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PRCTICA N 8: SEPARACIN DE PIGMENTOS VEGETALES POR COLUMNA

CROMATOGRAFICA EN COLUMNA.

1. INTRODUCCIN.
La cromatografa es una tcnica de separacin que se subdivide en muchos tipos
atendiendo a la instrumentacin utilizada, pero cuyo principio es el mismo. Se logra la
separacin de los componentes de una mezcla hacindola pasar a travs de un medio
adsorbente (adhesin a una superficie) denominada fase estacionaria; y arrastrada por
medio de un disolvente (eluyente) que lo arrastre a travs de sta. Los componentes se
separarn de acuerdo a su grado de afinidad por una fase u otra.

2. OBJETIVOS.
En esta prctica el alumno se familiarizar con las tcnicas ms comunes
que existen para preparar una columna cromatogrfica, la tcnica de elusin y
recoleccin de fracciones.
Al realizar el alumno esta tcnica obtendr destreza en separar
componentes de una muestra vegetal.

3. FUNDAMENTO.
La cromatografa en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se
llena con un soporte slido adsorbente (fase estacionaria: los ms utilizados son
gel de slice (SiO2) y almina (Al2O3)). La muestra que se quiere separar se
deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con
el eluyente (disolvente que constituye la fase mvil) que, por efecto de la
gravedad, hace mover la muestra a travs de la columna. Se establece un
equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente
que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una
mezcla establecer interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil,
sern transportados a diferentes velocidades y se conseguir su separacin. As,
de manera similar a otros tipos de cromatografa, las diferencias en las
velocidades de desplazamiento a travs del medio slido se corresponden con
diferencias en los tiempos de elucin por la parte inferior de la columna para cada
uno de los componentes de la muestra original, que se recogern en fracciones
diferentes.
La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los
diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes
polares compiten ms eficientemente con las molculas polares de una mezcla
por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazar
las molculas, incluyendo las ms polares, rpidamente a travs de la columna. Si
el disolvente es muy polar la elucin ser muy rpida y generalmente habr poca
separacin de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es
muy apolar, no eluirn los compuestos de la columna. Por lo tanto, la eleccin del
eluyente es crucial para el xito de la cromatografa en columna. A menudo se
utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elucin. La CCF se utiliza para
determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separacin.
En 1978 se introdujo una versin modificada denominada cromatografa en
columna rpida. La diferencia con la cromatografa en columna tradicional es que
en la tcnica rpida el disolvente se hace atravesar la fase estacionaria aplicando
una presin positiva. Esto hace que las separaciones mejoren en resolucin y se
pueda disminuir el tiempo de elucin, por lo cual constituye un mtodo de eleccin.
Anlisis de los eluatos de la columna
Si los compuestos separados en una cromatografa en columna son
coloreados, el progreso de la separacin se puede monitorizar visualmente. No
obstante, a menudo los compuestos que deben ser aislados suelen ser incoloros.
En este caso, se recogen secuencialmente pequeas fracciones de eluatos en
tubos rotulados y la composicin de cada fraccin se analiza por cromatografa en
capa fina. Una vez identificadas las diferentes fracciones que contienen el mismo
producto, se renen, se elimina el disolvente y se analiza la identidad de los
componentes por mtodos espectroscpicos




4. PROCEDIMIENTO.

a) EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS.


MATERIAL VEGETAL
Espinacas u otro de inters para el alumno.
EQUIPO Y MATERIALES.
Bomba de aire.
Mortero con pistilo.
Matraz Erlenmeyer.
Columna cromatogrfica.
Soporte universal con pinza.
Algodn.
Pipeta de 5 ml.
REACTIVOS.
Slica gel 60 GF (0.063-0.200 mm).
Carbonato de Calcio (CaCO
3
).
Azcar glass.
ter de petrleo (destilado).
Tetracloruro de carbono (destilado).
Metanol (destilado).

b) DESARROLLO DE LA PRCTICA.

Machaque 15 gr de espinacas y otro material, en un mortero
PREPARACIN DE LA COLUMNA.
1. Coloque un pedazo de algodn en la punta de una columna cromatografa,
cuide que el algodn no quede muy comprimido.
2. Agregue a la columna de 15 a 20grs. De silica gel 60 (0.063- 0.200 mm),
golpe suavemente la columna para que quede bien empacada, evite la
formacin de grietas o burbujas de aire.
3. Agregue 5 gr. De carbonato de calcio finamente molido tomando las
precauciones anteriores.
4. Agregue 5 gr. De azcar glass, bien molido y coloque un pedazo de
algodn sobre esta ltima capa.
5. Monte la columna obre un soporte universal.
ELUCIN DE LA COLUMNA.
1. Abra la llave de la columna y coloque debajo un matraz.
2. Con una pipeta coloque en la parte superior de la columna 5 ml del extracto
vegetal.
3. Cuando el nivel del extracto casi coincida con el nivel del absorbente,
agregue unos mililitros de una mezcla de tetracloruro de carbono y metanol
(8:2).
4. Prepare 500 ml de la mezcla de disolvente (CCL4, CH3,OH).
5. Cuando el nivel baje nuevamente, contine agregando la mezcla anterior.
6. Recolecte las fracciones en matraces, cambiando el matraz cada vez que
aparezca un color.
7. Identifique la fraccin ms verde como clorofila y a las otras fracciones
identifquelas con las pruebas para carotenos y xantofilas vistas en la
prctica nmero 1.
8. Para hacer ms rpida la separacin aplique aire al sistema.

5.- CONCLUSIN
Si los compuestos separados en una cromatografa en columna son coloreados, el
progreso de la separacin se puede monitorizar visualmente. No obstante, a
menudo los compuestos que deben ser aislados suelen ser incoloros.















UNIVERSIDAD AUTONOMA BENITO

JUREZ DE OAXACA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS




TRABAJO FINAL DE INVESTIGACIN:
CESTRUM NOCTURNUM L





CATEDRATICO:

M.C. ELIZABHET ESCOBAR


INTEGRANTES DEL EQUIPO:

LPEZ JUREZ KARIME ESTEFANIA
MORALES PREZ TIARE YEDID
RINCN SERRANO DIANA
TERN SANTIAGO TANIA ANGLICA







SEMESTRE: 7 A