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MTODOS DE IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS

R. Rodrguez-Herrera*, C. N. Aguilar-Gonzlez, L. A. Ayala-Labarrios, J.C. Rocha-Reilla, !.


"adilla-Garca, y #. C. $s%inosa-Hernndez
Laboratorio de Microbiologa y Biologa Molecular. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad
Autnoma de Coahuila . Saltillo Coahuila. M!ico." Corres#ondencia
RESUMEN
Los microorganismos juegan un rol muy importante para el humano dado que son benficos para su salud o economa
(vg. Probiticos, fijadores de nitrgeno etc o bien patgenos para el humano, o bien de los animales y plantas
econmicamente importantes. !ado lo anterior se han desarrollado una serie de metodologas para poder diferenciar
un microorganismo de otro, y para poderlos identificar. "stas metodologas se ha basado tradicionalmente en la
observacin de los sntomas que presentan los hospederos, en la observacin macro o microscpica del
microorganismo o bien de las estructuras reproductivas de los microorganismos, del desarrollo del patgeno en un
medio de cultivo especifico, de la tincin producida al aplicar algunos colorantes sobre el tejido infectado, o bien sobre
el patgeno y la reaccin de un anticuerpo a la presencia de un patgeno. "stas metodologas son buenas en
algunos casos pero deficientes en otros casos por lo que en las #ltimas tres dcadas se han desarrollado tcnicas
moleculares de deteccin e identificacin de microorganismos las cuales se basan en el an$lisis de los $cidos
nucleicos e%trados de los microorganismos en forma directa o bien de una muestra conteniendo el microorganismo en
cuestin. !entro de las ventajas de las tcnicas moleculares de deteccin se encuentran& "specificidad (pueden
detectar solo la molcula o microorganismo de inters, '.( )ensibilidad (son capaces de detectar la presencia de un
solo microorganismo, *.(+apide, (se puede identificar un microorganismo en menos de '- horas y -.( Pueden ser
automati,adas (permiten tener un diagnstico en un menor tiempo y reducir los costos. "l objetivo del presente
trabajo es describir las principales tcnicas moleculares en la deteccin e identificacin de microorganismos as como
sus ventajas y desventajas.
INTRODUCCIN
Los microorganismos juegan un papel muy importante en la vida del ser humano dado que no solo son patgenos a
los animales, plantas o seres humanos sino que muchos de ellos son benficos ya que pueden ser utili,ados para
controlar otros microorganismos, insectos, animales o plantas da.inas para el hombre o su economa. /ambin los
microorganismos pueden tambin ayudar a mejor el nivel de vida de los seres humanos como en el caso de los
prebiticos y bacterias utili,adas en el yogurt. Por otra parte pueden ser utili,ados para la produccin de alimentos
para humanos o animales, como el caso de los hongos comestibles (champi.ones, setas, huitlacoche, etc. o en la
fermentacin de alimentos como el queso, vino, pan etc. 0dem$s pueden ser utili,ados para rehabilitacin del medio
ambiente (bacterias degradadoras de hidrocarburos, tratamientos de aguas residuales etc.. Los microorganismos
pueden ser utili,ados para la produccin de metabolitos de importancia econmica (antibiticos, pigmentos,
amino$cidos, hormonas etc.. "n la 0gricultura, los microorganismos son utili,ados por ayudar en el buen desarrollo
de los cultivos (1acterias fijadoras de nitrgeno, micorri,as, etc.
"n epidemiologa es muy importante la identificacin no solo del microorganismo en cuestin sino que muchas veces
la identificacin a nivel de cepas o ra,as ayuda a& 2.( !eterminar el causante del brote infeccioso, '.( !etectar la
transmisin cru,ada de patgenos, *.( !eterminar la fuente de infeccin, -.(+econocer cepas particularmente
virulentas de organismos y 3.( 4onitorear los programas de vacunacin (5live y 1ean, 2666. "n el $rea clnica y en la
agricultura, la base para un tratamiento efectivo y cura de un paciente, animal o planta es el diagnstico r$pido de la
enfermedad y su agente causal (+eischl, 2667. "sto es especialmente importante cuando se pretende diagnosticar
microorganismos difciles de tratar o con crecimiento muy lento tales como Clamidia, micobacterias, micoplasmas,
virus del 8erpes y enterovirus (Louie y col. '999. "n investigaciones ecolgicas una identificacin r$pida y correcta
de los microorganismos ayuda a la cuantificacin de organismos y a la caracteri,acin de su actividad en diferentes
h$bitats (:an y Le1orgne, '992. "l objetivo del presente escrito es recalcar la importancia de las tcnicas moleculares
en la identificacin de microorganismos, describir algunas de las tcnicas moleculares m$s utili,adas, as como
algunas tcnicas con mayor potencial para aplicarse en el diagnstico molecular de microorganismos a corto pla,o y
relacionar lo anterior con algunos logros obtenidos en nuestro laboratorio.
MTODOS DE IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
!ado la gran importancia de los microorganismos para el ser humano, se han desarrollado una serie de metodologas
para poder diferenciar un microorganismo de otro. Las cuales se ha basado tradicionalmente en la observacin de los
sntomas que presentan los hospederos, en la observacin macro o microscpica del microorganismo o bien de las
estructuras reproductivas de los microorganismos, del desarrollo del patgeno en un medio de cultivo especifico, de la
tincin producida al aplicar algunos colorantes sobre el tejido infectado, o bien sobre el patgeno y la reaccin de un
anticuerpo a la presencia de un patgeno.
La identificacin de un microorganismo (patgeno basada en los sintomatologa presenta varias desventajas como
por ejemplo, los sntomas son muy variados y numerosos; dependen del hospedero del patgeno, e incluso de los
factores del medio ambiente en el que se desarrolla el proceso patolgico. !ebido a lo anterior la identificacin de
patgenos basada solo en los sntomas puede dar origen a errores graves en el diagnstico de una enfermedad dado
que dos diferentes patgenos pueden producir los mismos sntomas en el mismo hospedero, el mismo patgeno
puede producir diferentes sntomas en diferentes hospederos y aun los sntomas pueden variar dependiendo del
medio ambiente donde se desarrolla el proceso patolgico.
