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ANUARIO DE INVESTIGACIN

EN ETNOMEDICINA,
MEDICINAS COMPLEMENTARIAS
Y UTILIZACIN
DE PLANTAS MEDICINALES
ANUARIO DE INVESTIGACIN
EN ETNOMEDICINA,
MEDICINAS COMPLEMENTARIAS
Y UTILIZACIN
DE PLANTAS MEDICINALES
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2008
2008
Jos Federico Rivas Vilchis, Ed.
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ISBN : 970-31-0546-7
1
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ANUARIO DE INVESTIGACIN
EN ETNOMEDICINA,
MEDICINAS COMPLEMENTARIAS
Y UTILIZACIN
DE PLANTAS MEDICINALES
2008
Jos Federico Rivas Vilchis, Ed.
3
4
Rector General
Dr. Jos Lema Labadie
Rector de la Unidad Iztapalapa
Dr. Oscar Monroy Hermosillo
Director de la Divisin
Ciencias Biolgicas y de la Salud
Dr. J. Francisco Flores Pedroche
Jefe del Departamento
Ciencias de la Salud
Dr. Rubn Romn Ramos
5
ANUARIO DE INVESTIGACIN
EN ETNOMEDICINA,
MEDICINAS COMPLEMENTARIAS
Y UTILIZACIN
DE PLANTAS MEDICINALES
2008
6
COMIT EDITORIAL
Editor ejecutivo
Jos Federico Rivas Vilchis
Universidad Autnoma Metropolitana - Iztapalapa
Editores asociados
Fabio de Sousa Menezes
University of Dublin, Ireland
Ral G. Enrquez Habib
Instituto de Qumica, Universidad Nacional Autnoma de Mxico; Mxico
Enrique Jimnez Ferrer
Centro de Investigacin Biomdica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social, Mxico
Rubn Romn Ramos
Universidad Autnoma Metropolitana Iztapalapa, Mxico
Max Snchez Araujo
Universidad Francisco de Miranda, Coro, Venezuela
Diseo y formacin:
Miguel Linerio Morales
Universidad Autnoma Metropolitana Iztapalapa 2008
Todos los derechos reservados
Cuarta edicin 2008
ISBN: 970-31-0546-7.
Rivas Vilchis, Jos Federico
Universidad Autnoma Metropolitana - Iztapalapa
Tels. : +55-58044920, +55-58044728. FAX: +55-58044727
Direccin electrnica: jfrv@xanum.uam.mx
Hecho en Mxico
Contenido
Parte I. Plantas medicinales: utilizacin mdica
Toxicological Study on Bikihwan: the oriental medicinal prescription for anticancer therapy.
Seung-Hoo Yoo, Dae-Hwan Youn, Jungsun Kim, Yeon-Weol Lee, Chong-Kwan Cho,
Hwa-Seung Yoo. 11
Distictis buccinatoria (DC) A.H. Gentry, planta medicinal mexicana con potencial teraputico.
Mara Gabriela Rojas-Bribiesca, Rubn Romn-Ramos, Jaime Tortoriello-Garca, Macrina
Fuentes Mata, Margarita Avils Flores. 19
Diabetes mellitus y plantas medicinales en Mxico.
Francisco Javier Alarcn-Aguilar, Erica Hernndez Galicia y Rubn Romn-Ramos. 27
Parte II. Estudios de actividad biolgica y farmacolgica
Chemical composition and cytotoxic activity of Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling (Lamiaceae).
Patricia Fontes Esteves, Ricardo Machado Kuster, Nancy dos Santos Barbi, Fabio de Sousa
Menezes. 41
Actividad hematopoytica de Amphipterygium adstringens (Cuachalalate) in vitro e in vivo.
Rodolfo Velasco-Lezama, Catalina Pliego-Villanueva, Rafaela Tapia-Aguilar, Elisa Vega-vila y
Rubn Romn-Ramos. 49
Rastreo de actividad antifngica en especies medicinales, a travs de estudios de
microbiologa.
Ofelia Romero-Cerecero, Rubn Romn-Ramos, Enrique Jimnez-Ferrer, Jaime Tortoriello-
Garca. 57
Antioxidant activity of isoquercetin and Hyptis fasciculata on yeast cells.
Carmelita Gomes da Silva, Raul Raulino, Debora Malta Cerqueira, Marcos Dias Pereira, Anita
Dolly Panek, Joaquim Francisco Mendes da Silva, Elis Cristina de Araujo Eleutherio, Fabio de
Sousa Menezes. 69
Actividad antibacteriana de las semillas de Plantago major L.
Elisa Vega-Avila, Shindu Irais Gmez-Covarrubias, Rafaela Tapia-Aguilar, Rodolfo Velasco-
Lezama. 77
7
8
Parte III. Efecto placebo en teraputicas complementarias
Determina el diseo del placebo los resultados de los ensayos clnicos de acupuntura?
Meta-anlisis de 100 ensayos clnicos.
Max Snchez-Araujo. 83
Efecto placebo y acupuntura: mecanismos comunes en analgesia?
Miguel J. Reyes-Campos, Livia G. Daz-Toral, Jos L. Flores-Senz, Jos F. Rivas-Vilchis. 89
Apndice
Declaracin de Helsinki de la Asociacin Mdica Mundial: Principios ticos
para las Investigaciones Mdicas en Seres Humanos 97
9
Prefacio
Diversos retos que afronta la salud de la humanidad -algunos de ellos resultado del aumento
de la expectativa de vida, el sedentarismo, la polucin ambiental y la corrupcin de los hbitos
de alimentacin hacen necesario que los diversos estados nacionales procuren la utilizacin de
todos los recursos a su alcance para cubrir las necesidades sanitarias de sus poblaciones.
En esta cuarta edicin del Anuario de Investigacin en Etnomedicina, Medicinas Complementarias
y Utilizacin de Plantas Medicinales 2008 se ponen a disposicin de los lectores interesados
investigaciones en el campo de las medicinas complementarias.
Este nmero del anuario se recogen diversos estudios llevados a cabo en instituciones de
investigacin y educacin superior de diversos pases del mundo sobre la utilizacin clnica y la
farmacologa y qumica de plantas.
En la primera parte se presentan tres estudios enfocados en el empleo mdico de las plantas
medicinales. A continuacin se presentan cinco estudios relativos a la composicin qumica,
actividad biolgica y farmacolgica de plantas medicinales.
Por otra parte, el estudio del efecto placebo tiene inmediatas implicaciones clnicas, metodolgicas
y ticas. Los mecanismos biolgicos y fsiolgicos del efecto placebo son ahora estudiados
por importantes grupos de investigacin en diversos pases. La utilizacin del placebo en la
investigacin en medicinas complementarias genera problemas metodolgicos que siguen siendo
motivo de continuas discusiones tericas. Algunos de estos aspectos se discuten en la tercera
parte de este anuario de investigacin.
Finalmente consideramos importante la difusin de la versin ms reciente de la Declaracin de
Helsinki de la Asociacin Mdica Mundial. La World Medical Association accedi con extrema
gentileza a cedernos los derechos para reproducirla.
10
11
Toxicological Study on Bikihwan: the Oriental
Medicinal Prescription for Anticancer Therapy
Estudio toxicolgico de Bikihwan: la prescripcin
para el tratamiento del cncer en medicina oriental
Seung-Hoo Yoo
1
, Dae-Hwan Youn
2
, Jungsun Kim1, Yeon-Weol Lee
1
, Chong-Kwan Cho1, Hwa-Seung Yoo
1
*.
1
Department of Oriental Medicine, Daejeon University, Daejeon, South Korea
2
Meridian &Acupoint, College of Oriental Medicine, Dongshin University

Autor para correspondencia: Dr. Hwa-Seung Yoo
East-West Cancer Center, Dunsan Oriental Hospital of Daejeon University
1136 Dunsan-dong, Seo-Gu, Daejeon, 302-122, South Korea
Tel: 82-42-470-9132
Fax: 82-42-470-9006
e-mail: altyhs@hanmail.net
Abstract
Background: Many herbs and prescriptions had been
used to treat cancer in oriental medicine traditionally.
Bikihwan (BKH) was one of the well-known prescriptions,
but it hasnt been studied systemically about its toxicity.
BKH include some toxic herbs so we need to ensure
that it is safe enough to be administered in clinical way.
The aim of this study is to characterize the potential
toxic effect of BKH through oral administration and
verify the no-observed-adverse-effect level (NOAEL) of
BKH in male ICR rats.
