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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA METROPOLITANA

DE PUEBLA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

PROYECTO DESARROLLADO:
Caracterización de Vibrio cholerae en
muestras de camarón coctelero en la
ciudad de Puebla.


ALUMNAS

MARÍA FERNANDA DEL POZO GONZÁLEZ
LORENA GÁRATE VÉLEZ
DIANA VALERIA GONZÁLEZ MONTESINOS


PUEBLA DE ZARAGOZA A 30 DE ABRIL DEL 2014







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ÍNDICE págs.

I. INTRODUCCIÓN 3
II. MARCO TEÓRICO
2.1 Agente etiológico: Vibrio cholerae 5
2.2 Cólera 5
2.3 Composición genómica 6
2.4 Causa: toxina colérica 6
III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 8
IV. OBJETIVO GENERAL 9
V. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 9
VI. MATERIALES Y MÉTODOS 10
6.1 Obtención de cepas
a) Preparación del medio de cultivo 11
b) Esterilización 12
c) Muestreo de camarón 13
d) Pesado y pre enriquecimiento 13
e) Sembrado por goteo 15
6.2 Conteo celular 15
6.3 Resembrado de cepas 16
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 18
VIII. CONCLUSIÓN 20
IX. REFERENCIAS 21









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Caracterización de Vibrio cholerae en
muestras de camarón coctelero en la
ciudad de Puebla.

I. Introducción
ibrio está conformado por varias especies, que tienen repercusiones en la salud
pública, relacionadas con enfermedades gastrointestinales, particularmente con
enfermedades transmitidas por alimentos de origen marino (OPS, consultado el
27 de abril de 2014).
Las especies del género Vibrio, son bacilos curvos gram negativos de vida libre y
crecimiento rápido, no producen esporas y se mueven de forma errática debido a que
tienen un flagelo, son aerobios y anaerobios facultativos, fermentadores de glucosa y
oxidasa positivo. Son tolerantes a pH alcalino y algunas especies necesitan medios altos
en salinidad para su óptimo desarrollo (García-Lázaro, 2010).
Vibrio cuenta con un antígeno flagelar H que no distingue entre vibriones patógenos y no
patógenos, y un antígeno somático O que si logra esta distinción (García-Lázaro, 2010).
Están presentes en gran parte de ambientes acuático, ya sea en agua dulce o salada por
largas temporadas. Es común encontrarlas en aguas templadas y aislarse en mariscos y
pescados.
Pero hasta el momento se han encontrado más de 35 especies del genero Vibrio, de las
cuales, 12 son vibriones marinos que no se les ha encontrado una relación directa con
alguna patología humana. Y el resto de las especies, entre ellas: V. cholerae, V.
parahemolyticus, V. vulnificus etc; son causantes de enfermedades gastrointestinales,
infección de heridas y tejidos blandos y sepsis (OPS, consultado el 27 de abril de 2014).
Las especies patógenas mencionadas, Vibrio cholerae es la más común, la cepa O1 es la
responsable de cólera pandémico, relacionada a una enfermedad gastrointestinal
infecciosa, generalizado por los siguientes síntomas: vómito, diarrea y por consecuencia
deshidratación grave (OPS, consultado el 27 de abril de 2014).

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“La bacteria entra al organismo con el agua o los alimentos contaminados. La
enfermedad es endémica en por lo menos 80 países con epidemias que ocurren en varias
regiones, incluyendo África, Sudamérica y el sur y sudeste de Asia. V. cholerae O1,
biotipo El Tor es el responsable de la séptima pandemia que se inició en 1961 cuando
apareció la bacteria como causa de epidemia de cólera en Celebes (Sulawesi), Indonesia.
La enfermedad se propagó rápidamente a otros países de Asia del este y llegó a
Bangladesh en 1963, a India en 1964, y a la URSS, Irán e Irak en 1965-1966. En 1970 el
cólera invadió el oeste de África, la cual no había experimentado la enfermedad por más
de 100 años. La enfermedad se dispersó rápidamente a varios países de África y se
convirtió en endémica en casi todo el continente. En 1991 el cólera golpeó a
Latinoamérica, en donde también había estado ausente por más de un siglo. Su ingreso
fue por Perú. En el primer año se propagó a 11 países, y subsecuentemente a través del
continente” (OPS, consultado el 27 de abril de 2014).
En general el continente que más casos tiene es África, seguido por Asia y por ultimo
América (Ilustración 1).

