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IMPACTO DE LAS FUENTES DE CARBONO Y LAS

CONDICIONES VARIABLES DE NITROGENO EN LA
BIOSINTESIS BACTERIANA DE POLIHIDROXIALCANOATOS
A PARTIR DE AGUAS DEL RIO PASTO


Burbano Paola
1
, Mera Felipe
1
, Riascos Edison
1
, Rosales Esteban
1
, Villaquiran Zulma
1
., Revelo Romo Dolly
2
.


1. Estudiantes facultad de Ingeniería Agroindustrial – Universidad de Nariño
2. Docente guía en este trabajo, profesora del departamento de Biología de la Universidad de Nariño

RESUMEN

Palabras Clave:

INTRODUCCIÓN
El uso de polímeros convencionales derivados del
petróleo origina enormes problemas de
contaminación ambiental, debido a que no son
materiales biodegradables, perduran en los rellenos
sanitarios como contaminantes durante largos
períodos de tiempo, bloqueando la circulación de
gases y líquidos e impidiendo la estabilización de la
materia orgánica. Dado que cualquier sustancia de
origen biológico puede ser degradada por
microorganismos presentes en el ambiente, el
reemplazo de dichos materiales por polímeros
biodegradables podría resolver los problemas de
contaminación mencionados.

Entre estos biopolímeros, la familia de
Polihidroxialcanoatos (PHAs) son los únicos
completamente sintetizados de forma biológica,
presentan altas tasas de biodegradabilidad, son
biocompatibles y tienen propiedades físico-
mecánicas comparables a las de los plásticos
convencionales producidos a partir de petroquímicos
(Chen, 2010), presentándose como los candidatos
ideales para reemplazar los polímeros sintéticos
(Barbosa at al, 2005).

Los PHAs son polímeros de ácidos R-
hidroxialcanóicos, son termoplásticos elastoméricos
(Sudesh et al., 2000), que son sintetizados por un
gran número de bacterias Gram positivas y Gram
negativas como material de almacenamiento de
energía y carbono intracelular. En muchos casos son
acumulados bajo condiciones de estrés como
limitación de nitrógeno, fósforo u oxígeno con
exceso de fuente de carbono.

Existen como inclusiones que son típicamente de 0,2
a 0,5 µm de diámetro localizadas en el citoplasma y
pueden visualizarse con un microscopio de contraste
de fases debido a su alta refractividad o pueden ser
teñidas con negro de sudan (Khanna & Srivastava,
2005). Estructuralmente estos polímeros son
clasificados de acuerdo al número de átomos de
carbono en un rango de 3 a 14 y el tipo de unidades
monoméricas, produciendo homopolímeros o
heteropolímeros (Keshavarz & Roy, 2010). PHAs
con 3-5 átomos de carbono se considera un PHA de
cadena corta (PHASCL) y con 6 a 14 átomos de
carbono son llamados PHAs de cadena media
(PHAMCL) (Keshavarz & Roy, 2010;
Suriyamongkol et al., 2007; Ojumu et al., 2004).

Un número apreciable de PHAs con más de 150
monómeros ha sido identificado con masas
moleculares en el rango de 50.000 a 1’000.000 Da.,
por eso los PHAs y sus tecnologías asociadas forman
una cadena de valor industrial desde procesos de
fermentación, materiales, alimentos y energía hasta
los campos de la medicina debido a que estos son
biodegradables e inmunológicamente inertes
(Keshavarz & Roy, 2010).

La elección del microorganismo para la producción
industrial del biopolímero varía dependiendo de
factores como la habilidad celular para utilizar
fuentes de carbono no costosas, la velocidad de
crecimiento, la velocidad de síntesis del
biopolímero, la calidad y cantidad de PHA y el costo
de los procesos de recuperación (Lee & Choi, 2001).
A nivel industrial se emplean cepas como la
Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Azotobacter
vinelandii, Pseudomonas oleovorans, Paracccus
denitrificans, Protomonas extorquens y E. coli
recombinante (Lee, 1996).

