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Técnicas de ADN recombinante

Clonado de genes

Objetivo: Aislamiento y amplificación de un gen de interés para su posterior manipulación genética

Pasos:

  • 1. Aislamiento y fragmentación de la fuente de ADN: ADNg (genómico), ADNc (copia), producto de PCR.

  • 2. Inserción del fragmento de ADN en un vector de clonado.

  • 3. Introducción y amplificación del vector recombinante en un organismo huésped.

Enzimas de restricción (ER)

5’-GGATCC -3’ 5’-AGATCT-3’ 5’-GATC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 3’-TCTAGA-5’ 3’-CTAG-5’ Bam HI Bgl II Sau 3AI
5’-GGATCC -3’ 5’-AGATCT-3’ 5’-GATC-3’
3’-CCTAGG-5’ 3’-TCTAGA-5’ 3’-CTAG-5’
Bam HI
Bgl II
Sau 3AI

Dejan extremos compatibles

Enzimas de restricción (ER) 5’-GGATCC -3’ 5’-AGATCT-3’ 5’-GATC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 3’-TCTAGA-5’ 3’-CTAG-5’ Bam HI Bgl II Sau

Patrón de digestión del ADN con ER en gel de agarosa

Vectores para el clonado de genes

Componentes básicos de un vector de clonado plasmídico de E. coli

Vectores para el clonado de genes Componentes básicos de un vector de clonado plasmídico de E.

Estrategia de clonado en plásmido

Pasos:

  • 1. Construcción de vector recombinante.

  • 2. Transformación de células competentes.

  • 3. Plaqueo en medio selectivo con antibiótico (para seleccionar las bacterias que adquirieron el plásmido) + IPTG y X-Gal (para identificar las bacterias que tienen el plásmido con inserto)

Estrategia de clonado en plásmido Pasos: 1. Construcción de vector recombinante. 2. Transformación de células competentes.
Estrategia de clonado en plásmido Pasos: 1. Construcción de vector recombinante. 2. Transformación de células competentes.

4. Validación de la presencia de inserto mediante:

  • a. digestión de plásmidos de colonias + con

ER y análisis en gel de agarosa.

  • b. amplificación del inserto a partir de las

colonias (“colony PCR”) y gel.

Selección de recombinantes (screening azul-blanco): α-complementación

Selección de recombinantes ( screening azul-blanco): α -complementación

Otros Vectores de clonado

Otros Vectores de clonado Fagos filamentosos (M13) . Clonado en la forma replicativa (RF, doble c
Otros Vectores de clonado Fagos filamentosos (M13) . Clonado en la forma replicativa (RF, doble c

Fagos filamentosos (M13). Clonado en la forma replicativa (RF, doble cadena circular) de fagos filamentosos (M13).

Producen ADN simple cadena

Phagemids (pBs). Combina propiedades de plásmidos y fagos filamentosos. Posee ori de fago filamentoso (F1, M13) y ori de plásmido (pUC).

Producen ADN circular doble cadena o simple cadena.

Vector-T : Plásmido con extremos 5’- T simple cadena. Permite clonar productos de PCR que contienen

Vector-T: Plásmido con extremos 5’- T simple cadena.

Permite clonar productos de PCR que contienen A simple cadena en extremo -3’, sin previa digestión del vector con ER.

Vector mixto (shuttle vector) Se puede amplificar en dos organismos diferentes.

pMDS99. Posee un ori para replicación en bacterias (ori P15A) y otro para la replicación en haloarqueas (ori pHV2). Tiene dos marcadores de selección:

Kanamicina R para bacteria y Mevinolina R para haloarqueas.

Construcción y análisis de genotecas de ADN genómico

En bacteriófago λ Capacidad de clonado ~ 25 kbp

Bibliotecas de cósmidos

Digestión parcial del ADNg con ER de corte frecuente

(Sau3A)

Bibliotecas de cósmidos Digestión parcial del ADNg con ER de corte frecuente (Sau3A) Purificación de fragmentos

Purificación de fragmentos de ADNg del tamaño deseado

Análisis (screening) de genotecas

  • 1. Por hibridación con sondas específicas

  • 2. Con anticuerpos (inmunoscreening)

  • 3. Screening funcional. Ej. Detección de halos de proteólisis

  • 4. Transposon tagging. Generación de bacterias mutantes usando Tn, preparación de genoteca de la mutante y screening del gen mutado por hibridación usando como sonda secuencias del Tn. Usado para identificar genes relacionados con la virulencia en bacterias patógenas.

  • 5. Por complementación de una mutación.

