El rol de Phe82 y phe351 en la percepcin de sustrato de auxinas

inducidas por TIR1 ligasa de ubiquitina: Una Novela de Visin a

partir de Simulaciones de Dinmica Molecular
Resumen
Es bien conocido que las auxinas juegan un papel clave en el control de muchos aspectos
del crecimiento y desarrollo de las plantas. Estructuras cristalinas de inibhidores de
transporte de respuesta 1 (TIR1), un verdadero receptor de auxinas, se determinaron
hace muy poco para TIR1 s sola y en complejos con auxina y diferentes anlogos
sintticos y un cido indolactico (Aux/IAA) pptido sustrato. Sin embargo, los dinmicos
cambios conformacionales de los residuos clave de TIR1 que tienen lugar durante la
auxina y la percepcin del sustrato por una TIR1 y el mecanismo de detalle de estos
cambios an no estn claros. En el presente estudio, diversas tcnicas computacionales
se integraron para descubrir el mecanismo molecular detallado del proceso percepcin de
auxinas y Aux/IAA; estas simulaciones incluyen simulaciones de dinmica molecular (MD)
en complejos y en la enzima libre, los mecanismos moleculares de los clculos de
superficie molecular Poisson Boltzmann (MM-PBSA), anlisis de modo normal, y clculos
de la energa de enlaces de hidrgeno (HBE). Los resultados de la simulacin
computacional proporcionan una explicacin razonable para las relaciones entre
estructura y actividad de las auxinas y sus anlogos sintticos en vista de la energa.
Adems, tambin se propuso un modelo ms detallado para la percepcin de auxina y
Aux/IAA, lo que indica que phe82 y phe351 desempearon un papel fundamental en la
percepcin de Aux/IAA. A cerca de la unin de auxinas, phe82 sufri cambios
conformacionales para acomodar la posterior unin de Aux/IAA. Como resultado, la
auxina mejora las interacciones TIR1-Aux/IAA actuando como un pegamento molecular.
Adems, phe351 acta como un elemento de sujecin para mejorar an ms la unin del
sustrato. Las ideas estructurales y mecnicas obtenidas de este estudio proporcionarn
pistas valiosas para el diseo de anlogos prometedores.

Introduccin
Como una hormona de la planta central, las auxinas controlan muchos aspectos del
crecimiento y desarrollo de plantas [1-7] por modular la expresin gnica y, por lo tanto, lo
que lleva a los cambios en la divisin celular, la expansin y diferenciacin [8,9]. El cido
indolactico (IAA) es la principal auxina natural. Adems, varias auxinas sintticas
tambin se han desarrollado, incluyendo cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D), cido 1-
naftalenactico (1-NAA), cido 2-metoxi-3,6-diclorobenzoico (dicamba), cido 4-amino-
3,5,6-tricloropicolnico (tordon o picloram), -(p-clorofenoxi) isobutiril (PCIB, una anti
auxina), etctera [10]. Estas molculas qumicamente diversas comparten dos
caractersticas en comn: un anillo aromtico plano y una cadena lateral con un grupo
carboxilo. Aunque la auxina es conocida como uno de los ms importantes mensajeros
de sealizacin en el reino vegetal, el detallado mecanismo de accin de la auxina con
su receptor sigue siendo una de las preguntas ms interesantes en la biologa de las
plantas.
La protena de unin a la auxina 1 (ABP1), es la primera protena que se piensa sea un
posible receptor de auxinas. Un mecanismo fisiolgico potencial auxina-ABP1-para
cambios inducidos de la membrana plasmtica se ha encontrado recientemente por un
estudio del modelo molecular. Pero el papel fisiolgico detallado de esta protena en
regulacin de la seal de auxina mediada no se ha encontrado [12,18]. Adems, algunos
aspectos de la transcripcin auxina-regulacin son bien entendidos [19,20]. Por ejemplo,
dos familias de protenas del factor de transcripcin se han identificado en la respuesta de
transcripcin: los factores de respuesta de auxinas (ARFs) y el cido indolactico
(Aux/IAA) represor de protenas transcripcionales [21-26]. Recientemente los inhibidores
del transporte de respuesta (TIR1), la F-box subunidad de la protena (SCFTIR1), fue
identificado como un receptor verdadero de auxinas. Tambin se revel que la auxina se
une directamente a TIR1 y aumenta la unin entre Aux/IAA y TIR1 [27,28]. Lo ms
importante, una serie de estructuras cristalogrficas de TIR1, auxina, y complejo de
Aux/IAA fueron reportadas recientemente, que revel que la auxina, que acta como
"pegamento molecular", aumenta las interacciones de TIR1-Aux/IAA rellenando una
cavidad hidrfoba en la interfase entre TIR1 y Aux/IAA [26,29,30].
Actualmente, el anlisis estructural de TIR1 en complejo con auxina y las protenas
Aux/IAA descubrieron el papel fundamental de la auxina en la degradacin de protenas
Aux/IAA que en realidad activaron el ADN ARF inducido en la transcripcin [14,31-34].
Por lo tanto, el primer modelo estructural de un receptor de hormona de la planta ya se ha
propuesto. Sin embargo, el mecanismo detallado de los cambios conformacionales
dinmicos que los residuos clave de TIR1 que se someten durante la auxina y percepcin
del sustrato por TIR1 es an desconocido.
En el presente estudio, diversas tcnicas computacionales, incluyendo la dinmica
molecular (MD) simulaciones de complejos y la enzima libre, la mecnica molecular
Poisson Boltzmann rea (MM-PBSA) clculos de superficie, anlisis de modo normal
(NMA), y clculos de la energa de enlace de hidrgeno (HBE) fueron integrados para
descubrir el mecanismo molecular detallado del proceso de percepcin de Aux/IAA.
Las estructuras cristalinas de TIR1 en complejo con IAA; 2,4-D y 1-NAA fueron utilizados
como las estructuras iniciales para las simulaciones MD que se llevaron a cabo para
investigar la estabilidad de la conformacin de protenas, especialmente, la flexibilidad
conformacional del bucle 2 de TIR1 y su relacin con la vinculante. Adems, una
explicacin razonable para la relacin estructura-actividad de auxina y sus anlogos
fueron provistos por los resultados de los clculos NMA MM-PBSA. Con base en los
resultados de la simulacin computacional y clculo de la energa, se propuso un modelo
de percepcin detallado de Aux/IAA, que explica las principales funciones de co-factor
inositol hexakisfosfato (InsP6) y residuos de Phe82 y Phe351.

