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Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina, Escuela de Medicina


Depto. De Ciencias Básicas y Morfología
Laboratorio de Bioquímica

PRÁCTICO Nº 2 BIOQUÍMICA:
PROPIEDADES DE LAS
PROTEÍNAS

Nombre de Integrantes: Felipe Navarro


Ricardo Olave
Plinio Ramírez
Belén Rodríguez
Fecha de Realización: 02 de Abril de 2009
Fecha de Entrega de informe: 16 de Abril de 2009
Docentes Encargados: Dr. Reginaldo del Pozo
Bq. Mirna Muñoz M.Sc.
Bq. Javier Grandón
QA. Germán Rotter
INTRODUCCIÓN
Una proteína es una macromolécula compuesta por una o varias cadenas
polipeptídicas cada una de las cuales tiene una secuencia característica de
aminoácidos unidos por enlace peptídico.
Existe una técnica que permite diferenciar proteínas de aminoácidos, por medio
de una reacción con ninhidrina. Esta reacción tiene como objetivo detectar y cuantificar
cantidades de aminoácidos libres, estos en general reaccionan con la ninhidrina
cuando son calentados con un exceso de la misma. Todos los aminoácidos que
poseen un grupo amino libre reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco, un
aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original y
ninhidrina reducida. El amoniaco reacciona con otra molécula de ninhidrina y con la
ninhidrina reducida formando un producto de color azul o púrpura (que posteriormente
puede ser utilizado para cuantificar el aminoácido). Las proteínas a diferencia de los
aminoácidos reaccionan de forma muy débil, debido a la baja concentración de grupos
amino libres, por lo cuál, en términos prácticos se considera negativa.
Las propiedades biológicas de las proteínas, así como muchas de sus
propiedades físico-químicas, dependen de la integridad de sus estructuras. La pérdida
de la estructura tridimensional que es suficiente para originar la pérdida de la función
se denomina desnaturalización. La mayoría de las proteínas se pueden desnaturalizar
mediante calor, sobre 50ºC, el cual afecta de manera compleja a las interacciones
débiles de una proteína (los enlaces de hidrógeno principalmente). Este proceso
puede llevarse a cabo también por acción de extremos de pH, (ácidos fuertes como
ácido tricloroacético o álcalis fuertes como NaOH) ciertos disolventes orgánicos
miscibles en agua como el alcohol o la acetona, ciertos solutos tales como la urea o el
cloruro de guanidino o mediante detergentes. El tratamiento con cada unos de estos
agentes desnaturalizantes rompe enlaces no covalentes. La proteína desnaturalizada
presenta una solubilidad disminuida y habitualmente precipita.
Las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este
pH se le denomina punto isoeléctrico (pI), la proteína presenta su máxima posibilidad
para ser precipitada al disminuir su solubilidad, debido a que hay menos repulsiones
intermoleculares y facilita su agregación. La insolubilidad de la caseína (una
fosfoproteína) en su punto isoeléctrico puede ser utilizada para detectar su punto
isoeléctrico. El precipitado de caseína es de color blanco parecido a queso cottage.

OBJETIVOS

- Diferenciar aminoácidos de proteínas, según su reacción con ninhidrina,


comprendiendo que esto sólo ocurre en aminoácidos y no en proteínas.
- Reconocer los agentes físico-químicos que provocan la desnaturalización de
las proteínas y el efecto que eso conlleva en la función de estas.
- Descubrir si la temperatura es un agente lo suficientemente potente como para
desnaturar una proteína.
- Conocer y entender mecanismos de acción junto con bases físico-químicas de
técnicas de laboratorio usadas en bioquímica para la determinación del punto
isoeléctrico de la caseína.
- Comprender por qué la caseína en su punto isoeléctrico se hace menos
soluble, además de la incidencia que tiene el pH sobre ésta.
- En la preparación de las distintas muestras a analizar aprender la correcta
utilización de las pipetas conociendo la forma correcta de manipularlas.
MATERIALES

