You are on page 1of 14

Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina, Escuela de Medicina


Depto. De Ciencias Básicas y Morfología
Laboratorio de Bioquímica /

LABORATORIO Nº 3 y 4

REACCIÓN ENZIMÁTICA

Medicina Sección I

Integrantes:
 Franca González Beltrán
 Juan González Oyarzún
 Loreto Hernández
 Max Hetz Navarrete

Fecha del Laboratorio:


 15/04/2009
 22/04/2009
Fecha de Entrega:
 06/05/2009

Docentes:
 Dr. Reginald del Pozo Ph.D
 BQ. Javier Grandón P.
 BQ. Mirna Muñoz M.Sc
 QA. German Rotter M.
INTRODUCCIÓN

Las infinidades de reacciones bioquímicas que ocurren en nuestro organismo y


medio entorno orgánico requieren de un tiempo prudente y óptimo para realizarse, de lo
contrario, si transcurrieran lentamente, no serían eficaces. Debido a esto, la velocidad a
la cual se hace un trabajo adecuado, corresponde aun factor esencial para una mejor
producción de un sistema, cualquiera sea éste.

Si nos avocamos al sistema biológico, los procesos bioquímicos que involucra,


requieren viablemente una velocidad específica para que se lleven eficazmente a cabo.
Para obtener dicha velocidad necesitamos de las relevantes enzimas, catalizadores
mayormente de origen proteico, que aceleran adecuadamente las reacciones, éstas se
unen a un sustrato para que pueda la reacción posteriormente formar productos
rápidamente. El mecanismo de acción de las enzimas es muy específico, y aumenta la
velocidad de la reacción en un millón de veces y más.

Las moléculas que reaccionan deben alcanzar un estado de transición (estado de mayor
energía y el más inestable) un estado activado, donde es muy probable que estas
reaccionen formando producto. El alcanzar el estado de transición necesita de energía,
por tanto, lo que realiza la enzima es disminuir la cantidad de energía necesaria para
alcanzar este estado.

Las enzimas se encargan además de conferir un ambiente, favorable en


condiciones para la reacción, de este modo no producen grandes diferencias de energía
calórica en las células por ende en el cuerpo. Este nuevo ambiente es que cuando
modulan la reacción producen cambios en los reactantes formando nuevas fuerzas en las
moléculas, desestabilizándola y de esta forma la reacción ocurre más fácil y por ende
más rápida.

Como hemos mencionado, en los sistemas biológicos es muy importante la


velocidad con que ocurren los procesos. Esta puede ser medida cuantificando la
cantidad de producto generado o la cantidad de sustrato que ha desaparecido por unidad
de tiempo. Pero también cabe mencionar que las velocidades de reacciones enzimáticas
son influidas también por la concentración de enzima de una forma proporcionalmente
directa, en condiciones saturantes para la enzima.

Además la velocidad con que ocurren las reacciones catalizadas por enzimas
depende de si hay suficiente sustrato como para saturar la enzima. Cuando la enzima
esta saturada, ha alcanzado su velocidad máxima, esto se logra cuando la velocidad de
formación de producto se hace independiente de la cantidad de sustrato (reacción de
orden cero)

Conforme a lo anterior, analizaremos la acción de la enzima fosfatasa alcalina,


presente en intestino de ternera, catalizando la reacción de hidrólisis del 2-
fosfopropanodiol en glicerol y fosfato de sodio. Donde el comportamiento de dicha
reacción de acuerdo a sus factores influyentes (concentración de sustrato, velocidad de
reacción, concentración enzimática, etc.) se verá elucidada a forma de gráficas, tales
como ecuación de Lineweaver-Burk y Michaelis y Menten por ejemplo, que describe el
comportamiento de la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad inicial.
Así como también se puede detectar la constante Michaelis-Menten (Km) indicando la
afinidad que tiene una enzima por su sustrato, esta constante en el grafico nos sirve para
encontrar el valor de la concentración de sustrato cuando la velocidad inicial de
reacción es la mitad.