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras fueron recolectadas de aguas
contaminadas del rio Pasto, en el sector del puente
del polvorín (Barrio Pandiaco) se tomó una muestra
inicial de 500 ml en una botella de agua higienizada,
la cual se llevó de inmediato al laboratorio; se
procedió a tomar 1 ml de la muestra adicionándola a
10 ml de solución salina. Luego por el método de
dilución seriada se realiza la disolución en tubos de
ensayo con la misma cantidad de solución salina,
llegando a una dilución final de 10
-6
.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
La preparación del medio de cultivo se realizó en
dos fases, en la primera de ellas se empleó un medio
de cultivo con glucosa como fuente de carbono y
(NH)
2
SO
4
como fuente de nitrógeno, al medio de
cultivo con fuente de carbono y nitrógeno se lo
denominó Medio Mineral (MM) y al medio de
cultivo con fuente de carbono pero sin fuente de
nitrógeno se le denomino (MM-N); para evaluar el
crecimiento de la bacteria en condiciones
desbalanceadas se empleó el mismo medio
exceptuando la fuente de nitrógeno. Para la segunda
fase se empleó el medio empleado en la primera fase
variando las fuentes de carbono (Glucosa, Lactosa,
Glicerol, Ácido Cítrico), además se omitió la fuente
de nitrógeno. La composición detallada del medio
fue tomada de Shahid y colaboradores (2013), y se
presenta a continuación:

Tabla 1. Composición de macronutrientes en un
medio de cultivo (MM) para la obtención de PHA’s
COMPUESTO CANTIDAD UNIDADES
KH
2
PO
4
3.6 g/L
Na
2
HPO
4
12H
2
O 14.4 g/L
MgSO
4
7H
2
O 0.5 g/L
NaCl 0.015 g/L
CaCl
2
2H
2
O 0.05 g/L
FeSO
4
7H
2
O 0.009 g/L
(NH)
2
SO
4
3 g/L
Fuente de Carbono 5 g/L

Para los elementos traza se tomó 1 g/L de la
solución, la composición es la siguiente:
Tabla 2. Composición de micronutrientes en un
medio de cultivo (MM) para la obtención de PHA’s
COMPUESTO CANTIDAD UNIDADES
MnSO
4
H
2
O 1 g/L
CoCl
2
6H
2
O 0.5 g/L
CuCl
2
2H
2
O 0.2 g/L
ZnCl
2
0.1 g/L
Na
2
MoO
4
2H
2
O 40 mg/L
H
3
BO
3
0.5 g/L
NiCl
2
50 mg/L

El pH se ajustó a 7.4.
SELECCIÓN DE CULTIVO CON MEJOR
CRECIMIENTO
Para la determinación del mejor crecimiento, se
tomó 8 aislamientos de diferentes cultivos los cuales
se conservaron a temperaturas de refrigeración,
teniendo en cuentas las reglas de asepsia se tomó una
colonia de cada aislamiento (71, 71*, 72, 74, 74*,
75. 75*,76) en donde el símbolo * indica que para
esos aislamientos existía una réplica, se cultivaron
los aislamientos en MM (medio mineral) adaptado a
este trabajo de acuerdo a lo reportado anteriormente
por Shahid y colaboradores (2013). La siembra se
llevó a cabo por el método de siembra por
agotamiento en cajas Petri, cada cultivo se dejó a
temperatura ambiente durante 48 horas sin agitación,
paso continuo se seleccionaron los 4 cultivos que
evidenciaron un mejor crecimiento, para comprobar
la pureza de los cultivos se realizó tinción de Gram
tomando una colonia de los cultivos anteriores. La
tinción revelo que los nuevos cultivos se
encontraban en un estado puro y que poseían forma
de bacilos.
Teniendo en cuenta los cultivos seleccionados, se
cultivaron colonias en MM-N (Medio mineral sin
nitrógeno) en las mismas condiciones trabajadas
anteriormente. Después de 48 horas se determinó
que el mejor crecimiento evidenciado en la
adaptación al medio desbalanceado se presentó para
el cultivo del aislamiento 75, manteniéndose el
aislamiento a refrigeración a temperatura de 4ºC.
PREPARACIÓN DEL INOCULO Y EL
REACTOR
Tomando la preparación del medio desbalanceado se
cambió la fuente de carbono original y se preparó 4
medios de cultivo con diferentes fuentes de carbono
(glucosa, lactosa, glicerol, ácido cítrico). Se tomó un
tubo ensayo de 10 ml y se añadió 9 ml del medio
preparado con cada fuente de carbono, cultivando
una colonia del medio seleccionado en cada uno,
dejando durante 5 días a temperatura ambiente, sin
agitación.
Transcurrido el tiempo de crecimiento se preparó los
reactores donde se añadió el inoculo a 90 ml MM-N
en un Erlenmeyer de 250 ml, sin agitación, sin
aireación, empleando un sistema de cultivo batch.
OBTENCIÓN DE BIOMASA (MÉTODO
GRAVIMÉTRICO)
Para la determinación del cambio de biomasa, se
tomó 1 ml de muestra de cada reactor y de depósito
en un tubo eppendorf, tomando el peso inicial, a las
48 horas se tomó la muestra del peso final. Para
conocer el cambio de biomasa cuantitativo se
empleó el método gravimétrico donde se sometió
cada muestra a un proceso de separación mecánica
(centrifugación) en una centrifuga Marca de
centrifuga a 8000 rpm durante 15 min, se descartó
el sobrenadante y se secó hasta peso constante en
una mufla a 60ºC durante 2 horas, al final se pesó
cada eppendorf en una balanza analítica marca
Denver Instrument. APX-200 Max
OBTENCIÓN DEL PHA
Para conocer la cantidad de polihidroxialcanoato
producida se realizó un proceso de separación
mediante centrifugación con una posterior
extracción, en donde se tomó una muestra 20 ml de
cada reactor en un falcón de 50 ml, se realizó la
separación del material en una centrifuga *marca a
7800 rpm durante 20 min, descartando el
sobrenadante de cada falcón, posteriormente se
añadió 2ml de NaClO al 5% y EDTA 10 mM , se
colocó todas las muestras a 60ºC durante 30 minutos
en baño maría y se centrifugo a 7800 rpm durante 5
minutos, descartando el sobrenadante, nuevamente
se añadió 2 ml de agua destilada y se llevó la
muestra centrifugación en las mismas condiciones,
se descartó el sobrenadante y añadió 2 ml de
acetona, se procedió a centrifugar en las mismas
condiciones por último se descartó el sobrenadante y
se pesó el falcón con en una balanza analítica
Denver Instrument. APX-200 Max.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN


Tabla 1. Datos para la determinación de Biomasa por
el método gravimétrico

FUENTE DE
CARBONO
PESO
INICIAL (g)
PESO
FINAL (g)
DIFERENCIA
(g)
Lactosa 0,919 1,024 0,105
Glucosa 0,8975 1,0951 0,1976
Ác. Cítrico 0,945 1,107 0,162
Glicerol 1,0204 1,0997 0,0793

Después de realizados los procedimientos de
extracción mencionados anteriormente se encontró
que la única fuente de carbono sobre la cual se
evidencio precipitado que podría atribuirse a la
formación de PHA’s es la Glucosa, para la cual se
determinó la producción a partir de una muestra de
20 ml del medio de cultivo (reactor).


Tabla 2. Datos para la determinación de la
producción de PHA’s en Glucosa como fuente de
Carbono

GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO
PESO
INICIAL
(g)
PESO
FINAL (g)
DIFERENCIA
(g)
PRODUCCIÓN
PHA (g/L)
13,321 13,3526 0,0316 1,58





REFERENCIAS

Barbosa M, Espinosa A, Malagón D, Moreno N.
(2005). Producción de poli-B BB BB-hidroxibutirato
(PHB) por Ralstonia eutropha ATCC 17697.
Universitas Scientiarum, 45-54.

Chen G. (2010). Plastics from Bacteria Natural
Functions and Applications. Berlin: Springer.

Keshavarz, T, Roy, I. (2010).
Polyhydroxyalkanoates: bioplastics with a green
agenda. Current Opinion in Microbiology. 21–326.

Khanna S, Srivastava A. (2005). Recent advances in
microbial polyhidroxyalkanoates. Process
Biochemistry. 607-619.

Lee S. (1996). Plastic bacteria? Progress and
prospects for polyhydroxyalkanoate production in
bacteria. Trends Biotechnol, 14: 431-438.

Lee S, Choi J. (2001). Production of microbial
polyester by fermentation of recombinant
microorganisms. T. Scheper. Advances in
biochemical engineering/biotechnology. 71: 183-
207.

Ojumu T, Yu J, Solomon B. (2004). Minireview
Production of Polyhydroxyalkanoates, a bacterial
biodegradable polymer. African Journal of
Biotechnology. 18- 24.

Shahid S, Mosrati R, Dedauphin J, Amiel C,
Fontaine P, Gillard J, Corroler D. 2013. Impact of
carbon source and variable nitrogen conditions on
bacterial biosynthesis of polyhydroxyalkanoates:
Evidence of an atypical metabolism in Bacillus
megaterium DSM 509. Journal of Bioscience and
Bioengineering. 16: 302- 308.

Sudesh K, Abe H, Doi Y. (2000). Synthesis,
structure and properties of polyhydroxyalkanoates:
biological polyesters. Progress in Polymer Science.
1503- 1555.

Suriyamongkol P, Weselake R, Narine S, Moloney
M. Shah, S. (2007). Biotechnological approaches for
the production of polyhydroxyalkanoates in
microorganisms and plants — A review.
Biotechnology Advances. 148-175.