Methods and Results: 60 male ICR rats had been
consumed BKH water extracts per 0, 250, 2,500 and
25,000 mg/kg/day for 1-week single oral dose toxicity
test and per 0, 25, 125, 250 and 500 mg/kg/day for 13-
weeks repeated oral dose toxicity test.
In single and repeated dose toxicity studies, there
arent any signifcant clinical differences compared
with controls in survival, water and food consumption,
and chemical tests. Signifcantly higher value of body
and liver weight in the male ICR mice administered
BKH water extracts per 25 mg/kg/day compared
with that of the control group was shown in repeated
dose toxicity studies temporarily. And the mice those
are administered BKH extracts per 125, 250 and 500
mg/kg/day is presented signifcantly higher value of
creatinine statistically.
Conclusions: Short term use of BKH isnt harmful
to male mice but long term use of it may cause renal
toxicity. NOAEL of BKH in male mice is 125 mg/kg/
day.
Keywords: Bikihwan, toxicity, in vivo, no-observed-
adverse-effect level.

Resumen
Antecedentes: se han empleado en medicina tradicional
oriental muchas plantas y prescripciones para tratar el
cncer. Una de las prescripciones ms conocidas es
Bikihwan (BKH), pero no ha sido estudiada su toxicidad
en forma sistemtica. BKH incluye algunas plantas
txicas de tal manera que es necesario conocer su
seguridad para su administracin clnica. El objeto de
este estudio es caracterizar el efecto txico potencial
de BKH tras su administracin oral y verifcar el nivel
de efectos adversos no observados (NOAEL, siglas en
ingls) del BKH en ratas macho ICR.
Materiales y mtodos: 60 ratones macho ICR
recibieron extractos acuosos de BKH en dosis de 0, 250,
2,500 y 25,000 mg/kg/da, en una dosis nica para una
prueba de toxicidad de una semana y 0, 25, 125, 250
y 500 mg/kg/da durante 13 semanas en dosis orales
para una prueba de toxicidad por dosis repetidas.
12
Resultados: en estudios de toxicidad de dosis nica y
dosis repetidas, no se observaron diferencias clnicas
signifcativas cuando se compararon los controles
y tratados respecto a la supervivencia, consumo de
agua y alimentos y pruebas qumicas. Se observaron
temporalmente valores signifcativamente ms
elevados de peso corporal y del hgado en los ratones
macho ICR que recibieron extractos acuosos de BKH
25 mg/kg/da comparado comparado con los controles
en los estudios repetidos de toxicidad. Y los ratones
que recibieron extractos de BKH a dosis de 125, 250 y
500 mg/kg/da presentaron valores de creatitinina ms
elevados de manera estadsticamente signifcativa
respecto a los controles.
Conclusiones: el empleo a corto plazo de BKH no
tiene efectos deletreos para los ratones machos, pero
el empleo a largo plazo puede causar toxicidad renal.
El NOAEL del BKH en ratones macho es 125 mg/kg/
da.
Palabras clave: Bikihwan, toxicidad in vivo, nivel de
efectos advernsos no observados.

Introduction
Bikihwan (BKH) was an herbal mixture that was used for
eliminating some pathological masses in the right side
of abdomen. We could see that kind of symptoms in liver
cancer like Hepatocarcinoma or Cholangiocarcinoma.
1

BKH is consist of Rhizoma Coptidis, Cortex magnoliae,
Fructus Evodiae, Radix Scutellariae, Fructus Amomi,
Poria, Radix Ginseng, Rhizoma Alismatis, Herba
Artemisiae Capillaris, Rhizoma Zingiberis Siccatum,
Cortex Cinnamomi and Semen Tiglii.
Some herbs were known to have anti-cancer effects.
Panax Ginseng was a widely used respective anti-
cancer herb in the world.
2-4
Semen Tiglii was supposed
to inhibit the growth of tumor cells, decrease the size of
tumor in rats and activates the function of Natural Killer
(NK) cell.
5
It was supposed that Cortex Cinnamomi
also have anti tumor effects causing apoptosis of F9
embryonic carcinoma cells by proliferation inhibitory
factor, retinoic acid.
6
Semen Tiglii was effective on esophageal cancer,
gastric cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, acute
leukemia, lung cancer and breast cancer.
7
Phobal ester
without lipid compound known to be strong anticancer
material in Semmen Tiglii had made less growth in
S-180, Ehrlich JTC-26 cancer cell lines.
8
It was also
observed that Semen Tiglii makes A549 tumor cells
decreased and suppresses the growth of sarcoma-
180, Lewis lung carcinoma.
9
1% BKH extracts make
the survival rate of cancer cell lines, K562 from human
leukemia, Raji from Burkett lymphoma and MO4 from
lymphoblastic lymphoma reduced up to 96%.
10
As you see, the needs for defning the safety of BKH for
clinical use were increased but systematic non-clinical
toxicity studies had been performed on BKH yet.
11-13

Semen Tiglii, Herba Artemisiae Capillaris and Radix
Scutellariae are supposed to be herbs that cause drug-
induced hepatotoxicity, so the studies about the safety
of BKH have much more needs to be proven.
14
Here, we evaluated the safety of the BKH, to build the
safety evidence for clinical trial. This study is performed
to estimate the safety of BKH. The safety of was tested
in male ICR mice orally for a week and 13 weeks.

Methods
Chemicals
The crude herbs of BKH were obtained from Dunsan
Oriental Hospital (Daejeon, Korea). The 3,856 g BKH
(Rhizoma Coptidis 1,280 g, Cortex magnoliae 640
g, Fructus Evodiae 480 g, Radix Scutellariae 320 g,
Fructus Amomi 240 g, Poria 160 g, Radix Ginseng
160 g, Rhizoma Alismatis 160 g, Herba Artemisiae
Capillaris 240 g, Rhizoma Zingiberis Siccatum 80
g, Cortex Cinnamomi 64 g, Semen Tiglii 64 g and
Rhizoma Atractylodis Macrocephalae 32 g) except
Semen Tiglii and 64 g Semen Tiglii was washed several
times with distilled water, and then boiled with 80 C for
6 hrs separately. Solid particles and aggregates were
removed by centrifugation at 3,000 g for 30 min and
the supernatants were lyophilized. Finally, 13.2 g BKH
lyophilized extract except Semen Tiglii and 0.3 g Semen
Tiglii lyophilized extract were obtained each other and
used in this experiment. The lyophilized extract was
stored at -20 C until used.
Experimental Design
54 male ICR mice (5-week old upon receipt, Samtako,
Korea) were used after acclimatization for 8 days. The
animals were housed individually in suspended wire
cages (500300200 mm) in a temperature (20-25 C)
and humidity (45-40%) controlled room. Light: dark cycle
was 12 h: 12 h and feed (Pellet, Samyang, Korea) and
water were supplied free to access during the study.
A no-observed-adverse-effect level (NOAEL) was
sought for mice. 54 male ICR mice (5-week old upon
receipt, Samtako, Korea) were equally distributed into
each group (6 per group on single oral dose toxicity test,
6 per group on repeated toxicity study). The expected
human exposure to BKH is approximately less then 250
mg/kg/day. Based on the use of BKH in animal studies
and clinical applications, dose levels of 0, 250, 2,500
13
and 25,000 mg/kg/day on single oral dose toxicity test
and 0, 25, 125, 250, and 500 mg/kg/day on repeated
toxicity study were selected.
Representative dose preparations for each level were
analyzed for homogeneity of distribution, concentration
and stability during the study. An appropriate amount of
the test or vehicle control substance was administered
orally to each mouse for 1 week on single oral dose
toxicity test, and 13 weeks on repeated toxicity study.
Mice were observed for mortality, signs of gross toxicity
and behavioral changes at least once daily during the
study.
Body weights were recorded during the acclimation
period and weekly during the exposure period. Individual
food and water consumption was also recorded weekly.
Ophthalmological examination was conducted by
observing the appearance of eye at the last week of
this experiment. Blood was collected from all mice near
the end of the study before being sacrifced. Blood was
evaluated for clinical pathology and gross necropsy and
histopathologic evaluations were performed on organs
and tissues.
Hematology, biochemistry parameters and Urine
Analysis
All mice were fasted approximately 18 hours before
blood collection. Blood samples were collected from
descending aorta under ether anesthesia at the end of
the experiment. Urine examination including specifc
gravity, pH, leukocyte, nitrite, protein, glucose, ketone,
urobilinogen, bilirubin, blood was evaluated by using
Bayer Diagnostics Multistix 10SG (Not. 5J06C, U.S.A.)