La deteccin de un microorganismo basada en la observacin macro o microscpica es m$s eficiente que la
identificacin basada solo en los sntomas. La observacin a nivel macro o microscpico es un procedimiento simple,
es una deteccin directa de patgenos y puede diferenciar organismos distintos morfolgicamente. Presenta las
siguientes desventajas& 2.( "s un procedimiento lento, '.( Laborioso y *.(/edioso dado que se tiene que aislar el
microorganismo (lo cual no en todos los casos es posible y poner a crecerlo en un medio de cultivo hasta que se
alcance un tama.o o una etapa de crecimiento adecuada para su identificacin. La identificacin en forma
microscpica solo es posible en casos muy especficos. "s de baja sensibilidad. )e requiere contar con equipo muy
especiali,ado para la identificacin a nivel microscpico de algunos microorganismos (virus, micoplasmas, viroides,
priones. La estructura de un microorganismo puede cambiar debido a la influencia del medio ambiente, y se requiere
de una gran e%periencia para poder diferenciar una especie de otra a nivel microscpico.
La identificacin de patgenos por medio de tinciones o del desarrollo del patgeno en un medio de cultivo
especifico, puede detectar un amplio rango de variantes, no requiere de equipo muy sofisticado, son pruebas f$ciles
de reali,ar. )in embargo presenta las desventajas de que el tiempo para identificar un microorganismo puede ser
muy largo (en algunos casos hasta de '3 das, adem$s se requieren un gran n#mero de pruebas para estar seguro
de la identificacin del patgeno (una sola prueba no es suficiente en la mayora de los casos. Por usarse
diferentes pruebas, se utili,an una amplia gama de reactivos, lo cual incrementa el costo de la prueba
significativamente. 5tros procedimientos como el cultivo in vitro e inoculacin en ratones son tcnicas costosas y los
patgenos pueden presentar diferencias en infectividad dependiendo del hospedero.
"l uso de anticuerpos para la identificacin de microorganismos se ha empleado por ser una tcnica simple y r$pida.
)e puede automati,ar, y puede ser usada para trabajar con varias muestras al mismo tiempo. )in embargo la
deteccin no puede ser precisa cuando e%isten cantidades mnimas de microorganismos, en el caso de patgenos no
distingue entre infecciones activas y latentes. 0dem$s se carece de anticuerpos y antgenos para muchos
microorganismos y en algunos casos la deteccin no es precisa por la nula especificidad de algunos anticuerpos.
5tras desventajas son que los anticuerpos tienen un costo muy elevado o bien en algunos casos pueden ofrecer
falsos positivos, como por ejemplo en la primera generacin de pruebas para la deteccin de <=8, las cuales estaban
basadas en preparaciones puras del antgeno viral derivadas del cultivo del virus, y se obtenan falsos positivos,
debido a la presencia de antgenos celulares residuales los cuales fueron incorporados dentro de partcula viral
durante la maduracin (+eischl, 2667.
Las tcnicas moleculares se basan en el an$lisis de los $cidos nucleicos e%trados de los microorganismos en forma
directa o bien de una muestra conteniendo el microorganismo en cuestin.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MTODOS MOLECULARES
"n la actualidad las tcnicas moleculares para la identificacin de microorganismos est$n teniendo un auge muy
importante debido a& 2.( "specificidad (pueden detectar solo la molcula o microorganismo de inters, '.( )ensibilidad
(son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo, *.(+apide, (se puede identificar un
microorganismo en menos de '- horas y -.( Pueden ser automati,adas (permiten tener un diagnstico en un menor
tiempo y reducir los costos. "l uso de tcnicas moleculares ha permitido identificar nuevos microorganismos, los
cuales no haba sido posible su cultivo e identificacin por tcnicas tradicionales (:an y Le1orgne, '992. 0dem$s
permiten estudiar las poblaciones microbianas sin hacer aislamientos, por lo tanto, se evitan los sesgos que pueden
surgir con el cultivo de microorganismos (>han y col., '99'. 0s mismo estas tcnicas permiten la deteccin de
microorganismos altamente patgenos, los cuales pueden ser identificados muertos evitando as los riesgos de
infeccin del analista (:ohansson y col., '999. Las tcnicas moleculares han demostraron ser muy #tiles en
situaciones clnicas donde los mtodos convencionales son muy insensitivos (v.g. durante la etapa asintom$tica de las
infecciones del <=8, muy lenta (cultivo micobacterial o muy complicados para ser usados a gran escala (v.g.
aislamiento viral. 5tra aplicacin importante es en el monitoreo del surgimiento de mutaciones en el genoma, por
ejemplo, la seleccin de variantes resistentes durante la terapia antiviral?antibitica (+eischl, 2667.
0lgunas de las desventajas asociadas a las tcnicas moleculares son& 2.(@o distinguen entre organismos vivos y
muertos, aunque algunas veces esto no es precisamente una desventaja en el caso de Staphylococcus aureus la
bacteria muere a temperaturas que no degradan la to%ina as la deteccin de la bacteria muerta es un indicativo de la
presencia de to%inas en la muestra. '.()e tiene que contar con conocimientos de secuencias de nucletidos
especificas del patgeno diagnosticar, *.()e requiere de personal altamente capacitado para el desarrollo de las
pruebas de identificacin, -.()e requiere equipo mas especifico para el diagnostico, lo cual eleva la inversin inicial, y
3.()e desarrollan procedimientos con m#ltiples etapas, lo que incrementa la posibilidad de errores, adem$s de la
posibilidad de obtener falsos positivos y falsos negativos. "l alto costo de las tcnicas moleculares tendera a bajar a
medida que se incremente el uso de estas tcnicas. Por otra parte el problema de falsos positivos y falsos negativos
se puede solucionar si se incluye en cada an$lisis un testigo positivo y un testigo negativo (0yala y col., '99-.
DETECCIN MOLECULAR DE MICROORGANISMOS
)e han propuesto una gran variedad de tcnicas moleculares para la deteccin de microorganismos. !escribir cada
una de las tcnicas propuestas escapa de los alcances de este escrito. Por lo que solo se abordaran las m$s usadas
comercialmente. Ana de las tcnicas moleculares m$s sencillas para identificar bacterias consiste en determinar el
porcentaje de guaninas y citosina presente en su 0!@. "n este caso se reali,a la e%traccin del 0!@ de una colonia
pura y por espectrometra se determina el porcentaje de guanina y citosina. "n el gnero Pantoea se ha estimado un
porcentaje de guanina y citosina que va del 39 al 3BC y en bacterias del gnero Pseudomona un porcentaje va del 3B
al D9C. "sta tcnica tiene la desventaja de no poder identificar especies, solo se pueden identificar bacterias a nivel
de gnero, adem$s algunos gneros de bacterias presentan porcentajes de guaninas y citosina muy similares, por lo
cual, las posibilidades de obtener falsos positivos (identificar a un organismo presente cuando en realidad esta
ausente se incrementan. La mayora de las tcnicas moleculares se basan en la hibridacin de los $cidos nucleicos o
bien en la reaccin en cadena de la polimerasa (P>+.
a).- Tcnicas basaas !n "ib#iaci$n ! ADN
"stas tcnicas se desarrollaron a partir del conocimiento de que dos cadenas sencillas de $cido nucleico que tengan
secuencias complementarias se pueden unir o hibridar para formar una cadena doble. Las cadenas sencillas pueden
ser de 0!@ o 0+@, o bien una de 0!@ y otra de 0+@. !entro de las tcnicas de hibridacin mas utili,adas esta los
fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (+ELPFs.
