Desarrollo de un mtodo de HPLC para la determinacin de

aminocidos en vinagre y su validacin en muestras reales

Trabajo de investigacin presentado por

Raquel Callejn

Para optar al Diploma de Estudios Avanzados del Programa de Doctorado en Enologa




NDICE

1. INTRODUCCIN 1

1.1. EL VINAGRE 1
1.1.1. Tipos de vinagre 1
1.1.2. Historia 2
1.1.3. Las bacterias acticas 2
1.1.4. Mtodos de elaboracin de vinagre 6
1.1.4.1. Mtodos tradicionales de acetificacin con cultivo
superficial 6
1.1.4.2. Mtodos de acetificacin con cultivo sumergido 11

1.2. DETERMINACIN DE AMINOCIDOS EN PRODUCTOS
DERIVADOS DE LA UVA 13
1.2.1. Aplicaciones del anlisis de aminocidos en enologa 13
1.2.2. Mtodos de anlisis de aminocidos 16
1.2.3. Derivatizacin de aminocidos 19
1.2.4. Eleccin del mtodo ptimo 30

2. MATERIALES Y MTODOS 31

2.1. MATERIAL 31
2.1.1. Muestras 31
2.1.2. Reactivos 32
2.1.3. Instrumentacin 34
2.1.3.1. Cromatgrafo lquido de alta eficacia 34
2.1.3.2. Instrumentacin y material 34

2.2. MTODOS 35
2.2.1. Preparacin de las fases mviles 35
2.2.2. Condiciones cromatogrficas 35
2.2.3. Preparacin de patrones 36
2.2.4. Preparacin de muestras 38
2.2.5. Reaccin de derivatizacin 38
2.2.6. Identificacin 39
2.2.7. Cuantificacin 40
2.2.8. Lmites de deteccin y cuantificacin 41
2.2.9. Estudios de precisin 42
2.2.10. Estudios de recuperacin 43
2.2.11. Estudios de dilucin de las muestras 44

2.3. TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS RESULTADOS 44

3. RESULTADOS Y DISCUSIN 45

3.1. ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES
CROMATOGRFICAS 45

3.2. VALIDACIN DEL MTODO 46
3.2.1. Especificidad o selectividad 46
3.2.2. Linealidad 47
3.2.3. Exactitud 48
3.2.4. Lmites de deteccin y cuantificacin 51
3.2.5. Estudios de precisin 51

3.3. ELECCIN DE LA DILUCIN PTIMA DE LAS
MUESTRAS 53

3.4. APLICACIN DEL MTODO A MUESTRAS DE VINAGRE 54
3.4.1. Consumo de nitrgeno total 55
3.4.2. Evolucin en el perfil de aminocidos libres y amonio 57

4. CONCLUSIONES 62
5. BIBLIOGRAFA 64
6. ANEXO 71

Introduccin
1



1. INTRODUCCIN



1.1. EL VINAGRE

Segn la Reglamentacin Tcnico Sanitaria correspondiente (Presidencia del
Gobierno, 1993) con la denominacin genrica de vinagre se designa: el lquido apto
para el consumo humano resultante de la doble fermentacin, alcohlica y actica de
productos de origen agrario que contengan azcares o sustancias amilceas, con una
riqueza mnima de 50 g/L. Se entiende por grado de acidez de los vinagres su acidez
total expresada en gramos de cido actico por 100 mL, a 20C. El contenido permitido
por la norma para los vinagres, expresado en cido actico, no ser inferior a 50 g/L;
excepto para el vinagre de vino, que ser, al menos, de 60 g/L.



1.1.1. Tipos de vinagre

Cualquier sustrato azucarado o amilceo puede ser utilizado en la elaboracin de
vinagres. Asimismo los mtodos de elaboracin sern diferentes. Por tanto, los vinagres
se pueden clasificar en funcin del tipo de sustrato empleado o del mtodo usado en su
elaboracin.

Segn la materia prima originaria se establecen los siguientes tipos (Presidencia
del Gobierno, 1993):

- Vinagre de vino: Es el producto obtenido exclusivamente por
fermentacin actica de vino.
- Vinagre de frutas: Es el producto obtenido a partir de frutas o bayas.
- Vinagre de alcohol: Es el producto obtenido por la fermentacin actica
de alcohol destilado de origen agrario.
- Vinagre de cereales: Es el producto obtenido sin destilacin intermedia
por el procedimiento de doble fermentacin alcohlica y actica, de
cualquier cereal en grano, cuyo almidn se ha desdoblado en azcares
mediante un procedimiento distinto de la diastasa de la cebada malteada.
- Vinagre de malta: Es el producto obtenido sin destilacin intermedia por
el procedimiento de doble fermentacin alcohlica y actica a partir de la
cebada malteada, con o sin adicin de grano, cuyo almidn se ha
desdoblado en azcares mediante la diastasa de la cebada malteada.
- Vinagre de miel: Es el producto obtenido a partir de la miel.
- Vinagre de suero de leche: Es el producto obtenido a partir de suero de
leche.




Introduccin
2
1.1.2. Historia

El vinagre ha formado parte de la alimentacin humana desde la antigedad ms
remota como condimento y conservador de alimentos, as como base de remedios
sencillos para hombres y animales. La fermentacin alcohlica seguida de la actica se
produce espontneamente sobre cualquier sustrato azucarado expuesto al polvo y a los
insectos que transportan levaduras y bacterias. Duddington (1961) afirma que la
elaboracin de vino es un arte que data al menos de hace unos 10.000 aos, por lo que
podemos suponer la existencia del vinagre desde este tiempo. Las referencias ms
antiguas al uso del vinagre se hallan en la cultura babilnica (5000 a.C.) sobre la
obtencin de vinagre de dtiles.

En 1732, el holands Boerhaave hace notar que la llamada madre del vinagre
es un organismo vivo, aunque sin precisar su papel en la acetificacin. Lavoisier
demuestra que la acetificacin consiste en la oxidacin de etanol, pero sin sospechar la
existencia de bacterias acticas. Persono, (1822) describe las pelculas grasas que se
forman en la superficie del vino, la cerveza o el vinagre como sustancias de naturaleza
vegetal, y en la Micologa europea aade nuevas especies de Micoderma: ollare,
mesentericum, lagenoe y pergameneum. Tambin Chaptal haba observado que la
produccin de vinagre va bien cuando en la superficie del vino aparecen las llamadas
flores de vino, cuya aparicin anuncia y precede a la acetificacin, pero sobre esto
Berzelius adverta que en todas las materias orgnicas en descomposicin, expuestas al
aire aparece el mismo tipo de vegetacin. La acetificacin tambin llega a formar parte
de la controversia entre qumicos como Berzelius y Liebig quienes mantienen que el
proceso era puramente qumico (Berzelius 1829-1833) y aquellos que afirmaban que en
dicha transformacin intervena un ser organizado. En cuanto a la madre del
vinagre, Ktzing observ que la dbil pelcula que recubre la superficie del lquido
acidificado est formada por glbulos seis veces ms pequeos que los de las levaduras;
se trataba de bacterias acticas que fueron observadas al microscopio por primera vez
por Ktzing (1837) por lo que, en las primeras clasificaciones taxonmicas de estos
microorganismos, se denomin Acetobacter ktzingianum a una especie de ellos
(Llaguno, 1991).

Pasteur public en el ao 1864 una amplia memoria sobre la fermentacin
actica tudes sur le vinaigre, sa fabrication, ses maladies, mohines de les prvenir
que recoge la conferencia que pronunci en Orlens en 1867. Pasteur afirma que
siempre que el vino se transforma en vinagre, es debido a la accin de un velo de
Micoderma aceti desarrollado en su superficie.



1.1.3. Las bacterias acticas

Las bacterias acticas fueron observadas por primera vez al microscopio por
Ktzing en 1837. Estas bacterias constituyen un grupo ecolgico que comprende
bacterias gram-negativas (gram-positivas en cultivos viejos), aerobias estrictas y muy
sensibles al SO
2
. Son catalasa positiva y oxidasa negativa, pueden presentar
pigmentacin en cultivos slidos y producir diferentes tipos de polisacridos (De Ley et
al., 1984).

Introduccin
3
Al microscopio ptico las bacterias acticas se presentan como pequeas clulas
cilndricas, frecuentemente en parejas cocobacilares, cortas y algo gruesas, alineadas o
en cadenas, y a menudo agrupadas en forma de ocho. Constituyen un grupo de
morfologa variable, que se presentan en forma elipsoidal o de bastoncillos (Surez e
Iigo, 1990). Las bacterias acticas crecen en medios azucarados y alcoholizados,
ligeramente cidos como flores, frutas, cerveza, vino, sidra, vinagre, zumos de fruta
agrios y miel. En estos sustratos, las bacterias acticas oxidan los azcares y los
alcoholes, produciendo una acumulacin de cidos orgnicos como producto final.
Cuando el sustrato es etanol, producen cido actico, lo que ha originado el nombre que
reciben estas bacterias. La oxidacin del etanol tiene lugar en dos pasos. En el primero,
el etanol es oxidado a acetaldehdo y en el segundo el acetaldehdo es oxidado a acetato.
En ambas reacciones, los electrones son transferidos y el ltimo aceptor es el oxgeno
(Figura 1.1). Esta oxidacin de etanol a cido actico es la caracterstica mejor conocida
de la bacteria actica, pero estas bacterias tambin pueden oxidar glucosa a cido
glucnico, etc. Algunas de estas transformaciones resultan interesantes desde el punto
de vista de la biotecnologa. La aplicacin industrial mejor conocida de las bacterias
acticas es la produccin de vinagre pero tambin se usan para producir sorbosa,
sorbitol y celulosa.


















Figura 1.1. Proceso de oxidacin del etanol.



Las primeras clasificaciones de bacterias acticas se hicieron atendiendo
exclusivamente a criterios morfolgicos. Visser`t Hooft (1925) toma en consideracin
tambin su fisiologa, y ms tarde Asai (1968) clasifica las bacterias acticas segn su
capacidad para metabolizar la glucosa y el cido actico. Frateur (1950) propone un
sistema de clasificacin del gnero Acetobacter en cuatro grupos, basado en los
caracteres bioqumicos siguientes: produccin de catalasa, oxidacin de acetato y
lactato a carbonato, formacin de compuestos cetnicos, produccin de cido glucnico
y capacidad para crecer en un medio con alcohol y sales de amonio como nica fuente
de nitrgeno (medio de Hoyer). Propuso los siguientes grupos: Acetobacter peroxydans,
Acetobacter mesoxydans, Acetobacter oxydans y Acetobacter suboxydans. El nombre de
O2
Etanol
Acetaldehdo
2H NAD
+

2H
Acetato
CAT
Cit Cit
CR
1/2 O2
CO2
H2 O
CAT: ciclo de los cidos
tricarboxlicos
CR: cadena respiratoria
Introduccin
4
cada grupo alude fundamentalmente a su capacidad para oxidar el etanol a cido
actico.

Durante largo tiempo se acept que las bacterias acticas mviles, pertenecientes
al gnero Acetobacter, tenan flagelos polares monotricos, y dicho gnero estaba
incluido por lo tanto en la familia Pseudomonodaceae. Sin embargo, Leifson (1954)
descubri que 30 cepas de Acetobacter no mostraban este tipo de flagelos, poniendo de
manifiesto otro tipo de disposicin de flagelos: flagelacin pertrica. Propuso entonces
separar Acetobacter en dos gneros: Acetobacter y Acetomonas gnero nov., incluyendo
en este ltimo las especies con flagelos polares multitricos y las no flageladas, todas
incapaces de oxidar el acetato y el lactato a CO
2
y H
2
O.

Segn la clasificacin recogida en el manual de Bergey, en su 8 edicin (1974),
las bacterias acticas pertenecen al orden Pseudomonodales, familia
Pseudomonodaceae, incluyendo en esta ltima dos gneros distintos al gnero
Pseudomonas (sobre todo por su capacidad de crecimiento a pH inferior a 4.5): el
gnero Gluconobacter y el gnero Acetobacter, que incluye a su vez tres especies
importantes: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus y Acetobacter peroxydans. El
gnero Acetobacter puede variar en su forma de elipsoide a barra derecha, o ligeramente
curva, 0.6-0.8 m x

1.0-1.4 m. Se encuentran no agrupadas, en pares o formando
cadenas. Las clulas pueden ser mviles o no. Si son mviles, los flagelos son peritricos
o laterales, oxida acetato y lactato a CO
2
y H
2
O. El pH ptimo para el crecimiento es de
5.4-6.3 (De Ley et al., 1984). Sin embargo, estas bacterias pueden crecer a pH bajos,
entre 3-4. El gnero Gluconobacter es capaz de producir grandes cantidades de cido
glucnico a partir de glucosa, tiene incapacidad de formar pelculas en medios lquidos
y pobre crecimiento en sustratos que contienen etanol. Adems, es incapaz de oxidar el
acetato.

En una serie de trabajos publicados por diversos autores, principalmente
Shinwell y Carr (1960), se pone de manifiesto la clara tendencia de las especies de
Acetobacter a dar cepas mutantes, originndose especies distintas a las ya existentes.
Carr (1968) public un trabajo en el que pone de manifiesto las observaciones hechas
por Shimwell, y afirma que en general, las bacterias acticas no son genticamente
estables, aunque unas especies sean ms estables que otras.

La taxonoma tradicional de los microorganismos, basada fundamentalmente en
criterios morfolgicos y fisiolgicos, se ha visto sometida a continuas reordenaciones y
cambios. Esto se ha debido fundamentalmente a la aplicacin de tcnicas moleculares
muy potentes al estudio taxonmico como son la hibridacin ADN-ADN, la
secuenciacin de diferentes regiones del genoma bacteriano, etc. La familia
Acetobacteriaceae no ha sido una excepcin a este proceso de reordenacin de gneros
y especies. En el ao 1997, a los dos gneros mencionados, Acetobacter y
Gluconobacter, hay que sumarle la definicin de dos nuevos gneros de bacterias
acticas: Gluconoacetobacter y Acidomonas (Yamada et al.,1997); y en los dos ltimos
aos se han definido otros dos nuevos gneros ms: Asaia (Yamaguchi y Ninomiya,
2000) y Kozakia (Lisdiyanti et al., 2002).

Por tanto, en estos momentos, la familia Acetobacteriaceae est formada por 6
gneros y 34 especies de bacterias acticas (Tabla 1.1). Acetobacter y
Introduccin
5
Gluconoacetobacter, con 14 y 11 especies respectivamente, son los gneros donde
existe una mayor diversidad de especies (Guillamn et al., 2003).

El conocer qu cepas y bacterias acticas estn implicadas en la transformacin
de etanol en cido actico es de gran importancia por su repercusin y aplicacin a la
produccin industrial. En general, la produccin de vinagres slo se ha asociado con las
especies: A. aceti, A. pasteurianus, Ga. europaeus Gax. No obstante, es probable que la
especie G. oxydans se encuentre asociada a la produccin de condimentos
alimentarios que parten directamente de mosto para la produccin de actico, como
sera el Aceto Balsamico Tradizionale (Guillamn et al., 2003).



Tabla 1.1. Gneros y especies de bacterias acticas descritos segn Yamada, 2003.

Acetobacter Gluconoacetobacter Gluconobacter
A. aceti Ga. Liquefaciens G. oxydans
A. pasteurianus Ga. diazotrophicus G. frateurii
A. Pomorum Ga. xylinus G. assaii
A. peroxydans Ga. hansenii
A. indonesiensis Ga. obodiens
A. tropicalis Ga. intermedius
A. syzygii Ga. sacchari
A. cibinongensis Ga. entanii
A. orientalis Ga. johannae
A. orleanensis Ga. azotocaptans
A. lovaniensis Ga. europaeus
A. estunensis
A. malorum
A.cerevisiae
Acidomonas Asaia Kozakia
Ac. methanolica A. bogorensis K. baliensis
A. siamensis
A. indonesiensis
A. krungthepensis



La microbiologa del proceso no se comprende todava en su totalidad (Giudici,
2003). En el caso de las bacterias acticas, se estn desarrollando nuevas lneas de
investigacin centradas en la bsqueda de tcnicas de identificacin rpida que adems
pueden aplicarse a una correcta clasificacin de las mismas. Mediante la aplicacin de
las distintas tcnicas de biologa molecular se pretende alcanzar el objetivo de
identificar las bacterias viables responsables del proceso sin necesidad de que sean
previamente cultivadas. Como tcnicas especficas para la cuantificacin e
identificacin de la bacteria en el proceso de acetificacin se aplican en la actualidad las
siguientes:

Introduccin
6
PCR cuantitativa: Esta tcnica ya ha sido aplicada para la
cuantificacin del nmero total de bacterias (mediante el uso de
cebadores universales) en una muestra biolgica (Franke et al., 2000).
En el caso de bacterias acticas se podran utilizar cebadores
universales de bacterias acticas diseados ya para los mtodos de
identificacin (Ruiz et al., 2000), as como cebadores particulares de
especie, lo que permitira una segunda cuantificacin a nivel de
especie.

Sistemas basados en el uso de marcadores fluorescentes, como
epifluorescencia y FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation). La
primera de ellas ha sido utilizada para la cuantificacin de bacterias
acticas totales (Mesa et al., 2003). La tcnica de FISH podra
permitir la identificacin de bacterias acticas a nivel de especie lo
que sera de gran utilidad y posiblemente complementaria de la PCR
cuantitativa (Franke et al., 1999).



1.1.4. Mtodos de elaboracin de vinagre

En el mercado existen dos tipos de vinagres. El primero se obtiene como
producto de la fermentacin o acetificacin con cultivo superficial, las bacterias acticas
se encuentran en contacto directo con oxgeno gaseoso, situadas bien en la interfase
lquido/gas o bien fijadas a soportes de materiales tales como virutas, elaborndose as
la mayora de los vinagres tradicionales. El segundo tipo se elabora por la acetificacin
o fermentacin con cultivo sumergido, donde las bacterias acticas estn sumergidas
libremente en el seno del lquido a fermentar, en el que constantemente se introduce
aire, (solo o enriquecido con oxgeno), en condiciones que permitan la mxima
transferencia posible desde la fase gaseosa a la fase lquida. As se obtienen de forma
rpida los vinagres comerciales actuales de menor precio.

El vinagre de vino, se produce en los pases mediterrneos de forma mayoritaria
en biorreactores y con cultivo sumergido, que puede despus envejecerse o no en
madera. Los mtodos tradicionales, lentos, con cultivo superficial se llevan a cabo en
toneles de madera de diferente capacidad y suponen un menor volumen de produccin
(Garcia-Parrilla et al., 1998).



1.1.4.1. Mtodos tradicionales de acetificacin con cultivo superficial


a) Mtodo de Orlens

Es uno de los mtodos ms antiguos para fabricar vinagres. Emplea toneles de
aproximadamente 250-300 litros de capacidad, que se colocan tumbados en filas
horizontales y superpuestas, provistos de 2 agujeros de aproximadamente 5 cm en cada
extremo de los fondos de cada barril a 2/3 de la altura del fondo, que se rellenan con
Introduccin
7
estopa para evitar la entrada de las moscas del vinagre, pero que dejan pasar aire
(Figura 1.2).




Figura 1.2. Pilas de botas para la acetificacin en una fbrica de vinagre por el mtodo de Orlens.



Adems, en el lateral superior se hace otro orificio que se tapa con un tapn de
corcho por donde penetra un tubo de vidrio, recto, que llega casi hasta el fondo del
lquido permitiendo renovar el sustrato sin alterar el velo bacteriano situado en la
superficie (Figura 1.3). Se trata de un procedimiento esttico donde el lquido a
acetificar es una mezcla de vino de bajo grado alcohlico con un 20% de vinagre turbio.
Los rendimientos de la transformacin de etanol en actico son bajos y el proceso dura
de 8 a 10 das una vez comenzada la acetificacin, la velocidad depende de la
temperatura, ya que la temperatura de 30 C es la ptima para el crecimiento de la
bacteria actica.