REF 2300(03536597) strip and urine measurement
(Clinitek 500, U.S.A.).
Morphologic pathology evaluations
In repeated toxicity studies, whereas complete post
morphologic evaluations were immediately performed
on mice that were found dead to avoid autolysis of the
organs, overnight fasted surviving animals were weighed
and humanely killed at the end of the experiment using
anesthetic ether.
Gross pathologic evaluation were performed and
weight of liver, kidney, heart, spleen, lungs, testis
and brain were measured and recorded immediately
afterwards. Relative organ weight (organ to body
weight ratio) were also calculated and recorded for the
organs. Histopathological examination was performed
on routinely prepared sections of tissues (liver, kidney,
heart, spleen, lungs, testis and brain). The tissues were
fxed in 10% formalin immediately after removal and
weighing to avoid autolysis and standard hematoxylene-
eosin staining was performed.
Statistical Analysis
We used Mann-Whitney U-test to compare the
homogeneity of variance in the numerical data (Body
weight, food and water consumption, hematology,
blood chemistry and organ weights). If there was the
homogeneity of variance in the data between groups,
one way ANOVA test was conducted. For these analyses,
SPSS 10.1 was used and statistical signifcance was
decided by p-value<0.05.

Results
1. BKH-consumption group in single oral dose
toxicity test for 1 week shows no mortality and
signifcant differences comparable to the control
group
Average overall (Test Days 17) food and water
consumption data indicated that there were no
statistically signifcant differences among treated groups
compared with the controls and they all survived during
that experiment.
There were no ophthalmologic fndings or clinical
observations noted during the study that were
considered to be of biological signifcance, too.
Average overall body weight and body weight gain data
indicated that the treated rats regardless of dose level
were comparable to the controls. Absolute and relative
organ weights of treated mice indicated that there were
no statistically signifcant differences among treated
groups compared with the controls.
We also found no signifcant hematological and
biochemistry change attributable to BKH after the
dosing period. Also, there were no signifcant differences
between the control group and any treatment group in
the urinalysis during the dosing period.
2. BKH-consumption group in repeated dose
toxicity study for 13 weeks shows body and organ
weight gain that have statistical meaning in some
cases.
Average overall body weight and body weight gain
data indicated that the treated rats regardless of dose
level were comparable to the controls. We observe
a signifcantly higher value of body weight in mice of
the BKH-R5 group at 2 week compared with control
group and BKH-R4 and BKH-R5 group are signifcantly
increased on liver weight, compared with the control
group.
(Fig. 1, Table 1)
14
Figure 1. Body weight changes in mice administered orally with BKH for 13 weeks. Data are mean S.D (n=6). The point of BKH-
R2 group, that is administered 25mg/kg/day is higher than the points of rest of the groups in 2 weeks after starting this trial. Though
it has statistical meaning, that group gets similar level of body weight at the end of this trial.
3. BKH-consumption group in repeated dose toxicity
study for 13 weeks shows signifcantly higher value
of creatinine comparable to the control one that
have statistical meaning.
In blood chemistry, we observe signifcantly higher
value of creatinine in mice of the BKH-R3, BKH-R4, and
BKH-R5 group. We found no signifcant hematological
change attributable to BKH after the dosing period
without the value of creatinine. There were also no
signifcant differences between the control group and
any treatment group in the urinalysis during the dosing
period.
(Table 2)

Discussion
BKH is the herbal drug developed for improving
abdominal pain, jaundice, weight loss and anorexia,
the symptoms of abdominal mass like hepatocellular
carcinoma and cholangiocarcinoma.15
BKH includes 14 herbs and some of them have
been known to have anti tumor effects; Radix Ginseng,
Radix Scutellariae and Cortex Cinnamomi are.16,17
Semen Tiglii, the main component of BKH is known to
its effectiveness on esophageal cancer, gastric cancer,
rectal cancer, pancreatic cancer, acute leukemia, lung
cancer and breast cancer. It is observed that Semen Tiglii
makes A549 tumor cells decreased and suppresses the
growth of sarcoma 180, Lewis lung carcinoma.
BKH itself has reported anti-cancer effect. 1% BKH
extracts make the survival rate of cancer cell lines, K562
from human leukemia, Raji from Burkett lymphoma and
MO
4
from lymphoblastic lymphoma reduced up to 96%
and this result repeated in another study.
15
Actually, BKH
have been used usually in cancer patients by clinicians
only based on oriental medicinal theory. Considering
the broad usage of BKH in oriental clinical therapy, it
is necessary that studies about the safety of BKH are
performed.
There are some reports about the toxicities of herbs
used in BKH; Radix Ginseng. There are a few reported
cases of ginseng toxicity or descriptions of side effects
attributed to either the quantity or quality of ginseng
when taken at the recommended dasages.
18,19
There are some case reports of herbal-induced
hepatitis about Radix Scutellariae in English language
literature. Radix Scutellariae is reported 6 cases, and
is supposed to activate hypersensitivity reaction to
induce hepatotoxicity. Herba Artemisiae Capillaris
are supposed to induce hepatotoxic injury in Korean
language literature.
Semen Tiglii already has been known to its toxicity
for a long time. In oriental medicine, Semen Tiglii is
considered having huge toxic property and some side
20
25
30
35
40
45
50
55
60
BKH-R1(0)
BKH-R2(25)
BKH-R3(125)
BKH-R4(225)
BKH-R5(500)
Week
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
B
o
d
y

W
e
i
g
h
t
s

(
g
)

15
Table 1. Absolute organ weights of mice with orally BKH for 13 weeks. The liver weight of BKH-R4 and BKH-R5 groups are big-
ger than others statistically.
Group/
Dose (mg/
kg/day)
Body
weight
Liver Kidney Spleen Testis Brain Lung Heart
Lt. Rt. Lt. Rt.
(g) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg)
BKH-R1 Mean. 46.0 2544.5 357.0 344.6 150.5 118.9 113.9 500.4 243.7 198.2
(0) S.D. 9.65 584.09 102.34 87.67 35.65 13.10 18.70 21.82 42.30 43.74
BKH-R2 Mean. 46.0 2544.5 357.0 344.6 150.5 118.9 113.9 500.4 243.7 198.2
(25) S.D. 9.65 584.09 102.34 87.67 35.65 13.10 18.70 21.82 42.30 43.74
BKH-R3 Mean. 46.0 2258.7 428.9 392.5 128.4 323.6 137.1 498.5 232.3 192.3
(125) S.D. 2.53 139.43 57.45 46.08 26.31 447.80 22.14 22.06 36.40 22.08
BKH-R4 Mean. 46.7 1983.8* 377.3 345.7 153.5 130.7 121.4 503.8 250.8 186.1
(250) S.D. 1.86 232.37 32.80 29.76 59.10 12.40 13.27 12.18 40.18 22.83
BKH-R5 Mean. 43.5 1916.2* 348.4 328.2 126.4 118.2 111.4 530.1 240.7 178.7
(500) S.D. 1.87 89.42 35.12 34.42 15.55 19.48 22.59 39.62 14.83 22.96
*, signifcantly different from values of control group at P < 0.05 with Scheffe test.
Lt. : left, Ft.: right, S.D: Standard Deviation, BKH-R: Bikihwan repeated toxicity group
effect like diarrhea, anorexia and dyspepsia. So it has
been studied how to reduce the toxicity. It is suggested
that eliminating the oil or mixing with Rhizoma Rhei is
the way to attenuate the toxicity of Semen Tiglii.
But other herbs in BKH havent been studied yet. We
thought that the trial about toxicity of BKH is more useful
than that about toxicity of each herb in BKH because
it is mixture of herbs and there are no studies about
interaction with one herb and another. We usually use
BKH clinically, not each herb separately. For its broad
uses in hepatocarcinoma, splenomegaly, peritoneal
seeding and metastatic mass, we decided to perform
this trial to fgure out whether BKH is safe or not and to
fnd out its NOAEL.
Subsequently, BKH was tested in an oral 1-week
single oral dose toxicity test in male ICR mice and
13-week repeated toxicity study in those. Dose levels
of single oral dose toxicity test are 0, 250, 2,500 and
25,000 mg/kg/day and those of repeated toxicity study
are 0, 25, 125, 250, and 500 mg/kg/day. In single
dose toxicity study, there are no specifc changes or
abnormalities. In repeated dose toxicity studies, all of
the 30 male ICR mice had been alive during consuming,
looking well. They eat food and water well and showed
no differences.