RFL%s. "sta tcnica est$ basada en hibridacin de 0!@. >onsiste en e%traer 0!@ de un cultivo puro de un
microorganismo o bien de una muestra infectada y digerir el 0!@ con en,imas de restriccin (en,imas que cortan el
0!@ en sitios especficos, posteriormente estos fragmentos de 0!@ son separados en un gel de agarosa utili,ando
electroforesis. "l 0!@ est$ cargado negativamente, por lo tanto, en un campo elctrico el 0!@ migrara del polo
negativo hacia el polo positivo a travs de la matri, de un gel. La friccin entre el fragmento y la matri, ocasiona que
fragmentos peque.os migren m$s r$pido que fragmentos grandes. "n esta tcnica el 0!@ separado de la forma
antes descrita en la gel, es transferido a un soporte slido (membranas de nylon o nitrocelulosa, acto seguido se
hibridi,a el 0!@ de la membrana con una sonda de 0!@ especifica (fragmento de 0!@ de cadena sencilla de 239
a *99 nucletidos del microorganismo que se quiere identificar. La sonda va a unirse en el fragmento del 0!@ que
tenga su complemento. La sonda para la deteccin tiene que ser marcada en forma radioactiva (P*' o no radioactiva
(digo%igenina. La sonda puede ser aislada del genoma nuclear, del genoma mitocondrial o bien de 0!@ que codifica
para protenas (0!@c del microorganismo. "sta metodologa es muy especfica. )in embargo, no es muy r$pida ni
muy sensible (se requiere 29* a 297 copias de la molcula o secuencia de inters para dar un resultado confiable,
adem$s de que se requiere utili,ar radioactividad (si no es empleada adecuadamente y bajo condiciones especiales
de laboratorio, se pueden tener riesgos de salud del analista, contaminaciones de instalaciones o del medio
ambiente.
Ana variante de +ELPGs se ha dise.ado para la deteccin de Listeria. "sta consiste en fijar en un microtubo una
sonda de 0!@ complementaria a una regin del +@0 ribosomal de la bacteria. "l +@0 completo de la muestra es
e%trado y colocado en el microtubo con la sonda, la cual se unir$ al +@0 ribosomal, posteriormente se agrega otra
sonda de 0!@ complementaria a otra regin del +@0 ribosomal la cual est$ marcada con florescencia posteriormente
se detecta la presencia del microorganismo por un anticuerpo con anti(florescencia (Hiese, '992.
T#ans&!#!ncia '(# a')as*a( +s,-as" b)(*). "n esta tcnica la muestra a anali,ar se aplasta contra un soporte slido
originando una huella, la muestra se fija utili,ando alcohol o e%ponindola a A<. )e hibridi,a con la sonda especfica
para el microorganismo en cuestin. /iene la ventaja de ser una tcnica r$pida, que puede ser utili,ada en campo o
fuera de laboratorio. )in embargo es una tcnica sucia, lo cual a veces no permite distinguir una hibridacin de $cidos
nucleicos, con lo cual las probabilidades de obtener falsos negativos (diagnosticar el microorganismo como ausente
cuando en realidad est$ presente se incrementan. 5tra de las tcnicas son& /ransferencia de punto (dot blot similar a
squash blot y @orthern blot similar a +ELPs sin embargo lo que se separa es 0+@ y se hibridi,a con sondas de 0!@
presenta ventajas y desventajas similares a +ELPs.
ARN ! ca!na (b)!. "sta tcnica se utili,a principalmente para detectar clulas infectadas con un virus que tenga
como material gentico 0+@ (retrovirus. !ado que el 0+@ en una clula se encuentra como cadena sencilla, la
presencia de 0+@ de cadena doble implica la replicacin del virus dentro de la clula. "sta es una tcnica
relativamente sencilla, dado que incluye pocas etapas (e%traccin y purificacin del 0+@ de cadena doble y su
separacin en geles de poliacrilamida. )in embargo, presenta la desventaja de identificar solo clulas infectadas con
retrovirus, sin poderse especificar la ta%onoma del virus, por lo tanto es una tcnica muy limitada.
b).- Tcnicas basaas !n %CR
La #!acci$n !n ca!na ! )a '()i.!#asa +%CR) o la amplificacin en,im$tica in vitro de un segmento de 0!@
especfico del microorganismo blanco. "sta es la tcnica m$s utili,ada para la deteccin de microorganismos, se
basa principalmente en reali,ar millones de copias de un segmento de 0!@ especfico de un microorganismo. "n
esta tcnica la cadena doble de 0!@ es separada en dos cadenas sencillas sometindola a temperaturas mayores a
6' grados centgrados despus se hibridi,a o alineen dos peque.os segmento de 0!@ complementarios uno a
una cadena y el otro a la otra. "stos peque.os segmentos son llamados iniciadores, los cuales deben de ser
dise.ados de tal manera que solo hibridisen con el 0!@ del microorganismo que se desee y su tama.o
generalmente va de 2B a '3 bases. Ana ve, que los iniciadores est$n unidos a las cadenas complementarias se
adiciona a la reaccin una 0!@ polimerasa la cual va a formar la nueva cadena tomando como bases la cadena
sencilla y uno de los e%tremos del iniciador (*I. !espus de este primer ciclo, si se parti de una sola cadena doble
de 0!@ se tendran dos cadenas dobles. "sta amplificacin se incrementa en forma geomtrica a medida que se
repite el numero de ciclos, as despus de dos ciclos tendramos cuatro cadenas dobles de 0!@, y despus de tres,
ocho y as sucesivamente, despus de treinta ciclos tendramos una gran cantidad de 0!@ amplificado para ser
visuali,ado a simple vista. Las ventajas de P>+ sobre otras tcnicas de deteccin se han reportado en varias
ocasiones. La deteccin de C. trachomatis por P>+ resulto ser mas precisa, con sensibilidad de 69(299C y
especificidad mayor al 6DC que la deteccin por "L=)0 (Louie y col., '999. 0s mismo la P>+ ha ayudado a
identificar microorganismos infecciosos relacionados a enfermedades previamente identificadas como de origen no
infeccioso.