Metodologa
Preparacin del sistema
Las estructuras iniciales de IAA; 2,4-D, y 1-NAA-TIR1 complejos utilizados en nuestros
estudios computacionales vinieron de las estructuras cristalinas de Rayos X (AP entrada:
2P1Q, 2P1N, y 2P1O) en el Banco de Datos de Protenas [30]. Una molcula de agua de
cristalizacin implic un puente de agua entre los residuos y ligandos se retuvo para cada
sistema, y se eliminaron otras molculas de agua de cristalizacin. El campo de fuerza
estndar Amber ff99 fue asignado a la protena, y el campo de fuerza AMBER general
(arpn) fue asignado a los ligandos, incluyendo al co-factor InsP6 [35-37]. Las cargas
atmicas parciales de ligandos se calcularon utilizando el mtodo AM1-BCC
implementado en el mdulo antecmara del paquete Amber8 [38]. Estados de protonacin
por defecto se establecen en los residuos ionizables a pH = 7. Teniendo en cuenta la
neutralidad elctrica global del sistema, se aade un nmero apropiado de iones de Na +
a las reas ms electronegativas alrededor de la protena. Entonces, cada sistema se ha
incrustado en el cuadro de octaedro truncado de las molculas de agua TIP3P con un 8.0
Un tampn a lo largo de cada dimensin [39], lo que resulta en un sistema con, 88.000
tomos. Para evitar los efectos de borde, se aplicaron las condiciones de contorno
peridicas en todos los clculos.
Para cada sistema, minimizacin de energa y simulaciones MD se realizaron utilizando el
mdulo Sander del programa Amber8. En primer lugar, el complejo se congel y se
permiti que las molculas de disolvente y contraiones se les permit moverse durante
una minimizacin 5000-paso (2000 pasos del descenso ms agudo y 3.000 pasos de la
minimizacin de gradiente conjugado). Entonces, todos los tomos eran energa
minimizada con 10.000 pasos (5000 pasos de la mxima pendiente y 5.000 pasos de la
minimizacin de gradiente conjugado). Despus de la etapa de reduccin al mnimo, el
sistema se calent lentamente a partir de T = 10 a 300 K en 40 ps y equilibrada en 160 ps
antes de un tiempo suficientemente largo en simulacin MD a temperatura ambiente. Por
ltimo nos encontramos las simulaciones MD de cada sistema a 1 atm y 300 K durante 2
ns o ms para asegurarse de que se obtuvo una trayectoria MD estable para cada una de
las estructuras simuladas. El paso de tiempo utilizado para las simulaciones MD se
establece en 2,0 fs y las coordenadas se recogieron cada 1 ps. En la simulacin, los
enlaces covalentes a los tomos de hidrgeno se vieron limitados utilizando el algoritmo
SHAKE [40]. El mtodo de partculas de Ewald Mesh (PME) se utiliz para calcular las
interacciones electrostticas de largo alcance [41,42]. Las distancias de corte para los
trminos de energa de van der Waals y electrostticas de largo alcance se fij en 10,0 A
.

Clculos de MM-PBSA
Los clculos de las energas de unin de cada sistema se basaron en fotografas tomadas
desde una nica trayectoria de la compleja simulacin de MD. Un total de 100
instantneas fueron tomadas de la ltima 0,5 ns trayectoria con un intervalo de 5 ps para
cada sistema. Los contra-iones y molculas de agua (aguas relacionadas con el enlace de
hidrgeno crucial no fueron incluidos) fueron despojados. Se utiliz el enfoque de MM-
PBSA implementado en el programa Amber8 para calcular las energas libres de unin
relativas de ligandos a la protena TIR1. La descripcin detallada de este mtodo se
puede encontrar en otros lugares [43]. Generalmente, la protena-ligando energa libre de
unin se calcul utilizando las siguientes ecuaciones:
Figura 2. Parcelas RMSD de los complejos durante MD simulaciones.
RMSD de la columna vertebral se calcul de acuerdo con las coordenadas de las
principales cadenas de tomos de Ca muestran en negro y el RMSD del ligando se
calcul de acuerdo con las coordenadas de todos los tomos del ligando se muestra en
rojo.
doi: 10.1371/journal.pone.0010742.g002