Introduccin
8
Figura 1.3. Acetificacin por el mtodo de Orlens (Adams, 1980).



b) Mtodo Luxemburgus

El fundamento de este mtodo y su diferencia fundamental con el mtodo de
Orlens estriba en emplear virutas de haya que peridicamente quedan sumergidas en el
lquido que est acetificndose. As se consigue aumentar la superficie de acetificacin
de la bacteria y mejorar la transferencia de oxgeno, por lo que aumenta la velocidad de
acetificacin.

La cuba giratoria ms elemental (Figura 1.4) se prepara con un orificio grande
en el centro de uno de los fondos, para procurar la entrada de aire. En uno de los
costados de esta cuba, en la parte ms alejada de la abertura, se practica un orificio
estrecho, que puede obturarse con un tapn; es una canilla de madera o vidrio para
vaciado del envase. El tonel est dividido en dos partes desiguales por un falso fondo,
agujereado, con numerosos y finos orificios. La parte menor del tonel est llena de
virutas de haya. En este compartimento penetra un largo termmetro para controlar la
temperatura, aspecto muy interesante para todo mtodo rpido o semirrpido. Se
obtienen cantidades de vinagre, que pueden llegar como mximo, cada cuarenta y ocho
horas, a la cuarta parte del contenido de un tonel. El vinagre elaborado, que se extrae de
las cubas, se sustituye por porciones iguales de vino, continuando la elaboracin
indefinidamente (Xandri-Tagea, 1977).



Embudo cubierto de gasa
Orificio de
observacin
Grifo
Indicador
de nivel
Entrada de aire
cubierta con gasa
Orificio tapado
con algodn
Introduccin
9
Figura 1.4. Cuba rotatoria del mtodo Luxemburgus.



c) Mtodo de Schzenbach o Mtodo Alemn

Se emplean toneles o generadores verticales de encina con doble fondo
(Figura 1.5). Sobre el primero, agujereado, se colocan una serie de capas de virutas de
madera de haya, impregnadas de vinagre de buena calidad. Sobre el borde superior lleva
un diafragma perforado, con los orificios obturados con algodn. Al pasar el vino por el
diafragma, burbujea aire que existe entre las virutas. El vinagre se extrae por la parte
inferior. Se pueden emplear barriles de roble giratorios, parcialmente llenos de virutas,
consiguindose as una mejor aireacin. Las ventajas que se destacan de este proceso
son la regulacin de oxgeno y su uso para la produccin continua de vinagre.

El vinagre obtenido con el mtodo de cultivo superficial tiene el aroma y el
gusto propio de la lentitud de la acetificacin que se ve favorecido por el simultneo
envejecimiento (Llaguno y Polo, 1991a).

Introduccin
10
Figura 1.5. Esquema de un generador vertical, para la produccin de vinagres vnicos.



Los principales inconvenientes de los mtodos de acetificacin en cultivo
superficial que emplean las virutas como soporte son:

- Acumulacin de bacterias muertas sobre las virutas (debido a falta de
aireacin o aumentos de temperaturas).
- Desarrollo de bacterias productoras de celulosa.
- La infeccin por angululas (pequeos nematodos) que son imposibles de
combatir una vez que se desarrollan.
- Aumentos de temperatura difcilmente controlables, prdidas de alcohol
por evaporacin en la corriente ascendente de aire caliente, con bajada
del rendimiento.
- Necesidad de gran espacio (generadores de relleno).





X
X
Y
Y
Introduccin
11
Entre los vinagres artesanales producidos por fermentacin con cultivo
superficial con denominacin de origen y reconocimiento internacional destacan el
Aceto Balsmico Tradicionale de la ciudad italiana de Mdena y el no menos
prestigioso Vinagre de Jerez.



1.1.4.2. Mtodos de acetificacin con cultivo sumergido

Se entiende por fermentacin sumergida aquella en la que no se utiliza material
poroso o soporte, sino que se hacen circular pequeas burbujas de aire a travs de la
biomasa, con lo que se favorece el proceso fermentativo. Emplea toneles de madera o
tanques acero inoxidable quedando siempre una parte del vinagre de la operacin
anterior como inculo para iniciar el ciclo siguiente. Se llena con el vino, y se introduce
posteriormente una fuerte corriente de aire. La acetificacin es muy rpida. Este proceso
se utiliza ampliamente en la actualidad. Los rendimientos de la transformacin del
alcohol en cido actico (hasta el 94%) resultan ser muy elevados. La velocidad a la que
se desarrolla el proceso es mayor (25-30 horas), as como la uniformidad del producto
y, sobre todo, se puede lograr la acetificacin de iguales volmenes de alcohol en
mucho menor volumen de instalacin, con el consiguiente ahorro de espacio. Se puede
trabajar con dispositivos automticos que no slo regulen el control de la aireacin, sino
tambin los ciclos de carga y descarga (Llaguno y Polo, 1991a).


Modelos Frings

En 1878, Heinrich Frings fund en Aquisgrn una sociedad productora de
vinagre, que ms tarde, en 1950, incorpora las patentes de invencin resultantes de la
investigacin del proceso de fermentacin sumergida, alcanzando un alto grado de
desarrollo. Naci as el Acetator Frings, base de la biotecnologa vinagrera actual.

A partir de las investigaciones de Hromatka y Ebner (1949), en los aos 40 fue
construido el Acetator Frings (Figura 1.6) que se mantiene funcionando, con algunas
modificaciones, en gran parte de las industrias vinagreras actuales y en el que se elabora
la mayor parte de la produccin.


Introduccin
12

Figura 1.6. Acetator Frings en acero inoxidable
A, bomba de carga; B, aireador y motor; C, dispositivo para determinacin de alcohol residual; D,
vlvula entrada agua refrigeracin; E, termostato reguladora ; F, rotmetro; G, serpentn de
refrigeracin; H, entrada de aire; I, salida de gases; J, dispositivo antiespuma.



El fundamento es la presencia de cultivo sumergido en el seno del lquido a
acetificar, que se satura constantemente de pequeas burbujas de aire. Una mayor
poblacin bacteriana as como la disponibilidad de oxgeno para los microorganismos
permiten obtener un mayor rendimiento de la transformacin de etanol en cido actico
(del 94%) y una mayor velocidad del proceso (25-30 horas). Este procedimiento
requiere la estricta vigilancia de tres parmetros: la temperatura, la presin parcial de
oxgeno y los ciclos de carga y descarga.

La bacteria actica es viable entre 28-33C, pero la velocidad de fermentacin
vara en funcin de la temperatura. La temperatura de la fermentacin debe estar
comprendida dentro del intervalo entre 30-31C (Ormaechea, 1991) que es la
temperatura ptima para obtener un mayor rendimiento. Es obvio que la oxidacin de
etanol a cido actico es una reaccin exotrmica que puede producir alrededor de 8.4
MJ por cada litro de etanol que se oxida (Adams, 1985) elevando la temperatura del
depsito. Por otra parte, cuando la temperatura es elevada aumentan las prdidas de
alcohol y productos voltiles y, en menor cuanta, de cido actico, pero quizs lo ms
importante, es que puede ocurrir la parada del proceso por la muerte de bacterias.

Un elevado suministro de aire puede causar el fenmeno de sobreoxidacin y
arrastre de los componentes voltiles y, por otro lado, su carencia puede paralizar la
acetificacin dado el carcter aerobio de las bacterias acticas. Adems de la cantidad
de aire, se ha de tener en cuenta su calidad y pureza, ya que las bacterias acticas son
sensibles a los contaminantes de este.

Todos los parmetros estn interrelacionados en la acetificacin; el etanol no
debe llegar a agotarse totalmente ya que las bacterias acticas mueren rpidamente y se
pierde el cultivo. Por ello en este tipo de sistema de produccin de vinagre se suele
Introduccin
13
llevar a cabo la acetificacin de forma discontinua realizndose ciclos de descarga-
carga. As se impide que las bacterias acticas metabolicen el cido actico formado
convirtindolo en CO
2
y agua. Se descarga aproximadamente el 40-45% del volumen de
lquido, que se repone con nueva materia prima suministrndole sustrato a la bacteria.
Por eso, se puede trabajar de forma automatizada con dispositivos que regulen el control
de la temperatura y de la aireacin, as como los ciclos de carga y descarga. El
acetificador est constituido por un depsito de acero inoxidable de capacidad entre 100
y 300 HL. Los conductos estn rodeados por un intercambiador de calor de agua para
disipar el calor producido en el proceso y mantener la temperatura a 30C. Para evitar
las prdidas de compuestos voltiles se ha desarrollado un sistema cerrado (Cantero et
al., 1996), mejorando sensiblemente los resultados del proceso fermentativo. El
fermentador consta de un sistema de recirculacin de aire y un sistema de control
automatizado que inyecta oxgeno en dicha corriente a medida que ste es consumido
por la biomasa. Se alcanzan as rendimientos cercanos al 100% (Gmez et al., 1993).

Los aminocidos libres presentes en el medio son las principales fuentes de
nitrgeno para las bacterias acticas. Ya que el sustrato para la fermentacin actica
proviene de una fermentacin previa realizada por levaduras (Ciani et al., 1998) resulta
importante asegurar que dicho sustrato posea suficiente nitrgeno disponible para las
bacterias.



1.2. DETERMINACIN DE AMINOCIDOS EN PRODUCTOS DERIVADOS
DE LA UVA


1.2.1. Aplicaciones del anlisis de aminocidos en enologa

El anlisis de aminocidos encuentra aplicacin en muchos campos de
investigacin siendo uno de los ms importantes la estimacin del valor nutritivo de
alimentos para humanos y para animales. La elevada demanda de informacin
relacionada con el valor nutritivo ha dado lugar al desarrollo de mtodos precisos para
aminocidos. Adems, es creciente el nmero de aplicaciones como la deteccin de
posibles adulteraciones en alimentos y bebidas o la determinacin de aminocidos,
pptidos o derivados potencialmente txicos producidos por las nuevas tcnicas de
procesado de alimentos (White yHart, 1992b).

Ya en 1958, Stein y Moore aplican la cromatografa de lquidos para determinar
aminocidos utilizando una columna de intercambio inico y reaccin postcolumna con
ninhidrina. La importancia del anlisis de aminocidos no ha dejado de crecer desde
entonces, tanto desde el punto de vista clnico como farmacutico y alimentario.

Es conocida la importancia de los aminocidos del mosto como nutrientes para
el desarrollo de las levaduras que realizan la fermentacin alcohlica, as como el papel
que se les atribuye como precursores de los compuestos del aroma. Por otra parte, la
composicin en aminocidos del mosto est muy relacionada con la madurez de las
uvas y con la fertilizacin del terreno, por lo que son muchos los laboratorios
interesados en el anlisis de estos compuestos (Cceres et al., 1986). Los aminocidos
libres representan la parte ms importante del nitrgeno total en los mostos y vinos,
Introduccin
14
aproximadamente entre el 30 y 40 % (Hrberger et al., 2003). Estos aminocidos tienen
varios orgenes. Algunos proceden de la uva y pueden ser metabolizados parcial o
totalmente por levaduras al final de la fermentacin o liberados de las levaduras muertas
y otros son producidos por la degradacin enzimtica de las protenas de la uva. El
contenido de aminocidos de las uvas depende de varios factores como fertilizacin,
condiciones climticas y duracin de la maceracin de la piel en el mosto (Soufleros et
al., 2003).

Por tanto, la composicin de aminocidos es de gran importancia en la
produccin de vino (Kosir y Kidric, 2001 ). Muchos aminocidos experimentan una
serie de biotransformaciones, dando lugar a alcoholes de alto peso molecular, aldehdos,
steres y cidos cetnicos, los cuales tienen un gran impacto en las propiedades
organolpticas del vino. Por este motivo a los aminocidos se les atribuye el papel de
precursores del aroma (Soufleros et al., 2003).

A pesar de los diversos factores que afectan a los aminocidos presentes en el
vino, muchos investigadores los han empleado para la diferenciacin del producto
(Csomos y Simon-Sarkadi, 2001). Con dicho fin, as como para establecer la
autenticidad del vino, se han aplicado diferentes procedimientos quimiomtricos:
anlisis de cluster, anlisis de componentes principales y anlisis discriminante.
Hrberger et al. (2003) encontraron que la aplicacin de tcnicas quimiomtricas al
contenido de aminocidos y aminas bigenas result ser una buena herramienta para
clasificar vinos hngaros en funcin de la tecnologa de elaboracin empleada, sin
embargo, la diferenciacin de las mismas segn su origen geogrfico, variedad y
cosecha no fue del todo satisfactoria.

Asimismo, Soufleros et al. (2003) estudiaron el perfil de aminocidos de vinos
blancos griegos procedentes de siete variedades de uva, seis regiones geogrficas, y tres
vendimias y aplicando el anlisis discriminante los clasificaron en funcin de dichas
variables (variedad, origen geogrfico y vendimia).

Brescia et al. (2002) diferenciaron vinos procedentes de pequeas reas de
produccin de la misma regin aplicando estadstica multivariante a las determinaciones
de aminocidos por resonancia magntica nuclear (RMN). Con esto se consigui un
mtodo til para la proteccin de la denominacin de origen controlada (DOC) contra la
adulteracin.

Por otro lado, ya que las levaduras juegan un importante papel en el contenido
de aminocidos en el vino, otra de las aplicaciones ha sido el estudio de la influencia de
diferentes cepas de levadura sobre los cambios que sufren los aminocidos, pptidos y
protenas durante el envejecimiento del cava (Martnez-Rodrguez et al., 2002). En este
estudio se utiliz el mismo vino base y cinco cepas de levaduras. Con los datos
obtenidos se dedujo que los cambios que se producen en el proceso de envejecimiento
del cava ocurren en al menos cuatro fases claramente diferenciadas y adems se observ
que el empleo de una cepa de levadura u otra influye en el contenido de aminocidos
libres y pptidos.

Prez-Coello et al. (1999) analizaron 15 vinos elaborados en La Mancha con
varias cepas de Saccharomyces cerevisiae, utilizando la composicin voltil y el perfil
Introduccin
15
de aminocidos con el objeto de determinar la cepa ms adecuada para inocular los
mostos de esta regin.

En otros trabajos se adicion amonio y aminocidos a los mostos para estudiar
su efecto en la composicin aromtica y en las propiedades sensoriales de los vinos
obtenidos (Hernndez-Orte et al., 2002; 2005; 2006). A pesar de que el factor
determinante de la composicin voltil de los vinos es la cepa de levadura, la adicin
de nitrgeno a los mostos tambin influye, reduciendo el contenido de -feniletanol,
metionol e isoamilalcohol y aumentando el cido propinico. Adems, se observ que
los vinos que haban sido enriquecidos con amonio eran ms ricos en lactato de etilo y
cis-3-hexenol mientras que los vinos enriquecidos con aminocidos eran ms ricos en -
butirolactona e isobutanol. Desde el punto de vista sensorial, la adicin de amonio dio
lugar a un descenso en notas sulfhdricas y a un incremento en olor ctrico. Por otro
lado, se observ que las fermentaciones son mucho ms rpidas en los mostos
enriquecidos (Hernndez-Orte et al., 2005).

En el campo de los vinagres el anlisis de aminocidos se ha dirigido a la
caracterizacin de vinagres de vino (Kutln y Molnr-Perl, 2003) y a las
transformaciones qumicas y bioqumicas que se producen en los vinagres de Jerez
durante las diferentes fases de envejecimiento (Palacios et al., 2002).

La formacin de vinagre implica esencialmente la conversin del etanol en cido
actico. Los microorganismos responsables de dicha transformacin son bacterias
acticas pertenecientes a los gneros Acetobacter y Gluconobacter y los aminocidos
presentes en el medio constituyen la principal fuente de nitrgeno para estas bacterias.
Debido a que el sustrato inicial procede de una fermentacin previa realizada por
levaduras, es esencial asegurarse de que haya una cantidad adecuada de nitrgeno para
que se lleve a cabo la fermentacin actica (Valero et al., 2005).

Adems, se han desarrollado mtodos para la determinacin conjunta de
aminocidos y otras sustancias de inters como las aminas bigenas y poliaminas en
vinos y en vinagres (Bauza et al., 1995; Herbert et al., 2000; Kutln y Molnr-Perl.,
2003; Lozanov et al., 2004). Las aminas bigenas son compuestos que afectan a la salud
y pueden ser indicadores de unas condiciones de produccin antihiginica, formndose
a partir de ciertos aminocidos por descarboxilacin. Sin embargo, la cuantificacin
rutinaria de estas sustancias no se emplea en el control cualitativo de los vinos debido
principalmente a las dificultades del anlisis. De ah la importancia de desarrollar
mtodos sencillos que permitan determinar simultneamente las aminas bigenas y
aminocidos en vinos o en vinagres. Las poliaminas, por el contrario, tienen mltiples
funciones en los organismos vivos, tales como factores de crecimiento, antioxidantes,
estabilizadores de ADN y ARN, reguladores metablicos, nutrientes y segundos
mensajeros.

Los estudios de racemizacin constituyen otra rea en el anlisis de los
aminocidos. Los L-aminocidos de las protenas de los alimentos se isomerizan
parcialmente a D-ismeros por tratamiento alcalino o por calor. Este tratamiento puede
afectar al valor nutritivo y seguridad de los alimentos, ya que la mayora de los D-
aminocidos no pueden ser utilizados por los humanos y algunos son txicos. Los
ismeros tienen idnticas propiedades qumicas y por tanto, deben ser convertidos en
dipptidos diastereomtricos mediante una reaccin con un agente quiral antes de la
Introduccin
16
cromatografa. Alternativamente, se puede emplear una fase estacionaria o fase mvil
quiral. Para conseguir la separacin en un solo cromatograma de todos los aminocidos
en sus formas D y L, es necesario utilizar columnas largas y tiempos de anlisis de
incluso horas.

Se han propuesto diferentes mtodos para la determinacin aminocidos
enantimeros y aminas quirales tanto en vinos, vinagres, como en alimentos, cada uno
de ellos con sus ventajas e inconvenientes (Breckner et al., 1995; Jin et al., 1999; Voss
y Galensa, 2000; Toyooka et al., 2001; Abe et al., 2002; Erbe y Breckner, 1998 ).



1.2.2. Mtodos de anlisis de aminocidos

Durante los ltimos aos, la evolucin del anlisis instrumental ha permitido la
deteccin y cuantificacin de un gran nmero de aminocidos con gran precisin y
sensibilidad. La determinacin de aminocidos en muestras de mostos, vinos y vinagres
debe permitir: la deteccin de aminocidos primarios y secundarios, como la prolina,
que es el aminocido ms abundante de los vinos; un anlisis exacto de la arginina,
debido a la implicacin toxicolgica de este compuesto en reacciones posteriores que
dan lugar a la formacin de etilcarbamato y urea; bajos lmites de deteccin para todos
los aminocidos; un tiempo de anlisis corto, con objeto de poder tener un anlisis
rutinario para la certificacin del vino o del vinagre; y la habilidad de crear una base de
datos con las caractersticas de productos qumicos para ayudar a la identificacin de
adulteraciones (Herbert et al., 2000).

Existen diferentes tcnicas empleadas en el anlisis de aminocidos en vinos,
aunque son tres las que se usan con mayor frecuencia: cromatografa de intercambio
inico con derivatizacin postcolumna empleando ninhidrina como agente derivatizante
y deteccin por ultravioleta (UV); separacin de derivados voltiles de aminocidos
por cromatografa gaseosa (CG) y deteccin por espectrometra de masas (EM) y
separacin de aminocidos derivados por cromatografa de lquidos (CL) y su deteccin
por fluorescencia. La resonancia magntica nuclear (RMN) y la electroforesis capilar
(EC) son otras de las tcnicas usadas en el anlisis de aminocidos (Herbert et al.,
2000).


a) Separacin por cromatografa lquida de intercambio inico

Las resinas de intercambio inico son polmeros sulfonados con partculas de 5 a
10 micras de dimetro. El mecanismo de separacin est basado en la interaccin inica
con un soporte fuertemente cido, aunque no se pueden excluir una interaccin
secundaria con el polmero que constituye la base del intercambiador. En primer lugar
eluyen los aminocidos cidos, seguidos por los hidroxilados, luego los neutros y por
ltimo los bsicos (Cceres et al., 1986). Actualmente las columnas son muy eficaces,
con lo que los tiempos de anlisis son ms cortos, pero son bastante caras.