La tcnica de P>+ se ha utili,ado para la identificacin de virus, bacterias hongos, fitoplasmas nematodos etc. An
ejemplo es el mtodo desarrollado por 0yala y colaboradores '99-, para la identificacin de la bacteria Clavibacter
michiganensis subs. nebraskensis, la cual es causante de la enfermedad conocida como marchites bacteriana del
ma,, en este caso se dise.aron iniciadores especficos a un segmento entre los genes de r+@0 27 ) y '*). !ichos
iniciadores se compararon con las secuencias de 0!@ reportadas en los bancos de genes para comprobar que solo
se alinearan a la secuencia de Clavibacter michiganensis subsp nebraskensis. La precisin y reproducibilidad de los
ensayos de P>+ depende de la e%periencia tcnica y e%periencia de analista. La especificidad de la prueba puede ser
afectada por la contaminacin de la muestra durante su procesamiento. )i los iniciadores no son especficos o si las
condiciones de la P>+ no son optimas, se pueden amplificar productos no especficos (Louie y col., '999. Lo anterior
puede guiar a la deteccin de falsos negativos, de la misma manera la contaminacin de la muestra con inhibidores
($cidos h#micos, polifenoles, carbohidratos, etanol, etc de la en,ima polimerasa puede ocasionar tambin falsos
negativos. )in embargo esto se puede solucionar incorporando siempre controles positivos. La contaminacin de la
muestra con otro 0!@ o +@0, puede conducir a la deteccin de falsos positivos, esto se soluciona agregando siempre
un control negativo (0yala y col., '99-. La identificacin de microorganismos directamente de alimentos utili,ando
P>+ presenta algunas retos como es la baja sensibilidad provocada por la inhibicin debida a la matri, del alimento,
esto puede ser parcialmente restablecida con una etapa de enriquecimiento pero se alarga el tiempo para el
diagnostico (Hrant y col., 266*. 0un con estas desventajas, la fle%ibilidad, automati,acin, rapide, y confiabilidad de
las tcnicas moleculares basadas en P>+ son las tcnicas moleculares con m$s aceptacin en la actualidad para la
deteccin de microorganismos en general.
RT-%CR (amplificacin de un segmento de 0!@ previamente formado a partir de 0+@. "sta es una de las tcnicas
m$s utili,adas para identificar microorganismos cuyo material gentico es 0+@ (retrovirus y viroides. "n este caso se
e%trae primeramente 0+@ del microorganismo en cuestin o bien de una muestra presuntamente infectada por uno de
estos microorganismos, acto seguido el 0+@ se somete a una temperatura generalmente de B9 9> para lineari,ar el
0+@ dado que es por lo general una cadena sencilla y tiende a formar estructuras secundarias y terciarias.
Posteriormente se le a.ade un iniciador complementario y se coloca a una temperatura entre *D y -9 o> para que se
alinee el iniciador con la cadena complementaria, posteriormente se coloca la reaccin a -o> con lo cual se detiene
esta. !espus se coloca una en,ima denominada reverso transcriptasa la cual se va a encargar de formar 0!@
tomando como molde el 0+@ de cadena simple y un e%tremo ( *F del iniciador cuando el 0!@ ya ha sido formado se
procede a reali,ar la reaccin del P>+, esta tcnica puede ser reali,ada en un solo paso si se a.aden todos los
reactivos en un mismo tubo y se programan las temperaturas especificas y para cada etapa. An ejemplo de un
microorganismo que puede ser f$cilmente identificado utili,ando esta tcnica es el virus de la triste,a de los ctricos.
5tra de las ventajas de esta tcnica en la deteccin de microorganismos es que permite identificar infecciones activas
(Louie y col., '999.
%CR aniaa (amplificacin en,im$tica de un segmento de 0!@ interno de un segmento de 0!@ previamente
amplificado. La P>+ anidada es una tcnica que se utili,a principalmente cuando un microorganismo se encuentra
en muy bajas cantidades o bien cuando se quiere identificar si en una muestra e%isten microorganismos de un
determinado grupo y despus determinar que especies de microorganismos de ese grupo est$n presentes. "sta
tcnica consiste en amplificar un segmento grande de 0!@ (D99('999 pb por la tcnica de P>+ con un par de
iniciadores y posteriormente amplificar con otro par de iniciadores un segmento interno del primer fragmento
amplificado es decir esta tcnicas es una P>+ doble y por lo tanto se estima que es mil veces m$s eficiente que una
P>+ simple. La P>+ anidada se ha utili,ado con %ito para la identificacin de muestras presuntamente infectadas
con fitoplasmas, y si la muestra es positiva a la presencia de fitoplasmas. )e amplifica por segunda ocasin para
determinar el tipo especfico de fitoplasmas presente en dicha muestra. An ejemplo del uso de esta tcnica es la
deteccin del fitoplasma del amarillamiento letal del cocotero.
RA%Ds o polimorfismo del 0!@ amplificado al a,ar en este caso se reali,a una reaccin de P>+ con un solo iniciador
el cual tiene un tama.o de B a 2' bases con secuencia arbitraria. "n la etapa de alineamiento del iniciador se
emplean temperaturas bajas *D a -9 o> para asegurar que el iniciador se una a diferentes regiones del genoma del
microorganismo que se desee identificar. "n este caso la identificacin se reali,a solo de cultivos puros del
microorganismo y con una sola reaccin del P>+ se amplifican varios segmentos a la ve, (Eigura 2. /iene la ventaja
de que no se requiere conocimientos previos del microorganismo para poderlo identificar, esta tcnica como mtodo
de identificacin a nivel comercial no es muy utili,ada debido a los problemas de reproducibilidad, sin embargo es
muy #til cuando se requiere determinar diferencias entre ' microorganismos altamente emparentados pudindose
detectar estas diferencias aun a nivel de cepa. Padilla en el '99* utili,ando +0P!Fs logro identificar diferencias a nivel
de 0!@ entre * cepas del Aspergillus niger degradadoras de taninos. 5tra ventaja de los +0P!s es en el caso donde
se logra identificar un fragmento de 0!@ amplificado que se encuentre en una cepa en particular, este se puede
secuenciar y se pueden dise.ar a partir de esa secuencia iniciadores especficos para esa cepa. Lo mismo aplica
para el dise.o de iniciadores especficos a nivel de especie o de gnero esta tcnica es conocida como )>0+
(secuencia caracteri,ada de regin amplificada (Eigura '. 0dem$s de la desventaja de poca reproducibilidad, la
presencia de una banda +0P!, no permite distinguir entre los estados homocigoto y heterocigoto (1abalola, '99*.