OBJETIVOS

Aplicar conocimientos sobre ecuación Michaelis Menten, analizando la reacción


enzimática especifica de la fosfatasa alcalina, involucrando sus factores tales como
velocidad de reacción, concentración de sustratos, concentración de enzima e ir
comparando datos de acuerdo a dicha ecuación o a la gráfica de dobles recíprocos.

Manejar conceptos de métodos químicos tales como los especofotométricos, la


absorbancia detectada por la muestra y lo que nos permite deducir de aquella de acuerdo
a su concentración, en este caso la aplicación de una solución reductora a la muestra
enzimática producida.

Aplicar conocimientos matemáticos, para calcular valores como la velocidad inicial,


máxima, a partir de gráficos y ecuación de michaelis-menten o de dobles recíprocos,
cáculo de la Km y pendiente (Km/Vmáx).

MATERIALES Y METODOS

Materiales: Reactivos:
• Tubos de ensayo • Glicina/NaOH 0.1M (pH 9.4), NaCl
• Matraz Erlenmeyer de 100mL 0.1% p/v
• Pipetas de 2mL, 5mL y 10mL • β-glicerofosfato de sodio 0.003M
• propipetas • Fosfatasa alcalina de intestino de
• Gradilla para tubos de ensayo ternera
• Espectrofotómetro • Molibdato de amonio 2.5% en H2SO4
• micropipeta 200-1000µL 5N
• puntas para micropipeta • Ácido 1,2,4-aminonaftolsulfónico
• Vórtex • Fosfato de sodio 1µmol/mL
• Vaso de precipitado de 50 mL
• Soporte universal
• Nuez y pinza
• Baño a 37ºC
• Cubetas para medición en
espectrofotómetro
• Cronómetro
Flujogramas 1

Preincubar a 37° C en baño


termorregulador por 6 a 7 Enzima 5 ml
minutos (recordar que tiene
solución tampón pH= 9,4)

(Luego de 6 a
7 minutos)

Definición de alícuota: volumen o cantidad de masa que se


va a emplear en una prueba de plataforma o de laboratorio.

CADA ALÍCUOTA QUE SE SAQUE DEBE SER DE 3 ml.

Completar con Agua


Ejemplo: destilada y 0,4 ml de
Solución reductora

3ml de solución

(a los 5 minutos
exactos)
Observaciones
1. Flujograma1
• Se debe preparar un tubo blanco y estándar (2) además de los tubos para
blanquear y para tener el parámetro común:
Bco= Molibdato NH4 1ml
H2O 8.6ml
Std.(x2)= Molibdato NH4 1ml
Solución Std.Fosfato 1ml
H2O 7.6ml
• Se deben utilizar pinzas puesta en el cuello del matraz para poderlo transportar
al baño termorregulador
• -En el mismo instante en que la enzima toca la solución preincubada debe
cronometrarse el tiempo con un cronómetro el cual, durante el experimento,
nunca se detendrá debido a que llevará registro de los tiempos para poder sacar
cada alícuota. En el caso de la primera alícuota, esta debe sacarse en el instante
en el que se agrega la enzima.
• -El matraz erlenmeyer con la solución debe permanecer en el baño
termorregulador durante toda la experiencia para mantener temperatura
constante y no ser una variable.
• Cada tubo de ensayo en el que se agregarán las alícuotas debe tener molibdato
ácido y agua destilada (esto para poder parar la reacción y ver el avance según el
tiempo).
• Golpetear suavemente contra la mesa para eliminar burbujas y así no estropear
la medición de Abs.

Flujograma 2

500ul Enzima

500ul Buffer

1 2 3 4 5
S S S S S

mlSus. 2 1.5 1 0.5 0.25


H2O -- 0.5 1 1.5 1.75

Aquí la variable es la cantidad de sustrato, por lo


que se diluye con agua destilada (que tampoco
será la misma cantidad en cada caso) hasta que
todos los tubos queden con igual volumen y es
porque es la misma cantidad de enzima que se
agrega a todos los tubos.
(Todos los tubos deben
pasar por este proceso)

Preincubar a 37° C en baño


termorregulador por 6 a 7
minutos para alcanzar su
máxima actividad según
temperatura adecuada.