But a signifcantly higher level of body weight in mice
of the BKH-R5 group at 2 week compared with control
group was shown. It might be an important signal but it
was temporary; those mice in BKH-R5 group got similar
body weight like other mice. Signifcantly increasing
liver weight in mice of the BKH-R4 and BKH-R5 group
compared with the control group were also shown.
Changes of liver weight might mean hepatic injury in
chronic disease or severe fatty liver. But it is hard to
adapt this case to that because this trial wasnt chronic
one and they had no increasing level of liver function
test. In acute liver injury, the level of AST and ALT are
usually increasing enormously.
In blood chemistry, a signifcantly higher value of
creatinine in mice of the BKH-R3, BKH-R4 and BKH-R5
groups were shown. Creatinine is one of the valuable
components to evaluate renal function. So this result
means that BKH have kidney toxicity over 125 mg/kg/
day.
Consequently, BKH isnt harmful in short term
consuming but can make kidney bad when it has been
consumed over 125 mg/kg/day for a long time. So
NOAEL of BKH is 125 mg/kg/day in male.
During this experiment, we have a question about
the result. The mice had eaten BKH showed weight
gain after the test. We dont know why this phenomenon
happens. In some oriental medicine record, Semen tiglii
makes a mouse fat. But it didnt show the reason and
there havent been performed any experiment about
this. We had better choose another animal than mice.
BKH had been used to treat abdominal mass
traditionally, and has been a main cancer-fghting
drug to treat in oriental medicine. Many oriental
medicinal clinicians have used BKH in many ways,
but any systemic studies about its safety havent been
performed. Here, we performed the short-term and
long-term study about toxicity of BKH water extracts,
and we suggested that BKH have to use carefully and
evaluation of renal function is required during consuming
16
it. And further study of its safety in human bodies need
to be performed.
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Table 2. Blood Chemical values of mice with orally BKH for 13 weeks. The creatinine level of BKH-R3, BKH-R4 and BKH-R5
are higher than others statistically.
Group/
Dose (mg/
kg/day)
Total
protein
Albumin A/G ratio Creatinine BUN Totalcholesterol Triglycerides GOT GPT
(g/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (U/L) (U/L)
BKH-R1 Mean. 4.1 1.5 0.6 0.5 27.3 127.0 109.7 159.2 46.8
(0) S.D. 0.56 0.28 0.10 0.4 0.77 13.68 14.64 9.84 5.26
BKH-R2 Mean. 4.4 2.0 0.9 0.3 24.5 132.3 144.0 215.2 61.7
(25) S.D. 0.29 0.09 0.17 0.08 2.11 7.83 23.45 35.10 11.32
BKH-R3 Mean. 4.3 1.9 0.8 0.2* 25.5 124.0 94.8 173.3 60.0
(125) S.D. 0.21 0.10 0.05 0.04 1.89 15.34 17.95 16.89 6.84
BKH-R4 Mean. 4.4 1.9 1.1 0.2* 25.8 114.0 107.3 195.7 61.8
(250) S.D. 0.48 0.10 0.47 0.01 1.11 11.53 7.85 38.32 7.64
BKH-R5 Mean. 4.0 1.9 1.5 0.3* 27.0 128.5 115.2 141.2 36.5
(500) S.D. 0.47 0.10 0.80 0.03 1.82 13.14 13.85 22.56 5.80
*, signifcantly different from values of contol group at P < 0.05 with Scheffe test.
Lt. : left, Ft.: right, S.D: Standard Deviation, BKH-R: Bikihwan repeated toxicity group
17
standard herb & supplement reference: evidence-
based clinical reviews. Mosby, Inc. Philadelphia,
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18
19
Distictis buccinatoria (DC) A.H. Gentry:
planta medicinal mexicana con potencial teraputico
Distictis buccinatoria (DC) A.H. Gentry: Mexican
medicinal plant with therapeutical potential
Mara Gabriela Rojas-Bribiesca
1,3
, Rubn Romn Ramos
2
, Jaime Tortoriello Garca
3
, Macrina Fuentes Mata
4
,
Margarita Aviles Flores
4
.
1
Doctorado en Ciencias Biolgicas, Universidad Autnoma Metropolitana.
2
Departamento de Ciencias de la Salud, Divisin
de Ciencias de Ciencias Biolgicas y de la Salud, Universidad Autnoma Metropolitana - Iztapalapa.
3
Centro de Investigacin
Biomdica del Sur-IMSS, C.P. 55130 Xochitepec, Morelos.
4
Instituto Nacional de Antropologa e Historia, Matamoros 14
Acapantzingo, 62440 Cuernavaca, Morelos, Mexico
Autora para correspondencia: Mara Gabriela Rojas Bribiesca
Centro de Investigacin Biomdica del Sur-IMSS, C.P. 55130 Xochitepec, Morelos.
Direccin electrnica: gabrb02@yahoo.com.mx
Resumen
En Mxico las plantas medicinales han sido utilizadas
durante cientos de aos por la poblacin para
el tratamiento de afecciones gastrointestinales,
respiratorias, urinarias, genitales y de la piel en las que,
de acuerdo con la sintomatologa descrita, pudiese estar
involucrado un padecimiento infeccioso. La especie
Distictis buccinatoria (DC) A.H. Gentry (Bignoniaceae),
popularmente conocida como Tonacaxochitl es una
planta nativa de Mxico que ha sido utilizada desde
los tiempos prehispnicos con fnes medicinales.
Actualmente, los terapeutas tradicionales en el estado
de Morelos, Mxico, utilizan el cocimiento de las fores
para tratar la tos, anginas, infamacin y faringitis.
Estudios previos llevados a cabo en esta planta,
han demostrado que D. buccinatoria posee actividad
antimicrobiana in vitro contra las bacterias gram-positivas
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus faecalis, y contra los dermatoftos
Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum.
En la presente investigacin se evalu la actividad
antibacteriana de los extractos de hexano, diclorometano
y metanol de las fores y las hojas de esta especie
contra aislados clnicos de Staphylococcus aureus
con resistencia a algunos antibiticos utilizados en la
prctica mdica.
Los resultados obtenidos evidenciaron que los
extractos orgnicos de esta planta medicinal inhiben
el desarrollo in vitro de todos los aislados clnicos de
Staphylococcus aureus ensayados. La actividad ms
fuerte se encontr en el extracto de diclorometano
de las fores, con un valor de Concentracin Mnima
Inhibitoria (MIC, siglas en ingls) de 0.5 - 2 mg/mL
contra todas las bacterias estudiadas.
Conclusiones: D. buccinatoria, posee actividad
antimicrobiana contra los aislados clnicos de
Staphylococcus aureus, y constituye una alternativa
til para el tratamiento de problemas de las vas
respiratorias e infecciones causadas por esta bacteria.
Nuestros resultados muestran una fuerte correlacin
entre los usos de esta planta en la medicina tradicional
mexicana y los datos experimentales obtenidos.
Sustentando tambin la importancia que tiene la
etnofarmacologa como gua en la seleccin de plantas
para la obtencin de compuestos bioactivos.
Palabras clave: Distictis buccinatoria, plantas
medicinales, actividad antimicrobiana, aislados clnicos,
resistencia antibitica.
Abstract
In Mxico, medicinal plants have been used in
rural areas for thousands of years to treat illness in
which according to the symptomatology described
20
gastrointestinal, respiratory, urinary, and skin infections
could be included. Distictis buccinatoria (DC.) A.H.
Gentry (Bignoniaceae), locally know as Tonacaxochitl,
is a native Mexican plant that has been used since
pre-Hispanic times for medical purposes. Nowadays,
traditional healers in the state of Morelos in Mexico
use the decoction of its fowers to treat cough, tonsil
infammation and pharyngitis.
Previous reports carried out in this plant have
shown that D. buccinatoria possesses in vitro
antimicrobial activity against the Gram-positive bacteria
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus faecalis, and antifungal activity against
the dermatophytes Trichophyton mentagrophytes and
Trichophyton rubrum.
In this investigation, the antibacterial activity of the
hexane, dichloromethane, and methanol extracts from
the fowers and leaves of this medicinal plant were
evaluated against Staphylococcus aureus clinical
isolates which possesses resistance against some
antibiotics used in medical practice.