Ana tcnica similar a +0P!Gs es la conocida como amplificacin de huellas genmicas del 0!@ (!0E, en esta
tcnica se utili,an iniciadores de 3(29 bases para amplificar 0!@ genmico al a,ar, las bandas amplificadas se
separan en geles de poliacrilamida. "sta tcnica se ha utili,ado para el estudio de cepas de Salmonella enterica
(1abalola, '99*
In.-n(-%CR (unin de un microorganismo a un soporte slido utili,ando un anticuerpo y una posterior amplificacin
de 0!@ por P>+. "s una tcnica que combina las ventajas de las tcnicas inmunolgicas ("L=)0 y de las tcnicas
moleculares (P>+ para que las ventajas combinadas, disminuyan o eliminen las desventajas de ambas tcnicas.
+ocha en el '99*, menciona que "L=)0 es ineficiente en la deteccin cuando se presentan niveles muy bajos de la
molcula o microorganismo de inters en la muestra a anali,ar, mientras que la P>+ se ve inhibida por algunos
componentes de la muestra (compuestos fenlicos, polisac$ridos etc.. "stas caractersticas se combinan cuando se
desea detectar microorganismos cuarentenados directamente de rganos vegetales (semillas, tubrculos etc.
+ocha ('99* adapto la tcnica de inmuno P>+ para la deteccin de Pantoea stewartii, directamente de la semilla de
ma,. "n este caso fijo un anticuerpo primario a un microtubo, se lavo el e%ceso de anticuerpo y se coloco la muestra
molida de la semilla, la cual se conoca que estaba infectada por Pantoea stewartii, posteriormente se dejo
incubando por una hora para la unin antgeno(anticuerpo, se lavo para eliminar la muestra y en el tubo con el
antgeno y el anticuerpo se reali,o la P>+.
In.-n(.a/n!*ic %CR (similar a la anterior, en este caso el soporte es una esfera magntica, la cual es removida de
la muestra con un magneto y posteriormente se reali,a la P>+ . "n esta tcnica un anticuerpo primario se encuentra
unido a perlas met$licas las cuales se colocan dentro de la muestra a anali,ar, se deja incubar para la unin antgeno(
anticuerpo, posteriormente se e%traen estas perlas met$licas con un magneto, se lavan y se colocan en un tubo en el
cual se reali,a la P>+. "sta tcnica se ha utili,ado para la deteccin de Listeria monocytogenes en alimentos.
%CR-.0)*i')!. Ano de los problemas de las tcnicas de P>+ discutidas anteriormente es que solo permiten la
identificacin de un solo patgeno a la ve,. >on la finalidad de solucionar este problema se ha dise.ado la tcnica
conocida como P>+(m#ltiple la cual permite la deteccin de diferentes molculas o microorganismo de inters en una
sola reaccin. "n esta tcnica se incorporan a la reaccin un par de iniciadores por cada uno de las molculas o
microorganismos a detectar, lo cual permite un ahorro en tiempo y costo para la deteccin de diferentes
microorganismos simult$neamente. "sta tcnica presenta retos como el de dise.ar todos los iniciadores que se
deseen agregar a la reaccin con similar temperatura de alineamiento, no deben de presentar homologa entre ellos,
adem$s de amplificar fragmentos de diferentes longitudes. La sensibilidad de una P>+ m#ltiple es del orden de 29'
clulas o de '.6 pg de 0!@ de inters. )in embargo esta sensibilidad puede ser afectada por el dise.o ineficiente de
los iniciadores (+odrigues y col., '99*. "sta tcnica se ha utili,ado para la deteccin de diferentes especies de
Listeria en una misma muestra, as como para detectar diferentes microorganismos a la ve, como es el caso de
Salmonella, Campylobacter, Shigella y E. coli (1abalola, '99*. La P>+ m#ltiple tambin ha sido usada para detectar
diferentes genes de un mismo organismo en una muestra. >lulas infectadas no retienen todos los genes del virus del
papiloma humano por lo tanto usando P>+ m#ltiple se identific la presencia de varios genes vrales a la ve,, lo cual
confirm el agente causal (Jarlsen y col., 2667. "sta tcnica tambin es usada para identificar cuales genes de
resistencia a antibiticos poseen una determinada cepa bacteriana (Pre,(+oth y col., '992.
IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS ALTAMENTE EM%ARENTADOS
"n algunas ocasiones uno se encuentra en una situacin en la cual tiene que identificar una cepa especial de un
microorganismo ya que esta presenta caractersticas sobresalientes de produccin de alguna en,ima o bien de
adaptacin a una determinada condicin, o bien cuando se requiere preservar la identidad de una cepas en particular,
lo cual ayudara a determinar si se contamin, as mismo cuando se quieren establecer relaciones de parentesco
gentico (filogentica entre diferentes cepas de una especie, diferentes especies de un gnero, diferentes gneros
de una misma familia o bien entre diferentes familias de microorganismos. /odos estos casos se presentan cuando se
identifica una cepa con una caracterstica no reportada previamente, por lo tanto las tcnicas moleculares permiten
tener un control sobre la produccin y diseminacin de esta cepa. 0lgunas de las tcnicas moleculares que ayudan
para la identificacin de microorganismos altamente emparentados adem$s de las discutidas previamente son& +epK
P>+, P>+(+ELP, 0ELPFs entre otros.
R!'-%CR esta tcnica est$ basada en la amplificacin simult$nea de diferentes regiones con secuencias repetidas,
se ha utili,ado preferentemente en bacterias amplificando las regiones 15L, "+=>, y +ep. "n este caso se obtienen
varios fragmentos de diferentes tama.os los cuales son amplificados simult$neamente lo cual permite distinguir dos
microorganismos altamente emparentados al comparar los patrones de amplificacin de estos microorganismos. )e
ha propuesto que la tcnica +"P(P>+ puede ser usada para elucidar las bases genticas de la variabilidad fenotpica
entre diferentes especies, dado que se producen patrones de bandeado reproducibles, de complejidad similar, y
permiten la diferenciacin de cepas al nivel de subespecie (:ohansson y col.. '999. "sta tcnica se ha utili,ado para
la identificacin de diferentes especies de Xanthomonas y de rancisella.
%CR-RFL% esta tcnica consiste en amplificar por P>+ un segmento especfico de un microorganismo y
posteriormente digerir el 0!@ amplificado con en,imas de restriccin, esto permite poder determinar diferencias entre
los patrones de bandas amplificadas y?o entre los patrones de los fragmentos resultantes de la digestin del 0!@.