Tradicionalmente el anlisis de aminocidos se ha llevado a cabo mediante
cromatografa de intercambio catinico, donde los aminocidos se separaban y
posteriormente reaccionaban con ninhidrina en un sistema de derivatizacin
Introduccin
17
postcolumna. Finalmente se detectaban por absorbancia en la regin del UV-visible a
una o dos longitudes de onda. Aunque ha demostrado tener buena fiabilidad y excelente
poder de resolucin, los tiempos de anlisis son demasiado largos, la sensibilidad es
limitada, pueden resultar picos demasiado anchos y los sistemas de derivatizacin
postcolumna resultan difciles de manejar y mantener. Por otro lado, aunque este
mtodo da buenos resultados requiere una larga preparacin de las muestras, y su
aplicacin en vinos no permite la cuantificacin de la cistena, la cual es un precursor de
los tioles caractersticos de la variedad Sauvignon (Pripis-Nicolau et al., 2001), entre
otras. Adems tiene problemas con las interferencias de la matriz y con los lmites de
deteccin (Herbert et al., 2000). De todos modos, esta tcnica se ha empleado
extensamente en la caracterizacin de vinos en funcin del contenido de aminocidos
(Csomos y Simone, 2002).


b) Separacin por cromatografa de lquidos en fase reversa

La mayor parte de los trabajos realizados sobre anlisis de aminocidos por
cromatografa de lquidos (CL) se ha llevado a cabo en columnas de fase reversa que
tienen como fase estacionaria slice, a la que se unen grupos C-8 o C-18. Estas
columnas, empaquetadas con partculas de slice muy pequeas (3-10 m) y de pequeo
dimetro (2-5 mm), estn sometidas a una alta presin con una velocidad de flujo de las
fases mviles muy controlada.

Las fases mviles ms utilizadas en fase reversa son mezclas de agua y un
disolvente orgnico (metanol, acetonitrilo, o tetrahidrofurano, normalmente). Cuando la
muestra tiene sustancias que contienen grupos cidos o bsicos dbiles, como son los
aminocidos, se recurre al control del pH de la fase mvil mediante un tampn (Cceres
et al., 1986).

La cromatografa en fase reversa utiliza las propiedades de solubilidad de la
muestra para distribuirla entre un solvente hidroflico y otro lipoflico. La distribucin
de los componentes de la muestra entre las dos fases va a depender de sus respectivas
caractersticas de solubilidad. Los componentes menos hidrofbicos se asociarn
primeramente con la fase hidroflica, y los componentes ms hidrofbicos se
encontrarn en la fase lipoflica. El proceso entero depende del poder extractivo de la
fase hidroflica. En fase reversa, las partculas de slice cubiertas con cadenas
hidrocarbonadas representan la fase lipoflica, mientras que la mezcla acuosa de un
solvente orgnico que rodea las partculas representa la fase hidroflica.

Puesto que el conjunto de los aminocidos muestra una amplia gama de
polaridades, para resolverlos en un solo cromatograma es preciso ir variando la
composicin de la fase mvil a lo largo de la separacin, aumentando su poder de
elucin; de esta forma, mediante el empleo de un gradiente de polaridad, se consigue
separar todos los compuestos en un tiempo razonable, lo que sera imposible de
conseguir con una elucin isocrtica (Cceres et al., 1986).

Esta tcnica tiene muchas aplicaciones como por ejemplo la caracterizacin de
vinos (Soufleros et al., 2003) y diferenciacin de vinagres en funcin de la composicin
en aminocidos (Valero et al.,2005); el estudio de la evolucin de los aminocidos en el
proceso de elaboracin del vino (Martnez-Rodrguez et al.,2002); relacin del
Introduccin
18
contenido en aminocidos con los compuesto voltiles en el vino (Pozo-Bayn et al.,
2005) y la determinacin simultnea de aminas bigenas y aminocidos en vinos y en
vinagres (Krause et al. 1995; Lozanov et al., 2004; Kutln y Molnr-Perl, 2003).

Adems, la cromatografa de lquidos se ha utilizado para determinar los
ismeros L y D de los aminocidos en vinos (Breckner et al., 1995; Jin et al., 1999;
Voss y Galensa, 2000; Toyooka et al., 2000). Los ismeros tienen idnticas
propiedades qumicas y por tanto, deben ser convertidos en dipptidos diastereomtricos
mediante una reaccin con un agente quiral antes de la cromatografa. Alternativamente,
se puede emplear una fase estacionaria o fase mvil quiral.


c) Cromatografa de gases (CG)

La cromatografa de gases capilar constituye otra alternativa para el anlisis de
aminocidos. Esta tcnica es rpida, y tiene un alto poder de resolucin y sensibilidad,
pero se necesita gran experiencia. Adems, como los aminocidos libres no son
suficientemente voltiles necesitan ser convertidos en derivados voltiles para poder
determinarlos. Los steres de aminocidos acilados son la clase ms frecuente de
derivados para el anlisis de aminocidos por CG.

La principal desventaja de la cromatografa de gases parece ser el procedimiento
de la derivatizacin, debido a la complejidad de las reacciones y los tipos de reactivos
usados. La velocidad de derivatizacin difiere de un aminocido a otro y la
reproduccin estricta de las condiciones de reaccin es esencial para todas las muestras.
Adems, la mayora de los derivados de aminocidos voltiles se pueden perder tambin
durante la concentracin de la muestra. Por otro lado esta tcnica requiere una
minuciosa extraccin y preconcentracin de la muestra, por lo que se deben tener en
cuenta a la hora de asegurar la fiabilidad de los resultados finales (Herbert et al., 2000).

Se ha comparado la cromatografa de intercambio inico y la cromatografa de
gases en cuanto a la precisin. Ninguno de los mtodos fue claramente superior. La CG
result tener una menor varianza intralaboratorio excepto para la histidina y la arginina.
Tambin se ha comparado la CG y CL. Considerando muchos factores como la
facilidad de la derivatizacin y la duracin del tiempo de anlisis el mtodo de eleccin
fue la CL. Aunque la CG tiene ventajas (velocidad y sensibilidad) la mayora de los
anlisis de aminocidos todava se llevan a cabo por la clsica cromatografa de
intercambio inico o por la cromatografa de lquidos en fase reversa. Muchos autores la
han aplicado para la determinacin de D-aminocidos y separacin de enantimeros
tanto en vinos (Abe et al., 2002) como en vinagres ( Erbe y Breckner, 1998).


d) Electroforesis capilar

La tcnica de electroforesis capilar (EC) se ha usado para separar y detectar
aminocidos, pptidos y protenas.

La EC permite el anlisis de muestras extremadamente pequeas, y por lo tanto
se requieren detectores de alta sensibilidad. Estos detectores incluyen fluorescencia
inducida por lser, la cual tiene unos lmites de deteccin del orden de 10
-20
moles para
Introduccin
19
la separacin por electroforesis capilar de zona de aminocidos derivatizados con
isotiocianato de fluorescena. Un inconveniente de esta tcnica es el consumo de tiempo
que conlleva la preparacin de las muestras, ya que requieren un proceso de
derivatizacin y preconcentracin previo a su anlisis (Kosir y Kidric, 2002).

As mismo, se puede aplicar la EC con un detector de fluorescencia inducida por
lser para reacciones postcolumna usando como agentes derivatizantes el o-ptaldehido y
el naptaneno-2,3-dicarboxialdehido (Male y Luong, 2001; Kilgore y Smith, 2003).

El anlisis por electroforesis capilar de zona de aminocidos seleccionados tiene
unos lmites de deteccin extremadamente bajos. En la prctica, no se precisan lmites
de deteccin tan bajos en el anlisis rutinario de aminocidos en alimentos. Sin
embargo, podran producirse nuevos compuestos en mtodos de procesado de alimentos
del futuro en unos niveles suficientemente bajos como para poder recomendar la
aplicacin de esta tcnica.


e) Resonancia magntica nuclear

La espectroscopia de resonancia magntica nuclear (RMN) se ha aplicado
ampliamente en el campo del anlisis qumico de alimentos ya que es una tcnica no
destructiva, sensible y capaz de detectar simultneamente un gran nmero de
compuestos, concretamente aminocidos, en mezclas complejas como es el caso del
vino ( Kosir y Kidric, 2001; 2002).

Aunque la cromatografa de lquidos y la electroforesis capilar son ms
sensibles, requieren una preparacin de las muestras antes del anlisis. Normalmente, la
separacin, derivatizacin y preconcentracin en el caso de compuestos presentes en
bajas concentraciones, son pasos imprescindibles en el procedimiento. Por el contrario,
la preparacin de muestra para la resonancia magntica nuclear es ms simple y
consume menos tiempo. Otra gran ventaja de esta tcnica es la posibilidad de detectar la
resonancia magntica de diferentes ncleos presentes en una molcula en diferentes
ambientes electrnicos y espaciales.

Esta tcnica ha sido empleada, obtenindose muy buenos resultados, en la
caracterizacin de la autenticidad del vino, determinacin del origen geogrfico y ao
de produccin (Brescia et al., 2002).



1.2.3. Derivatizacin de aminocidos

Los aminocidos pueden ser detectados directamente en el ultravioleta, ya que
absorben a una longitud de onda entre 190-210 nm. Sin embargo, en esta regin del
espectro tambin absorben la mayora de los disolventes y otros componentes de las
muestras, por lo que normalmente se recurre a la formacin de derivados detectables a
otras longitudes de onda o fluorescentes (Cceres et al., 1986).

Introduccin
20
La derivatizacin puede llevarse a cabo antes de la separacin cromatogrfica
(precolumna), inmediatamente despus de la elucin (postcolumna) o, menos frecuente,
en la misma columna. Cada forma de obtener el derivado presenta ventajas e
inconvenientes (Tabla 1.2).

En la derivatizacin postcolumna la separacin de aminocidos no derivatizados
se lleva a cabo con una resina de intercambio catinico con un gradiente de tampones
acdicos. Despus de la separacin se convierten en derivados de ninhidrina coloreados
para la deteccin colorimtrica, o en derivados de ortoftaldehdo para la deteccin por
fluorescencia.



Tabla 1.2. Ventajas e inconvenientes de la derivatizacin precolumna y postcolumna
(Cceres et al., 1986)

Derivatizacin Ventajas Inconvenientes
Postcolumna
-Es posible utilizar varios sistemas de
deteccin y eluir los compuestos de la
columna detectndolos por mtodos no
destructivos antes de derivatizarlos.

-La reaccin es reproducible sin
necesidad de formar un nico derivado.

-Presencia de interferencias debidas al exceso de
reactivo o a productos de degradacin.

-Prdida de resolucin producida por el
ensanchamiento de la banda cromatogrfica en el
reactor donde se produce la reaccin.

-No se pueden utilizar tiempos de retencin muy
largos.

-Puede resultar un mtodo caro debido a las
modificaciones que hay que realizar en el equipo
instrumental para llevar a cabo la reaccin.
Precolumna
-La nica limitacin a las condiciones de
la reaccin es que se complete en un
periodo de tiempo razonable y que sea
cuantitativa.

-La reaccin se puede desarrollar en un
disolvente no compatible con la fase
mvil utilizada en la separacin
cromatogrfica.

-Se pueden separar los productos
secundarios formados, en la misma
columna o antes de la separacin
cromatogrfica.


-Presencia de picos interferentes en los
cromatogramas debidos al mismo reactivo, a
productos de reaccin o de degradacin o a
impurezas de los reactivos.

-Conviene eliminar el exceso de reactivo,
disolvente u otros componentes de la mezcla de
reaccin antes de la inyeccin en el cromatgrafo.

- Una parte sustancial de todos los derivados ser
idntica. Pequeas diferencias de la cadena lateral
de los aminocidos tendrn un efecto menor en el
comportamiento cromatogrfico de los derivados,
dando una separacin ms dificultosa.





Aunque la derivatizacin precolumna ofrece ms ventajas, los mtodos tradicionales
postcolumna no se han eliminado totalmente.





Introduccin
21


Los agentes derivatizantes ms utilizados en el anlisis de aminocidos son:


a) Ninhidrina

La ninhidrina se utiliza para la determinacin de los aminocidos tras su separacin
en su forma natural por cromatografa de intercambio inico. Por tanto, la derivatizacin
con ninhidrina es exclusivamente postcolumna (White y Hart, 1992a).

La reaccin de la ninhidrina con los aminocidos es muy sensible, llegndose a
detectar cantidades inferiores a un picomol pero raramente reproducibles por debajo de
100 picomoles. Esta limitacin la hace inadecuada para muchas de las aplicaciones
demandadas actualmente. La sensibilidad de la ninhidrina depende de una serie de
factores: es muy sensible a la luz, al oxgeno atmosfrico, a cambios de temperatura y
de pH.

Con los aminocidos primarios forma un complejo morado (Ruhemanns purple)
que absorbe a una de 570 nm, y con los aminocidos secundarios, prolina e
hidroxiprolina, forma un complejo amarillo que absorbe a 440 nm. Cuando empieza a
oxidarse el reactivo, su color no se desarrolla bien a 570 nm pero la absorcin a 440
permanece constante. Por eso cuando la altura de la prolina a 440 nm es igual a la altura
del cido glutmino a 570 nm indica la degradacin del reactivo.

Algunos autores han aplicado esta tcnica para la caracterizacin de vinos en
funcin del contenido de aminocidos (Herberger et al., 2003).


b) Cloruro de dansilo

El cloruro de dansilo (DNS-Cl) es un reactivo fluorognico de derivatizacin
precolumna que permite la determinacin de aminas primarias y secundarias.

La dansilacin se ha usado como un mtodo para la determinacin de
aminocidos libres, tanto los procedentes de la hidrlisis de protenas como los
aminocidos terminales de protenas y pptidos. Los derivados son detectables por
fluorescencia (
ex
360 nm;
em
470) o por ultravioleta (254 nm) y los niveles de
deteccin estn en el orden de picomoles o fentomoles dependiendo de la sensibilidad
del detector (White y Hart, 1992a).

La reaccin de los aminocidos con el cloruro de dansilo transcurre en
condiciones ptimas entre 35-50 minutos en medio bsico, a temperatura ambiente y en
la oscuridad. Adems de los dansilaminocidos se forma como producto secundario el
cido dansilsulfnico. Por otro lado, el exceso de cloruro de dansilo reacciona con los
dansilaminocidos formando dansilamida. La formacin de la dansilamida era una
inevitable limitacin del mtodo y la cantidad formada depende de la concentracin de
aminocidos y del exceso de cloruro de dansilo. Conviene, pues, reducir en lo posible la
aparicin de tales productos secundarios (Cceres et al., 1986).

Introduccin
22
Los derivados son relativamente estables a la hidrlisis lo que no ocurre con el
reactivo. Hay que evitar, sin embargo, la exposicin a la luz por ser fotosensibles. Los
dansilaminocidos son estables al menos 7 das si se mantienen a 4 C.

Esta tcnica se utiliza generalmente en derivatizacin precolumna. Numerosos
autores lo han empleado para la determinacin de aminocidos en mostos de uva, vinos
y vinagres (Botella et al., 1990; Valero et al., 2005).

La mayora de aminocidos dan monodansil derivados, excepto lisina, ornitina,
histidina, tirosina y cistena que forman didansil derivados.

Este mtodo ofrece una buena reproducibilidad para la mayora de los
aminocidos excepto para la histidina debido a la baja respuesta relativa de
fluorescencia del derivado didansilado y por la formacin de dos dansil derivados
(White y Hart, 1992a).


c) Cloruro de dabsilo

Los derivados obtenidos con el cloruro de dabsilo tienen una absorcin mxima

a 420 nm (regin visible), son altamente estables y son rpidamente separados y
detectados a niveles de picomoles. Los derivados se mantienen perfectamente estables
durante cuatro semanas a temperatura ambiente.

Una limitacin del mtodo es que la presencia de una excesiva cantidad de sal,
urea, fosfato, o bicarbonato amnico alterar el pH del tampn e interferir en la
reaccin de dabsilacin.

Para un anlisis cuantitativo de muestras desconocidas, los estndares de
aminocidos dabsilados tienen que obtenerse de una mezcla de estndares de
aminocidos hidrolizada y dabsilada en paralelo en las mismas condiciones que las
muestras (White y Hart, 1992a)

Krause et al. (1995) propusieron el uso del cloruro de dabsilo como un mtodo
alternativo al anlisis convencional de aminocidos y aminas bigenas en alimentos y
muestras biolgicas, logrando separar ms de cuarenta compuestos simultneamente.


d) Dinitrofluorobenceno

El dinitrofluorobenceno (DNFB) es un agente de derivatizacin precolumna que
se utiliza para la caracterizacin de aminocidos terminales de cadenas peptdicas
(Cceres et al., 1986).

Este agente reacciona con los aminocidos primarios y secundarios formando
compuestos que muestran fluorescencia a 365 nm. La reaccin se lleva a cabo a 50 C
durante 30 minutos. Los derivados son estables durante 48 horas si se protegen de la
luz.

Introduccin
23
Con este reactivo se pueden detectar pequeas cantidades de aminocidos, del
orden de picomoles, y es muy adecuado para determinar aminocidos que otros
reactivos resuelven peor. Uno de los inconvenientes de este mtodo est en que destruye
los pptidos (White y Hart, 1992a).


e) Fenilisotiocianato

El agente derivatizante fenilisotiocianato se ha utilizado durante ms de 30 aos
en el mtodo de la degradacin de Edman para secuenciar protenas y pptidos. Este
agente reacciona con los aminocidos libres produciendo feniltiocarbamil aminocidos
(Cceres et al., 1986). Se ha empleado, asimismo, para determinar aminocidos en
zumos de naranja (Naulet et al., 1997), vinos ( Botella et al., 1990; Lehtonen et al.,
1996; Puig-Deu y Buxaderas, 1994; Hernndez-Orte et al., 1999; Fox et al., 2001) y
vinagres (Palacios et al., 2002).

Hay que sealar que se consigue la cuantificacin de los aminocidos
secundarios prolina e hidroxiprolina. A diferencia de la ninhidrina y ortoftaldehdo, los
derivados feniltiocarbamil de la prolina y la hidroxiprolina tienen aproximadamente la
misma respuesta molar que los otros aminocidos.

La selectividad es adecuada y no hay evidencia de formacin de derivados
disustituidos con tirosina o histidina. Slo lisina y cistina reaccionan con dos molculas
del agente. En condiciones suaves, la reaccin se completa en menos de diez minutos, y
como el reactivo es voltil, se puede usar en exceso. Este exceso se elimina a baja
presin. Las muestras secas pueden ser almacenadas a 20 C, y resultan estables
durante 4 semanas.

Debido a que los derivados no son fluorescentes, la tcnica est limitada a la
deteccin por UV, la cual se lleva a cabo a 254nm (
mx
= 269 nm). Esta tcnica no es
tan sensible como las que utilizan reactivos fluorescentes, pero la alta absorcin en el
UV de los derivados hace que puedan ser detectados a niveles de picomoles, los cuales
representan los niveles prcticos de sensibilidad para muestras reales. El lmite de
sensibilidad es 50 picomoles en una relacin seal / ruido de 2.5, la cual es 50 veces
menos sensible que la deteccin de los derivados de ortoftaldehdo y 9-fluorenilmetil
cloroformato.


f) Ortoftaldehido

El ortoftaldehido (OPA), fue introducido en 1971 y es el agente de
derivatizacin ms comnmente usado en cromatografa lquida de alta resolucin en
fase reversa para la determinacin de aminocidos. Se ha aplicado a vinos (Pozo-Bayn
et al., 2005; Soufleros et al., 2003; Lehtonen et al., 1996) y vinagres (Kutln y Molnr-
Perl, 2003). Otra de las aplicaciones de este reactivo ha sido la determinacin de
aminocidos enantimeros en alimentos y bebidas (Breckner et al., 1995).