The obtained results showed that the organic
extracts of this medicinal plant inhibited the in vitro
growth of all the Staphylococcus aureus clinical isolated
assayed. The strongest activity was displayed by the
dichloromethane extract from the fowers with Minimal
Inhibitory Concentration (MIC) values of 0.5 - 2 mg/mL
for all the bacteria assayed.
Conclusions: D. buccinatoria showed antimicrobial
in vitro activity against the Staphylococcus aureus
clinical isolates, and constitute an useful alternative for
the treatment of respiratory illness and infections caused
by this bacterium. Our results show a strong correlation
between the reported uses of this plant in mexican folk
medicine and the obtained experimental data. They
also support the importance of ethnopharmacology as
a guide in the selection of plants for the discovery of
bioactive compounds.
Keywords: Distictis buccinatoria, medicinal plants,
antimicrobial activity, clinical isolates, antibiotic
resistance.
Introduccin
En el transcurso de la historia, las enfermedades
infecciosas y parasitarias han sido una causa
importante de morbilidad y mortalidad en todo el
mundo. Con la aparicin de los antibiticos y su
distribucin comercial a partir de 1940, se ofrecieron
nuevas y mejores posibilidades para su tratamiento
(1). Sin embargo, a pesar de los grandes avances en
el campo de la medicina, hoy da las enfermedades
infecciosas causadas por bacterias, hongos, virus y
parsitos siguen constituyendo un problema de salud
pblica, siendo los pases en vas de desarrollo los
principalmente afectados debido a la baja disponibilidad
de servicios de salud adecuados, de medicamentos y
al surgimiento de cepas resistentes (2).
Los datos de informacin epidemiolgica
proporcionados en el ao 2005 por la Secretara de
Salud de los Estados Unidos Mexicanos, durante el
perodo 2000-2004, revelan que las enfermedades
respiratorias agudas ocuparon el primer lugar de
las veinte principales causas de enfermedad a nivel
nacional por grupo de edad de la poblacin general,
seguida por las infecciones intestinales y las mal
defnidas, siendo la faringitis y amigdalitis la sptima
causa (3).
Debido a que el uso de los antibiticos suele presentar
problemas como induccin de resistencia bacteriana,
hipersensibilidad, alergias y efectos secundarios, la
bsqueda y desarrollo de nuevos agentes teraputicos
es fundamental para el cuidado de la salud y todas las
posibles estrategias deben ser exploradas. En este
sentido, la naturaleza nos ha dotado con una gran
variedad de productos con actividad biolgica, por lo
que en los ltimos aos se ha incrementado el inters
por estudiar los productos naturales como una fuente
potencial de nuevos productos antimicrobianos. As,
en la ltima dcada la utilizacin y la investigacin de
plantas medicinales en el mundo han tenido un gran
auge, encontrndose que en los pases desarrollados
se comercializan de manera importante diversos
medicamentos herbolarios denominados ftofrmacos.
Hoy da, los ftofrmacos son utilizados y aceptados
ampliamente por la sociedad por lo que las instituciones
de investigacin e industrias farmacuticas se han
dado a la tarea de desarrollar tecnologas y mtodos
que permitan conocer las propiedades farmacolgicas
y la naturaleza qumica de los compuestos activos de
las plantas a fn de ofrecer productos estandarizados y
con dosifcaciones adecuadas (4-6).
En Mxico, las plantas medicinales constituyen
el recurso teraputico tradicional ms ampliamente
utilizado durante cientos de aos por las diversas culturas
de nuestro pas, existiendo una extensa bibliografa
al respecto (7-9). As, el uso de plantas en forma de
infusiones, decocciones, cataplasmas, compresas,
alcoholatos etctera, es una prctica muy extendida en
el tratamiento de diversos padecimientos, incluyendo
aquellos en los que, de acuerdo a la sintomatologa
descrita, pudiese estar involucrado un padecimiento
infeccioso (10,11). De acuerdo con una encuesta
realizada en Mxico a nivel nacional bajo el programa
IMSS-COPLAMAR durante el periodo 1983-1985, se
21
determin que el 78% de las 140 plantas medicinales
ms frecuentemente empleadas en 2242 comunidades
rurales, son especies utilizadas para curar o prevenir
enfermedades gastrointestinales, respiratorias y de
la piel (12). Sin embargo, la investigacin cientfca
sobre el potencial teraputico de estas plantas es
an limitado. Debido a esto, es importante el estudio
de plantas medicinales con potencial antimicrobiano,
tomando como antecedente los datos etnomdicos.
Enfermedades infecciosas
Las enfermedades infecciosas y parasitarias, tales
como las infecciones respiratorias agudas, tuberculosis,
diarrea, HIV/SIDA y malaria, son una causa importante
de morbilidad y mortalidad en el mundo entero.
De acuerdo a la informacin proporcionada por la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS), se sabe que
durante el ao 2003, las enfermedades agudas de las
vas respiratorias causaron 3, 963,000 muertes (13).
Las infecciones de vas respiratorias son de las
enfermedades infecciosas ms prevalentes en el mundo.
La neumona adquirida en la comunidad, afecta a 3-4
millones de personas actualmente en Estados Unidos
y una quinta parte necesitar hospitalizacin, lo que
supone ms de 600,000 altas anuales. Considerando
que entre el 50% y el 80% de estas neumonas se
tratan en forma ambulatoria, las estadsticas son
probablemente mucho ms altas. A su vez, la sinusitis y
la faringoamigdalitis causan unas 40 millones de visitas
anuales en la atencin primaria de los Estados Unidos
(14). En Mxico, durante el ao 2000, las infecciones
respiratorias agudas fueron la primera causa de los 15
casos nuevos de enfermedad ms importantes (15).
Durante el periodo 1999-2001, la neumona e infuenza
fueron la octava causa de defunciones generales a nivel
nacional, y las enfermedades intestinales infecciosas
ocuparon la onceava posicin, sin considerar las muertes
debidas a otras infecciones lo que elevara la cifra total
(16). Los datos de informacin epidemiolgica del ao
2005 revelan que por grupo de edad de la poblacin
general, en el perodo 2000-2004, las enfermedades
respiratorias agudas ocuparon el primer lugar de las
veinte principales causas de enfermedad a nivel nacional
seguida por las infecciones intestinales y las mal defnidas,
encontrndose tambin dentro de estos primeros veinte
casos de morbilidad la faringitis, la amigdalitis y algunas
otras enfermedades infecciosas (3).
Dada la frecuencia con que se presentan las
enfermedades respiratorias y diarreicas en los pases
en vas de desarrollo, la prescripcin inadecuada y la
automedicacin de antibiticos genera la aparicin de
cepas resistentes, fenmeno que se ha hecho muy
evidente en el mbito hospitalario, a pesar de que existen
guas y normas para el manejo de los mismos (17).
En la ltima dcada ha aumentado en todo el mundo
la resistencia de los patgenos a los antimicrobianos,
hecho de especial trascendencia en las infecciones de
vas respiratorias en que la mayora de las veces el
tratamiento antibitico es emprico (14).
De acuerdo con algunos autores, la rapidez con
que surgen los microorganismos multiresistentes
no es igual a la velocidad con que surgen nuevos
antibiticos, razn por la que se considera que pronto
habr difcultades para contar con antibiticos tiles
para el tratamiento de pacientes infectados con este
tipo de microorganismos. El Staphylococcus aureus,
es uno de los microorganismos que se aisla con mayor
frecuencia en las infecciones nosocomiales y las
adquiridas en la comunidad, presenta una patogenicidad
variable que le permite causar desde infecciones de
las vas respiratorias y de la piel hasta infecciones con
compromiso vital tales como endocarditis, septicemias,
meningitis, entre otros (18).
Plantas medicinales
El conocimiento y utilizacin de las plantas por los
pueblos del mundo tiene una larga e interesante historia,
reconocindose que desde siempre el ser humano ha
encontrado en las plantas un fel aliado para satisfacer
muy diversas necesidades: alimento, techo, abrigo,
armas, as como la recuperacin y el mantenimiento
de la salud. Mediante el estudio de restos fsiles,
se ha determinado que en la era paleoltica (60000
aos atrs) el hombre ya utilizaba diversas plantas
como medicinas (19). Actualmente, la gran mayora
de lo pases desarrollados y en desarrollo siguen
haciendo uso de ellas y los mdicos tradicionales y
sus plantas medicinales han dejado de ser califcados
negativamente, establecindose programas y proyectos
para la investigacin, aplicacin e industrializacin de
los productos derivados de plantas. Esto ha conducido
a que muchas de las drogas utilizadas en la teraputica
moderna tienen sus orgenes en la medicina tradicional
de diversas culturas antiguas (20).