ILUSTRACIÓN 1 DISTRIBUCIÓN MUNDIAL DE LOS BROTES DE CASOS DE CÓLERA EN LOS AÑOS 2011-2012 ( OMS,2013)






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II. Marco teórico

2.1 Agente etiológico: Vibrio cholerae
Vibrio cholerae es un bacilo Gram negativo, móvil, flagelado que no forma esporas, que
sobrevive en medios alcalinos a temperaturas entre 22 y 40°C. Agente etiológico del
cólera epidémico y pandémico humano, se clasifica con base en su antígeno somático O,
actualmente se conocen 198 serogrupos. Cada serogrupos se define por su suero
monoespecífico; Vibrio cholerae O1 se define con este nombre ya que aglutina con el
suero O1, mientras que los otros 198 restantes serogrupos se les denomina
genéricamente como NO-O1 (Koneman et al., 2001; SSA, 2001).

2.2 Enfermedad: Cólera
La infección por Vibrio cholerae es adquirida por la ingestión de agua o alimentos
contaminados consumidos crudos o insuficientemente cocidos. La posibilidad de que se
desencadene un brote de cólera en una región dada depende de varios factores: el
número de individuos susceptibles, la exposición a aguas cloacales o aguas no tratadas y
alimentos contaminados, y la presencia de un reservorio acuático de Vibrio cholerae
(Caffer et al., 2007) (Ilustración 2).
El ser humano es un huésped incidental y transitorio pero es quien disemina la bacteria
hacia las fuentes de agua y alimentos (SSA, 2001), los Vibrios se desarrollan como
células de vida libre en los reservorios de estuarios marinos. Mejorar las condiciones
sanitarias puede hacer posible un control eficaz de la enfermedad (Murray et al., 2006).

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ILUSTRACIÓN 2. PRINCIPALES EVENTOS EPIDEMIOLÓGICOS DE CÓLERA OCURRIDOS DESDE 1817. (LENDON ET AL, 2006)

2.3 Composición genómica
El genoma de Vibrio cholerae contiene 3885 marcos de lectura abiertos distribuidos en
dos cromosomas circulares, el cromosoma 1 (2.96 millones de pares de bases) y el
cromosoma 2 (1.07 millones de pares de bases). El primer cromosoma contiene genes
para funciones celulares esenciales como la replicación del ADN, la transcripción y la
síntesis de proteínas, además de contener la mayoría de los genes de virulencia como el
gen de la toxina del cólera que está localizado en el fago CTX integrado en este
cromosoma. El segundo cromosoma también contiene genes esenciales como genes de
proteínas ribosomales y genes de transporte (Prescott et al., 2002).

2.4 Causa: toxina colérica
La toxina colérica es una enterotoxina de tipo A-B y está constituida por un componente A
de 27,200 Da y por cinco subunidades B, cada una de 11,600 Da, la subunidad B
contiene el sitio de unión a través del cual la toxina colérica se combina específicamente
con el gangliósido GM1 en la membrana citoplasmática epitelial, la acción tóxica
corresponde a la cadena A que activa la enzima celular adenilato ciclasa que transforma
el ATP en AMP cíclico (cAMP), el aumento en los niveles de cAMP lleva consigo la

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secreción activa en el intestino de iones cloruro y bicarbonato procedentes de las células
mucosas que van al lumen del intestino. Este cambio en el equilibrio iónico origina la
secreción de grandes cantidades de agua, la intensidad de la perdida acuosa en el
intestino delgado es mayor que la reabsorción del agua en el intestino grueso (Ilustración
3), (Fernández, 2008; Madigan et al., 2003).


ILUSTRACIÓN 2 MÉTODO DE INFECCIÓN DE VIBRIO CHOLERAE (RODRÍGUEZ ET AL, 2000)












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III. Planteamiento del problema
Los resultados obtenidos mediante el aislamiento microbiológico permiten determinar la
cantidad de microorganismos patógenos como Vibrio cholerae presente en el camarón,
sin embargo, es necesario evaluar la cantidad de este microorganismo dentro de las
muestras a analizar así como otros factores de patogenicidad con la finalidad de
determinar si es un agente causal de cólera.



