1. Trípode 11. Rejilla

2. Gradilla 12. 16 Tubos de Ensayo

3. Mechero de Bunsen 13. 5 microtubos de polipropileno


(KHAN)
4. Vaso Precipitado Kimax 500 ml.
14. Vortex
5. Tres Pipetas de 5 ml.
15. Fósforos
6. Pipeta de 10 ml.
16. Marcador Permanente
7. Pipeta de 1 ml.
17. Cronometro
8. Pinza Metálica
18. Agua Potable
9. Propipetas (verde-azul)
19. Agua Destilada
10. Vaso Precipitado 50 ml.

REACTIVOS

Experimento N°1:

1. Solución alcohólica de ninhidrina al 0,1%

2. Solución Neutra de Aminoácidos 0,1 M (Glicina)

3. Solución Neutra de Caseína: 0,5 g de caseína en 100 ml. de buffer fosfato


0,1 M, ph 7.0.

Experimento N°2:

1. Muestra Proteica Albúmina (BCA)

2. Acido Tricloroacético (TCA) al 10% p/v

Experimento N°3:

1. Caseína al 0,5% en Acetato de Sodio 0,1 M

2. Acido Acético 1 M.
MÉTODO

Método Experimental N°1: Identificación de aminoácidos por la reacción de


Ninhidrina y su diferenciación con las proteínas:

Mezclar
Agregar 0,5
Vortex
2,5 ml. de Sol. ml. Ninhidrina
todos los
Neutra de glicina tubos

2,5 ml. de Sol.


Neutra de
Caseína

Se someten a
baño maría por
2 minutos aprox.

2,5 ml. de
Agua Destilada

Observar y anotar
resultados

Método Experimental N ° 2: Reconocimiento de proteínas por reacciones de


precipitación por desnaturalización por calor y ácido tricloroacético:

0,5 ml de Muestra Baño María


Proteica (BSA) por 3 minutos

Agitar tubos en
Vortex
0,5 ml de Agua
Destilada

0,5 ml de Muestra
Proteica (BSA)

0.5 mL de
0,5 ml de Agua ácido
Destilada tricloroacético
al 10%. Observar y Anotar resultados

Método Experimental N°3: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína:

3.2 ml 6.8ml de
de Acido H2O
Acético destilada
Sacar 5ml del Tubo 1
y Traspasar al Tubo 2

1 Mezclar en 2
Vortex

Agregar 5ml de
Agua destilada

Repetir el procedimiento de
dilución seriada hasta el tubo 9
Sacar 5ml del Tubo 2
3
y Traspasar al Tubo 3 Mezclar en
vortex

Eliminar
5 ml del
Tubo 9

1ml de caseína
en acetato 0.1M
Agregar finalmente 1 ml de solución
de caseína en acetato de sodio 0.1
M. a todos los tubos (del 1 al 9)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Observar y Anotar
Mezclar inmediatamente
resultados inmediatos y
en vortex todos los tubos
luego de 15 minutos

RESULTADOS

Resultados experimento N°1

Componentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Solución Neutra 2.5 ml - -


De Aminoácidos
Solución Neutra - 2.5 ml -
De Caseína
Agua Destilada - - 2.5 ml
Solución 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Alcohólica De
Ninhidrina
Resultados + - -

Resultados experimento N°2

Componentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4


Muestra 0.5 ml - 0.5 ml -
Proteica
Agua - 0.5 ml - 0.5 ml
Destilada
Ácido - - 0.5 ml 0.5 ml
Tricloroacétic
o 10 %
Resultados negativo negativo precipitado Negativo
Resultados experimento Nº3

0 = NO CAMBIA + = OPALESCENCIA X = PRECIPITADO


Tub Tub Tub Tub Tub Tub Tub Tub Tub
o1 o2 o3 o4 o5 o6 o7 o8 o9
Ph 3.5 3.8 4.1 4.4 4.7 5.0 5.3 5.6 5.9

Resultad + + + × × × + 0 0
o
Inmediato
Resultad + + + ×x ×x × + 0 0
o A Los
15 Min.