En Mxico las plantas medicinales son el recurso
material ms amplio y valioso de la medicina indgena
tradicional (21). Su estudio es un tema recurrente en
la historia de Mxico, tarea muy compleja si se piensa
en la enorme riqueza cultural y forstica del pas
(tercero en el mundo en biodiversidad y segundo en el
hemisferio occidental de lenguas y culturas distintas).
Se tiene estimado que en nuestro pas existen cerca
de 30,000 especies de plantas de las cuales, en 1994
el Instituto Nacional Indigenista document 3,000 con
usos medicinales, esto es el 10% del total de la riqueza
forstica del pas (9).
22
Los datos sobre las caractersticas vegetales,
formas de uso, propiedades teraputicas, recoleccin y
comercio de numerosas plantas medicinales utilizadas
en nuestro pas, han dado origen a diversos textos.
Entre los ms conocidos podemos citar los siguientes:
el Cdice Florentino o Historia de las cosas de la Nueva
Espaa realizado por Fray Bernardino de Sahagn, el
Libellus de Medicinalibus Indorum Herbis del indgena
Mexicano Martn de la Cruz y Juan Badiano, conocido
como el Cdice Badiano, otra fuente importante
son las obras completas de Francisco Hernndez
denominadas Historia Natural de Nueva Espaa. En
las ltimas dcadas hubo un resurgimiento en cuanto
al inters sobre el registro y documentacin de las
plantas medicinales utilizadas por nuestras culturas,
siendo algunos de los textos ms conocidos: Las
Plantas medicinales de Mxico escrito por Maximino
Martnez; Las Monografas de Nombres, Sinonmias y
Usos de las Plantas Medicinales de Mxico de Jos Luis
Daz; el Atlas de las plantas de la Medicina Tradicional
Mexicana escrito por Arturo Argueta y colaboradores,
as como diversos listados de plantas de herbarios y
jardines botnicos especializados en el tema.
Distictis buccinatoria, (DC.) A. H. Gentry.
La especie Distictis buccinatoria, (DC.) A. H. Gentry
perteneciente a la familia Bignoniaceae es una planta
de origen mexicano, los reportes que se tienen en
fuentes bibliogrfcas que hacen referencia a la poca
prehispnica (22,23) demuestran que desde entonces
ha sido utilizada en nuestro pas con fnes medicinales.
En la bibliografa especializada en plantas medicinales
de Mxico no se encuentran registros sobre ella. Sin
embargo, an hoy da esta especie sigue siendo usada
por terapeutas tradicionales de la zona de Tetela del
Volcn en el Estado de Morelos, para el tratamiento
de afecciones respiratorias (Comunicacin verbal). En
la literatura cientfca se reporta que D. buccinatoria
posee actividad antimicrobiana in vitro contra las
bacterias Gram-positivas Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis,
contra los dermatoftos Trichophyton mentagrophytes
y Trichophyton rubrum, y actividad citotxica contra la
lnea celular cancerosa KB (24).
El objetivo de la presente investigacin fue evaluar
el potencial antimicrobiano de Distictis buccinatoria
contra aislados clnicos de Staphylococcus aureus con
patrn de resistencia, obtenidos de exudados farngeos
de pacientes que cursaron al menos 5 veces en un ao
con infeccin de la garganta.
Material y mtodos
Material vegetal
Se colectaron fores y hojas de Distictis buccinatoria
en el municipio de Tetela del Volcn, Morelos.
Se prepararon ejemplares de herbario, para su
identifcacin y clasifcacin en el herbario del Instituto
Nacional de Antropologa e Historia Morelos (INAHM),
quedando registrada bajo el cdigo INHAM-2007. El
material vegetal se extendi en camas de secado en
un cuarto oscuro y bien ventilado hasta su completa
deshidratacin y se tritur con ayuda de un molino
elctrico.
Preparacin de extractos
Extractos de forK. Doscientos cincuenta gramos de
fores secas y molidas fueron extradas secuencialmente
dejndolas macerar con n-hexano durante 24 - 48 horas
a temperatura ambiente, despus de lo cual, se fltr
el disolvente y se evapor a presin reducida en un
rotavapor, se aadi nuevamente el disolvente al material
vegetal, repitiendo el proceso 5 veces. Se extendi el
material vegetal en una campana de extraccin para
evaporar los restos del disolvente. Para la obtencin del
extracto de diclorometano, el material vegetal libre de
restos de hexano, fue extrado mediante el procedimiento
y nmero de extracciones descrito anteriormente
utilizando diclorometano como disolvente. Finalmente,
se realiz el proceso de extraccin nuevamente con
metanol para obtener el extracto correspondiente. Los
extractos obtenidos fueron colocados en frascos de
vidrio y se mantuvieron en una campana de extraccin,
hasta que se evaporaron completamente los restos del
disolvente. Se determin el rendimiento para cada uno
de los extractos (Cuadro 1).
Extractos de hoja. Doscientos cincuenta gramos
de hojas secas y molidas, fueron extradas utilizando
la metodologa descrita en el prrafo anterior. Se
determin tambin el rendimiento para cada uno de
ellos (Cuadro 1).
Cepas bacterianas
Las cepas de aislados clnicos de Staphylococcus.
aureus utilizadas en el ensayo fueron obtenidas
en clnicas del IMSS en la ciudad de Cuernavaca
Morelos. Dichas cepas fueron aisladas de exudados
farngeos de pacientes con infecciones recurrentes (5
o ms por ao) de vas respiratorias altas (faringitis,
faringoamigdalitis) y presentaban resistencia a varios
antibiticos (Cuadro 2).
23
Ensayo antimicrobiano
Para la evaluacin antibacteriana de los extractos de
hexano, diclorometano y metanol de las hojas y fores de
Distictis buccinatoria se utiliz el mtodo de doble dilucin
en agar como se describe de manera previa (25).
Los extractos se disolvieron en Dimetilsulfoxido
(DMSO; Merck) y agua; se prepararon diluciones
seriadas dobles, las cuales se incorporaron en cajas Petri
al medio de cultivo licuado (agar Muller-Hinton). El rango
de concentracin ensayado estuvo comprendido en el
rango de 0.25 - 8 mg/mL. Las bacterias se mantuvieron
en cajas Petri con agar tripticasa de soya (TSA Merck).
Para el desarrollo de la prueba se inocularon caldos
Muller-Hinton (BHM Merck) con cada una de las
bacterias a ensayar, los cuales fueron incubados en una
estufa bacteriolgica a 37 C. Una vez desarrolladas las
bacterias, se ajust la concentracin de los inculos a
una turbidez de 0.5 de McFarland lo que corresponde
a una concentracin de 108 UFC/mL. La densidad del
inculo fue corroborado espectrofotomtricamente
(absorbancia de 0.08-0.10 a una longitud de onda de
625 nm). Cada inculo se diluy (1:20) y se aplic en
la superfcie del agar con una pipeta calibrada, en un
volumen de 0.002 mL, para obtener una gota que se
dispers en forma de crculo con un dimetro de 5 a 8
mm y que contena 10
4
UFC. Las placas se incubaron
por 24 horas a 37 C.
Como estndar de referencia se utiliz Gentamicina
y como controles de la prueba Dimetilsulfoxido y el
medio de cultivo. Las observaciones se llevaron a cabo
por duplicado y los resultados se expresaron como
la concentracin ms baja de extracto que produjo la
completa supresin del crecimiento bacteriano (CMI).
Resultados y discusiones
En el cuadro 1, se muestran los rendimientos de
los extractos por extraccin sucesiva con hexano,
diclorometano y metanol de las fores y hojas de
Distictis Buccinatoria, los cuales fueron calculados en
relacin al peso seco del material vegetal que se utiliz
para el proceso de extraccin.
De los extractos orgnicos obtenidos mediante el
proceso de extraccin secuencial de las hojas y fores
de D. buccinatoria, el metanol fue el disolvente que
proporcion un mayor rendimiento en ambos casos.
El rendimiento de los extractos hexnico y metanlico
obtenidos de las hojas fue mayor que el obtenido de los
extractos de las fores.