El OPA es un reactivo que no tiene fluorescencia natural, la desarrolla al
reaccionar con funciones amino primarias. La reaccin tiene lugar en medio acuoso a
pH fuertemente alcalino en presencia de un agente reductor como el 2-mercapto-etanol,
Introduccin
24
3-mercapto-1-propanol o etanotiol. El derivado isoindlico formado es inestable y debe
ser estabilizado por acidificacin. La reaccin se completa totalmente en 1 2 minutos
a temperatura ambiente (Cceres et al., 1986).

Este reactivo se puede emplear tanto para la derivatizacin postcolumna como
para la precolumna.

No es necesario eliminar el exceso de OPA antes de inyectar la muestra ya que
el reactivo por s mismo no interfiere en la separacin o deteccin. Sin embargo, como
los derivados OPA-aminocidos son inestables, para conseguir unos resultados
reproducibles es esencial una completa automatizacin de la reaccin precolumna
controlando de manera muy precisa el tiempo de reaccin. El lmite de deteccin con
este reactivo est en el rango de los fentomoles, lo que demuestra que esta tcnica es
diez veces ms sensible que la reaccin con ninhidrina.

Por otro lado, el OPA no reacciona con grupos amino secundarios, por tanto, si
queremos determinar prolina e hidroxiprolina simultneamente con el resto de los
aminocidos, hay que recurrir a una oxidacin con hipoclorito sdico que rompe el
anillo y los convierte en aminocidos primarios. Otra alternativa es utilizar OPA con
otro agente que permita derivatizar los aminocidos secundarios. Algunos autores
usaron una doble derivatizacin con ortoftaldehdo y 9-fluorenilmetil cloroformato para
determinar los aminocidos primarios y secundarios en mostos y vinos (Herbert et al.,
2000; Martnez-Rodrguez et al., 2002). Pripis-Nicolau et al. (2001) desarrollaron un
mtodo para determinar la cistena y otros aminocidos en mostos y vinos utilizando
una derivatizacin previa con cido iodoactico (IDA) seguida de otra con OPA.

Otro inconveniente de este reactivo es la dbil respuesta de la lisina, que puede
ser debida a la presencia de dos estructuras isoindlicas fluorescentes que interaccionan.
La cistena es tambin un aminocido que presenta una dbil respuesta debido
probablemente a la fcil descomposicin del derivado. La solucin que proponen
algunos autores es realizar una oxidacin previa con cido peroxifrmico o una
carboximetilacin y detectar el aminocido como cido cistico o carboximetilcistena
(Cceres et al., 1986).

Los derivados tambin se pueden detectar en ultravioleta a 330 nm, pero para
una mayor sensibilidad, se utiliza con preferencia la deteccin por fluorescencia, cuya
emisin se mide a una de 430 nm.


g) 9-Fluorenilmetil cloroformato

Se ha demostrado que el 9-fluorenilmetil cloroformato (FMOC-CL) es adecuado
para la deteccin por fluorescencia de aminocidos primarios y secundarios. Este
reactivo da lugar a derivados estables y altamente fluorescentes (Bauza et al., 1995).

A diferencia de los otros derivatizantes precolumna que producen derivados
fluorescentes, el FMOC-CL es por s mismo fluorescente. FMOC y los productos
obtenidos de su hidrlisis pueden interferir en la cuantificacin de los aminocidos
derivados, sin embargo, esta propiedad no tiene por qu ser un factor limitante, ya que
el exceso de reactivo y los productos fluorescentes formados en reacciones laterales se
Introduccin
25
pueden eliminar sin que se pierdan los aminocidos derivados mediante una extraccin
lquido-lquido. Otra mtodo alternativo para evitar la interferencia del FMOC-OH es
que el exceso de FMOC reaccione con una amina muy hidrofbica para formar un
derivado que eluya despus de los picos de inters (White y Hart, 1992a).

Este agente derivatizante se ha empleado para determinar aminas bigenas y sus
aminocidos precursores en vinos (Bauza et al., 1995; Lehtonen et al., 1996) y en
alimentos (Kirschbaum et al., 1994).


h) Etoximetilenmalonato de dietilo

El etoximetilenmalonato de dietilo (EMMDE), es otro agente de derivatizacin
precolumna capaz de reaccionar con aminocidos primarios y secundarios dando lugar a
derivados detectables en la regin UV-visible.

Este agente se ha aplicado para determinar el contenido de aminocidos en
muestras de vino (Chichn et al., 2001) y posteriormente en diferentes tipos de mieles
espaolas (Hermosn et al.,2003). En este ltimo trabajo de investigacin, se examin la
informacin obtenida para establecer si la composicin de aminocidos libres de una
miel poda explicar sus orgenes botnicos.

Ms recientemente, Hermosn et al. (2006) han desarrollado un mtodo para el
anlisis conjunto de aminas bigenas, aminocidos e in amonio en vinos. Este mtodo
consiste en la separacin mediante CL en fase reversa de las aminoenonas formadas por
reaccin de los aminocidos, las aminas bigenas y el in amonio con el agente
prederivatizante etoximetilenmalonato de dietilo (EMMDE).

La reaccin de derivatizacin se realiza en medio metanlico bsico, durante 30
minutos. Posteriormente, la muestra se calienta 2 horas a 70C para la completa
degradacin del exceso de reactivo y de sus productos secundarios de reaccin. La
mayora de los derivados obtenidos son perfectamente estables, al menos durante la
primera semana, excepto prolina e hidroxiprolina, por lo que de ser necesaria su
cuantificacin, el anlisis debera realizarse en las 24 horas siguientes a la reaccin de
derivatizacin. Este es uno de los inconvenientes del mtodo.

Sus ventajas son: derivatizacin directa sin preparacin previa; cuantificacin
simultnea de 24 aminocidos (incluida prolina), 9 aminas bigenas y el in amonio;
empleo del detector UV-Visible, el ms habitual en cualquier laboratorio y no
interferencia en el cromatograma del exceso de agente derivatizante.

Los lmites de deteccin estn por debajo de 0.4 mg/L entre los aminocidos, y
de 0.07 mg/L entre las aminas bigenas. Con otros agentes se han conseguido lmites de
deteccin ms bajos por lo que este reactivo se debe usar cuando no se requiera una
sensibilidad por debajo de picomoles. Otro inconveniente es el tiempo de
derivatizacin, ya que con otros agentes se consiguen procesos de derivatizacin ms
cortos (Alaiz et al., 1992).



Introduccin
26
i) 6-Aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato

El 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) es un agente para la
derivatizacin de grupos aminos, especficamente diseado para el anlisis de
aminocidos, con la idea de simplificar la reaccin de derivatizacin, aumentar los
rendimientos de la reaccin e incrementar la sensibilidad y selectividad de los derivados
formados cuando se trabaja con deteccin por fluorescencia (Cohen y Michaud, 1993;
Cohen y Antonis, 1994; Wandelen y Cohen, 1997). HernndezOrte et al. (2003)
optimizaron las condiciones de separacin propuestas por Cohen y Michaud (1993) para
conseguir una cuantificacin simultnea de los aminocidos libres de los mostos y vinos
sin problemas de interferencia debidos al contenido de azcar.

Este compuesto reacciona rpidamente con los aminocidos primarios y
secundarios formando productos altamente estables con una fuerte fluorescencia a
395 nm (Figura 1.7). Los derivados que resultan son estables a temperatura ambiente
durante, al menos, una semana y se separan fcilmente por CL en fase reversa utilizando
una columna de C18.




Figura 1.7. Reaccin de derivatizacin del AQC



El exceso del reactivo se hidroliza durante la reaccin para formar 6-
aminoquinolina (AMQ) (Figura 1.8), cuyas caractersticas espectrales son netamente
diferentes a cualesquiera de los aminocidos derivatizados. Ello permite programar una
longitud de onda que maximice la respuesta de emisin de los derivados y reduzca al
mnimo la respuesta del AMQ. En esta hidrlisis del reactivo tambin se forma N-
O
N
N
O
N
O
O
H
+
R
1
N H
R
2
AQC Aminocido 1 y 2
N
N
N
O
H
R
1
R
2
+
O H
O
N
O
Aminocido derivatizado NHS
Introduccin
27
hidroxisuccinimida (NHS) y dixido de carbono pero stos no interfieren en el anlisis
cromatogrfico. La destruccin de exceso del reactivo es completa en un minuto.




Figura 1.8. Hidrlisis del exceso de AQC



El protocolo de derivatizacin, agregado del reactivo y calefaccin de la muestra
previamente tamponada, es simple y directo. Los derivados de los aminocidos se
inyectan directamente sin preparacin adicional de la muestra, mientras que las sales
(presentes en la muestra) prcticamente no causan interferencias en la reaccin o en la
reproducibilidad de los resultados (Wandelen y Cohen, 1997).

Este mtodo ha sido optimizado para su uso con un detector de fluorescencia con
el fin de lograr lmites de deteccin de 50-300 fentomoles para los aminocidos
existentes en pptidos e hidrolizados de protenas (Hernndez-Orte et al., 2003).

Utilizando un detector de UV, a 250 nm, el AMQ absorbe alrededor de 200
veces ms que cualquiera de los aminocidos derivatizados y esto puede ocasionar
dificultades en la cuantificacin del cido asprtico, que es el primero de los
aminocidos en eluir. Esto no ocurre cuando la deteccin se lleva a cabo por
fluorescencia, ya que la seal del AMQ es mucho menor a la obtenida en el UV. Otra
caracterstica del AMQ es que su tiempo de retencin puede variar dependiendo del pH
de la fase mvil.

La presencia de dos grupos fluorescentes en una misma molcula puede
disminuir considerablemente su fluorescencia debido a un fenmeno conocido como
"quenching interno". Este efecto se observa muy dbilmente en el caso de la molcula
O
NH
N
O
N
O
O
+
AMQ
+
O H
O
N
O
NHS
O H
2
NH
2
N
+
CO
2
AQC
Introduccin
28
de lisina, pero es bien notorio con el triptfano. En este caso la sensibilidad del mtodo
se ve ampliamente favorecida por el uso de un detector UV.
Tanto el anlisis de muestras con triptofano, como el anlisis de aminocidos libres en
una solucin intravenosa, puede ser eficazmente realizado usando ambos detectores en
serie, primero el de fluorescencia para la mayora de los aminocidos y luego el detector
UV para el triptofano.

Este reactivo tambin se ha utilizado como una alternativa al reactivo de
derivatizacin ms comn, OPA, para determinar aminas biognicas en vinos (Busto et
al., 1996) y para estudiar la evolucin de los aminocidos y pptidos durante la
fermentacin alcohlica y autolisis de los vinos (Alexandre et al., 2001).

En la siguiente tabla se muestra un resumen de los agentes empleados en la
derivatizacin de los aminocidos con sus ventajas e inconvenientes.



Tabla 1.3. Agentes empleados en la derivatizacin de aminocidos

Reactivo

Derivatiz.

Mec
separacin

Tipo detec.

Ventajas

Inconvenientes

Ninhid
rina
a
Postcolumna
Intercambio
inico
UV
-Reaciona con aa
primarios y secundarios

-Capaz de detectar
picomoles
-No reproducible en
cantidades menores a 100
picomoles
-Problemas de
interferencias con la
matriz
-Sensible a la luz, O
2,
cambios T y pH

DNS-
Cl
a b
Precolumna
y
Postcolumna
Fase reversa
Fluorescencia

UV
-Reacciona con aa
primarios y secundarios
-Capaz de detectar
picomoles o fentomoles
-Derivados estables a la
hidrlisis
-Buena reproducibilidad
para todos aa menos para
His
-Muy adecuado para
determinar Cys
-El exceso de reactivo
interfiere en el cromatog.
-Los derivados son
fotosensibles
-Reaccin lenta
-His forma picos
mltiples
-No es especfico y
reacciona con otros
compuestos
DABS-CL Precolumna Fase reversa Visible
-Reacciona con aa
primarios y secundarios.
-Derivados muy estables
(4 semanas a T
ambiente)
-Capaz de detectar
picomoles
-El exceso de reactivo
interfiere en el cromatog.
-Las sales y detergentes
presentes en las muestras
interfieren
-Produce mltiples
derivados
DNFB
Precolumna Fase reversa Fluorescencia
-Reacciona con aa
primarios y secundarios
-Capaz de detectar bajos
niveles de picomoles
-Determina aa que otros
agentes resuelven peor
-Los derivados son
fotosensibles
-Reaccin muy lenta.
-Mtodo destructivo para
pptidos
a
Aplicado en muestras de vino
b
Aplicado en muestras de vinagre


Introduccin
29
Tabla 1.3. Agentes empleados en la derivatizacin de aminocidos (Continuacin)

Reactivo Derivatiz.
Mec
separacin
Tipo detec. Ventajas Inconvenientes
PITC
a b
Precolumna Fase reversa UV
-Reacciona con aa
primarios y secundarios.
-Determina Prolina e
Hidroxiprolina con una
sensibilidad de picomoles
-Reaccin rpida
-Forma derivados ms
estables que otros
reactivos
-El reactivo se puede usar
en exceso porque no
interfiere
-Problemas de
interferencias con la
matriz en el anlisis de
mostos
-No adecuado para su
automatozacin
-Sensibilidad menor a
otros mtodos (50 veces
menor que OPA y
FMOC)

-El proceso es lento
porque necesita un paso
de evaporacin a
sequedad
OPA
a b
Precolumna
y
Postcolumna
Fase reversa
y
Cromatg.
Intercambio
inico
Fluorescencia

UV
-El reactivo se puede usar
en exceso porque no
interfiere
-Reaccin rpida
-Derivados altamente
fluorescentes
-10 veces ms sensible
que reaccin con
Ninhidrina
-Los derivados son
inestables
-No reacciona con aa
secundarios (prolina)
-Necesita una completa
automatizacin de la
reaccin
-Respuesta de la
Lys,Hidroxilisina y Cys
baja
-Derivados se
descomponen
FMOC
a
Precolumna Fase reversa Fluorescencia
-Reacciona con aa
primarios y secundarios
-Reaccin rpida (30
segundos)
-Derivados estables y
altamente fluorescentes
-Muy sensible

-Produce mltiples
derivados
-El reactivo es por s
mismo fluorescente e
interfiere en el cromatog.
-El Proceso de derivatiz.
es lento ya que se tiene
que eliminar el reactivo
EMMDE

Precolumna Fase reversa UV-Visible
-Reacciona con
aminocidos primarios y
secundarios
-Derivatizacin directa
sin previa preparacin
-El exceso de reactivo no
interfiere
-Sensibilidad de
picomoles
-Proceso de
derivatizacin lento
-Inestablilidad de los
derivados de prolina e
hidroxiprolina
-No sensible a niveles
inferiores a picomoles

AQC
a
Precolumna Fase reversa
Fluorescencia

UV
-El exceso de reactivo no
interfiere
-Reacciona con aa
primarios y secundarios
-Derivados estables y
altamente fluorescentes
-Muy sensible (50-300
fentomoles)
-Reaccin rpida
-Derivados se inyectan
sin previa preparacin de
la muestra
-Las sales y detergentes
de muestras no interfieren
-Lys y Trp muestran una
menor fluorescencia por
el llamado quenching
interno
-Si el amonio no se
derivatiza totalmente, el
exceso de ste puede
distorsionar el anlisis de
Arg y Thr
a
Aplicado en muestras de vino
b
Aplicado en muestras de vinagre
Introduccin
30
Aunque la derivatizacin precolumna ofrece ms ventajas, ninguno de los
agentes prederivatizantes estudiados se considera el agente universal ya que ninguno
cumple todos los requisitos:

Reaccionar rpidamente bajo condiciones suaves para obtener el
derivado de forma cuantitativa.

Reaccionar con aminocidos primarios y secundarios.

Los derivados deberan ser estables durante varios das, preferiblemente
a temperatura ambiente para permitir el anlisis automatizado de
mltiples muestras.

Respuesta lineal en los niveles de concentracin tpicos de la mayora de
las aplicaciones.

El exceso de reactivo o productos secundarios no deberan interferir en el
anlisis de aminocidos.


1.2.4. Eleccin del mtodo ptimo

Cada uno de los mtodos tiene sus propias ventajas e inconvenientes. El criterio
predominante que influir en la seleccin de la derivatizacin y en los procedimientos
de CL son la resolucin, la sensibilidad y la velocidad.

Hasta ahora los agentes derivatizantes que se han aplicado para la determinacin
de aminocidos en vinagres ha sido cloruro de dansilo, fenilisotiocianato y
ortoftaldehdo. El ortoftaldehdo es el ms utilizado para la determinacin de
aminocidos tanto en muestras de vino como de vinagre, sin embargo, lo descartamos
ya que no reacciona con la prolina, que es uno de los aminocidos ms abundantes en
las muestras de vinagre. Adems, los derivados que se obtienen son inestables. Los
otros dos agentes (cloruro de dansilo y fenilisotiocianato), tambin se descartaron ya
que se ha visto que dan problemas de interferencias con la matriz y el proceso de
derivatizacin es lento. Otro de los motivos por lo que se descart el cloruro de dansilo
fue la fotosensibilidad de los derivados.

Por otro lado, el etoximetilenmalonato de dietilo, a pesar de sus numerosas
ventajas tambin se descart por tener un proceso de derivatizacin ms largo y por la
inestabilidad que presentan los derivados de la prolina. Los restantes reactivos
derivatizantes, tambin mostraban problemas en cuanto a la estabilidad de los derivados
y a la interferencia del exceso de reactivo en el cromatograma.

En este trabajo de investigacin, se propone la utilizacin del mtodo empleado
por Hernndez-Orte et al., (2003) para aplicarlo a la determinacin de aminocidos en
muestras de vinagre de vino y para el seguimiento del proceso de acetificacin. Los
aminocidos de separan mediante CL tras una previa derivatizacin con el agente AQC
y se determinan por fluorescencia. La validacin de este mtodo para vinagres
comprende la determinacin de los parmetros analticos: selectividad, exactitud,
precisin, linealidad, sensibilidad y lmites de deteccin y cuantificacin.
Materiales y Mtodos
31



2. MATERIAL Y MTODOS



2.1. MATERIAL


2.1.1 Muestras

La determinacin se llev a cabo en un total de 36 muestras de vinagres de vino
o de vinos en proceso de acetificacin (Tabla 2.1), que se obtuvieron a partir de dos
sustratos vnicos distintos. La acetificacin de los mismos se llev a cabo mediante
cultivo superficial (mtodo de Orlens) utilizando barricas de diferentes tipos de
maderas.

La codificacin empleada para identificar las muestras de vinagre es de la forma
XYZ
n
.

X indica el vino del que proviene el vinagre, por tanto, tomar los dos posibles
valores:

- F, vino tinto procedente del sur de Francia cuyas caractersticas aparecen
en la Tabla 2.1., con elevado azcar residual.

- T, vino tinto de la denominacin de origen Priorato cuyas caractersticas
aparecen en la misma Tabla.