"%isten diferentes variantes de esta tcnica dependiendo del fragmento especfico amplificado y digerido. "ntre los
segmentos m$s com#nmente amplificados y posteriormente digeridos se encuentran los genes ribosomales (27s en
el caso de procariotes y 2Bs en el caso de eucariotes, los espacios entre el conjunto de genes ribosomales
(espacios intergnicos =H) (Eigura - y los espacios internos transcritos (=/) (Eigura 3 del conjunto de genes
ribosomales. "l gen ribosomal 27) est$ altamente conservado pero con la variabilidad suficiente para hacer
distinciones entre gneros y especies (:an y Le1orgne '992. )e han desarrollado iniciadores a partir de la secuencia
del gen ribosomal 27) dentro de un rango muy amplio (universales, desde el nivel de dominio (bacterias, archaea o
eucariotes, grupos (bacterias metanognicas, bacterias sulfatoreductoras, bacterias l$cticas, etc hasta gneros
individuales ("scherichia (:an y Le1orgne '992. )in embargo cuando la resolucin del an$lisis basado en el gen 27)
r+@0 es muy peque.a para hacer inferencias sobre el parentesco de microorganismos altamente relacionados se ha
propuesto la utili,acin del gen gyr1 el cual codifica para la subunidad 1 del polipptido de la 0!@ girasa. )e ha
estimado que este gen evoluciona m$s r$pido que el gen 27) r+@0 mientras que aun mantiene una alta correlacin
con la homologa del genoma total anali,ada por hibridacin total 0!@(0!@ y microarreglos (+odrgue, y col.., '99*.
)e han establecido metodologas para la identificacin r$pida basada en P>+(+ELP de cuatro especies altamente
emparentadas de Carnobacterium las cuales son importantes en la industria alimentaria (1abalola, '99*. La
amplificacin de los segmentos =H) y su posterior digestin con la en,ima 8ind === permiti identificar diferentes cepas
de Penicillum purpurogenum ("spino,a, '99- La amplificacin de los segmentos =/) y su posterior digestin con la
en,ima Lho = permiti la identificacin de diferentes cepas altamente emparentadas de Aspergillus niger (Padilla,
'99*.
AFL%1s. 0mplificacin de fragmentos de longitud polimrfica. "sta tcnica se basa en la amplificacin de un subgrupo
de fragmentos de 0!@ generados por la digestin con en,imas de restriccin. "l 0!@ de los microorganismos es
aislado, purificado y sometido a digestin con las en,imas de restriccin "co += y 4se=. Los fragmentos de restriccin
son despus ligados a adaptadores los cuales contienen sitios de restriccin a cada uno de los e%tremos del
fragmento y una secuencia homologa al sitio de apareamiento del iniciador. Los iniciadores usados para la
amplificacin contienen secuencias de 0!@ homologas a los adaptadores y contienen una a dos bases selectivas a
las terminaciones *F de los fragmentos. 0s los nucletidos selectivos, permiten la amplificacin de solo un subgrupo
de los fragmentos cortados. Los 0ELPGs han demostrado ser reproducibles, y una buena forma de diferenciar cepas
de microorganismos altamente emparentadas. La deteccin a nivel comercial se ve restringida por el alto costo del
secuenciador que se utili,a para visuali,ar los fragmentos amplificados (5live y 1ean, 2666. +estrepo y col.., en 2666
evaluaron la eficiencia de la tcnica de 0ELPGs para detectar la variacin gentica entre diferentes cepas de
Xanthomonas a!onopodis.
DGGE. "lectroforesis en geles con gradiente desnaturali,ante. "sta tcnica es capa, de separar secuencias
altamente relacionadas por su diferente movilidad en gradientes desnaturali,antes (JoMalchuN y col.., 266D. "n esta
tcnica com#nmente se amplifica alguno de los genes que codifican para el +@0 ribosomal (27) r!@0, 2B) r!@0
etc. "l ambiente desnaturali,ante se crea manteniendo una temperatura uniforme (39(79 o> y un gradiente lineal con
urea y formamida. "l incremento de una concentracin desnaturali,ante separa las cadenas dobles de 0!@ en
dominios distintos. >uando un dominio alcan,a su temperatura de desnaturali,acin en una posicin particular del gel
ocurre una transicin del hlice doble a parcialmente desnaturali,ado, y la migracin de la molcula pr$cticamente se
detiene. Las variaciones en la secuencia de los dominios causa que sus temperaturas de desnaturali,acin sean
diferentes; por lo tanto, migran a posiciones diferentes dentro del gradiente desnaturali,ante, logr$ndose la separacin
de los dominios de manera efectiva (:an y Le1orgne, '992. JoMalchuN y col. en 266D amplificaron el gen 2B) r+@0
de '9 especies f#ngicas y sometieron los productos amplificados a !HH", adem$s secuenciaron las bandas
separadas con !HH", con esto se pudo identificar algunas cepas f#ngicas.
TGGE. "lectroforesis en geles con gradiente de temperatura. )imilar al !HH", sin embargo en este caso el gradiente
se crea incrementando gradualmente la temperatura durante la electroforesis. "l ambiente desnaturali,ante se forma
por una concentracin constante de urea en el gel, combinado con el gradiente de temperatura temporal (:an y
Le1orgne, '992. "sta tcnica puede utili,arse para estudiar la diversidad de especies en una comunidad de
microorganismos y comparar as la diversidad de especies entre comunidades. "sta comparacin se basa en que el
n#mero, la posicin precisa y la intensidad de las bandas reflejan el n#mero y abundancia de los tipos dominantes de
r!@0 en una muestra y as se puede comparar dos comunidades de microorganismos ("ichner y col., 2666.
FUTURO DE LA DETECCIN DE MICROORGANISMOS
0ctualmente e%isten tcnicas muy prometedoras que en los pr%imos a.os jugar$n sin duda un papel importante en la
deteccin y cuantificacin de un microorganismo en una muestra dada, las consideradas con m$s futuro se enuncian
a continuacin.