En la tabla anterior se presentan los resultados de la interacción de la Caseína,, la cual se torna


insoluble en su punto isoeléctrico precipitando. El punto isoeléctrico corresponde al promedio de lo
pH donde se produce la precipitación de la proteína.
Punto isoeléctrico = (4.4+4.7)/2 = 4.55

CONCLUSIÓN

Los aminoácidos y las proteínas poseen distintas características algunas de las


cuales logramos observar en este práctico, algunas reacciones de detección, pruebas
de denaturalización y determinación de puntos isoeléctricos de aminoácidos y
proteínas son de gran valor al momento de analizar y comprender este tipo de
moléculas tan importantes para la vida.
El primer experimento realizado, reacciones de aminoácidos y proteínas con
ninhidrina pretendía demostrar la especificidad de esta prueba para determinar la
presencia de aminoácidos libres, que dio positivo, en contraste con la reacción con
proteínas, que dio negativo, se realizó también una muestra control de agua destilada
con ninhidrina, cuyo resultado fue lógicamente negativo. Se obtuvieron los resultados
esperados ya descritos anteriormente. Los aminoácidos al tener todos por lo menos
un grupo amino libre, toda la masa de aminoácidos presente en la solución reacciona
resultando un producto de color violeta intenso y por lo tanto visible al ojo humano,
esta sería la información cualitativa que podemos obtener de la reacción; que a
diferencia de las proteínas, en las cuales gran parte de los grupos amino de sus
aminoácidos constituyentes se encuentra bloqueada por los enlaces covalentes que
unen cada uno de éstos con el anterior por lo cual sólo el NH3 del amino terminal y
algunos de los aminoácidos básicos reaccionan dando un tono violeta muy débil o
como fue en nuestro caso no hubo coloración. Dudando del resultado dejamos aún
cinco minutos más incubando el tubo de ninhidrina + proteínas para ver si había algún
cambio pero no se evidenció mayor diferencia que una opacidad casi imperceptible.
En la desnaturalización de proteínas trabajamos con Albúmina de Suero Bovino
(BSA). Este proceso con el cual podemos afectar la función de una proteína (la BSA
funciona como molécula transportadora de lípidos a través de la sangre) por el
rompimiento de los enlaces, no covalentes principalmente, que estabilizan la
estructura secundaria o terciaria de una proteína ya sea por medios físicos o químicos.
En este caso la desnaturalización se desarrolló probando con dos agentes
desnaturalizantes, calor y por otra parte desnaturalización con ácidos fuertes, ácido
tricloro acético (TCA) específicamente. Al alterarse la estructura secundaria y terciaria
las interacciones hidrofóbicas, que en la forma nativa se encuentran “protegidas” por
las interacciones hidrofílicas que están hacia el exterior en la proteína plegada para
que ésta pueda ser soluble en agua, se desestabilizan quedando expuestas al exterior
disminuyendo la solubilidad y precipitando finalmente cuando se logra desnaturalizar la
proteína. Sólo se consiguió observar la desnaturalización en presencia de TCA ya que
éste es un fuerte agente desnaturalizante que actúa rápidamente insolubilizando la
proteína; al someter BSA sólo a calor no se apreció ningún resultado producto de que
para desnaturalizar con este agente es necesario en algunos casos mantenerlo por un
tiempo considerable hasta poder visualizar una cantidad razonable de proteína
insoluble (desnaturalizada), este comportamiento es de gran importancia ya que ofrece
resistencia a la desnaturalización en un proceso febril. El conocer estos tipos de
mecanismos que afectan la actividad de proteica, que en el caso de una enzima