Se han seguido seis acetificaciones por cada sustrato que se indican con los
dgitos YZ. Las acetificaciones de cada sustrato se llevaron a cabo en seis barricas de 60
L de capacidad que se llenaron con un total de 40 L. Estas barricas presentan diferencias
en cuanto a sus caractersticas de madera (indicado con la letra Y) y tonelera (indicado
con la letra Z). Las acetificaciones duraron entre 1.5 - 2.5 meses para las muestras del
sustrato vnico F y entre 5 - 9 meses para las del sustrato vnico T.

n indica el momento de la toma de muestra durante el proceso de acetificacin,
tomando 3 posibles valores:

i si se encuentra al inicio (0.37 0.62 grados acticos)

m si se encuentra a mitad del proceso de fermentacin (3.5 4 grados
acticos)

f si se encuentra al final del proceso de fermentacin (5.5 6 grados
acticos)


Materiales y Mtodos
32



Tabla 2.1. Muestras estudiadas en la presente memoria

Puntos de muestreo durante la acetificacin
Vino de partida Madera
Inicio Mitad Final
AL FAL
i
FAL
m
FAL
f
BL FBL
i
FBL
m
FBL
f
CK FCK
i
FCK
m
FCK
f
CL FCL
i
FCL
m
FCL
f
CM FCM
i
FCM
m
FCM
f
Sustrato F

Grado alcohlico: 9.2
Grado actico: 0.9

DL FDL
i
FDL
m
FDL
f
AL TAL
i
TAL
m
TAL
f
BL TBL
i
TBL
m
TBL
f
CL TCL
i
TCL
m
TCL
f
DK TDK
i
TDK
m
TDK
f
DL TDL
i
TDL
m
TDL
f
Sustrato T

Grado alcohlico: 11.3
Grado actico: 0.9

DM TDM
i
TDM
m
TDM
f




2.1.2. Reactivos


a) Reactivo empleado para la reaccin de derivatizacin

Kit AccQ-Fluor, constituido por 6-Aminoquinolil-N-Hidroxisuccinimidil
Carbamato (AQC), acetonitrilo para disolver el reactivo y disolucin tampn de borato
sdico 0.2 mM a pH 8.8. Waters WAT052880 (Milford, MA, USA).


b) Sustancias patrn

Se han empleado un total de 24 patrones comerciales, correspondientes a los
principales aminocidos en el vino y en vinagre, amonio y patrn interno (Tabla 2.2)











Materiales y Mtodos
33
Tabla 2.2. Patrones de aminocidos

Aminocido Proveedor
Referencia

L-cido Asprtico Aldrich A9,310-0
L-Asparagina Fluka 11150
L-Serina Fluka 84960
L-cido Glutmico Aldrich 12,843-0
L-Histidina Sigma H-8000
L-Glutamina Fluka 49419
L-Glicina Merck 1.04201
L-Arginina Fluka 11009
L-Treonina Fluka 89179
L-Alanina Aldrich A2,680-2
L-Prolina Fluka 81710
cido -Aminobutrico Sigma 2129
cido -Aminobutrico (PI)
*
Fluka 07200
L-Cisteina Fluka 30089
L-Tirosina Fluka 93830
L-Valina Fluka 94620
L-Metionina Fluka 64320
L-Ornitina monohidroclorada Merck 1.06906
L-Lisina Sigma L-5501
L-Isoleucina Fluka 58880
L-Leucina Fluka 61820
L-Fenilalanina Fluka 78020
L-Triptfano Fluka 93659
Sulfato Amnico Sigma A-2939

* PI: Patrn Interno



c) Otros Reactivos

Para la preparacin de los eluyentes se han utilizado distintos productos de calidad
HPLC (Tabla 2.3). El agua desionizada fue obtenida con un sistema de purificacin
Milli-Q Millipore.




Tabla 2.3. Reactivos para eluyentes

Materiales y Mtodos
34
Reactivo
Proveedor Referencia

EDTA clcico disdico Sigma ED2SC
Acetato sdico trihidratado Fluka 71190
Trietilamina (TEA) Fluka 90335
cido fosfrico Sigma-Aldrich 466123
Acetonitrilo Merck 1.14291

Adicionalmente se emplearon para la preparacin de las disoluciones de
patrones:

cido Clorhdrico 32% Merck 1.00319
Amoniaco 25% Merck 1.05432



2.1.3. Instrumentacin


2.1.3.1. Cromatgrafo lquido de alta eficacia

- Equipo cromatogrfico Waters, formado por:

Inyector automtico Waters 717

Bomba cuaternaria Waters 600E System Controller

Horno Waters Steel Columm Heater Module

Estacin de datos Millennium
32

Desgasificador en lnea AF Waters

Detector de haz de fotodiodos Waters 996

Detector de fluorescencia Waters 474

- Columna de slice Luna C18 en fase reversa, tamao de partcula 5m, 250 x
4.6 mm Phenomenex (Torrance, CA, USA) (Distribuida por Jasco Analtica
SPAIN, Madrid).

- Precolumna 4.0 mm x 3.0 mm Phenomenex (Torrance, CA, USA).
(Distribuida por Jasco Analtica SPAIN, Madrid).

- Software Millennium
32
Chromatography Manager de Waters.



2.1.3.2. Instrumentacin y material
Materiales y Mtodos
35

Balanza Analtica Mettler con aproximacin de 0.0001g

Agitadores magnticos Selecta-P

Bao Ultrasonido Selecta-P con capacidad de 6 L

Bomba de Vaco de Membrana Vacuubrand Schott Iberia de 1.7
m
3
/h

pH-metro Crison GLP22

Bao de agua termostatizado Selecta-P Digiterm 3000542

Vortex IKA 230V, 50/60Hz

Sistema de filtracin de agua Milli-Q Millipore

Filtros con un tamao de poro de 045m Millipore

Micropipeta digital Nichipet EX Nichiryo de 10 a 100l

Micropipeta digital Nichipet EX Nichiryo de 100 a 1000l

Desecador de vidrio con gel de slice



2.2. MTODOS


2.2.1. Preparacin de las fases mviles

La disolucin de acetato sdico se prepar disolviendo 19.05 g de acetato sdico
trihidratado con agua Milli-Q hasta un volumen final de 1 L. Seguidamente se ajust el
pH de dicha disolucin a 5.5 con una disolucin de cido fosfrico en agua al 10%
(p/v). Una vez ajustado el pH se aadi 1 mL de una disolucin de EDTA clcico
disdico en agua (1g/L) y 2.37 mL de trietanolamina (TEA). Finalmente se ajust de
nuevo el pH bien a 4.92 (para la preparacin la fase mvil D) o a 5.15 (para la
preparacin de las fases B y C) con el cido fosfrico al 10% y se aadi la
correspondiente proporcin de acetonitrilo (fases D, C y B). Para la fase mvil A se
utiliz acetonitrilo y agua en la proporcin 60:40.

Todas las disoluciones fueron filtradas a travs de un filtro de membrana
Millipore con un tamao de poro de 0.45 m antes de ser usadas.



2.2.2. Condiciones cromatogrficas
Materiales y Mtodos
36

Los derivados de aminocidos se separaron empleando un gradiente cuaternario
compuesto por las siguientes fases mviles:





Fase Mvil A: acetonitrilo - agua Milli-Q (60:40)

Fase Mvil B: acetato sdico pH 5.15 - acetonitrilo (80:20)

Fase Mvil C: acetato sdico pH 5.15 - acetonitrilo (96:4)

Fase Mvil D: acetato sdico pH 4.92 - acetonitrilo (96:4)


Partiendo del gradiente propuesto por Hernndez-Orte et al. (2003) se realizaron
sucesivas pruebas de gradiente, resultando ser el ms adecuado el que figura en la
siguiente tabla:



Tabla 2.4 . Gradiente de elucin
















Los cambios de gradiente se realizaron de manera lineal y el anlisis
cromatogrfico se llev a cabo a 34 C. El volumen de inyeccin fue de 20 L.



2.2.3. Preparacin de patrones

Se prepararon disoluciones para cada uno de los patrones de aminocidos
estudiados, as como para el amonio. Las disoluciones de cada patrn se prepararon
disolviendo en agua Milli-Q una cantidad correspondiente a 400 mg de patrn hasta un
Tiempo (min) %A %B %C %D
0 0 0 0 100
20 0 0 0 100
22 0 0 100 0
25 0 31 69 0
28 0 34 66 0
44 0 57 43 0
64 0 100 0 0
84 100 0 0 0
94 0 0 0 100
Materiales y Mtodos
37
volumen final de 25 mL. Para algunos aminocidos fue necesaria la adicin de cido
clorhdrico o amoniaco para su completa disolucin como se indica en la Tabla 2.5.







Tabla 2.5. Concentraciones de las distintas disoluciones empleadas

Patrones Riqueza
%
mg Patrn 1
(mg/L)
Patrn 3
(mg/L)
Asprtico (Asp)

98 400 1.568 333.2
Asparagina (Asn)
a
>99 400 1.584 330.66
Serina (Ser)

99 400 1.584 265.32
cido Glutmico (Glu)
a
99 400 1.584 368.28
Histidina (His) 99 400 1.584 388.08
Glutamina (Gln)
a
>99.5 400 1.592 366.16
Glicina (Gly) 99.7 400 1.595 189.43
Arginina (Arg) >99.5 400 1.592 437.8
SulfatoAmnico (NH4
+
)

98 1498 1.600
*
45.2
Treonina (Thr) >99.5 400 1.592 298.102
Alanina (Ala) 99 400 1.584 222.948
Prolina (Pro) 99 400 1.584 289.08
cido -Aminobutrico (GABA) 99 400 1.584 259.38
Cisteina (Cys)
a
>99.5 400 1.592 455.4
Tirosina (Tyr)
a
>99 400 1.584 293.04
Valina (Val)
a
>99 400 1.584 374.22
Metionina (Met)
a
>99 400 1.584 332
Ornitina monohodroclorada (Orn)

99 515 1.600
**
366.52
Lisina (Lys) 98 400 1.568 328.68
Isoleucina (Ileu)
a
>99 400 1.584 328.68
Leucina (Leu)
a
99 400 1.584 413.82
Fenilalanina (Phe) >99 400 1.584 513.42
Triptfano (Trp)
b
>99.5 400 1.592


*
Concentracin de amonio
a
Se aadi cido clorhdrico al 32% hasta disolucin

**
Concentracin de ornitina
b
Se aadi amoniaco al 25% hasta disolucin



La preparacin de la disolucin del patrn interno -aminobutrico (disolucin
patrn 2) empleada en el estudio se llev acabo en dos pasos. En primer lugar se
disolvi 26.04 mg de patrn en 50 mL de agua Milli-Q, resultando una disolucin de
520 mg/L teniendo en cuenta su riqueza. En segundo lugar, se tom 1.25 mL de la
disolucin anterior y se llev a un volumen final de 10 mL con agua Milli-Q. Esta
nueva disolucin tiene una concentracin de 64.45 mg/L de cido -aminobutrico.

Los aminocidos y el in amonio son inestables en disolucin a temperatura
ambiente y con el tiempo se van descomponiendo. Por este motivo se deben conservar a
Materiales y Mtodos
38
una temperatura entre 4 y 8C y los ms inestables (cisteina, metionina, triptfano,
ornitina, tirosina y amonio) a 20C.

A partir de las disoluciones patrn 1 de los distintos estndares se prepararon,
mediante sucesivas diluciones, la disolucin patrn 3 y la disolucin mezcla
enriquecimiento.

La disolucin patrn 3, es una mezcla de todos los aminocidos estudiados y
se emple para preparar los diferentes niveles de concentracin de la recta de calibrado.
Por otro lado, la disolucin mezcla enriquecimiento que se utiliz para realizar
los estudios de recuperacin se prepar aadiendo todos los aminocidos estudiados,
resultando tener una concentracin final de 1 mg/L de cada uno de ellos. Debido a que
los estndares de aminocidos contienen como impureza in amonio, se prepar, de
forma independiente, una disolucin con la misma concentracin (1 mg/L), que slo
contena dicho compuesto.

Antes de la derivatizacin, se procedi del siguiente modo, tanto para disoluciones de estndares, como
para muestras:

- Se tomaron 50 L de -ABA (PI) de la disolucin Patrn 2 (64.45 mg/L), 125 L bien de las
disoluciones estndares o de las muestras diluidas y se aadi agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5
mL. A esta disolucin se le denomin mezcla prederivatizacin.

La mezcla prederivatizacin de aminocidos usada para la seleccin del
gradiente ms adecuado contena una concentracin de 0.01 mM de PI, 0.1 mM de
ornitina, 0.15 mM de triptfano y cisteina y 0.05 mM del resto de aminocidos y
amonio.



2.2.4. Preparacin de muestras

Las muestras de vinagre se filtraron con papel de filtro y posteriormente se
diluyeron al 25% aadiendo 500 L de la muestra a 1500 L de agua Milli-Q. A partir
de las muestras as diluidas se prepar la mezcla prederivatizacin correspondiente tal y
como se ha explicado en el apartado anterior.



2.2.5. Reaccin de derivatizacin

La reaccin de derivatizacin se llev a cabo siguiendo las instrucciones del kit
(Cohen y Michaud, 1993). Para ello se aadieron 20 L de la mezcla prederivatizacin
de los estndares o de las muestras diluidas a 60 L de una disolucin tampn de borato
sdico 0.2 mM a pH 8.8 y se agit vigorosamente con un vortex durante 10 segundos.
Posteriormente, a esta mezcla se le aadi 20 L de la solucin AQC agitando
nuevamente otros 10 segundos y se llev a un bao de agua a 55C durante 10 minutos
(Figura 2.1).




Materiales y Mtodos
39






























Figura 2. 1. Protocolo de derivatizacin




2.2.6. Identificacin

La deteccin de los distintos aminocidos y el amonio se realiz con un detector
de fluorescencia usando una
ex
de 250 nm y una
em
de 395 nm.

La identificacin se llev a cabo utilizando los tiempos de retencin
correspondientes a los picos cromatogrficos de los patrones y los tiempos de retencin
relativos de stos frente al patrn interno (Tabla 2.6). Para conocer tanto los tiempos de
retencin como el orden de elucin de los compuestos estudiados se comenz
inyectando de forma individual 0.04 nmoles del PI, 0.4 nmoles de ornitina, 0.6 nmoles
de triptfano y cisteina y 0.2 nmoles del resto de aminocidos y el amonio y finalmente
se inyect una mezcla de todos los patrones para comprobar la resolucin de los picos
cromatogrficos.



Mezcla
Prederivatizacin
60 L tampn borato
20 L AQC
Inyectan 20 L
55C-10 min

20 L
Materiales y Mtodos
40







Tabla 2.6. Tiempos de retencin


Tiempo de
retencin
Tiempo de retencin relativo
AMQ
*
23.784 0.442
Ac Asprtico(Asp) 30.414 0.566
Asparagina (Asn) 31.566 0.588
Serina (Ser) 32.938 0.613
Ac Glutmico(Glu) 34.599 0.643
Histidina (His) 34.863 0.648
Glutamina (Gln) 35.578 0.662
Glicina (Gly) 35.914 0.668
Arginina (Arg) 38.610 0.718
Amonio (NH4
+
) 39.881 0.742
Treonina (Thr) 41.453 0.771
Alanina (Ala) 43.773 0.814
Prolina (Pro) 47.865 0.890
Ac -Aminobutrico (GABA) 49.809 0.925
cido -Aminobutrico (PI) 53.772 1.000
Cisteina (Cys) 57.716 1.073
Tirosina (Tyr) 60.323 1.122
Valina (Val) 64.239 1.195
Metionina (Met) 65.736 1.222
Ornitina (Orn) 67.124 1.248
Lisina (Lys) 69.727 1.297
Isoleucina (Ileu) 75.565 1.405
Leucina (Leu) 76.346 1.420
Fenilalanina (Phe) 77.165 1.435
Triptfano (Trp) 77.883 1.448

*
AMQ: derivado de la hidrlisis del reactivo AQC que tiene lugar durante la reaccin de derivatizacin
(Figura 1.8 de Introduccin)




2.2.7. Cuantificacin

La cuantificacin se llev a cabo utilizando un patrn interno. Para ello se
construyeron rectas de calibrado tomando los cocientes entre las reas de los picos de
Materiales y Mtodos
41
cada compuesto y la del patrn interno frente a la concentracin de cada compuesto en
la mezcla prederivatizacin.

Como se seal en el apartado 2.2.3, para realizar las rectas de calibrado de los
aminocidos se tomaron diferentes volmenes de la mezcla patrn 3, cuyas
concentraciones se muestran en la Tabla 3.2 del apartado 3.2.2 de Resultados y
Discusin. Para el caso del in amonio y debido a que los estndares de aminocidos
contienen como impureza in amonio, se prepar de forma independiente una
disolucin patrn 3 que contena slo dicho compuesto, a partir de la cual, tomando
diferentes volmenes, se construy la recta de calibrado del amonio.

Las rectas de calibrado se construyeron inyectando por duplicado los distintos
niveles de concentracin, previa derivatizacin tambin por duplicado.



2.2.8. Lmites de deteccin y cuantificacin

Dado un mtodo analtico determinado, se entiende por lmite de deteccin
(LDD) la mnima concentracin o cantidad de analito presente en la muestra que se
puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo las condiciones
experimentales descritas; y por lmite de cuantificacin (LDC) la mnima concentracin
o cantidad de analito en la muestra que se puede cuantificar, bajo dichas condiciones
experimentales, con una adecuada precisin y exactitud.

Existen diferentes formas de determinar los lmites de deteccin y cuantificacin
dependiendo si el procedimiento es no-instrumental o instrumental (ICH, 1996):
Basados en una evaluacin visual
Basados en la seal/ruido
Basados en la desviacin estndar de la respuesta y la pendiente
Basados en la extrapolacin de la recta de calibrado a concentracin cero

En nuestro caso, los lmites de deteccin y cuantificacin fueron determinados
por el mtodo basado en la relacin seal/ruido. Este mtodo, uno de los ms conocidos
y empleados, requiere que el procedimiento de anlisis sea instrumental y que
proporcione una seal blanco, un ruido de fondo o una lnea de base, es decir una seal
residual a concentracin cero del analito tal como ocurre en los mtodos
cromatogrficos.

Para estimar los lmites de deteccin y cuantificacin en estos casos se han
propuesto estrategias basadas en la medida de la magnitud del ruido y de la altura de los
picos de los analitos. Generalmente se define el lmite de deteccin como la
concentracin que origina una seal/ruido (S/R), igual a un determinado valor, que
generalmente es 3. Anlogamente, el lmite de cuantificacin corresponde a una
relacin S/R de 10. As pues, en la prctica fue preciso medir la magnitud del ruido,
multiplicar su valor por el factor elegido y convertirlo en una concentracin mediante la
recta de calibrado. Para estimar la magnitud del ruido se realizaron mediciones sobre la
lnea base de un cromatograma obtenido con un blanco, midindose su amplitud, es
decir la diferencia entre el valor mximo y el mnimo.

Materiales y Mtodos
42
Debido a que no es posible encontrar en nuestro caso muestras blancas, es
decir muestras de vino o vinagre sin aminocidos, para la elaboracin del blanco se
realiz la reaccin de derivatizacin sobre una disolucin acuosa que contena
exclusivamente el patrn interno.




2.2.9. Estudios de precisin

El objetivo del estudio de la precisin es conocer la variabilidad del mtodo de
ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo mtodo de
ensayo. Como consecuencia de la existencia de estos errores, los anlisis efectuados
sobre muestras idnticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a
resultados idnticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un
ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos,
tiempo, etc.) de aqu la importancia del estudio de la precisin.

La precisin es una medida del grado de separacin o dispersin entre las
medidas realizadas empleando un mtodo analtico y trabajando en condiciones
normales de operacin. Se expresa normalmente como porcentaje de desviacin
estndar relativa (DER) o coeficiente de variacin (CV). La precisin debe evaluarse a
tres niveles: repetitividad, precisin intermedia y reproducibilidad.

La repetitividad es una medida del grado de dispersin de una serie de medidas
realizadas en un espacio de tiempo corto (en un mismo da). La precisin intermedia es
una medida de la dispersin de los resultados obtenidos por un mtodo analtico en un
espacio de tiempo ms amplio que la repetitividad, modificando ciertas condiciones de
operacin: diferentes das, analistas, equipos, etc. Por ltimo, la reproducibilidad
expresa la precisin entre laboratorios, formando parte de los estudios interlaboratorio.

Para cumplir los objetivos marcados en el presente trabajo, la precisin fue
evaluada a dos niveles: repetitividad y precisin intermedia. Se determin tanto para el
mtodo analtico como para el proceso de derivatizacin.

La medida de precisin, expresada como coeficiente de variacin (CV), se
determin mediante la expresin:

% CV = (s/x) 100

Donde s y x representan los valores de desviacin estndar y valor medio de una
serie de medidas repetidas.

Para los estudios de precisin se utiliz una muestra de vinagre diluida al 15%
enriquecida con una concentracin de 250 g/L de cada patrn .


a) Repetitividad

Materiales y Mtodos
43
Repetitividad del proceso de derivatizacin: Para llevar a cabo la
repetibilidad del proceso de derivatizacin se realizaron 5 derivatizaciones
de la muestra diluida inyectando cada una por duplicado en la misma sesin
de trabajo.