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IV. Objetivo General:

Aislar Vibrio cholerae del camarón coctelero a partir de los puntos de venta más
representativos de la ciudad de Puebla.


V. Objetivos específicos:

 Diseñar la metodología óptima de muestreo para que sea representativo
 Desarrollar la metodología de aislamiento así como realizar la conservación de
cepas.
 Identificar las especies de Vibrio en el aislamiento en medio TCBS
 Establecer el número de UFC obtenidas en cada muestreo.












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V. Materiales y métodos

Descripción del material
CANTIDAD NOMBRE
2 Mechero Bunsen
3 Vasos de precipitado (250 mL)
3 Matraz Erlenmeyer ( 500 mL)
100 Puntas amarillas para
micropipeta
2 Probetas (200mL)
80 Tubos Eppendorf
20 Tubos Falcon
2 Asas bacteriológicas
2 Espátulas
50 Cajas Petri
1 Bisturí
1 Pinzas de disección
1 Pipeta
1 Perilla

Descripción del equipo
CANTIDAD NOMBRE
1 Parrilla con agitación
3 Micropipetas 2-20µL/ 20-200 µL/
100- 1000 µL c/u
1 Balanza granataria
1 Autoclave
1 Incubadora
1 Balanza analítica
1 Campana de flujo laminar
1 Contador de células


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Descripción de los reactivos
NOMBRE
Agar TCBS (Tiosulfato, citrato, sales
biliares y sacarosa)
Peptona de caseína
NaCl
Extracto de levadura
Agua destilada
Alcohol etílico al 70%


6.1 Obtención de cepas
Para la producción de las cepas de Vibrio cholerae en el presente estudio se llevó a cabo
el mismo procedimiento para cada una de las 20 muestras con sus respectivas réplicas.
a) Preparación de medios de cultivo
TCBS (Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa)
Para la elaboración del medio de cultivo se utilizó 1 L de agua destilada la cual se llevó a
una temperatura aproximada de 94°C, posteriormente se pesaron y agregaron 89g de
agar TCBS diluyéndose a una temperatura controlada en la parrilla de agitación hasta que
se observara una dilución homogénea.
Se vertieron 20mL de agar TCBS en cada una de las cajas bajo condiciones de
esterilidad hasta obtener un total de 50 cajas con medio de cultivo (Ilustración 4).

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LB (Luria Bertani)
Para su elaboración en un volumen de 200mL se pesaron 10g de NaCl, 10g de Extracto
de levadura y 10g de peptona a los cuales se disolvieron en 200mL de agua destilada
(Ilustración 5).

b) Esterilización
Los tubos falcon junto con matraz se esterilizaron en autoclave a 15 libras de presión y
120°C por 15 minutos; durante este lapso estas condiciones fueron vigiladas para evitar
errores y accidentes. Después de ese tiempo el equipo se apagó y desconectó en espera
de que las condiciones de esterilización regresaran a su estado inicial, en consecuencia
se retiró el material del equipo próximo a utilizarse.

ILUSTRACIÓN 4. PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO
SÓLIDO TCBS, MEDIO PREFERENTE PARA EL AISLAMIENTO
DE MICROORGANISMOS DEL GÉNERO VIBRIO
ILUSTRACIÓN 5. PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO
LÍQUIDO LB, MEDIO QUE FUE UTILIZADO PARA EL
ENRIQUECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

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c) Muestreo de camarón
La toma de muestras se realizó dentro de la ciudad de Puebla de forma representativa,
abarcando así los principales puntos de venta de camarón coctelero con una distribución
adecuada de los mismos (Ilustración 6).
Cada una de las muestras fue transportada en hielo al laboratorio para ser procesadas
como se describe a continuación.

d) Pesado y pre enriquecimiento
Se pesaron 3g de camarón de cada una de las muestras, posteriormente se adicionaron
10mL de agar LB en cada uno de los tubos falcon a los que se vertieron los 3g de
camarón con la ayuda una pinzas dentro de la campana de flujo laminar y un mechero
para mantener las condiciones de inocuidad adecuadas (Ilustración 7). Cada tubo fue
etiquetado y llevado a la incubadora a una temperatura de 30°C por un período de 24
horas.

