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Las placas deben ser rotuladas para
hacer el conteo de levaduras y puestas
en anaerobiosis en la cámara de
neubauer

Mediante el contador de colonias
podemos identificar el numero de
microorganismos desarrollados en los
días estudiados.


6.- CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION:

- Curva de crecimiento de levaduras en extracto de manzanas.

Fecha temperatura densidad pH
Levaduras
ufc/ml
observaciones
27/05/13 21 1.079 3.5 2x10
6
Inicia la
fermentación
28/05/13 22 1.076 3.5 14x10
6

El olor se siente
más acentuado
29/05/13 23 1.054 3.5 65x10
6

Continua la
fermentación
30/05/13 22 1.034 3.5 60x10
6

La fermentación
disminuye
31/05/13 21 0.98 3.5 60x10
6

La fermentación
llega a su etapa
final
03/06/13 20.5 0.96 3.5 30x10
6
Prácticamente
termino la
fermentación
04/06/13 21 0.95 3.5 25x10
5

Se paralizo la
fermentación.


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5.1. DISCUSION DE RESULTADOS

La levadura del vino en este caso la Saccharomyces cerevisiae es un hongo, unicelular,
sus células son ovoides y se reproduce por gemación, miden entre 5 y 10 micras, vienen
estado aislado hasta que adquieren el tamaño necesario para dividirse, taxonómicamente
pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase Hemiascomycetes, del orden
Saccharomycetales y de la familia de las Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le
permite crecer tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann,
2005).

Además posee alta actividad metabólica, por lo que en la fase aerobia se caracteriza por
la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la producción de etanol,
fermentando alrededor del 90% del medio. Es importante la fase aeróbica, ya que la
levadura presenta una fase de adaptación para producir las enzimas necesarias (tipo
invertasa) que le permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada
para la fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo
el 2% se asimila como material celular (Sánchez, 2010).

En el transcurso de la fermentación hay 4 fases de crecimiento: 1) lag o de adaptación en
el que no hay incremento en el número de células, sino que se adaptan al medio y en
ocasiones sintetizan enzimas o componentes estructurales; 2) exponencial o log, donde
las células se reproducen sin limitación de de sustancias nutritivas a velocidad máxima y
toman sustratos, excretando productos metabolizados; 3) estacionaria, que es la estapa
donde el crecimiento celular desciende o para completamente ya que se han
transformado las sustancias nutritivas, el sustrato se ha metabolizado y las condiciones el
medio se han modificado y la 4) muerte, en donde las células mueren, debido a que su
reserva de energía se ha agotado (Sánchez, 2003).

0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
60000000
70000000
80000000
0 2 4 6 8 10
u
f
c
/
m
l

dias de fermentacion
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Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de
cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol
durante el proceso de fermentación (Feldmann, 2005).

En esta práctica se monitoreó el crecimiento de Saccharomyses cerevisiae, con el fin de
medir el cambio de diferentes parámetros, como pH, acidez y unidades formadoras de
colonias, así como la duración de cada etapa del crecimiento. Y así adquirir
conocimientos para realizar experimentos de este tipo y además aplicarlo en la
elaboración de productos fermentados.

7.- CONCLUSIONES:

 La fermentación de verduras es una de la formas de conservar alimentos que está
más extendida por el mundo. El comer pickles en cada comida puede ayudar a la
digestión y asimilación de lo comido.
 El primer microorganismo en crecer en vegetales puesto a fermentar, es el
Leuconostoc mesenteroides el cual degrada la glucosa por vía heterofermentativa
produciendo CO2, ácido láctico, etanol, etc.
 Los lactobacilos que no producen gas, principalmente especies de Lactobacillus
plantarum, contienen la producción de ácido, elevando la acidez al 1,5 – 2,0 %, esta
bacteria produce ácido láctico a partir de la fermentación de los azúcares.
 Los principales organismos para producir ácido láctico son: el Streptococccus y el
Lactobaccillus, dependiendo del uso que se le da para obtener un producto tratado
con dicho ácido, el beneficio que nos presta este ácido es el de conservar los
alimentos sin alterar nutrientes ni su composición química.
 En esta práctica se monitoreó la cinética de crecimiento de levaduras, evaluando
parámetros como pH, acidez, consumo de sustrato, densidad y unidades formadoras
de colonias; y de esta forma conocer cómo varían cada uno de ellos con respecto al
tiempo (manteniendo constantes las condiciones de operación), además se llevó a
cabo la medición del crecimiento de levaduras, que arrojó una gráfica en la que se
observó claramente las cuatro etapas del crecimiento, conforme pasó el tiempo, la
levadura metabolizó el sustrato acidificando el medio, aumentando las unidades
formadoras de colonias y disminuyendo la cantidad de glucosa en el medio. El
monitoreo de la cinética de crecimiento de microorganismos es de gran importancia,
en especial la de Saccharomyces cerevisiae, por sus tantas aplicaciones, ayudando
así a obtener productos con la calidad o características deseadas u optimizar
procesos.
 En la práctica de crecimiento de levaduras se hizo uso del azúcar del vino para el
crecimiento de levaduras; donde se le dio condiciones adecuadas de temperatura,
acidez, los ºBrix; esto durante una semana en biorreactores dio un favorable
crecimiento; solo que puede haber existido pequeños errores de conteo que se
puede reflejar en la curva; ya que no se controló durante los últimos días, sin
embargo se debió dar un crecimiento óptimo.

8.- BIBLIOGRAFIA:

- Biosca J., Fernández R., Larroy C., González E. y Parés X. (2002). Descripción y
funciones metabólicas de las alcohol deshidogenadas de Saccharomyces cerevisiae.
Algunos aspectos de ingeniería metabólica aplicados a la fabricación de la cerveza.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias.
Universidad Autónoma de Barcelona. España.