Repetitividad del mtodo analtico: En este caso se realizaron 5 replicados de
la muestra derivatizada en una nica sesin de trabajo.


b) Precisin intermedia

Precisin intermedia del proceso de derivatizacin: Para la precisin
intermedia del proceso de derivatizacin se realizaron 5 derivatizaciones de
la muestra diluida en 5 sesiones de trabajo diferentes, a lo largo de un
periodo de 25 das, inyectando cada una de ellas por duplicado.

Precisin intermedia del mtodo analtico: En el caso de la precisin
intermedia del mtodo se analiz la muestra derivatizada en 5 sesiones de
trabajo a lo largo de un periodo de 7 das.



2.2.10. Estudios de recuperacin

La exactitud se evalu mediante los estudios de recuperacin. Para llevar a cabo
dichos estudios se realiz la adicin de patrones a una muestra de vinagre diluida al
15% a tres niveles de concentracin: Nivel 0 = 250 g/L, Nivel 1 = 300 g/L, Nivel 2 =
350 g/L. Estas concentraciones se eligieron por estar dentro del intervalo de linealidad
de los distintos patrones.

La adicin se llev a cabo en la mezcla prederivatizacin del siguiente modo:

Nivel 0: Se tomaron 125 L de la muestra de vinagre diluida, 125 L de la
mezcla enriquecimiento y 50 L de la disolucin patrn 2 del PI, y se
diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5 mL, obtenindose
una concentracin de 250 g/L de cada patrn. (En el apartado 2.2.3 se
explica como se prepar la mezcla enriquecimiento).

Nivel 1: Se tomaron 125 L de la muestra de vinagre diluida, 250 L de la
mezcla enriquecimiento y se diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen
final de 2.5 mL, obtenindose una concentracin de 300 g/L de cada patrn.

Nivel 2: Se tomaron 125 L de la muestra de vinagre diluida, 375 L de la
mezcla enriquecimiento y se diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen
final de 2.5 mL, obtenindose una concentracin de 350 g/L de cada patrn.


Posteriormente se llev a cabo la reaccin de derivatizacin de los diferentes
niveles por duplicado y se inyect en el cromatgrafo 20 l de cada duplicado.
Materiales y Mtodos
44









2.2.11. Estudio de dilucin de las muestras

Dada la elevada sensibilidad del mtodo fue necesario diluir las muestras. Con objeto de
determinar la dilucin ptima de las mismas se realizaron diferentes diluciones en agua
tanto para vino como vinagre: 5, 15, 25, 35 y 50%.


2.3. TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS RESULTADOS

Con objeto de establecer si existen o no diferencias significativas entre las
muestras se aplic el anlisis de la varianza (ANOVA), usando el programa informtico
STADISTICA

99, versin 5.5.




















Resultados y Discusin
45



3. RESULTADOS Y DISCUSIN



3.1. ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES CROMATOGRFICAS

Se parti de las condiciones cromatogrficas recomendadas en el mtodo
original para vinos (Hernndez-Orte et al., 2003):

- Fases mviles: acetato sdico 0.14 M a pH 4.92 y 5.15, acetonitrilo y agua
Milli-Q.
- Flujo: 1 mL/min.
- Temperatura de la columna: 34C.
- Deteccin: fluorescencia con
ex
de 250 nm y
em
de 395nm.


La resolucin entre los picos correspondientes a la parte inicial y final del
cromatograma obtenido de la disolucin patrn no era satisfactoria por lo que se
hicieron varias modificaciones en el gradiente hasta conseguir la mejor resolucin. Las
fases mviles y el gradiente definitivo aparecen en la Tabla 2.4 de Materiales y
Mtodos. El resto de las condiciones se mantuvieron igual que en el mtodo original.

En la Figura 3.1. se muestra un cromatograma de una disolucin de patrones en
las condiciones ptimas del mtodo.




Figura 3.1. Cromatograma de una disolucin de patrones en las condiciones ptimas del
mtodo. R: AMQ (Producto de la hidrlisis del reactivo); 1: Asp; 2: Asn; 3: Ser; 4: Glu; 5: His; 6: Gln;
7: Gly; 8: Arg; 9: Amonio; 10: Thr; 11: Ala; 12: Pro; 13: GABA; 14: Cys; 15: Tyr; 16: Val; 17: Met; 18:
Orn; 19: Lys; 20: Ileu; 21: Leu; 22: Phe; 23: Trp.


Resultados y Discusin
46


Una vez establecidas las condiciones cromatogrficas se llev a cabo la
validacin del mtodo.



3.2. VALIDACIN DEL MTODO

La definicin ISO (International Standars Organization) de validacin aplicada a
los mtodos analticos podra interpretarse como el proceso mediante el cual queda
establecido, por estudios experimentales, que la capacidad del mtodo satisface los
requisitos para la aplicacin analtica requerida.

Existe una gran variedad de documentacin acerca de la validacin de los
mtodos analticos (Huber, 1998; AEFI, 2001; ICH, 1996), especialmente para mtodos
concretos (Filipe-Ribeiro y Mendes-Faia, 2006), y numerosas organizaciones
promueven su difusin e importancia, como la AOAC (Association of Official
American Chemists), EPA (Environmental Protection Agency), FDA (Food and Drug
Administration), ICH (International Conference on Harmonization), USP (United States
Pharmacopeia), EURACHEM (European Analytical Chemistry), etc.

La validacin de la metodologa propuesta se realiz siguiendo las
recomendaciones de la ICH y EURACHEM publicados en guas para la validacin de
mtodos y procedimientos analticos (EURACHEM, 1993; ICH, 1996).

La validacin lleva consigo la evaluacin de varios parmetros del mtodo como
la selectividad, exactitud (estudios de recuperacin), precisin, linealidad de la
respuesta del detector frente a la concentracin, sensibilidad, as como lmites de
deteccin y cuantificacin (Huber, 1998).



3.2.1. Especificidad o selectividad

Ambos trminos se utilizan con frecuencia indistintamente, an siendo
conceptos diferentes. Para los mtodos cromatogrficos, la especificidad es la capacidad
del mtodo para medir con exactitud la respuesta de un analito en presencia de todos los
posibles componentes de una muestra, mientras que el trmino selectividad se refiere a
un mtodo que proporciona respuestas para un nmero de entidades qumicas que
pueden o no ser distinguidas de otras. Si la respuesta se distingue de todas las dems, se
dice que el mtodo es selectivo. Por tanto, el trmino adecuado en nuestro caso es
selectividad (Huber, 1998).

La selectividad se determin en un sustrato vnico y en muestras de vinagre
tomndose como criterio que los picos adyacentes correspondientes a los analitos
tuvieran una resolucin de al menos 1.5 respecto a los picos restantes. Cuando se
calcula la resolucin en el sustrato vnico y vinagre todos los aminocidos presentan
resoluciones superiores a 1. En el sustrato vnico (Tabla 3.1 Resolucin A), de todos
los pares de picos, 16 tienen valores superiores a 2 y slo tres entre 1 y 1.5 (resolucin
entre Ser-Glu, Glu-His y NH4
+
). Por otro lado, la resolucin de los picos en las
Resultados y Discusin
47
muestras de vinagre (Tabla 3.1 Resolucin B) tambin fueron para casi todos los
pares de picos superiorres a 1.5 y slo para dos de ellos entre 1.1 y 1.5 (resolucin entre
Glu-His y Arg-NH4
+
).


Tabla 3.1. Resolucin de los picos cromatogrficos

Compuesto t
R
(min) Resolucin A Resolucin B
Asp 30.414
3.2 3.0
Ser 32.938
1,2 2,8
Glu 34.599
1,1 1.33
His 34.863
1,5 1,7
Gly 35.914
3,6 4,0
Arg 38.610
1,7 1,2
NH4
+
39.881
1,1 2,0
Thr 41.453
3,5 2,6
Ala 43.773
5,7 4,6
Pro 47.865
2,9 1,6
GABA 49.809
4,5 5,1
AABA(PI) 53.772
8,4 8.0
Tyr 60.323
5,0 5,5
Val 64.239
2,4 2,0
Met 65.736
2.0 3,4
Orn 67.124
2,8 3,6
Lys 69.727
7,3 8,6
Ileu 75.565
2,1 1,8
Leu 76.346
2,2 2.0
Phe 77.165
Resolucin A: Valores de resolucin calculados en el sustrato vnico diluido al
25%
Resolucin B: Valores de resolucin calculados en muestras de vinagre diluidas al
25%.



3.2.2. Linealidad

La linealidad de un procedimiento analtico se define como su capacidad (dentro
de un intervalo) para obtener resultados que sean directamente proporcionales (o por
Resultados y Discusin
48
medio de ecuaciones matemticas) a la concentracin (cantidad) de analito en la
muestra.

Para determinar la linealidad se tom el rea relativa de los picos de cada uno
de los aminocidos estudiados y amonio a diferentes niveles de concentracin (entre 5 y
9), dentro del intervalo esperable en las muestras de vinagre, vino y sustratos de partida
para los procesos de acetificacin una vez que hayan sido diluidas convenientemente
para su anlisis (al 25%). Los ensayos se realizaron por duplicado.

En la Tabla 3.2 aparece el intervalo de concentracin lineal, los niveles de
concentracin, la ecuacin de regresin lineal de la concentracin frente a la respuesta
del detector y el coeficiente de regresin lineal de cada compuesto. Se observ una
adecuada linealidad obtenindose en todos los casos unos coeficientes de correlacin
superiores a 0.992 en los intervalos de concentracin indicados en dicha Tabla.



Tabla 3.2. Rectas de calibrado de los aminocidos y amonio determinado en vinagres

Compuestos Intervalo
a
n
*
Ecuacin r
2
L.D.D.
a
L.D.C.
a
Asp 33.28 1663.75 7 y = 0.0003x - 0.0029 0.995 25.15 53.99
Asn 33.03 1651.50 7 y = 0.0003x + 0.0395 0.993 16.5 33.00
Ser 13.14 1313.63 7 y = 0.0004x + 0.069 0.992 14.0 28.52
Glu 18.39 1839.13 8 y = 0.0003x + 0.0093 0.999 13.91 35.84
His 19.40 1939.50 8 y = 0.0005x + 0.0325 0.997 35.1 70.05
Gln 18.27 1826.88 8 y = 0.0003x +0.0174 0.996 26.14 52.27
Gly 9.38 938.38 7 y = 0.0009x + 0.0205 0.998 6.42 14.74
Arg 21.80 2177.50 9 y = 0.0005x - 0.0006 0.999 45.73 62.05
NH4
+
4.5 112.5 5 y = 0.0035x + 0.7566 0.997 5.07 16.90
Thr 14.89 1489 8 y = 0.0006x + 0.0132 0.999 0.92 2.11
Ala 11.14 1113.63 8 y = 0.0008x + 0.0190 0.999 0.20 9.61
Pro 14.40 1439.13 8 y = 0.0003x - 0.0008 0.999 36.61 64.40
GABA 12.89 1289 9 y = 0.0007x + 0.0109 0.996 10.21 21.87
Cys 30.29 1514.50 8 y = 0.0001x + 0.0014 0.998 17.4 34.8
Tyr 45.30 2264.88 8 y = 0.0003x + 0.0060 0.999 33.81 55.96
Val 14.64 1464.38 8 y = 0.0009x + 0.0105 0.998 17.82 25.92
Met 18.65 1865.13 9 y = 0.0006x + 0.0021 0.999 26.11 39.75
Orn 16.52 1652 7 y = 0.0004x + 0.0225 0.998 24.24 60.59
Lys 36.55 1827.38 9 y = 0.0003x + 0.0104 0.999 14.35 43.86
Ileu 16.40 1639.75 9 y = 0.0011x + 0.0199 0.998 7.53 14.35
Leu 16.40 1147.82 8 y = 0.0013x - 0.0078 0.995 16.39 31.55
Phe 20.65 1445.41 7 y = 0.0013x + 0.0158 0.996 32.12 83.51
Trp 127.6 2552.8 5 y = 0.00004x + 0.0019 0.994 110.37 280.78
a
Concentracin en g/L (referido a la mezcla prederivatizacin)
*
Niveles de concentracin


3.2.3. Exactitud

La exactitud de un mtodo analtico es un parmetro que indica la cercana de
los resultados obtenidos por este mtodo a un valor considerado como real.

Resultados y Discusin
49
Existen varios procedimientos para determinar la exactitud de una metodologa
analtica:

- Aplicacin del procedimiento analtico a materiales de referencia certificados
(MRC), cuya concentracin de analito es conocida y comparacin del valor
medido con el valor certificado como real.

- Comparacin de los resultados obtenidos por la metodologa propuesta con
aquellos obtenidos mediante un mtodo normalizado cuya trazabilidad es
conocida.

- Recuperacin de cantidades conocidas de analito, obtenidas mediante el
enriquecimiento de las muestras. La media de las rplicas indica el grado de
exactitud del mtodo.

Para validar la exactitud de la propuesta metodolgica, se opt, ante la ausencia
de un MRC para este tipo de analitos en muestras de vinagres, por el
enriquecimiento de las muestras.

En nuestro caso, la recuperacin media se calcul a partir de los valores
obtenidos al inyectar por duplicado una muestra de vinagre diluida al 15% enriquecida
con todos los patrones a tres niveles de concentracin: nivel 0 (250 g/L), nivel 1 (300
g/L) y nivel 2 (350 g/L). Las recuperaciones as obtenidas se presentan en la Tabla
3.3.


Tabla 3.3. Ensayo de recuperacin en una muestra de vinagre enriquecida con aminocidos y
amonio a tres niveles de concentracin.

Compuesto

Aadido
( g/L)

Recuperado
(%)
Recuperacin
Media (%)
Asp 250 77.5 76.0
300 73.5
350 77.04
Asn 250 92.2 90.1
300 86.7
350 91.5
Ser 250 52.9 64.35
300 68.5
350 71.6
Glu 250 89.7 88.5
300 84.8
350 90.9
His 250 84.5 88.5
300 82.4
350 82.3
Gln 250 103.5 102.7
300 102.1
350 102.5
Gly 250 79.0 80.3
300 80.2
350 81.6
Resultados y Discusin
50


Tabla 3.3. Ensayo de recuperacin en una muestra de vinagre enriquecida con aminocidos y
amonio a tres niveles de concentracin (continuacin)

Compuesto

Aadido
( g/L)

Recuperado
(%)
Recuperacin
Media (%)
Arg 250 85.0 81.22
300 75.3
350 83.4
NH4
+
250 82.74 86.6
300 86.7
350 90.2
Thr 250 92.6 90.1
300 87.8
350 89.7
Ala 250 91.1 87.11
300 78.1
350 92.1
Pro 250 86.4 82.7
300 73.8
350 87.8
GABA 250 106.9 106.3
300 105.3
350 106.6
Cys 250 52.8 53.0
300 46.2
350 59.9
Tyr 250 90.9 91.9
300 91.4
350 93.5
Val 250 89.1 86.5
300 85.8
350 84.8
Met 250 91.7 91.3
300 91.3
350 90.9
Orn 250 69.7 79.6
300 83.1
350 86.0
Lys 250 84.5 86.9
300 85.9
350 90.2
Ileu 250 88.1 87.6
300 86.3
350 88.2
Leu 250 78.1 81.8
300 82.5
350 84.7
Phe 250 86.2 91.0
300 92.2
350 94.5
Trp 250 68.8 80.0
300 88.3
350 82.8


Resultados y Discusin
51

Segn el manual de la AOAC (Huber, 1998), para concentraciones entre 1 ppm
y 100 ppb las recuperaciones deben ser entre el 80 y 110%. En nuestro caso, para casi
todos los aminocidos las recuperaciones fueron superiores al 80%, y por tanto estn de
acuerdo con los valores propuestos por la AOAC. nicamente serina y cistena
mostraron recuperaciones ms bajas, pero, coincidiendo con Valero et al. (2005), en las
muestras de vinagre este aminocido se encuentra en pequea concentracin e incluso,
no se consigue determinar. Adems, en muchos trabajos de investigacin se ha
comprobado que la cistena tambin se encuentra en muy pequea concentracin,
incluso no detectable, en muestras de vino (Hernndez-Orte et al., 2003; Pripis-Nicolau
et al., 2001; Puig-Deu y Buxaderas, 1994; Botella et al, 1990). Sin embargo, en los
vinagres de Jerez tradicionales si se ha podido determinar este aminocido con una
concentracin media de 10 mg/L (Palacios et al., 2002).



3.2.4. Lmites de deteccin y cuantificacin

Los lmites de deteccin y cuantificacin se determinaron segn la relacin
seal/ruido (S/R) tal como se explic en el apartado 2.2.8 de Materiales y Mtodos.

Los resultados obtenidos, mostrados en la Tabla 3.2, fueron una media de diez
veces superiores a los obtenidos por Hernndez-Orte et al. (2003) para casi todos los
aminocidos y amonio excepto para la treonina y alanina. Los lmites de deteccin
oscilaron entre 0.20(Ala)-45.73(Arg) g/L y los lmites de cuantificacin entre 2.11
(Thr) 70.05 (His) g/L, excepto para el caso del triptfano, el cual tuvo unos lmites
superiores (LDD: 110.37 g/L y LDC: 280.75 g/L). Estos valores demostraron que el
mtodo era suficientemente sensible para determinar los aminocidos y amonio
presentes en las muestras de vinagre de vino.



3.2.5. Estudios de precisin

Para cumplir los objetivos marcados en el presente trabajo, la precisin fue
evaluada a dos niveles: repetitividad y precisin intermedia. Se determin tanto para el
mtodo analtico como para el proceso de derivatizacin. (En el apartado 2.2.9 de
Materiales y Mtodos se explica como se determin la repetitividad y la precisin
intermedia).


c) Repetitividad y precisin intermedia del mtodo analtico

Los valores de repetitividad obtenidos, medidos como CV, variaron entre 0.2
para la arginina y el amonio y 11.6 para la asparagina (Tabla 3.4). Estos valores estn de
acuerdo con los propuestos por el manual de la AOAC (Huber, 1998), donde para
concentraciones comprendidas entre 1 ppm y 100 ppb se aceptan unos coeficientes de
variacin entre 11 y 15%.

Resultados y Discusin
52
La precisin intermedia del mtodo analtico se realiz durante 5 sesiones de
trabajo mediante la medida de la muestra derivatizada, la cual se repiti cinco veces. En
la Tabla 3.4 se muestran los valores de precisin intermedia expresados como
coeficiente de variacin (CV). Estos valores variaron en un intervalo de entre 0.3
(leucina) y 13.9 (asparagina).



Tabla 3.4. Repetitividad y precisin intermedia del mtodo analtico

Repetitividad
(n = 5)
Precisin Intermedia
(n = 5) Compuestos
Media
a
C.V. (%) Media
a
C.V. (%)
Asp 350.1 3.2 402.1 8.3
Asn 142.3 11.6 142.3 13.9
Ser 207.4 1.5 294.1 0.9
Glu 522.0 1.4 532.3 3.3
His 297.8 2.6 283.3 1.4
Gln 270.8 1.8 281.0 0.9
Gly 324.7 0.5 416.9 3.2
Arg 545.6 0.2 526.0 2.4
NH4
+
222.2 0.2 178.1 0.8
Thr 311.0 2.8 472.9 0.9
Ala 395.3 1.2 467.4 2.3
Pro 639.8 1.3 691.8 2.6
GABA 333.6 6.9 297.1 1.2
Cys 132.0 5.6 188.2 4.8
Tyr 330.0 2.8 375.7 2.4
Val 306.4 2.1 325.7 0.9
Met 240.2 2.8 225.2 3.5
Orn 260.7 0.6 292.2 1.1
Lys 392.3 1.9 361.7 3.3
Ileu 262.7 1.5 266.8 0.6
Leu 315.8 1.7 320.7 0.3
Phe 349.3 4.4 363.9 1.5
Trp 172.1 1.7 170.4 1.1

a
Media de la concentracin en g/L (referido a la mezcla prederivatizacin)



d) Repetitividad y precisin intermedia del proceso de derivatizacin

En la Tabla 3.5 se muestran los valores de repetitividad y de precisin intermedia, expresados como
coeficientes de variacin. Los valores encontrados para la repetitividad oscilaron entre 0.1 para el amonio y 12.5 para
la fenilalanina.