 

Approximate maximum length of DNA that can be cloned into vectors

Vector type

Cloned DNA (kb)

Plasmid

20

lambda phage

25

Cosmid

45

P1 phage*

100

BAC (bacterial artificial chromosome)

300

YAC (yeast artificial chromosome

1000

Bacs y Yacs usados para construir genotecas apropiadas para la secuenciación de genomas completos de un microorganismo

Expresión heteróloga de proteínas recombinantes

El gen clonado se expresa en un tipo celular diferente al organismo de origen. Propósito: Obtener cantidad suficiente de la proteína de interés para su caracterización y/ o para su aplicación biotecnológica.

Elementos típicos de un vector de expresión

La secuencia nucleotídica del inserto se debe clonar “en fase” con el codón de inicio de la traducción (ATG) del vector.

Expresión en bacterias. (E. coli)

Ventajas:

  • - Fisiología y genética muy conocida

  • - Fácil manipulación en laboratorio

  • - Relativo bajo costo

Desventajas:

No produce muchas de las modificaciones post-traduccionales requeridas para la expresión de proteínas de eucariotas

- IPTG + IPTG
- IPTG
+ IPTG

Plásmido de expresión pET

Promotor T7 y operador lac (región reguladora) rbs: sitio de unión al ribosoma Sitios múltiples de clonado dentro del gen lacZ (NdeI contiene codón inicio traducción ATG) “His-tag”: cola de polih istidina + codón stop (TGA) Terminador transcripcional T7

Clonado y expresión del gen de una proteasa extracelular de arquea halófila (Nep) en dos sistemas heterólogos:

  • a. E coli (bacteria)

  • b. Haloferax volcanii (arquea halófila extrema)

Gen de interés: nep

Hfx. volcanii DS70

Clonado y expresión del gen de una proteasa extracelular de arquea halófila (Nep) en dos sistemas
pET-24b(+) nep::His6 Hind III
pET-24b(+)
nep::His6
Hind III

E. coli Rosetta (DE3)

Clonado y expresión del gen de una proteasa extracelular de arquea halófila (Nep) en dos sistemas
Nde I Nde I
Nde I
Nde I
pJAM nep::His6
pJAM
nep::His6

Bpu 1102 I

Bpu 1102 I

Clonado y expresión del gen de una proteasa extracelular de arquea halófila (Nep) en dos sistemas

Se analiza la expresión

de la proteína de interés

por SDS-PAGE y

determinación de

actividad proteasa

Análisis de colonias recombinantes

  • - PCR

  • - crecimiento en placas con caseína

  • - Actividad azocaseinolítica

Expresión de nep en E. coli

SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie de las proteínas celulares (C) y del medio de cultivo (M) de E. coli recombinante conteniendo el plásmido pET-nepHis6

Expresión de nep en E. coli SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassi e de las

La proteína recombinante se sintetizó eficientemente en E. coli pero no se secretó ni presentó actividad enzimática

Expresión del gen de la proteasa extracelular Nep de arquea halófila ( Natrialba magadii, Nm) en un sistema heterólogo haloarqueano (Haloferax volcanii, Hv)

Expresión del gen de la proteasa extracelular Nep de arquea halófila ( Natrialba magadii, Nm )

La proteína recombinante se sintetizó y secretó eficientemente en H.v. y presentó actividad enzimática

Manipulación de genes bacterianos

Técnicas de mutagénesis dirigida. Permite cambiar bases en la secuencia nt de un gen. Usos: determinar actividad biológica de proteínas con sustituciones de AA conocidas.

Manipulación de genes bacterianos Técnicas de mutagénesis dirigida. Permite cambiar bases en la secuencia nt de

Mediante PCR

Mutagénesis sitio dirigida usando un oligo sintético

Mutagénesis sitio dirigida usando un oligo sintético El inserto se clona en un vector que produzca

El inserto se clona en un vector que produzca copias simple cadena del inserto (fago M13) necesarias para usar como templado.

Mutagénesis sitio dirigida usando un oligo sintético El inserto se clona en un vector que produzca

Cassette mutagénesis y disrupción génica

Cassette: fragmento de ADN sintético, lleva gen resistencia a Ab. Se usan para reemplazar o interrumpir un gen y generar una mutación.

Disrupción génica por cassette mutagénesis

Se anula la función de un gen dado por mutagénesis por inserción. Genera mutación knockout (KO).

En procariotas (haploides) las células KO son viables sólo si el gen no es esencial.

El plásmido con el cassette se linealiza para impedir su replicación en la bacteria transformada, por la tanto, las células resistentes surgen por RH y poseen sólo una copia del gen (la mutante por inserción)