Aunque son experimentos que pretenden determinar diferentes resultados, para reducir el tiempo de las
experiencias se ha decidido el cronometrar en seguimiento para el cronómetro y economizar la espera. Cada
llenado de los tubos se debe realizar de manera conjunta por el equipo para luego cronológicamente con diferencia
de 1 minuto por tubo (para eso además están con número y con letras diferenciadas de abreviación para cada
experimento) agregar el volumen específico de enzima que aunque en el primer caso no varíe, es la que actúa
sobre el sustrato y sirve además para poder llevar un orden y no cambiar de pipeta por el tiempo.

Se agrega la cantidad de
enzima a cada tubo en un
intervalo de tiempo distinto

Tiempo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
(min)
Tubo S1 S2 S3 S4 S5 E1 E2 E3 E4 E5

Se agrega a cada tubo 3 ml de


Solución de Molibdato para detener
la acción enzimático.

Tiempo 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
(min
Tubo S1 S2 S3 S4 S5 E1 E2 E3 E4 E5

Se agregan 3,6ml de agua destilada y


0,4 de solución reductora
Observaciones
2. Flujograma 2
• Cada tubo, una vez que se le agrega el volumen correspondiente de enzima debe
vorterearse de 3 a 5 segundos y volver a incubar por 10 minutos cada tubo, esto
para mezclar y a la vez tratar de mantener la temperatura constante y no se
transforme en una variable.
• Se debe preparar un tubo blanco y estándar (2) además de los tubos para
blanquear y para tener el parámetro común:
Bco= Buffer 0.5ml
H2O 2.5ml
Std.(x2)= Buffer 0.5ml
Std.Fosfato 1ml
H2O 1.5ml
• El desarrollo del laboratorio se realiza en base a reacciones sucesivas para
disminuir tiempo con intervalos de 1 min entre cada incorporación de sustancia
a cada tubo.
• Golpetear suavemente contra la mesa para eliminar burbujas y así no estropear
la medición de Abs.

RESULTADOS

Tiempo µmoles totales µmoles de PO4H-2 µmoles de PO4H-2


Tubo Nº (min) Absorvancia de PO4H-2 menos 0 min en 5 min
1 0 0,006 0,02 - -
2 5 0,066 0,21 0,19 0,21
3 10 0,078 0,24 0,22 0,04
4 15 0,118 0,37 0,35 0,12
5 20 0,132 0,41 0,39 0,04
6 25 0,143 0,45 0,43 0,03
7 30 0,162 0,50 0,49 0,06
8 40 0,180 0,56 0,54 0,03
9 50 0,216 0,67 0,65 0,06
10 60 0,223 0,69 0,68 0,01

Tabla 1.- Corresponde a los Datos obtenidos en la primera fase del Laboratorio de
Enzimas, donde se reflejan la Absorbancia, y la cantidad de moles de producto
obtenidos a diferentes intervalos de tiempo de reacción enzimático.

Estandar 1 0,322
Estandar 2 0,320

Estándar 1.- Corresponde a los estándares realizados para la Tabla 1, para determinar
un promedio , y utilizar este en los procedimientos de calculo de producto.
Gráfico 1.- Corresponde al gráfico de Velocidad (abscisa), y Tiempo (ordenada), donde
podemos ver reflejado el descenso de la velocidad enzimático a lo largo que avanza el
tiempo de reacción. No se ha graficado el valor 0,04 µmoles/5min debido a que es un
dato que desvía incorrectamente la curva, y esto se desvió lo mas probable por efectos
de variaciones en el detenimiento de la reacción enzimático.

Gráfico 2.- en el gráfico se muestra el desarrollo de la curva de aumento de la


concentración de producto en base al progreso de tiempo de la reacción enzimático.
Tubo Nº [S] (mM) Absorbancia Velocidad 1/[S] 1/Vi
1 4 1,145 3,16 0,25 0,32
2 3 1,074 2,97 0,33 0,34
3 2 1,012 2,80 0,50 0,36
4 1 0,661 1,83 1,00 0,55
5 0,5 0,396 1,09 2,00 0,91

Tabla 2.- Corresponde a la tabla que refleja los resultados obtenidos en la segunda parte
del Laboratorio, donde en iguales circunstancias reactivas se vario la concentración de
Soluto, para luego obtener Absorbancia, y Velocidad.

ESTANDAR 1 0,367
ESTANDAR 2 0,357

Estándar 2.- Corresponde a los Estándares calculas para obtener un promedio y utilizar
en los cálculos para obtener la velocidad enzimático expuesta en la Tabla 2.

Gráfico 3.- Corresponde a la curva de Progreso en base a la Tabla 2, donde se refleja


Velocidad versus Concentración de Sustrato y podemos visualizar la curva regida por la
ecuación de Michaelis-Menten
Gráfico 4.- Corresponde al gráfico también llamado de los Dobles Recíprocos, en
donde se utilizan los valores inversos de Velocidad y Sustratos que se encuentran en la
Tabla 2.

Para obtener los valores exactos debemos utilizar la ecuación de dobles recíprocos o de
Lineweaver- Burk:
1 Km 1 1
= x +
Vi V máx S V máx.

Según los datos obtenidos en el práctico nos dio la siguiente ecuación de la recta:

y = 0,3476x + 0,2109

Entonces la velocidad máxima será :

0,2109 = 1/ V máx.
V máx. = 1/ 0.5556
V máx. = 4,7416 (µmoles) PO4H-/10 min

Para calcular la Km lo haremos mediante la relación de la pendiente de la recta:

Km
= 0,3476
V máx

Km = 0,3476 x V máx.
Km = 0,3476 x 4,7416

Km = 1,64
Tubo Nº Enzima (ml) Absorvancia Velocidad
1 0,1 0,340 0,94
2 0,2 0,540 1,49
3 0,4 0,779 2,15
4 0,6 0,971 2,68
5 0,8 1,033 2,85
ESTANDAR 1 0,367
ESTANDAR 2 0,357

Tabla 3.- Corresponde alos datos obtenidos en situación reactivas idénticas pero
con variaciones de la cantidad de enzima presentes. Además se adjuntan los Estándares
para obtener un promedio y utilizarlo en el calculo de la Velocidad.

Grafico 5.- corresponde a la Tabla 3, visualizando el ascenso lineal de la velocidad de


la reacción catalizada por enzima, al ir aumentando la cantidad de esta ultima. El
gráfico no posee el dato 2,85 de velocidad debido a que era un dato que desviaba
demasiado la recta debido a quizás errores en tiempo de preparación.

Para obtener el promedio de la Absorbancia de los Estándares, se realiza lo


siguientes:(Tabla 1)
0, 322 + 0, 320
2
A lo cual obtenemos: 0,321 de Absorbancia PROMEDIO.

Para calcular la concentración de producto en base a la Absorbancia obtenida de cada


muestra, nos basamos en los promedios de los estándares:
Estándar Promedio:0,321

La absorbancia equivale a la concentración de 1 µmol de fosfato, que sería el producto


de la acción enzimático de la fosfata alcalina., y por ende con dividir las
concentraciones muestreadas por la del estándar promedio obtendremos la
concentración final.

Absorbancia 5 min: 0,066 0, 066


Absorbancia Promedio: 0,321 0, 321

Obtenemos un concentración de producto de: 0,021 µmoles

En el caso del calculo de las velocidad, basta tan solo con dividir la concentración de
producto ya valorizado con la cantidad de tiempo que se desea sacar la velocidad, que
puede ser por minuto o por 5 minutos.

Cabe destacar que las tablas adjuntas de las cuales se desarrollaron los gráficos,
poseen variación debido a que en el calculo por medio de Excel se utilizan todos los
decimales, para así hacer las representación gráficas mas representativa.

CONCLUSION Y DISCUSION

Durante la última actividad práctica que realizamos tratamos el tema de Enzimas. Esta
actividad se encontraba dividida en dos partes, en las que pudimos observar el
comportamiento de la velocidad de la reacción enzimática en función del tiempo y la
influencia que tienen la concentración de sustrato y la concentración de enzima en la
velocidad de la reacción.
Para realizar ambas partes de este práctico utilizamos como enzima la fosfatasa alcalina
(FA) de intestino de ternera. El sustrato de esta enzima es el β-glicerofosfato de sodio,
el cual en presencia de agua y FA es hidrolizado a glicerol y fosfato de sodio. Al utilizar
FA hay que tener en consideración que toda enzima trabaja a una temperatura y a un pH
óptimo, los cuales en este caso son 37° C y 9,4 respectivamente. Para detener la
reacción se agregó solución stop (molibdato de amonio 2,5% en H2SO4 5N), el H2SO4
acidifica el medio y desnaturaliza a la enzima, haciendo que esta deje de formar
producto. Por otra parte, el molibdato se une al fosfato generado por la reacción
enzimática, formando un complejo que puede detectarse al agregar solución reductora
(ácido 1,2,4-aminonaftosulfónico), la cual hace que la solución tome un color azul-
violáceo, que es usado para medir la concentración de fosfato mediante
espectrofotometría.

En la primera parte del práctico estudiamos el progreso de la reacción enzimática en


función del tiempo de incubación, lo que puede observarse en el Gráfico 2. El progreso
de una reacción enzimática puede medirse utilizando como referencia la cantidad de
sustrato consumido o el producto formando, en este caso utilizamos el producto, que
según la curva del Gráfico 2 aumenta de forma hiperbólica.
La curva toma una forma hiperbólica ya que la FA, al encontrarse un medio rico en
sustrato y con condiciones óptimas para reaccionar, comienza su actividad catalítica de
forma eficiente. El sustrato es saturante ya que se encuentra en gran cantidad en
relación a la cantidad de enzima presente, la formación de producto es rápida y eficiente
ya que todos los sitios activos de la enzima están siendo ocupados por sustrato. A
medida que aumenta la concentración de producto, disminuye la concentración de
sustrato, los sitios activos de la enzima no serán ocupados en su totalidad, por lo que la
formación de fosfato se hace cada vez más lenta.
La velocidad aumenta de forma repentina de 0 a un valor de 0,22 de forma tan rápida
que no se puede observar en la Gráfico 1 (se trata del tiempo que demoran encontrarse
la enzima con el sustrato). Teóricamente, la velocidad debería permanecer constante por
un breve periodo de tiempo, pero al mirar la curva del Gráfico 1 esto no resulta así. Esto
pudo ocurrir debido a una descoordinación del trabajo en grupo, ya que si se deja pasar
mucho tiempo entre retirar una alícuota y vaciarla en el tubo con solución stop, sigue
llevándose a cabo la reacción y sigue consumiéndose sustrato, disminuyendo la
liberación de fosfato y, por consiguiente, disminuyendo la velocidad de reacción.
Según el Gráfico 1 la velocidad de reacción disminuye a medida que pasa el tiempo.
Teóricamente la velocidad puede llegar a ser 0 cuando se alcanza el equilibrio de la
reacción.