Para la precisin intermedia del proceso de derivatizacin se realizaron 5
derivatizaciones de la muestra diluida en 5 sesiones de trabajo diferentes inyectando
cada una de ellas por duplicado. Los valores obtenidos variaron entre 0.1 para el amonio
y 12.8 para la glicina. Estos valores junto con los de la repetitividad estn de acuerdo
con los propuestos por Huber (1998).




Resultados y Discusin
53

Tabla 3.5. Repetitividad y precisin intermedia del proceso de derivatizacin

Repetitividad
(n = 5)
Precisin Intermedia
(n = 5) Compuestos
Media
a
C.V. (%) Media
a
C.V. (%)
Asp 343.5 0.3 316.0 1.8
Asn 154.1 8.9 145.2 5.3
Ser 217.4 0.6 193.1 2.2
Glu 504.8 0.5 478.1 9.8
His 255.7 3.4 249.3 7.0
Gln 225.0 0.4 212.5 2.1
Gly 307.9 4.9 328.2 12.8
Arg 515.3 0.2 507.0 5.2
NH4
+
225.6 0.1 225.6 0.1
Thr 313.7 1.7 307.4 5.8
Ala 380.5 1.7 410.8 7.4
Pro 629.8 4.8 653.9 1.4
GABA 368.8 0.6 338.0 0.4
Cys 193.8 8.1 160.5 5.6
Tyr 377.0 2.7 390.7 8.1
Val 378.9 6.8 320.8 0.8
Met 282.7 2.7 278.4 3.3
Orn 267.0 0.7 293.4 8.1
Lys 349.6 1.4 362.7 4.6
Ileu 275.3 2.0 280.8 4.7
Leu 320.2 0.4 322.7 2.4
Phe 324.6 12.5 360.7 1.7
Trp 151.1 6.9 155.2 6.9

a
Media de la concentracin en g/L (referido a la mezcla prederivatizacin)



3.3. ELECCIN DE LA DILUCIN PTIMA DE LAS MUESTRAS

Dada la elevada sensibilidad del mtodo fue necesario diluir las muestras de
vinagre. Con objeto de determinar la dilucin ptima de las mismas se realizaron
diferentes diluciones (5, 15, 25, 35 y 50%) tanto para sustrato vnico como vinagre
(apartado 2.2.10 de Materiales y Mtodos).

Para este estudio se emple un sustrato vnico con elevada acidez voltil (0.9
actico/100 mL), el cual se utiliz posteriormente como sustrato en la acetificacin de
las muestras de vinagre analizadas, y un vinagre de Jerez.

El sustrato vnico contena todos los aminocidos menos la asparagina y
glutamina; y el vinagre de Jerez adems de stos careca de cistena y metionina.

Despus de valorar las concentraciones de aminocidos y amonio esperables en
las muestras de vinagre y los intervalos de linealidad de dichos compuestos en vino y en
vinagre, se opt por una dilucin del 25%, la cual permitir cuantificar los aminocidos
y el amonio tanto en sustratos vnicos como en vinagres. Adems comprobamos que las
diluciones ensayadas mostraron una adecuada linealidad (Tabla 3.6) obtenindose unos
coeficientes de correlacin aceptables.

Resultados y Discusin
54

Tabla 3.6. Linealidad de las muestras diluidas




3.4. APLICACIN DEL MTODO A MUESTRAS DE VINAGRE

Por ltimo, tras la validacin del mtodo slo queda aplicarlo a muestras reales y de caractersticas
diferentes descritas en el apartado 2.1.1 de Materiales y Mtodos.

Al objeto de comprobar la validez del mtodo y llevar a cabo un seguimiento de los aminocidos durante
los procesos de acetificacin, se analizaron un total de 36 muestras de diferentes caractersticas.

En el Anexo (Tablas de la 1 a la 12) aparecen los valores medios obtenidos en las muestras para cada
aminocido y amonio acompaados de sus desviaciones estndares.







3.4.1. Consumo de nitrgeno total

El consumo de nitrgeno total en los procesos de acetificacin estudiados fue
evaluado considerando conjuntamente el nitrgeno aportado por los aminocidos libres
y el procedente del amonio.
Vino picado Vinagre de Jerez
Compuestos
Intervalo
de dilucin
r
2
Intervalo
de dilucin
r
2
Asp 25-50 % 0.991 5-50% 0.999
Asn n.d. n.d. n.d. n.d.
Ser 15-50% 0.990 5-50% 0.981
Glu 15-50% 0.943 5-50% 0.999
His 15-50% 0.874 5-50% 0.994
Gln n.d. n.d. n.d. n.d.
Gly 15-50% 0.987 5-50% 0.985
Arg 15-5% 0.934 5-50% 0.999
NH4
+
25-50% 0.877 5-50% 0.809
Thr 15-50% 0.920 5-50% 0.987
Ala 15-50% 0.962 5-50% 0.998
Pro 15-50% 0.933 5-50% 0.999
GABA 15-50% 0.932 5-50% 0.999
Cys 15-50% 0.993 n.d. n.d.
Tyr 15-50% 0.934 5-50% 0.993
Val 15-50% 0.950 5-50% 0.990
Met 15-50% 0.983 n.d. n.d.
Orn 15-50% 0.950 5-50% 0.998
Lys 15-35% 1.000 5-50% 0.994
Ileu 15-50% 0.994 5-50% 0.993
Leu 15-50% 0.992 5-50% 0.999
Phe 15-50% 0.996 15-50% 0.996
Trp n.d. n.d. 15-50% 0.998
Resultados y Discusin
55

Al inicio de la fermentacin las muestras del sustrato F tenan una cantidad de
nitrgeno entre 84.7 y 120.2 mg/L, y las del sustrato T entre 174.1 y 196.5 mg/L. El
descenso total del contenido de nitrgeno en todas las acetificaciones estudiadas oscila
entre 7.3-52%. Las acetificaciones duraron 5-9 meses para las muestras del sustrato T y
1.5-2.5 meses para las del F, comenzando, ambas, en el mes de Agosto. Las primeras se
llevaron a cabo en bodega y las del sustrato F al aire libre. En el caso del sustrato T,
coincide el menor consumo con el periodo de tiempo de acetificacin ms corto (5
meses) y parece existir una relacin entre consumo de nitrgeno y tiempo invertido en
la acetificacin.

Comparando 4 acetificaciones en las muestras del sustrato F (Figura 3.2), los
descensos oscilaban entre 17.3-33.2%.



0
20
40
60
80
100
120
A B C D
N

(
m
g
/
L
)
I
F

Figura 3.2. Descenso del contenido de nitrgeno en las muestras del sustrato F



En las muestras del sustrato T (Figura 3.3) los descensos oscilaron entre 20-
52.0%. Todas las acetificaciones de este sustrato mostraron descensos mayores a los
obtenidos en el sustrato F, probablemente debido a la mayor duracin del proceso de
acetificacin en el sustrato T que conlleva un mayor requerimiento de nitrgeno por
parte de las bacterias acticas.

0
50
100
150
200
250
A B C D
N

(
m
g
/
L
)
I
F

Figura 3.3. Descenso del contenido de nitrgeno en las muestras de Tarragona


Resultados y Discusin
56

Comparando los dos sustratos, F y T, se observa que los descensos menores se
producen en el mismo sistema de acetificacin (CL).

Por otro lado, en el sustrato F tambin se compararon las acetificaciones CK,
CL y CM (Figura 3.4) siendo la acetificacin CK la que present un mayor
descenso seguido por la CM. Se obtuvo un descenso mucho menor en la CL.
Podramos decir que CK y CM se asemejan ms en cuanto al consumo de
nitrgeno.



0
50
100
150
200
CK CL CM
N

(
m
g
/
L
)
I
E

Figura 3.4. Comparacin de las acetificaciones CK, CL y CM en cuanto al descenso de
nitrgeno en las muestras del sustrato F



Para el sustrato T se estudiaron las acetificaciones DK, DL y DM
(Figura 3.5) . En este caso DK y DL mostraron descensos elevados del orden del
50% y por el contrario, el descenso de DM fue mucho menor, siendo, adems, el
menor de todos los obtenidos en todas las muestras analizadas, tanto las T como las F.

Por tanto, como se puede observar, las acetificaciones se completan con
consumos muy diferentes de nitrgeno total en las mismas condiciones ambientales.

Resultados y Discusin
57
0
50
100
150
200
250
DK DL DM
m
g
/
L
I
F

Figura 3.5. Comparacin de las acetificaciones DK, DL y DM en cuanto al descenso de
nitrgeno en las muestras del sustrato T



Aplicando el tratamiento estadstico del anlisis de la varianza (ANOVA) al
cambio en el contenido total de nitrgeno se demostr que todos los descensos
observados resultaron ser estadsticamente significativos.



3.4.2. Evolucin en el perfil de aminocidos libres y amonio

En todas las muestras iniciales (F y T) el aminocido mayoritario fue la prolina, seguido de la arginina,
coincidiendo con lo observado por otros autores (Herbert et al., 2000; Soufleros et al., 2003; Hernndez-Orte et al.,
2003). Estos altos contenidos de prolina al inicio de la fermentacin actica se deben a la dificultad con la que las
levaduras metabolizan este aminocido durante la fermentacin alcohlica, por lo que las cantidades de prolina en los
vinos son similares a la de los correspondientes mostos (Hernndez-Orte et al., 2003).

La prolina aport en las muestras del sustrato F un 34.7% del contenido de nitrgeno inicial y en las del
sustrato T un 49.9% y la arginina aport un 20% en las muestras F y un 14% en las T (Figura 3.8). Por otro lado, en
ninguna de las muestras se detect la asparagina, glutamina, cistena y triptfano, coincidiendo este ltimo con lo
descrito en la bibliografa (Llaguno y Polo, 1991b; Valero et al. 2005). Segn lo observado por Hernndez-Orte et
al., (2003), durante la fermentacin alcohlica de los vinos el nivel de aminocidos decrece, llegando en algunos
casos, como la cistena, a consumirse totalmente.

Durante la fermentacin se produjeron modificaciones en el contenido de
aminocidos y amonio, dndose descensos importantes y en otros ligeros aumentos. De
forma general, se observaron descensos estadsticamente significativos en la mayora de
los casos para: prolina, metionina, asprtico, amonio, glicina, arginina, isoleucina,
tirosina y leucina. Los dos primeros, prolina y metionina, descendieron en todos las
acetificaciones, siendo estos descensos estadsticamente significativos. En el caso del
asprtico los descensos fueron estadsticamente significativos en 9 de las 12
acetificaciones estudiadas. Por otro lado se constataron ligeros aumentos no
significativos para la serina, histidina y glutmico.

En todas las acetificaciones del sustrato F (Figura 3.6) se observaron descensos
estadsticamente significativos en los siguientes compuestos: prolina (descenso medio:
75%) y metionina (66%). Tambin disminuyeron en la mayora de los casos (siempre en
las acetificaciones AL y BL): asprtico, gamma-aminobutrico, amonio, alanina,
Resultados y Discusin
58
isoleucina y arginina. Por tanto, en las muestras del sustrato F el aminocido que
presenta el descenso ms marcado es la prolina.

Por otro lado, el cido glutmico aument en todos las acetificaciones. Tambin
presentan tendencias al aumento en la mayora de los casos la ornitina, valina, y
fenilalanina. Estos aumentos no fueron estadsticamente significativos en ninguno de los
casos. Para el resto de los aminocidos no se puede indicar una tendencia clara en los
procesos estudiados.



0
50
100
150
200
250
300
A
S
P
S
E
R
G
L
U
H
I
S
G
L
Y
A
R
G
T
H
R
A
L
A

P
R
O
G
A
B
A
T
Y
R
V
A
L
M
E
T
O
R
N
L
Y
S
I
L
E
U
L
E
U
P
H
E
N
H
4
m
g
/
L
I
F
Figura 3.6. Evolucin de los aminocidos y amonio en una muestra del sustrato F



En todas las acetificaciones del sustrato T (Figura 3.7) se observaron descensos
estadsticamente significativos en los mismos aminocidos que en el sustrato anterior,
prolina y metionina, y adems en valina. Tambin disminuyeron en la mayora de los
casos (siempre en las acetificaciones AL, BL, DL y DK) los aminocidos
leucina, tirosina, fenilalanina, alanina, asprtico, glicina, arginina, gamma-
aminobutrico e isoleucina, as como el amonio. Estos descensos producidos en los 4
procesos de acetificacin fueron estadsticamente significativos salvo para la glicina.
Adems, en este caso, la ornitina y lisina tambin disminuyeron en la mayora de los
casos y al presentar contenidos iniciales bajos se llegaron a valores no detectables.

En cuanto al cido glutmico aument en la mayora de las acetificaciones
(12.3%), aunque tambin de forma no significativa como en las muestras F, y
nicamente la serina, histidina y treonina no demostraron una tendencia clara en los
procesos estudiados.




Resultados y Discusin
59
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
A
S
P
S
E
R
G
L
U
H
I
S
G
L
Y
A
R
G
T
H
R
A
L
A

P
R
O
G
A
B
A
T
Y
R
V
A
L
M
E
T
O
R
N
L
Y
S
I
L
E
U
L
E
U
P
H
E
N
H
4
m
g
/
L
I
F

Figura 3.7. Evolucin de los aminocidos y amonio en una muestra del sustrato T



Comparando la evolucin de los aminocidos y amonio en los dos tipos de
muestras (F y T) podemos observar que muchos de ellos presentan la misma tendencia
como el asprtico, prolina, gamma-aminobutrico, metionina, isoleucina, arginina,
alanina, amonio (descienden) y glutmico (aumenta).

Por otro lado, encontramos algunos aminocidos con evoluciones diferentes
como la leucina, fenilalanina, valina y glicina (en las muestras F no presentan una
tendencia clara y en las T descienden mayoritariamente).

En resumen, de todos los compuestos estudiados el que presenta el mayor
descenso en todas las acetificaciones es la prolina. Si nos fijamos en el aporte de
nitrgeno de cada aminocido el de mayor consumo, en ambos casos, sigue siendo la
prolina, observndose descensos del orden de 24.76 mg N/L en las muestras F y 43.4
mg N/L en las muestras T. Esta tendencia es contraria a la observada por otros autores
(Valero et al., 2005) en cultivos sumergidos, donde la leucina es el aminocido ms
consumido por las bacterias acticas. En nuestro caso la leucina ocup el sptimo y el
noveno lugar en el orden de preferencia de las bacterias acticas en las muestras F y T
respectivamente (Figura 3.8 y 3.9).




Resultados y Discusin
60
Escala Izquierda
Escala Derecha
C
o
n
s
u
m
o

d
e
l

r
e
s
t
o

d
e

a
m
i
n
o

c
i
d
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s

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m
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i
o

(
m
g

N
/
L
)
C
o
n
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m
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e

P
r
o
l
i
n
a

(
m
g

N
/
L
)
0
4
8
12
16
20
24
28
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
A
S
P
G
L
Y
A
R
G
T
H
R
A
L
A
N
H
4
G
A
B
A
M
E
T
I
L
E
U
L
E
U
P
R
O



Figura 3.8. Consumo de aminocidos y amonio en funcin de la concentracin de nitrgeno
aportado en las muestras F .







Escala Izquierda
Escala Derecha
C
o
n
s
u
m
o

d
e
l

r
e
s
t
o

d
e

a
m
i
n
o

c
i
d
o
s

(
m
g

N
/
L
)
C
o
n
s
u
m
o

d
e

P
r
o
l
i
n
a

y

a
m
o
n
i
o

(
m
g

N
/
L
)
0
10
20
30
40
50
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
A
S
P
G
L
Y
A
R
G
T
H
R
A
L
A
G
A
B
A
T
Y
R
V
A
L
M
E
T
O
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N
L
Y
S
I
L
E
U
L
E
U
P
H
E
N
H
4
P
R
O


Figura 3.9. Consumo de aminocidos y amonio en funcin de la concentracin de nitrgeno
aportado en las muestras T.



Resultados y Discusin
61
En los vinagres finales obtenidos el aminocido mayoritario sigue siendo la
prolina, pero ahora supone un 17% del total de aminocidos frente al 45% que
representaba en el sustrato de partida en las muestras F y un 57% frente al 62% inicial
en las muestras T. Segn lo descrito en la bibliografa (Valero et al., 2005; Palacios et
al., 2002; Erbe y Breckner, 1998; Llaguno y Polo, 1991b) en todos los vinagres de
vino la prolina es el aminocido mayoritario, pudindose considerar la presencia de ste
en el vinagre como un indicador de su procedencia vnica.

A pesar de los cambios experimentados durante la acetificacin el orden de
abundancia del resto de aminocidos se mantiene prcticamente igual al sustrato de
partida tanto en las muestras F como en las T.



























Conclusiones
62



4. CONCLUSIONES


1. Se ha adaptado y validado un mtodo para la determinacin de aminocidos en
vinagres de vino y vino en proceso de acetificacin mediante Cromatografa de
Lquidos empleando el agente 6-aminoquinolil-N-hidrosicuccinimidil carbamato
(AQC), obtenindose los siguientes resultados:

- En cuanto a la selectividad, la resolucin de los picos cromatogrficos
fue superior a 1.5 para la mayora de aminocidos.

- Se obtuvo una adecuada linealidad con unos coeficientes de correlacin
superiores a 0.992.

- El mtodo demostr tener una alta sensibilidad, con unos lmites de
deteccin entre 0.20 (Ala) - 45.73 (Arg) g/L y unos lmites de
cuantificacin entre 2.11 (Thr) - 70.05 (His) g/L, excepto para el caso
del triptfano, el cual tuvo unos lmites superiores (LDD: 110.37 g/L y
LDC: 280.75 g/L).

- Las recuperaciones fueron superiores al 80% para todos los aminocidos
excepto para serina y cistena.

- La precisin fue evaluada a dos niveles: repetitividad y precisin
intermedia. Estos niveles se determinaron tanto para el mtodo analtico
como para el proceso de derivatizacin, obtenindose en ambos casos
unos coeficientes de variacin acordes con los propuestos por el manual
AOAC.

2. Dada la alta sensibilidad del mtodo es necesario diluir las muestras. Despus de
valorar las concentraciones de aminocidos y amonio esperables en las muestras
tanto de vino como de vinagre y los intervalos de linealidad de dichos
compuestos, se opt por una dilucin del 25%.

3. Se han estudiado una serie de acetificaciones con cultivo superficial en madera,
y en ellos se observaron descensos estadsticamente significativos del nitrgeno
total.

4. En todas las muestras estudiadas, vinos y vinagres, el aminocido ms
abundante es la prolina seguido de la arginina; no detectndose, por el contrario
la asparagina, glutamina, cistena y triptfano. De todos los compuestos
estudiados el que las bacterias acticas utilizan en mayor extensin es la prolina.



Conclusiones
63
5. Durante la acetificacin con cultivo superficial se observaron en la mayora de
los casos descensos estadsticamente significativos para: prolina, metionina,
asprtico, amonio, glicina, arginina, isoleucina, tirosina, y leucina. Los dos
primeros, prolina y metionina, mostraron descensos estadsticamente
significativos en todos las acetificaciones.

6. Ciertos aminocidos como la leucina, fenilalanina, valina y glicina presentan
evoluciones diferentes, ya que en las muestras F no presentan una tendencia
clara y en las T descienden mayoritariamente.