%CR !n *i!.'( #!a). "n esta tcnica adem$s de los componentes tradicionales de una P>+ normal se agrega un
sonda de 0!@ la cual en un e%tremo tiene un quincher y en el otro e%tremo un beacon esta sonda es
complementaria al 0!@ que se desea amplificar por lo tanto se alineara con todas las cadenas de 0!@ en donde
est$ su complemento cuando la 0!@ polimerasa amplifica los fragmentos libera esta sonda del 0!@ la cual est$
unida, al liberarse se emite una fluorescencia la cual puede ser detectada, as entre mas 0!@ se amplifique m$s lu,
se emitir$ por lo tanto se puede estimar el n#mero de fragmentos de 0!@ amplificado. >on esto podemos cuantificar
el n#mero de molculas del 0!@ del microorganismo presente en la muestra en cuestin. "sta tcnica ha sido usada
para medir cuantitativamente la carga viral con el objetivo de monitorear la respuesta a la terapia por pacientes con
infecciones de <=8, citomegalovirus, o virus de la 8epatitis > (Louie y col. '999. La cuantificacin de un determinado
microorganismo en una muestra es de importancia prognstica, ayuda a predecir el progreso de una enfermedad, y es
usada para asistir en la decisin del tratamiento mdico. 0dem$s, la tcnica de P>+ en tiempo real se adapta para la
evaluacin de un n#mero grande de muestras al mismo tiempo, permitiendo un diagnstico de laboratorio, r$pido,
confiable, eficiente y barato (Jlot, y col.., '99*
Mic#(a##!/)(s ( .ic#(c"i's. "sta tcnica utili,a la complementariedad de las bases nitrogenadas del 0!@ y
consiste de un arreglo ordenado de cientos o miles de secuencias de 0!@ (oligonucleotidos, c!@0, etc depositados
sobre una superficie slida (2.' % 2.' cm.. Los soportes slidos son pie,as de silicio o de vidrio. Para la deteccin de
microorganismos se puede construir un arreglo (chip con 0!@ de diferentes microorganismos, posteriormente una
muestra conteniendo 0!@ de uno o varios microorganismos puede ser depositada e hibridada sobre el arreglo y
cualquier 0!@ no hibridado puede ser eliminado por lavados. "l arreglo es despus anali,ado y escaneado para
poder determinar con que 0!@ especfico se hibrido el 0!@ de la muestra e identificar el o los microorganismos
presentes en la muestra. 0ctualmente esta tcnica es muy costosa tanto por los reactivos empleados como por el
digitali,ador de im$genes utili,ado para escanear los microarreglos (+apley, '999.
S!c-!nciaci$n. La determinacin del orden o secuencia de bases a travs de un segmento de 0!@ es una de las
tcnicas centrales de la biologa molecular. )e cuenta con dos tcnicas para secuenciar una basada en un mtodo
en,im$tico y la otra en un mtodo qumico. Los requisitos que debe tener una secuencia para poder utili,arse en la
identificacin de microorganismos son 2.( La secuencia debe de ser conservada entre un n#mero de organismos
relativamente grande. '.( )u proporcin de cambio debe ser constante sobre largos periodos y entre diversos
organismos y deber$ permitir inferencia de la distancia evolutiva entre un amplio rango de formas de vida; la
secuencia no debe ser sujeta a grados amplios discrepantes de la presin de evolucin. /ercero, La secuencia deber$
no haber sido compartida entre diferentes organismos por transmisin hori,ontal. Einalmente, la secuencia deber$ ser
factible de ser amplificada y detectada de variadas formas (+elman, 266B. )ecuencias que cumplen con los
anteriores requisitos son las regiones que codifican para las peque.as unidades ribosomales 27) en procariotes y 2B
) en eucariotes (<inayagamoorthy y col. '99' reportan un mtodo basado en la secuencia de nucletidos que puede
simult$neamente generar secuencias cortas conocidas de nucletidos de un n#mero de segmentos del mismo
genoma o de diferentes genomas. La secuenciacin es uno de los mtodos con m$s futuro dado que se puede solo
amplificar por P>+ el gen ribosomal 27) o 2B), separar las bandas amplificadas, secuenciar o mandar secuenciar las
bandas encontradas, posteriormente comparar esas secuencias con las secuencias depositadas en los bancos de
genes y poder llegar a identificar el o los microorganismos presentes en una muestra.
MTODOS R2%IDOS MODERNOS !n )a !*!cci$n ! .ic#((#/anis.(s
!ra. @orma Laura 8eredia +ojas
!epto. de 4icrobiologa, Eacultad de >iencias 1iolgicas, A.0.@.L. 0pdo. Postal 2'-(E )an @icol$s, @.L. 77-32,
>orreo electrnico& normaOmicrobiosymas.com
Los mtodos r$pidos y la automati,acin en microbiologa es un campo de estudio din$mico que conjunta la utili,acin
de mtodos microbiolgicos, bioqumicos, fisiolgicos, inmunolgicos y serolgicos para el aislamiento m$s efectivo, la
deteccin, caracteri,acin y enumeracin m$s r$pida de microorganismos y sus productos en muestras clnicas,
ambientales o de alimentos.
"l avance reciente de muchos de los mtodos nuevos, ha sido posible gracias a los avances tecnolgicos que se han
dado en los #ltimos a.os tales como los microprocesadores y las computadoras.
Las enfermedades alimentarias constituyen uno de los problemas m$s dispersados del mundo contempor$neo. La
gran mayora de las enfermedades alimentarias tiene un origen microbiolgico. Por lo que la b#squeda de
metodologas r$pidas que puedan asegurar una buena calidad de los productos es una necesidad real. "n los #ltimos
23 a '9 a.os los microbilogos de alimentos han empe,ado a adaptar tecnologas r$pidas y automati,adas en sus
laboratorios y actualmente e%iste un gran inters por su b#squeda y su utili,acin rutinaria.
)e puede decir que un mtodo r$pido es aquel que es m$s r$pido, sencillo o confiable que lo convencional. )in
embargo, siempre al hablar de metodologas r$pidas estamos tratando subjetivamente. )in embargo, en lo que todos
concuerdan es que estos mtodos han revolucionado y lo seguir$n haciendo, la forma de reali,ar los an$lisis
microbiolgicos.
0unque un mtodo r$pido pueda ser llevado a cabo en un tiempo muy corto, como es el caso de un ensayo
serolgico, que puede tardar 29 min, estos mtodos siempre partir$n de un cultivo aislado o al menos de un medio de
enriquecimiento, lo cual alargar$ el tiempo real del ensayo de '- a -B h. 0parte de todo esto, los mtodos r$pidos
tambin tienen limitaciones como lo son la aparicin de tecnologas nuevas que en muchas ocasiones requieren de
tiempo para estandari,arse, la ya mencionada dependencia de enriquecimiento, en la mayora de los casos se
requiere confirmacin de resultados positivos, se debe tomar en cuenta que en ocasiones se presentan interferencias
con los componentes del alimento, los mtodos moleculares se basan en la deteccin de gen no de su actividad, lo
que no nos demuestra que en ese momento el gen de inters est activado. Los ensayos r$pidos normalmente est$n
dirigidos contra un solo microorganismo y en la mayora de los casos, se requiere buscar un grupo de
microorganismos, lo que provoca una elevacin en el costo del an$lisis final.