afectarán su capacidad catalítica, permiten conocer la función de una proteína por
medio de la pérdida de su función, en el cuerpo humano estados de acidosis y fiebre
pueden producir daño a proteínas que cumplen funciones importantes.
El último experimento correspondía a la determinación del punto isoeléctrico de
la caseína, como ya sabemos este punto corresponde al cual la carga neta de un
aminoácido o proteína es igual a cero, lo que quiere decir que las cargas positivas y
negativas están igualadas. La caseína posee un punto isoeléctrico que es a pH 4,6,
sabiendo que este valor depende de la concentración de H+ se prepararon 9
soluciones de distinto valor de pH; de 3,5 el primer tubo hasta 5,9 con diferencias de
0,3 en el valor de pH de cada uno de los tubos intermedios. Sabiendo que la caseína
(una fosfoproteína) es insoluble en su punto isoeléctrico podemos determinarlo en
base a este dato. Aplicando una cantidad determinada de esta proteína a cada tubo
podemos observar el comportamiento de ella a los distintos pH. Los resultados los
podemos agrupar en tres grupos distintos la primera serie de tubos del 1 al 3 (pH
desde 3,5 a 4,1) y el tubo 7 (pH 5,3) se obtuvieron como resultado cierta opalescencia
la cual puede ser explicada en base a una desnaturalización de la proteína ya que
como sabemos los medios ácidos favorecen esta situación debido a que la forma
nativa donde es soluble en agua se ve alterada. La forma nativa tiene lugar a pH 6,6
que es el pH de la leche por lo cual cualquier pH muy ácido desnaturalizará y afectará
por ende la solubilidad de la proteína. Otro grupo de resultados muy importante es el
que se obtuvo en los tubos 8 y 9 (pH 5,6 y 5,9) donde se no se observó ningún cambio
en la transparencia de la muestra, probablemente debido a que son los pH más
cercanos al valor del pH de la leche, por lo cual la estructura secundaria y terciaria aún
no han sido alteradas o se han alterado muy poco; debemos tener en cuenta que entre
los tubos 8 y 9 en comparación con la leche la mayor diferencia de pH es de un punto
(pH 5,6 en tubo 9 v/s pH 6,6 en leche), lo que en términos de concentración molar de
H+ equivale a una diferencia de 2,25 * 10-6 M (2,5 * 10-6 M en tubo 9 v/s 2,5 * 10-7 M en
leche de concentración de H+), a pesar entonces de la diferencia en un orden de
magnitud de las concentraciones molares son concentraciones muy pequeñas a las
que nos referimos en este caso. Finalmente tenemos el último grupo de resultados
(tubos 4, 5 y 6 a pH 4,4; 4,7 y 5,0 respectivamente) los cuales todos dieron un
precipitado de color blanquecino, como ya mencionamos anteriormente la caseína
precipita al pH de su punto isoeléctrico, debido a que las nuevas cargas que adquieren
los grupos ionizables de ella desestabilizan la solubilidad de la proteína y decanta,
produciéndose este resultado. Se requerían hacer dos observaciones, una inmediata y
otra a los 15 minutos, en los dos primeros grupos no fueron observables cambios
notorios pero sí en los tubos 4, 5 y 6 se observó que en los que se había producido
mayor cantidad de proteína decantada eran los tubos 4 y 5 (pH 4,4 y 4,7
respectivamente) por lo tanto podemos deducir que su PI se encuentra entre ambos
valores, coincidiendo con el resultado teórico que correspondía a pH 4,6.
BIBLIOGRAFÍA

Nelson y otros, Lehninger. “Principios Básicos de Bioquímica”. Tercera edición, 2001.


Ediciones Omega. Barcelona, España.

R. del Pozo, M. Muñoz, J. Grandón, G. Rotter. “Guía de trabajos prácticos Bioquímica


2009.” UCSC, Facultad de Medicina, Escuela de Medicina.

http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/Desnaturalizaci%C3%B3n

http://www.ehu.es/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm