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Patricia Lobos

Rodrigo Medina

Mitchel Materola

Rafael Moya
INTRODUCCIÓN

Existen muchos métodos para separar sustancias, muestras y componentes, como la cromatografía en columnas,
cromatografía en papel y cromatografía en capa fina; en este laboratorio nos especificaremos en la cromatografía
de filtración en gel. Aquí las macromoléculas pueden separarse en forma muy selectiva mediante su tamaño. En
este primer práctico calibraremos una columna de 40x1 de Biogel y estimaremos el Vo y Vt.

En este tipo de cromatografía se permite obtener mucha cantidad de proteínas pero el problema es que posee un
menor poder resolutivo que la electroforesis, lo especial de esta cromatografía es su matriz solida porosa que
consiste en un polímero que tiene la tendencia de ser muy hidratado y de diámetro 100 uM aproximadamente.
Existen más matrices en el mercado, las más habituales son el sephadex, la sheparosa y el Biogel, esta última
matriz posee la cualidad que las moléculas menores entran en esta esfera pero las que poseen un mayor peso
molecular no. Por lo tanto las moléculas grandes fluyen con más rapidez a través de la columna y salen antes
porque poseen un volumen menor. Esto nos advierte que el orden de aparición de las moléculas en la columna es
inverso al orden de la electroforesis en el cual la trama continua del polímero impedía el movimiento de las
moléculas mayores.

En el segundo práctico se separaron y analizaron vesículas y micelas de bilis vesicular humano. Las micelas son de
menor tamaño que las vesículas (alrededor de 30 a 60 A) constituidos por fosfolípidos y sales biliares, tienen
como cualidad ser muy termodinámicamente estables pero estás transportan muy poco colesterol, en cambio las
vesículas son más grandes (alrededor de 150 a 500 A), transportan muy bien el colesterol pero soy muy
metaestables, es decir, de muy baja estabilidad. Lo característico de las micelas es que se rompen muy fácilmente
durante la separación cromatografica es así que es indispensable la presencia de sales biliares en las distintas
fracciones de elución. Luego se determinaran los fosfolípidos a través de la identificación de fosforo inorgánico
por la reacción de Fiske y Subbarow, es importante mencionar que previo a esta reacción se debe mineralizar la
muestra mediante procesos de oxido reducción con acido sulfúrico y peróxido de hidrogeno, a temperaturas muy
altas de 150ºC a 200ºC y finalmente el fosforo al unirse con molibdato de amonio creará una solución de color
azul y esta la leeremos en el espectrofotómetro a 830 nm. Paralelamente se determinará también las proteínas
totales con el método de Lowry que consiste en una reacción de reducción de molibdeno en presencia de un
agente reductor, contenidos en un reactivo comercial llamado Folin-Ciocalteu. Esta reacción ocurre
principalmente en presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina y triptófano) y es exacerbada por la adición de
cu+2, lo difícil de este método es que es muy sensible a interferentes, por lo tanto se le adicionará previo a la
cuantificación acido tricloroacético y se lavará con dietiléter-etanol (2:1) para su delipidación del sedimento
proteico obtenido.

Luego de obtener los resultados de proteína y fosfolípidos se deberá hacer una grafica de “Fosfolípidos y
proteínas versus número de fracción de elución”. Es aquí lo principal de nuestro trabajo ya que discutiremos los
resultados y la probable asociación entre proteínas y las estructuras que transporta en colesterol biliar

OBJETIVOS

 Comprender la técnica de separación cromatografica


 Calibrar la comuna de Biogel
 Estimación del Vo y Vt del gel
 Separar una muestra de bilis humana
 Establecer la presencia de transportadores biliares de colesterol
 Determinar una eventual asociación entre proteínas y los transportadores de
colesterol.
Materiales

 Bomba peristáltica  Agua destilada


 Columna de vidrio (50cm de altura x 1cm de  Micropipeta
diámetro)con el gel (Bio-Gel A 5 cm o  Gradilla
equivalente)  Agua destilada
 Colector de fracciones  Vórtex
 Buffer de elución: Tris 20 mM (ph:8.0), NaCl  Bloque metálico (termoblock)
140 mM, NaN3 0,03 %  Espectrofotómetro
 0,5 ml de fase isotrópica (obtenida de la bilis  Posillos para espectrofotómetro
nativa)  Ac. Tricloroacético (TCA) 20%
 H2SO4 10N  Dietiléter:etanol (2:1, v/v)
 H2O2  NaOH 1N y 2N
 Molibdato de amonio  Reactivo alcalino:
 Fiske 1: o 50ml de NaCO3 2%
o Disulfito de sodio 3.425g en o 1ml de CuSO4 1%
25ml de H2O o 1ml de Na-K-tartrato 2%
o Ac. 1-amino-  Reactivo Folin- Ciocalteu:H2O (1:1, v/v)
2hidroxinaftalensulfónico  Estándar de BSA 1mg/ml
0.0625g  Microcentrífuga
 Fiske2:  Repipeteadores
o Sulfito de sodio 1,5g en 25ml de  Lápiz marcador
H2O  Ultrasonido
 Estandar de fosfolípidos: Fosfatidilcolina-  Tubos plásticos
dimiristoil 4mM  Tubos Eppendorf
 Tubos de vidrio

Métodos

1) Llenado de la columna con el gel (Paso realizado por profesores encargados)

2) Calibración del gel (realizado por profesor a cargo): No realizamos este paso del práctico descrito en la
guía de laboratorio, la calibración fue previamente hecha por el profesor a cargo. La calibración nos sirve
para saber desde que fracción el gel
comienza a separar. El profesor nos dio
de la fracción 9 en adelante.

3) Elución de la muestra bilar: El flujo


de la bomba es de 0,15 ml/min.

Se nos hizo la demostración de cómo


se realizaba la elución de la muestra en
el gel. Sin embargo, la elución de la
muestra biliar estaba lista. Nuestras
fracciones eran 9, 10, 11, 12, 13 y 14.

Cada fracción debía ser sometida a


procedimientos de extracción de
fosfolípidos y proteínas.
4)

Observaciones:

1.- Proteger reactivo de la luz

2.- Se puede sacar el sobrenadante volteando el tubo ya que las proteínas (en el caso que las hubiese)
quedan adheridas al fondo del tubo.

3.- Nos tocó hacer estándar 2mM

4.- Realizado por profesores encargados

5.- Realizado por profesores encargados


RESULTADOS

Gráfico de absorbancia vs fracción

0,75
0,7
0,65
0,6
0,55
0,5
Absorbancia (*)

0,45
0,4
Fosfolípidos
0,35
0,3
Proteínas
0,25
0,2
0,15 2 per. media móvil
(Fosfolípidos)
0,1
0,05 2 per. media móvil
(Proteínas)
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
Fracción

(*) 830nm y 750nm respectivamente para fosfolípidos y proteínas

Curva de calibración para fosfolípidos Curva de calibraciñon para Proteínas

0,8
0,3
0,7

0,6
0,25
Absorbancia (830nm)

Absorbancia (750nm)

0,5 0,2
0,4
0,15
0,3
0,1
0,2

0,1 0,05

0 0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Concentración (m M) Std fosfolípidos mM Std Proteínas mg/ml
Concentración (m g/m l)
Lineal (Std Lineal (Std Proteínas

Ejemplos de Cálculo de Concentración de Fosfolípidos: (para la fracción nº 31)

• Fórmula de concentración en base a la absorbancia según gráfico: (*)


• Concentración = 4,2603*(abs)-0,0321
• Abs = 0,722
• Resultado = 3,0438366

Ejemplos de Cálculo de Concentración de Proteínas: (para la fracción nº 31)

• Fórmula de concentración en base a la absorbancia según gráfico:


• Concentración = 3,7015*(abs)
• Abs = 0,139
• Resultado = 0,5145085
(*) La formula se obtiene de la línea de tendencia, por eso es que para algunos casos el resultado es incoherente Ej: para
absorbancia de fosfolípidos 0,001 la concentración que da es de -0,0278397; Para el caso de las proteínas no ocurre esto ya que
solo existen 2 puntos (el 0,0 y el obtenido en el práctico).
Ica Indica el V y el Vt de izquierda a derecha respectivamente.
0
Absorbancia Concentración Absorbancia Concentración
Fracción fosfolípidos en mM Proteínas en mg/ml
9 0 0 0 0
10 0 0 0 0
11 0 0 0 0
12 0 0 0 0
13 0 0 0 0
14 0,032 0,1042296 0 0
15 0,027 0,0829281 0,002 0,007403
16 0,017 0,0403251 0,004 0,014806
17 0,022 0,0616266 0,031 0,1147465
18 0,002 0 0 0
19 0,009 0,0062427 0,005 0,0185075
20 0,039 0,1340517 0,01 0,037015
21 0 0 0 0
22 0,017 0,0403251 0 0
23 0,022 0,0616266 0 0
24 0,026 0,0786678 0 0
25 0,016 0,0360648 0 0
26 0,04 0,138312 0 0
27 0,062 0,2320386 0,004 0,014806
28 0,077 0,2959431 0 0
29 0,164 0,6665892 0,061 0,2257915
30 0,419 1,7529657 0,121 0,4478815
31 0,722 3,0438366 0,139 0,5145085
32 0,681 2,8691643 0,086 0,318329
33 0,431 1,8040893 0,053 0,1961795
34 0,191 0,7816173 0,063 0,2331945
35 0,08 0,308724 0,028 0,103642
36 0,041 0,1425723 0,011 0,0407165
37 0,037 0,1255311 0,009 0,0333135
38 0,005 0 0,001 0,0037015
39 0,001 0 0 0
40 0,001 0 0 0
41 0,001 0 0 0
42 0 0 0 0
43 0 0 0 0

(*) Para efectos lógicos los valores que según la ecuación de la recta dieron negativo (imposibles) se cambiaron a 0.
CONCLUSIÓN

La técnica bioquímica de Cromatografía en Gel, separa los componentes de una mezcla dado el tamaño de los
componentes de ésta. En nuestro práctico, sometimos a análisis una muestra de bilis humana a partir de la cual,
identificamos las concentraciones de fosfolípidos y proteínas, dado las características propias de éstos de acuerdo a su
tamaño y concentración, y a partir de tal información analizaremos, su relación con dos moléculas de transporte
conocidas previamente; micelas y vesículas. Éstas últimas son de mayor tamaño que las micelas, por lo que debieran
aparecer antes en las fracciones obtenidas, y con tal información como premisa, inferiremos su composición o
relación con proteínas y fosfolípidos.

Comenzando con los fosfolípidos, pudimos observar en los resultados y luego plasmado en los gráficos, que las
primeras fracciones no presentaban tal tipo de moléculas, comenzando a aparecer sólo en la fracción número 14, y
mostrando un pequeñísimo peak entre las fracciones 14, 15, 16 y 17, para luego decrecer y llegar a concentraciones
de 0 nuevamente, o en otras palabras, desaparecer. Usando la premisa mencionada anteriormente, podemos asociar
este peak a la presencia de las vesículas; hubo una máxima concentración de fosfolípidos de 0.104mM en la fracción
14, por lo que podemos inferir que en dicha fracción encontramos la mayor cantidad de vesículas dado su tamaño.
Luego de desaparecer la concentración de fosfolípidos, éste vuelve a ascender para llegar a un prominente peak entre
las fracciones 25 y 38 aproximadamente, dentro del cual el punto más alto correspondió a la fracción número 31 en la
cual había una concentración de fosfolípidos equivalente a 3.04 mM aproximadamente. Tal presencia corresponde a
la de micelas, y comparando ambas podemos afirmar que la muestra entregada, presenta mayor concentración de
micelas que de vesículas, debido a la gran diferencia entre ambos peaks.

Analizando ahora los resultados obtenidos correspondientes a las concentraciones presentes de proteínas, podemos
ver que entre las fracciones 15 y 20 aparece un pequeñísimo peak de proteínas, teniendo valores muy cercanos a 0,
por lo que son casi nulos. Tales valores, se relacionan directamente con la presencia de fosfolípidos en estas mismas
fracciones, por lo que podemos inferir que existe una pequeña proporción de proteínas en las vesículas, pero
reiteramos, que esta proporción es bajísima sólo ya que su punto más alto fue de 0.037 mM aprox (desestimamos el
valor de la fracción 17, situación que explicaremos en la discusión). A partir de la fracción número 21 vuelven a
desaparecer, para luego encontrarse nuevamente entre las fracciones número 27 y 38, porción que debe corresponder
a la de micelas, alcanzando su mayor peak en la número 31 (0.514mM), misma fracción que obtuvo el peak de
fosfolípidos, aunque la proporción entre éstos y proteínas es muy desigual: 6:1(utilizando las concentraciones
obtenidas en este punto). De todas formas podemos observar que existe una mayor concentración de proteínas en la
porción correspondiente micelas que a la de vesículas, a partir de lo cual concluimos que existe algún tipo de
asociación entre proteínas y micelas.

DISCUSIÓN

Los valores obtenidos en éste práctico fueron acordes a los esperados, sin embargo debemos considerar, un factor
para nada despreciable; el error humano. A pesar de que en un principio este proceso fue automatizado gracias al
fraccionador, la adición de reactivos fue totalmente responsabilidad nuestra, por lo que pudimos observar algunos
errores en las mediciones, que revelan tal factor. Específicamente se observa en la fracción 17 de proteínas, una
elevadísima concentración de éstas, en comparación a las fracciones contiguas a ésta (16 y 18) y dado esto decidimos
desestimar dicho valor, pudiéndose deber tanto al error humano como a algún tipo de problema con la cubeta
utilizada.

Así también obtuvimos dispares resultados en lo que a estándares se refiere, aunque se mantuvieron dentro de un
margen racional. Sólo en el caso del estándar 4mM tuvimos que no considerar 2 valores ya que éstos arrojaron una
absorbancia de 0.008, muy distante a los 0.667 y 0.746 de otro grupo. Dado esto es que al calcular algunos valores de
concentraciones, utilizando la ecuación de la recta obtenida al graficar, es que se obtuvieron valores levemente
negativos por lo que debimos aproximarlos a 0, situación que no alteró en absoluto los resultados que esperados.

A pesar de todo lo anteriormente mencionado, los resultados fueron exitosos y a partir de ellos pudimos realizar un
correcto análisis de concentraciones de fosfolípidos y proteínas.
Bibliografía
Bibliografía

• Guía de laboratorio de bioquímica año 2009.

• Libro del Curso de bioquímica.

• Libro Lehninger.