5tra dificultad radica en la e%istencia de una abundancia de ensayos, lo cual hace difcil la seleccin del m$s
adecuado y tambin que muy pocos mtodos se encuentran validados, lo que hace difcil tambin su utili,acin.
Los mtodos r$pidos los hemos clasificado en $reas de acuerdo a lo que se busca&
)istemas para facilitar la toma de muestras
4todos para ayudar al procesamiento de las muestras
)istemas de cuantificacin microbiolgica
4todos para identificacin y cuantificacin de microorganismos
)istemas especiales para an$lisis de muestras de aguas, ambientales y superficies
)istemas para deteccin?cuantificacin de to%inas microbianas
)istemas de identificacin mediante mtodos moleculares
4todos inmunolgicos para deteccin y?o cuantificacin de microorganismos
5tros mtodos miscel$neos
0 continuacin se har$ una descripcin muy breve de algunos de estos grupos de ensayos&
)istemas de >uantificacin 4icrobiolgica.
2.( Las placas *4/ Petrifilm/ ayudan a ma%imi,ar la productividad en el laboratorio. "stas placas listas para usarse
reducen el tiempo y optimi,an el espacio.
'.( "l sistema !ip @P>ount frascos con esponjas cuadriculadas con agar permitiendo contar diferentes tipos de
organismos. Los resultados que se obtienen no son e%actos, y son apro%imaciones.
*.( "l sistema )implate sirve para reali,ar recuento de organismos selectos& >uenta total, coliformes totales y fecales,
8ongos, levaduras y Campylobacter.
-.( La >ompa.a )piral 1iotechnology ofrece el )istema 0utoplate -999 que puede ser usado para enumeracin
bacteriana, an$lisis de susceptibilidad antimicrobiana, ensayos de mutagenicidad.
3.( )istema Protocol es un sistema modular que abarca desde un sistema para la cuenta de las colonias, hasta el
c$lculo de las diluciones, pudiendo leer
placas tipo espiral, ahorrando medio de cultivo. )e conecta a una computadora b$sica y funciona con QindoMs.
7.( +abit =mpedance !etection )ystem y el Lactmetro que se basan en el concepto de impedancia (resistencia al flujo
de una corriente alternante que es pasada a travs de un material conductor.
D.( "l sistema 4althus es un sistema para cuantificar microorganismos basado en cambios de conductancia.
B.( 5tros mtodos mas sofisticados que incluyen al sistema >hem)can +!=, )istema ! >ount (se basa en una
combinacin de marcaje celular, e%itacin laser y procesamiento digital.
)istemas de =dentificacin 4icrobiana "%isten muchos mtodos, algunos de ellos son&
2.( Los sistemas de identificacin api comprende celdillas con '9 pruebas bioqumicas en miniatura. )istema 4irobac,
tambin consiste de plaquitas con 27 pruebas bioqumicas.
'.( "l sistema de identificacin 4icro(=!. Principio& "stos sistemas incluyen 23 celdillas con discos de papel filtro
impregnados con reactivos para detectar la presencia especfica de en,imas o productos metablicos.
*.( )istema >oli/raN da un resultado presuntivo de cuentas de coliformes, reempla,ando al @4P y especialmente
aplicado a ensayos de aguas.
-.( )istema <iteN autom$tico que iidentifica en ' a '- h y reali,a tambin confirmacin de Patgenos. Los equipos son
e%pandibles con *', 79, 2'9, '-9 -B9 e%$menes y adem$s reali,a el antibiograma.
3.( "l sistema P0)>5 es semejante al sistema <iteN.
7.( "l sistema 1iolog es capa, de identificar encima de 2-99 especies de bacterias aerobias, anaerobias, hongos
filamentosos y levaduras.
)istemas de =dentificacin mediante 4todos 4oleculares. Los que son m$s comunes y actualmente est$n en el
mercado incluyen,
2.( Los sistemas 10LR utili,an el poder del P>+ para lograr resultados r$pidos y confiables. >ada prueba esta
dise.ada para amplificar un segmento de !@0
especfico de cada organismo, produciendo en pocas horas niveles tales para ser detectados.
'.( Los sistemas 10L simplifican el P>+ ya que incluyen todos los primers requeridos, polimerasa y nucletidos en
una pastilla #nica, empaquetada dentro del tubo de muestra, evitando errores de manipulacin
*.( /he +iboPrinterR 4icrobial >haracteri,ation )ystem. "ste sistema detecta m#ltiples copias del gen +@0r 27 s
logrando la identificacin de cualquier bacteria en menos de B horas.
-.( "l sistema !0+0) es un equipo robtico totalmente automati,ado, el cual combinado con las columnas !0+0)
componen todos los pasos asociados con los an$lisis rutinarios de 1iologa 4olecular.
4todos inmunolgicos para deteccin y?o cuantificacin de microorganismos. "stos mtodos est$n sumamente
difundidos. 0lgunos de los ensayos ofrecidos actualmente incluyen&
2.( <=!0)R y mini <=!0). "mplea la tecnologa "LE0 ("n,yme LinNed Eluorescent 0ssay que utili,a el principio de
determinacin que asocia el marcaje por una en,ima y una medida por fluorescencia.
'.( )istemas <=P. "s un ensayo de inmuno(precipitacin, f$cilmente leble y de alta reproducibilidad.
*.()istemas "=0 (=nmunoensayo Policlonal. )on sistemas que se corren en microplacas. 8ay para la deteccin de
diferentes patgenos& 0ssurace Salmonella "=0, 0ssurace Hold Salmonella "=0, "8"> "=0, Listeria "=0 y
Campylobacter "=0.
-.( )istema "S >oli/4, +apid !etection )ystem. "ste sistema es utili,ado para cultivar y presumiblemente identificar
a "8">.
3.( )istemas /eN. "nsayos de tipo "L=)0 para detectar patgenos a partir de muestras de alimentos.
7.( )istemas +eveal. "stos sistemas combinan "lisa tipo sandMich con el poder de la cromatografa para dar
resultados r$pidos y confiables
D.( )istemas /ecra. Atili,a un ThisopoT recubierto con anticuerpos que captura a los microorganismos. /oda la
reaccin toma lugar en los contenedores del mdulo. Los resultados se indican visiblemente.
B.( Salmonella =mmunocapture. "ste sistema provee resultados mas r$pidos que los mtodos tradicionales y se utili,a
junto con /">+0 =nmunoensayo <isual (<=0.