ILUSTRACIÓN 6. MUESTREO DE CAMARÓN PACOTILLA.
PARA EVITAR UNA MAYOR PROLIFERACIÓN DE
MICROORGANISMOS LAS MUESTRAS FUERON
PROCESADAS EL MISMO DÍA QUE SE OBTUVIERON.

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e) Serie de diluciones
Las diluciones se realizaron como se explica en el siguiente diagrama (Ilustración 8):




ILUSTRACIÓN 7. ADICIÓN DE LA MUESTRA AL MEDIO DE
CULTIVO LB PARA UN ENRIQUECIMIENTO ADECUADO DE
LOS MICROORGANISMOS.
ILUSTRACIÓN 8. DILUCIÓN DE LA MUESTRA CONCENTRADA, LO QUE PERMITE QUE
EN EL MOMENTO DE SEMBRADO LA DISTRIBUCIÓN Y CONTEO DE LAS COLONIAS SEA
MEJOR

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f) Sembrado por goteo
Se dividieron cada una de las cajas por la mitad para el aprovechamiento de espacio y se
marcó cada una de las diluciones desde la 10
-1
hasta la 10
-3
, abriendo las mismas dentro
de la campana de flujo laminar para deshidratarlas por lo menos 20 minutos;
posteriormente se tomaron 20L de cada una de estas diluciones por medio de una
micropipeta y se colocó dicha cantidad en el lugar señalado en forma de gota colocando
en el centro de las disoluciones la misma cantidad de muestra sin diluir (Ilustración 9). De
esta forma se realizaron 4 réplicas por muestra de camarón.
Al finalizar este proceso las cajas se etiquetaron y sellaron para posteriormente incubarlas
a 30°C durante 24 horas.

6.2 Conteo celular
Por medio de un equipo cuenta colonias se procedió a contar el total de ufc (unidades
formadoras de colonias) en cada una de las diluciones (Ilustración 10), donde
posteriormente y por medio de una fórmula es posible obtener el resultado estimado de
colonias por mililitro de solución.


ILUSTRACIÓN 9. TÉCNICA DE SEMBRADO POR GOTEO, DE
ESTA MANERA ES POSIBLE TENER UNA MAYOR CONTROL
EN LAS DILUCIONES YA QUE NO HAY UNA DISPERSIÓN DE
LA MUESTRA EN EL MEDIO DE CULTIVO.
IMAGEN TOMADA DE HARLEY, PRESCOTT, LABORATORY EXERCISES IN MICROBIOLOGY

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6.3 Resembrado de cepas
Posterior al crecimiento de los microorganismos en el medio de cultivo, debe realizarse un
resembrado de las cepas obtenidas, es decir, bajo condiciones de esterilidad con la
ayuda de la campana de flujo laminar, mechero y un asa bacteriológica, se tomó una
cantidad adecuada de inóculo y posteriormente se sembró por técnica de estriado en un
espacio dentro de la caja en la cual se marcó el área empleada y los datos del sembrado;
con la finalidad de conservar las mismas cepas por tiempos prolongados al adicionar a las
bacterias los nutrientes necesarios para que continúen su crecimiento (Ilustración 11).
Al finalizar este proceso las cajas se etiquetaron y sellaron para posteriormente incubarlas
a 30°C durante 24 horas.

ILUSTRACIÓN 10. CONTEO DE CÉLULAS EN
UN PERÍODO DE CRECIMIENTO POSTERIOR
A LAS 24 HORAS
ILUSTRACIÓN 11. SEMBRADO Y AISLAMIENTO
DE CEPAS DE INTERÉS, LAS CUALES PUEDEN
CONSERVARSE POR ÉSTA TÉCNICA PARA
ANÁLISIS POSTERIORES.

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En términos generales, el proceso realizado fue el siguiente (Diagrama 1)

DIAGRAMA 1. PROCESO GENERAL DEL AISLAMIENTO MICROBIOLÓGICO UTILIZADO EN ESTE ESTUDIO




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VII. Resultados y discusión.
















ILUSTRACIÓN 12. SEMBRADO DE COLONIAS EN CULTIVO TCBS DE LOS
MICROORGANISMOS AISLADOS A PARTIR DE LAS MUESTRAS DE CAMARÓN
COCTELERO.