En la segunda parte del práctico estudiamos los parámetros que cambian la velocidad de
reacción al ser modificados. El primer parámetro que modificamos fue la concentración
de sustrato. Se puede observar la variación de la velocidad en función de la
concentración de sustrato en la curva de saturación Gráfico 3. La fosfatasa alcalina, al
no ser regulada alostéricamente, sigue la cinética de Michaelis-Menten, por lo que se
pueden obtener del gráfico los valores de Vmáx y Km. La importancia de estos valores se
debe a su significado, mientras la velocidad máxima es la velocidad inicial más alta que
se alcanza, en la que la enzima está saturada; Km es la relación entre k1, k2 y k3
(constantes de velocidad de la reacción enzimática) y es bastante útil a la hora de
comparar la eficiencia de diferentes enzimas o bien, de una misma frente a distintos
sustratos; enzimas con menor valor de Km muestran ser más eficientes y afines a su
sustrato, ya que a menor [S] se alcanza la mitad de Vmáx, la catálisis es más rápida pues
toma menos tiempo para que se forme el complejo enzima sustrato.
Puede observarse que a bajas concentraciones de sustrato, la Vi aumenta casi
linealmente con el incremento de la concentración de sustrato, esto ocurre porque a
bajas [S] no han sido ocupados todos los sitios activos de las enzimas. Cuando la
concentración de sustrato llega a ser saturante, es decir, todos los sitios activos se
encuentran ocupados, se llega a un estado estacionario, que en el gráfico se observa
como una meseta, la velocidad de reacción deja de ser dependiente de la concentración
de sustrato y pasa a depender solamente de la velocidad en que ocurre la catálisis en el
sitio activo, y se alcanza la Vmáx.
Como se mencionó anteriormente se pueden obtener los valores de Vmáx y Km a partir
del gráfico, pero de forma aproximada, los cuales serían 3,16 µmoles/5 minutos y 1,4
mM respectivamente. El valor de velocidad máxima que se calcula a partir del gráfico
es aproximado, ya que se acerca a él pero nunca lo alcanza. Para calcular estos valores
con certeza se utiliza la ecuación de los dobles recíprocos (Gráfico 4) obteniéndose
valores más reales y confiables, 4,7619 µmoles/5 minutos para la Vmáx y 1,6554 mM
para Km.
El segundo parámetro modificado fue la concentración de enzima. Se agregan distintas
cantidades de enzima a distintas soluciones con igual concentración de sustrato. La
concentración de sustrato utilizada es saturante (6 mM), por lo que sin importar la
cantidad de enzima que se agregue, sus sitios activos siempre estarán ocupados, por lo
que al hablar de velocidad, se habla específicamente de Vmáx. Entonces, la velocidad de
la reacción será directamente proporcional a la concentración de enzima, si se
mantienen constantes todos los otros factores, tales como el pH, la temperatura, la
concentración de sustrato, etc. Esto puede observarse en el Gráfico 5.

Para finalizar, podemos decir que los errores que pudieron cometerse realizando este
práctico fueron debidos al factor humano. El práctico requería de gran minuciosidad y
de coordinación entre los integrantes del grupo de trabajo.
Las soluciones que se ocuparon en el práctico debían realizarse con exactitud y
siguiendo un cierto orden, especialmente al agregar la solución reductora; también debía
medirse al espectrofotómetro en el mismo orden (blanco, estándar 1, estándar 2, otros)
ya que el color se intensifica a medida que pasa el tiempo, ya que la formación de
compuesto coloreado continúa. También hay que tener en consideración la coordinación
del grupo de trabajo, especialmente entre la persona que manejaba el cronómetro y la
persona que debía detener la reacción con solución stop, ya que un par de segundos de
error podían cambiar drásticamente los resultados.

BIBLIOGRAFÍA

• Del Pozo. R, Texto guía de Bioquímica Medicina, volumen I, Universidad


Católica de la Santísima Concepción, Facultad de Medicina

• Nelson. D, Cox. M, Lehninger Principios de Bioquímica, Tercera Edición,


Ediciones Omega, 2000, Barcelona, España.

• Del Pozo R., Muñoz Mirna, Grandón Javier, Rotter German; “Guía de
trabajos prácticos” (2009), Universidad Católica de la Santísima
Concepción.