Parte area Extracto Rendimiento %
a
Flor Hexano 0.99
Flor Diclorometano 1.36
Flor Metanol 8.33
Hoja Hexano 0.95
Hoja Diclorometano 2.08
Hoja Metanol 9.42
Cuadro. 1. Rendimiento de los extractos.
a
Residuo seco del extracto en relacin al peso seco del material vegetal
Clasifcacin Patrn de Resitencia
Staphylococcus aureus CL20-211 (A) *Dc, Am, Pn
Staphylococcus aureus CL20-523 (B) Dc, Am, Pn
Staphylococcus aureus CL20-604 (C) Pn, Amp, Er
Staphylococcus aureus CL20-625 (D) Pn, Amp, Te
Staphylococcus aureus CL20-630 (E) Er, Dc, Am, Pn, Er
Cuadro. 2. Aislados clnicos de Staphylococcus aureus con patrn de resistencia a antibiticos.
* Antibiticos: DC= dicloxacilina; Am = amikacina; Pn = penicilina; Amp= ampicilina; Te= tetraciclina.
24
En el cuadro 3 se muestran los resultados de
la evaluacin de la actividad antibacteriana de los
extractos de las hojas y fores de D. buccinatoria contra
aislados clnicos de Staphylococcus aureus, as como
los valores de concentracin mnima inhibitoria (CMI)
obtenidos para los extractos correspondientes.
De los 6 extractos ensayados, cinco de ellos (83%)
inhibieron el desarrollo de al menos 5 de los aislados
clnicos de Staphylococcus ensayados con valores
de CMI entre 0.5 y 8 mg/mL, siendo el extracto de
diclorometano el que result ser ms activo con un
valor de CMI de 0.5 mg/mL para todas las cepas
ensayadas.
Aunque en algunos autores consideran como
activos solo aquellos extractos que presentan valores
de CMI, semejantes a los antibiticos utilizados como
estndar, en nuestra experiencia, y de acuerdo a
estudios llevados a cabo en nuestro laboratorio, se ha
podido evidenciar que extractos vegetales con valores
de CMI entre 2.5 y 15 mg/mL, han conducido a al
aislamiento de compuestos con una fuerte actividad
antibitica (10, 24) y a la produccin de ftofrmacos
que al ser probados en la clnica han demostrado una
gran efectividad y tolerabilidad teraputica sin presentar
efectos colaterales (26, 27) de acuerdo a este criterio,
se consideraron como activos aquellos extractos que
presentaron valore de CMI, igual o menor a 8 mg/mL.
Los resultados obtenidos contra estos aislados
clnicos de Staphylococcus aureus resultan
especialmente importantes y sugieren que esta especie
puede constituir una alternativa en el tratamiento de
procesos infecciosos causados por cepas de este
microorganismo, con resistencia a algunos de los
antibiticos utilizados en la clnica. As mismo, estos
hallazgos, convalidan el uso mdico que dan a esta
especie los terapeutas tradicionales del estado de
Morelos, quienes utilizan las fores de este vegetal para
el tratamiento de enfermedades de la garganta y la tos,
ya que el Staphylococcus aureus es un patgeno muy
frecuente en estos padecimientos.
Conclusiones
Los resultados obtenidos en las evaluaciones
antimicrobianas llevadas a cabo con los extractos
orgnicos de las fores y hojas de Distictis buccinatoria
permitieron concluir que esta planta medicinal iinhibe el
desarrollo in vitro de aislados clnicos de Staphylococcus
aureus provenientes de exudados farngeos que
presentan resistencia a algunos de los antibiticos
utilizados en la clnica lo que permite proponer a esta
planta medicinal como una especie con potencial
teraputico para la posible obtencin de un ftofrmaco
para el tratamiento de infecciones causadas por este
patgeno. As mismo demuestran la importancia de la
etnobotnica como gua en la seleccin de productos
naturales para la obtencin de bioproductos tiles para
el cuidado de la salud.
Actualmente se estn llevando a cabo estudios
farmacolgicos y ftoqumicos con la fnalidad de
establecer la actividad antiinfamatoria de esta especie
y aislar y purifcar los metabolitos responsables de las
actividades biolgicas de esta especie medicinal.
Parte
Ensayada
Extracto CMI mg/mL
Aislados clnicos de Staphylococcus aureus
a A B C D E
Flor Hexano 8 8 8 8 8
Flor Diclorometano 1 0.5 0.5 1 2
Flor Metanol >8 >8 >8 >8 >8
Hoja Hexano 1 1 0.5 1 2
Hoja Diclorometano 2 1 1 1 2
Hoja Metanol 2 2 2 2 4
Gentamicina
b
5 5 5 5 5
Cuadro. 3. Actividad antibacteriana contra cepas de aislados clnicos de Staphylococcus aureus con patrn de resis-
tentencia a antibiticos.
a Aislados clnicos de Staphylococcus aureus (CL20): A=211; B=523; C= 604; D= 625; E= 630
b Antibitico de referencia (g/mL)
25
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with Pityriasis capitis (dandruff). A double blind
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27
Diabetes mellitus y plantas medicinales en Mxico
Diabetes mellitus and medicinal plants in Mxico
Francisco Javier Alarcn-Aguilar, Erica Hernndez-Galicia y Rubn Romn-Ramos
Departamento de Ciencias de la Salud, Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud. Universidad Autnoma Metropolitana,
Unidad Iztapalapa.
Autor para correspondencia: Francisco Javier Alarcn-Aguilar
Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autnoma Metropolitana
San Rafael Atlixco 186, Iztapalapa, DF, Mxico 09340
Tel. +55-58046483, Fax. +55-58044727
Correo electrnico: aaasj2@prodigy.net.mx
Resumen
Se destaca la importancia que tiene la diabetes mellitus
(DM) en Mxico, haciendo una descripcin general
de este padecimiento y resaltando la necesidad de
incrementar la bsqueda de nuevas alternativas para su
control. Se analizan los datos etnobotnicos acerca de
las plantas medicinales usadas en el control emprico de
la DM, as como los resultados obtenidos hasta ahora
en el estudio de sus propiedades hipoglucemiantes,
haciendo hincapi en las plantas usadas en Mxico.
Aunque en nuestro pas se tienen reportadas ms de
250 plantas antidiabticas, slo 13 han sido estudiadas
con cierta profundidad, enfocndose hacia la
purifcacin y caracterizacin qumica de las sustancias
responsables de su actividad hipoglucemiante;
adems, tambin se han reportado estudios dirigidos
a la validacin experimental de las propiedades
medicinales de varias plantas antidiabticas. En este
sentido, nuestro grupo de investigacin ha estudiado
el efecto antihiperglucmico agudo de 62 plantas, 33
de las cuales mostraron reducciones signifcativas
de la glucemia en conejos sanos con hiperglucemia
temporal (P<0.05), inducida con dos cargas de
glucosa por va subcutnea. Hasta la fecha, al menos
17 agentes hipoglucemiantes potenciales aislados
de 13 especies antidiabticas mexicanas han sido
caracterizados qumicamente. El anlisis de estos
resultados refeja varios aspectos importantes para el
estudio de las plantas medicinales usadas en el control
de la DM. Es recomendable la realizacin de estudios
toxicolgicos que permitan fundamentar su estudio
clnico. Adems, conjuntamente con la investigacin
dirigida al aislamiento, purifcacin y caracterizacin
qumica de las sustancias responsables de la
actividad hipoglucemiante, se considera importante
iniciar programas dirigidos al cultivo, mantenimiento y
conservacin de estas plantas medicinales.
Abstract.
In this work, the importance that the diabetes mellitus
(DM) has at present is remarked, making a general
description about this ailment and remarking the
necessity to increase the research of new alternatives
for its control. An analysis of the most recent
ethnobotanical information about the medicinal plants
used for the DM control, as well as of the results
obtained in the investigation of the hypoglycemic
activity of such plants, was made. Special importance
was given to those plants studied in Mexico. Although
in Mexico more than 250 anti-diabetic plants have
been reported, only 13 have been chemical and
pharmacologicaly researched; Furthermore, various
studies have been made to validate experimentally the
hypoglycaemic activity of various other plants. In this
respect, our investigation group has studied the acute
anti-hyperglycaemic effect of 62 plants, out of which
33 showed signifcant reductions of the glycemia in
healthy rabbits with temporary hyperglycemia (P<0.05),
induced by two subcutaneous injections of glucose. Up
to date, at least 17 promising hypoglycaemic agents
have been isolated and chemically characterized
from 13 Mexican anti-diabetic pants. Analysis of these
results showed various important facts for the study of
28
the medicinal plants used in the control of the diabetes
mellitus. Toxicological studies that permit to establish
the bases for its clinical study are recommended.