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En total se analizaron 20 muestras de diferentes
supermercados y mercados del estado de Puebla, dando
un porcentaje mayor positivo a Vibrio cholerae la cual es
una bacteria infecciosa en el ser humano, se puede inferir
que una de las principales causas por la cual las
muestras de camarón contenían este microorganismo, es
debido al mal manejo salubre del vendedor o la
decadencia que tienen los servicios de sanidad o calidad
dentro de las empresas, sin embargo en el mismo estudio
otras muestras fueron negativas, lo cual indica que en
ciertos establecimientos, es de suma importancia la
calidad e inocuidad de los alimentos frescos.
Cabe mencionar que la cantidad de Vibrio cholerae es
bastante mayor a la cantidad de colonias encontradas de
Vibrio parahemolyticus (5%), sin embargo no se descarta
la presencia de ellas, si no que su carga bacteriana es
muy baja.
En el caso de Vibrio cholerae, el número de unidades
formadoras de colonias en los ensayos realizados se
encuentra en un rango de 10
5
a 10
7,
en un 75 % de los
mismos, alcanzando valores más altos que en estudios
realizados en 2013; en otras 3 muestras analizadas, la
cantidad de colonias no excedía de 100 por lo que su
presencia en las diluciones era escasa. Considerando
que la cantidad mínima para adquirir la enfermad de
cólera, es 1 x 10
4
bacterias por gramo de marisco, es
posible que la cantidad reportada sea suficiente para desencadenar síntomas y la
enfermedad si no se mantiene la higiene necesaria.
Número de ufc de bacterias

muestra aisladas/ml

1 Negativa

2 3.7 x 10
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3 3.6x 10
5


4 Negativa

5 4.4 x 10
4


6 Negativa

7 2.5 x 10
4


8 6.8 x 10
5


9 2.5 x 10
4


10 Negativa

11 Negativa

12 3.7x 10
5


13 0

14 2.5 x 10
4


15 0

16 8.2 x 10
5


17 8.1 x 10
5


18 0

19 6.7 x 10
5

20 3.1x 10
4

TABLA 1. AISLAMIENTO DE V. CHOLERAE
EN MUESTRAS DE CAMARÓN COCTELERO.

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Cabe mencionar que las cantidades reportadas en comparación con las muestras
analizadas en el 2013 (Rojas y col, 2013) presentan una carga bacteriana mucho mayor,
sin embargo la presencia de Vibrio parahemolyticus es menor.

VIII. Conclusión

El utilizar técnicas microbiológicas para un análisis de calidad es de gran utilidad ya que
nos es posible determinar de forma rápida si existe un cumplimiento de la misma. Cabe
mencionar que aunque Vibrio cholerae se encuentra de forma natural en ambientes
acuáticos, la carga bacteriana que presentan los alimentos en este estudio es mayor, por
lo tanto, la prevención desde el manejo, conservación y cocción de los mismos es
imprescindible en estas circunstancias.
Además, mediante el análisis periódico que permite establecer un seguimiento de los
resultados, es posible comparar la cantidad de microorganismos en el ambiente en
ciertas temporadas, por lo que el control y prevención durante este tiempo podrían ser
más adecuados tomando las medidas necesarias.











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IX. Referencias


OPS Año del Centenario1902-2002 Noticias de Salud Semana a Semana Comunicado N° 7 OPS Año
del Centenario.htm [ Consultado 27 de abril de 2014]

Garcia Lázaro, M. (2010). Facmed. Recuperado el 27 de Abril de 2014, de
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/pdf/Colera_actualizaci%C3%B3n_Medicina20
10.pdf
Leal Rodríguez, R. (2000). Biomed. Recuperado el 28 de Abril de 2014, de
http://www.uady.mx/~biomedic/revbiomed/pdf/rb98915.pdf

Lendon, T. (27 de Noviembre de 2006). Redalyc. Recuperado el 28 de Abril de 2014, de
http://www.redalyc.org/pdf/1812/181221557015.pdf

Rojas- Ruiz, N. E., Muñoz, G., Gárate, L., Gónzález, D., & Del Pozo, M. F. (2013). Aislamiento
microbiológico de Vibrio cholerae y Vibrio parahemolyticus en muestras de camarón
coctelero de la ciudad de Puebla. Enfermedades Infecciosas y Microbiología, 147-151.
Harley, Prescott, Laboratory Exercises in Microbiology, 5th Edition