7. Los cambios en la concentracin de aminocidos y amonio a lo largo de la
acetificacin no suponen una alteracin en el orden de abundancia de los
mismos en los dos tipos de sustratos.
Bibliografa
64



6. BIBLIOGRAFIA

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Anexo
71

Tabla 1. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin AL del sustrato F

Muestras de Vinagre
FAL
i
FAL
m
FAL
f



mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 31.705
a
0.005 25.505 0.07 18.453
b
0.005
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 14.414
a
0.022 32.083 0.024 7.123
a
0.006
Glu 39.410
a
0.003 41.288 0.001 40.341
a
0.001
His 14.331
a
0.011 18.358 0.013 14.034
a
0.002
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 18.506
a
0.019 23.196 0.019 13.833
a
0.009
Arg 61.062
a
0.002 55.821 0.012 53.458
b
0.006
NH4
+
11.186
a
0.085 6.499 0.065 10.612
a
0.110
Thr 12.758
a
0.005 14.267 0.005 10.533
a
0.004
Ala 32.923
a
0.010 31.355 0.000 26.912
a
0.018
Pro 291.142
a
0.006 106.074 0.009 93.971
b
0.000
GABA 11.457
a
0.001 9.249 0.003 8.796
a
0.001
Cys n.d. - n.d. - n.d. -
Tyr 14.580
a
0.002 20.756 0.005 12.361
b
0.001
Val 17.570
a
0.008 20.821 0.007 9.149
b
0.006
Met 2.138
a
0.000 0.936 0.001 0.548
b
0.000
Orn 5.864
a
0.007 13.187 0.026 6.675
a
0.000
Lys 25.676
a
0.002 28.113 0.000 24.770
a
0.002
Ileu 6.164
a
0.004 7.132 0.005 5.009
b
0.003
Leu 19.019
a
0.005 16.802 0.002 14.472
b
0.010
Phe 17.952
a
0.007 16.826 0.008 14.826
b
0.013
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.

.



Anexo
72
Tabla 2. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin BL del sustrato F

Muestras de Vinagre
FBL
i
FBL
m
FBL
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 20.420
a
0.006 18.040 0.001 17.511
a
0.005
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 0.185
a
0.000 10.619 0.012 18.011
a
0.031
Glu 28.116
a
0.008 45.892 0.004 50.790
b
0.002
His 16.039
a
0.008 12.512 0.004 17.823
a
0.010
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 14.480
a
0.000 14.879 0.006 16.323
a
0.026
Arg 60.948
a
0.031 52.284 0.002 53.439
a
0.005
NH4
+
13.793
a
0.092 3.041 0.084 8.973
a
0.045
Thr 9.966
a
0.001 10.678 0.002 11.182
a
0.005
Ala 33.442
a
0.006 26.546 0.007 27.458
a
0.020
Pro 255.196
a
0.043 95.429 0.004 68.596
b
0.000
GABA 14.201
a
0.000 9.353 0.001 11.334
a
0.024
Cys n.d. - n.d. - n.d. -
Tyr 10.873
a
0.000 13.845 0.001 13.470
a
0.010
Val 9.035
a
0.000 8.895 0.002 11.876
a
0.021
Met 1.726
a
0.000 0.619 0.000 0.544
b
0.001
Orn 3.346
a
0.003 3.971 0.001 6.915
a
0.016
Lys 26.602
a
0.006 24.768 0.001 25.337
a
0.000
Ileu 6.197
a
0.009 5.479 0.001 5.071
a
0.011
Leu 14.914
a
0.005 14.720 0.006 15.088
a
0.008
Phe 14.211
a
0.002 14.303 0.004 15.856
a
0.017
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.






Anexo
73
Tabla 3. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin CK del sustrato F

Muestras de Vinagre
FCK
i
FCK
m
FCK
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 31.131
a
0.004 21.251 0.005 11.515
b
0.001
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 7.462
a
0.012 3.067 0.005 7.018
a
0.006
Glu 57.938
a
0.001 43.779 0.003 32.631
b
0.005
His 14.526
a
0.004 16.590 0.006 15.248
a
0.007
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 18.322
a
0.016 20.684 0.013 13.984
a
0.001
Arg 66.751
a
0.001 58.193 0.002 51.327
b
0.002
NH4
+
26.605
a
0.001 10.105 0.005 3.933
b
0.023
Thr 13.030
a
0.003 11.235 0.000 12.627
a
0.001
Ala 30.533
a
0.004 32.431 0.012 21.793
b
0.006
Pro 308.428
a
0.000 129.703 0.003 76.723
b
0.007
GABA 15.884
a
0.003 9.130 0.009 7.872
b
0.001
Cys n.d. .- n.d. -. n.d -
Tyr 19.493
a
0.003 16.435 0.005 15.420
a
0.004
Val 16.963
a
0.000 8.722 0.005 16.754
a
0.015
Met 2.115
a
0.001 0.688 0.001 0.400
b
0.000
Orn 4.824
a
0.004 4.103 0.004 4.667
a
0.004
Lys 28.904
a
0.008 27.071 0.002 27.387
a
0.001
Ileu 7.168
a
0.002 6.167 0.000 5.44
b
0.002
Leu 20.219
a
0.001 16.507 0.003 14.387
b
0.003
Phe 19.754
a
0.002 16.00 0.004 15.359
b
0.002
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.






Anexo
74
Tabla 4. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin CL del sustrato F

Muestras de Vinagre
FCL
i
FCL
m
FCL
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 23.048
a
0.006 30.061 0.001 17.526
a
0.007
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 7.793
a
0.048 13.200 0.022 23.295
a
0.026
Glu 28.131
a
0.011 46.165 0.008 42.135
b
0.006
His 10.679
a
0.031 13.937 0.002 17.289
a
0.007
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 18.128
a
0.045 17.253 0.012 19.007
a
0.014
Arg 54.858
a
0.002 58.911 0.000 55.428
a
0.004
NH4
+
4.457
a
0.107 10.354 0.0222 10.245
a
0.034
Thr 11.722
a
0.012 14.290 0.007 12.706
a
0.005
Ala 24.496
a
0.029 25.195 0.030 29.126
a
0.008
Pro 267.840
a
0.012 135.289 0.002 43.500
b
0.010
GABA 12.807
a
0.003 4.858 0.002 9.207
b
0.003
Cys n.d - n.d. - n.d. -
Tyr 11.966
a
0.003 20.093 0.002 16.372
b
0.003
Val 13.260
a
0.010 16.613 0.010 18.932
b
0.003
Met 1.864
a
0.001 0.413 0.001 0.700
b
0.000
Orn 5.624
a
0.016 6.945 0.003 10.170
a
0.012
Lys 22.475
a
0.002 29.124 0.003 24.974
b
0.002
Ileu 4.656
a
0.004 6.263 0.007 6.084
b
0.005
Leu 15.953
a
0.011 16.016 0.006 16.550
a
0.010
Phe 14.751
a
0.000 16.289 0.015 17.483
b
0.014
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.






Anexo
75
Tabla 5. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin CM del sustrato F

Muestras de Vinagre
FCM
i
FCM
m
FCM
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 34.247
a
0.010 19.278 0.006 14.550
b
0.001
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 20.107
a
0.084 13.711 0.012 13.325
a
0.008
Glu 55.358
a
0.010 48.535 0.001 37.503
b
0.004
His 19.543
a
0.039 13.996 0.005 14.478
a
0.002
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 21.538
a
0.020 15.920 0.006 16.024
b
0.001
Arg 68.109
a
0.022 51.877 0.003 54.681
b
0.002
NH4
+
27.453
a
0.232 1.616 0.013 12.754
a
0.010
Thr 14.308
a
0.021 10.496 0.001 11.957
a
0.004
Ala 29.555
a
0.001 27.866 0.002 27.222
b
0.003
Pro 295.392
a
0.151 109.143 0.004 75.687
b
0.017
GABA 15.275
a
0.034 9.684 0.004 7.560
a
0.015
Cys n.d. - n.d. - n.d. -
Tyr 18.329
a
0.004 16.771 0.002 15.234
a
0.011
Val 16.920
a
0.000 8.093 0.005 8.294
b
0.005
Met 1.359
a
0.001 0.630 0.000 0.538
b
0.000
Orn 6.565
a
0.008 5.626 0.002 4.648
a
0.004
Lys 28.522
a
0.003 24.860 0.001 26.388
a
0.002
Ileu 7.144
a
0.005 5.212 0.008 5.092
b
0.001
Leu 19.307
a
0.187 14.672 0.004 14.596
a
0.019
Phe 18.376
a
0.018 14.492 0.009 14.857
a
0.014
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.






Anexo
76

Tabla 6. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin DL del sustrato F

Muestras de Vinagre
FDL
i
FDL
m
FDL
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 35.109
a
0.003 15.363 0.006 21.423
b
0.007
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 24.576
a
0.008 8.935 0.010 17.948
a
0.026
Glu 44.096
a
0.004 46.734 0.010 48.882
a
0.011
His 18.373
a
0.004 14.342 0.003 16.089
a
0.010
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 21.926
a
0.013 14.936 0.008 16.581
a
0.021
Arg 60.534
a
0.039 53.728 0.006 55.312
a
0.013
NH4
+
12.993
a
0.126 0.467 0.015 10.381
a
0.158
Thr 14.098
a
0.005 12.091 0.004 12.345
a
0.005
Ala 34.005
a
0.002 27.077 0.006 28.665
a
0.035
Pro 277.259
a
0.089 116.911 0.011 70.918
b
0.009
GABA 4.276
a
0.047 10.152 0.002 9.058
a
0.025
Cys n.d. - n.d. n.d. -
Tyr 18.484
a
0.001 13.197 0.003 17.544
a
0.017
Val 9.205
a
0.002 18.435 0.008 15.132
a
0.087
Met 1.494
a
0.001 0.742 0.000 0.624
b
0.001
Orn 7.794
a
0.011 3.736 0.003 6.292
a
0.009
Lys 25.744
a
0.005 25.189 0.004 28.442
a
0.003
Ileu 6.544
a
0.004 5.696 0.001 6.009
a
0.006
Leu 17.600
a
0.017 15.849 0.010 15.611
a
0.017
Phe 16.041
a
0.023 15.666 0.004 16.239
a
0.028
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.





Anexo
77
Tabla 7. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin AL del sustrato T

Muestras de Vinagre
TAL
i
TAL
m
TAL
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 31.030
a
0.004 27.470 0.007 25.415
b
0.001
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 9.631
a
0.000 14.840 0.005 16.498
a
0.020
Glu 49.670
a
0.009 69.961 0.003 54.763
a
0.000
His n.d.
a
- 0.730 0.001 2.698
b
0.003
Gln n.d.

- n.d. - n.d. -
Gly 25.869
a
0.005 27.818 0.007 21.231
a
0.022
Arg 79.238
a
0.002 90.209 0.002 70.799
b
0.001
NH4
+
24.501
a
0.025 12.218 0.009 10.838
b
0.111
Thr 12.087
a
0.003 17.073 0.004 13.558
a
0.006
Ala 54.073
a
0.008 56.284 0.001 41.633
b
0.015
Pro 728.950
a
0.053 637.734 0.006 394.449
b
0.003
GABA 24.790
a
0.001 31.422 0.002 23.826
a
0.009
Cys n.d. - n.d. - n.d. -
Tyr 11.417
a
0.001 13.219 0.003 0.931
b
0.000
Val 20.441
a
0.007 30.847 0.003 2.983
b
0.003
Met 1.355
a
0.000 0.594 0.000 0.109
b
0.000
Orn 11.218
a
0.002 12.323 0.003 n.d.
b
-
Lys 22.446
a
0.001 30.876 0.003 6.898
b
0.004
Ileu 8.081
a
0.001 8.356 0.003 5.029
b
0.006
Leu 16.418
a
0.006 18.080 0.003 2.914
b
0.009
Phe 18.584
a
0.007 17.521 0.015 8.628
b
0.002
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.






Anexo
78
Tabla 8. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin BL del sustrato T

Muestras de Vinagre
TBL
i
TBL
m
TBL
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 33.015
a
0.009 30.394 0.003 22.775
b
0.000
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 19.481
a
0.003 26.047 0.001 13.364
b
0.008
Glu 45.175
a
0.004 63.250 0.001 45.655
a
0.001
His 7.051
a
0.001 2.030 0.002 0.897
b
0.001
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 28.568
a
0.005 24.056 0.011 20.705
b
0.015
Arg 82.489
a
0.012 85.936 0.009 60.430
b
0.004
NH4
+
24.443
a
0.074 14.494 0.018 7.537
b
0.036
Thr 16.496
a
0.004 14.301 0.004 11.663
b
0.006
Ala 55.540
a
0.018 53.924 0.028 31.300
b
0.015
Pro 742.528
a
0.005 607.089 0.014 388.140
b
0.004
GABA 25.932
a
0.001 27.679 0.000 22.770
b
0.000
Cys n.d. - n.d. - n.d. -
Tyr 12.432
a
0.000 11.214 0.002 1.554
b
0.000
Val 22.184
a
0.006 29.129 0.018 2.570
b
0.001
Met 1.527
a
0.000 0.432 0.000 0.801
b
0.000
Orn 13.107
a
0.005 9.254 0.003 n.d.
b
-
Lys 24.822
a
0.002 27.764 0.007 n.d.
b
-
Ileu 6.454
a
0.000 7.089 0.004 3.381
b
0.002
Leu 15.731
a
0.004 17.377 0.016 2.141
b
0.000
Phe 14.668
a
0.006 15.649 0.012 7.610
b
0.002
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.






Anexo
79
Tabla 9. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin CL del sustrato T

Muestras de Vinagre
TCL
i
TCL
m
TCL
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 33.036
a
0.005 28.329 0.002 25.747
b
0.002
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 4.8780
a
0.016 14.844 0.001 16.339
a
0.009
Glu 49.660
a
0.009 66.814 0.008 62.289
a
0.000
His n.d.
a
- 6.539 0.001 4.429
b
0.009
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 29.385
a
0.048 25.358 0.001 24.734
a
0.006
Arg 88.670
a
0.014 87.641 0.011 83.155
a
0.001
NH4
+
30.982
a
0.207 27.347 0.015 33.286
a
0.131
Thr 14.638
a
0.019 16.673 0.005 16.130
a
0.004
Ala 59.597
a
0.023 53.351 0.005 49.970
b
0.003
Pro 819.126
a
0.021 571.705 0.021 479.010
b
0.012
GABA 29.373
a
0.010 32.894 0.004 31.798
a
0.009
Cys n.d. - n.d. - n.d. -
Tyr 14.070
a
0.011 14.446 0.001 12.945
a
0.001
Val 23.190
a
0.005 19.809 0.003 18.819
b
0.007
Met 1.834
a
0.001 0.348 0.000 0.191
b
0.000
Orn 10.813
a
0.003 13.057 0.001 12.107
a
0.001
Lys 26.074
a
0.003 34.846 0.007 30.860
b
0.001
Ileu 7.457
a
0.025 9.473 0.003 8.107
a
0.001
Leu 17.694
a
0.032 18.176 0.001 16.258
a
0.001
Phe 17.632
a
0.050 17.433 0.009 15.977
a
0.006
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.






Anexo
80
Tabla 10. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin DK del sustrato T

Muestras de Vinagre
TDK
i
TDK
m
TDK
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 34.046
a
0.002 27.056 0.001 17.381
b
0.002
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 15.141
a
0.003 15.209 0.004 27.169
b
0.008
Glu 48.415
a
0.003 65.308 0.001 50.691
a
0.010
His 0.347
a
0.001 1.760 0.001 3.330
b
0.001
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 30.413
a
0.018 26.557 0.008 18.860
b
0.007
Arg 81.165
a
0.002 85.273 0.001 60.694
b
0.008
NH4
+
40.053
a
0.009 18.948 0.078 15.076
b
0.081
Thr 15.013
a
0.006 16.410 0.004 11.479
b
0.004
Ala 55.681
a
0.027 53.389 0.002 29.853
b
0.003
Pro 752.184
a
0.015 598.532 0.008 338.283
b
0.010
GABA 26.218
a
0.003 33.611 0.002 24.119
b
0.005
Cys n.d. - n.d. - n.d. -
Tyr 12.042
a
0.006 12.394 0.000 1.762
b
0.000
Val 22.473
a
0.009 19.967 0.008 2.228
b
0.001
Met 1.641
a
0.001 0.297 0.000 0.889
b
0.000
Orn 15.462
a
0.002 12.411 0.003 n.d.
b
-
Lys 24.722
a
0.004 31.618 0.001 n.d.
b
-
Ileu 15.283
a
0.005 7.941 0.003 3.407
b
0.002
Leu 16.446
a
0.004 16.086 0.000 1.974
b
0.000
Phe 15.491
a
0.003 16.128 0.002 8.018
b
0.006
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.






Anexo
81
Tabla 11. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin DL del sustrato T

Muestras de Vinagre
TDL
i
TDL
m
TDL
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 32.034
a
0.005 26.178 0.000 23.099
b
0.004
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 20.367
a
0.007 16.137 0.001 19.125
a
0.004
Glu 54.366
a
0.007 66.096 0.002 50.498
a
0.004
His 1.062
a
0.002 n.d. - 0.773
a
0.002
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 31.229
a
0.004 25.666 0.013 19.559
b
0.012
Arg 82.325
a
0.007 84.161 0.000 60.229
b
0.004
NH4
+
29.494
a
0.016 12.537 0.021 5.400
b
0.026
Thr 14.941
a
0.003 16.033 0.003 12.777
b
0.001
Ala 59.555
a
0.010 53.548 0.008 29.828
b
0.003
Pro 756.355
a
0.023 603.600 0.016 357.264
b
0.020
GABA 26.839
a
0.005 34.518 0.003 25.457
a
0.001
Cys n.d. - n.d. - n.d. -
Tyr 11.472
a
0.000 12.451 0.007 1.799
b
0.000
Val 22.444
a
0.014 19.325 0.005 2.519
b
0.000
Met 1.522
a
0.000 0.308 0.000 0.681
b
0.000
Orn 17.227
a
0.003 10.043 0.000 n.d.
b
-
Lys 25.292
a
0.005 29.249 0.007 n.d.
b
-
Ileu 6.893
a
0.005 7.690 0.002 3.584
b
0.001
Leu 16.111
a
0.002 15.866 0.003 2.203
b
0.001
Phe 14.710
a
0.010 15.712 0.001 7.518
b
0.007
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.






Anexo
82
Tabla 12. Determinacin de aminocidos y amonio en la acetificacin DM del sustrato T

Muestras de Vinagre
TDM
i
TDM
m
TDM
f
Compuestos
mg/L DE mg/L DE mg/L DE
Asp 26.645
a
0.000 23.700 0.001 31.105
a
0.006
Asn n.d. - n.d. - n.d. -
Ser 13.365
a
0.001 10.999 0.001 25.451
b
0.004
Glu 38.728
a
0.001 59.270 0.005 70.921
b
0.001
His n.d. - n.d. - 3.035
b
0.003
Gln n.d. - n.d. - n.d. -
Gly 20.938
a
0.009 23.186 0.001 29.430
b
0.022
Arg 59.825
a
0.002 77.415 0.003 83.153
b
0.007
NH4
+
75.913
a
0.037 38.912 0.060 33.363
b
0.055
Thr 13.244
a
0.003 14.414 0.000 17.827
b
0.004
Ala 41.816
a
0.001 48.959 0.003 54.240
b
0.004
Pro 552.473
a
0.006 550.465 0.005 489.257
b
0.000
GABA 22.115
a
0.005 31.632 0.001 34.389
b
0.002
Cys n.d. - n.d. - n.d. -
Tyr 8.002
a
0.000 11.289 0.001 12.912
b
0.004
Val 9.623
a
0.001 16.983 0.001 29.740
b
0.000
Met 14.522
a
0.003 0.950 0.000 0.145
b
0.000
Orn 6.925
a
0.000 10.224 0.000 17.252
b
0.007
Lys 13.837
a
0.004 26.563 0.001 31.713
b
0.002
Ileu 3.461
a
0.003 6.968 0.000 8.619
b
0.003
Leu 11.803
a
0.002 14.438 0.000 16.377
b
0.013
Phe 11.113
a
0.001 14.635 0.001 16.063
b
0.020
Trp n.d. - n.d. - n.d. -
a, b
Superndices diferentes en la misma fila indican diferencias
significativas de acuerdo con el anlisis de la varianza (ANOVA).
DE: Desviacin estndar. n.d.: no detectado.