Furthermore, in conjunction with studies looking for the
isolation, purifcation, and chemical characterization of
the hypoglycaemic principles, it is considered primordial
to start programs to crop, maintain and preserve these
medicinal plants.
Introduccin
La diabetes mellitus (DM) es un trastorno metablico
comn asociado con una morbimortalidad importante
(Zimmet et al. 2001). La DM se caracteriza por una
hiperglucemia crnica que resulta de defectos en la
secrecin de insulina y/o defciencias en la accin de esta
hormona, llevando a una alteracin en el metabolismo
de carbohidratos, lpidos y protenas (Committee Report
2002). El tratamiento farmacolgico de la DM se basa en
la administracin de agentes hipoglucemiantes orales
e insulina (ADA 1997). Sin embargo, por la va emprica
tambin se utilizan numerosas plantas antidiabticas
(Aguilar et al. 1994, 1998).
A pesar de que en Mxico se reportan ms de
250 plantas usadas por la poblacin en el control de
este padecimiento, la mayora de las investigaciones
realizadas hasta 1990 estuvieron dirigidas al estudio
experimental y clnico de nicamente dos especies:
Tecoma stans (tronadora) y Opuntia streptacantha (una
especie de nopal) (Lozoya 1980, Frati et al. 1991).
Cabe destacar que en los ltimos 10 aos diversos
grupos de investigacin del pas en la Universidad
Nacional Autnoma de Mxico, en el Instituto Mexicano
del Seguro Social y en la Universidad Autnoma
Metropolitana, entre otros, comenzaron una serie
de estudios dirigidos principalmente a la validacin
experimental de la accin hipoglucemiante de las
plantas usadas en Mxico para el control de la DM,
aspecto primario en el desarrollo de medicamentos
en el que, en general, se busca demostrar si una o
varias sustancias poseen efectos farmacolgicos
importantes. En estas investigaciones se ha llegado
a evaluar experimentalmente el efecto hipoglucmico
agudo de extractos y fracciones obtenidos de algunas
plantas antidiabticas, e inclusive, se han aislado
y/o a caracterizado qumicamente algunos agentes
hipoglucemiantes potenciales.
En este trabajo se analiza la informacin etnobotnica
acerca de las plantas usadas empricamente por la
poblacin mexicana en el control de la DM y se analizan
los resultados obtenidos en la investigacin de sus
propiedades antidiabticas, tomando como referencia
las investigaciones realizadas en otros pases con
plantas antidiabticas.
Generalidades acerca de la diabetes mellitus (DM)
La DM es la enfermedad endocrina con los ndices ms
altos de prevalencia y mortalidad por lo que representa
uno de los problemas de salud ms importantes
(Committee Report 2002). La cantidad de pacientes
diabticos aumenta ao con ao y oscila del 2 al 6%
de la poblacin. En Mxico, estudios recientes reportan
una incidencia del 12% y se calcula que para el ao
2025 se llegar al 18% de la poblacin. La DM se
encuentra entre las 10 primeras causas de muerte.
Sin embargo, es importante sealar que en los pases
industrializados, as como en las grandes ciudades de
los pases en vas de desarrollo, la DM como causa
de muerte se ubica en tercer lugar, slo despus de
las enfermedades cardiovasculares y oncolgicas
(Committee Report 2002; Barcel y Rajpathak 2001).
La DM se puede defnir como un grupo de
enfermedades metablicas caracterizado por un estado
de hiperglucemia crnica que obedece a un dfcit en
la actividad insulnica. La insulina es una hormona que
sintetizan y secretan las clulas beta de los islotes de
Langerhans del pncreas. El dfcit en la actividad de
la insulina origina anormalidades en el metabolismo de
carbohidratos, lpidos y protenas, lo cual fnalmente
se traduce en hiperglucemia, hiperaminoacidemia e
hipertrigliceridemia (Saltiel y Kahn 2001).
Las principales anomalas de la DM origina varios
signos y sntomas caractersticos como polidipsia,
polifagia, poliuria, hiperglucemia, prdida de peso sin
causa aparente y, en algunos casos graves, cetonemia
y cetonuria. A largo plazo, estas anormalidades
pueden llevar al desarrollo de complicaciones agudas
y crnicas, tales como: coma cetoacidtico o diabtico,
coma hiperosmolar, macro- y microangiopata,
retinopata, nefropata e infecciones recurrentes. Dichas
complicaciones son las principales causas de la invalidez
y la mortalidad de los pacientes con DM (Nathan 1993).
A la DM se le suele clasifcar en 4 tipos: tipo
1 (conocida anteriormente como DM insulino
dependiente), tipo 2 (conocida anteriormente como
DM no insulinodependiente), otros tipos especfcos
de diabetes y diabetes gestacional. Cabe sealar que
desde el punto de vista clnico los dos primeros son los
ms importantes, ya que de todos los casos de diabetes
diagnosticados por ao, cerca del 10% pertenecen al
tipo 1, alrededor del 80% pertenece al tipo 2 y el 10%
restante a los otros dos grupos (ADA 1997, Mancillas et
al. 2002).
El tratamiento de la DM se realiza con base en 4
factores fundamentales: educacin del paciente, dieta,
29
ejercicio fsico y administracin de medicamentos
hipoglucemiantes como los derivados de las
sulfonilureas, biguanidas, tiazolidinedionas e insulina
(White 1996; Gmez y Rull 1997; Wildasin et al. 1997).
Sin embargo, por la va emprica tambin se acude a
la medicina tradicional. De acuerdo con datos de la
Organizacin Mundial de la Salud, ms del 70% de
la poblacin mundial tiene que recurrir a la medicina
tradicional, como nica alternativa a su alcance,
para resolver sus principales necesidades de salud.
Dentro de la medicina tradicional la DM se trata con la
administracin de plantas medicinales, las cuales son
conocidas popularmente como plantas antidiabticas
(Farnsworth et al. 1985).
Plantas antidiabticas estudiadas en el mundo
Marles y Farnsworth (1994) reportan que son utilizadas
en el mundo ms de 1200 plantas medicinales en el
control de la DM. Algunas de estas plantas han sido
objeto de estudios farmacolgicos exhaustivos dirigidos
hacia la validacin de sus propiedades antidiabticas.
Sin embargo, a ms de las dos terceras partes de las
plantas reportadas como antidiabticas no se les ha
realizado estudio alguno (alrededor de 800 especies
vegetales de las 1200 reportadas en el mundo como
antidiabticas).
De acuerdo con el tipo de estudios realizados con las
plantas estudiadas (alrededor de 400 especies), Bailey
y Day (1989), as como Marles y Farnsworth (1994 y
1995), las clasifcaron en tres categoras:
1) Plantas antidiabticas a partir de las cuales se ha
logrado aislar un agente hipoglucemiante potencial.
2) Plantas antidiabticas cuyo efecto hipoglucmico
ha sido estudiado a nivel experimental y/o clnico,
pero a partir de las cuales no se ha logrado
aislar la sustancia responsable de la actividad
hipoglucemiante.
3) Plantas antidiabticas cuyo efecto hipoglucmico fue
estudiado experimental y/o clnicamente, pero cuyos
resultados fueron negativos o contradictorios.
De acuerdo con estos datos, ms de 300 mostraron
accin hipoglucemiante y de ellas se han aislado
alrededor de 150 compuestos hipoglucemiantes.
As mismo, en el 19% de las 400 plantas estudiadas
los resultados fueron negativos o contradictorios.
Cabe sealar tambin que la inmensa mayora de
los estudios realizados con estas plantas ha sido a
nivel experimental, estudiando efectos agudos (90%),
mientras que a nivel toxicolgico y clnico slo se ha
evaluado una minora (slo el 10%). Por su parte,
en menos del 10% de las plantas estudiadas se han
realizado estudios dirigidos a la determinacin de su
actividad biolgica a largo plazo.
De acuerdo con Marles y Farnsworth (1994, 1995),
las familias botnicas que contribuyen con ms especies
antidiabticas en todos los pases son las siguientes:
Fabaceae, Asteraceae, Lamiaceae, Liliaceae, Poaceae
y Euphorbiaceae, entre otras. As mismo, entre las
plantas ms ampliamente utilizadas en el mundo se
mencionan: Momordica charantia L. (Cucurbitaceae),
Catharanthus roseous (Apocynaceae), Anacardium
occidentale (Anacardiaceae), Aloe vera (Liliaceae),
Syzygium cumini (Myrtaceae), Tecoma stans
(Bignoniaceae), Urtica dioica (Urticaceae), Lupinus
albus y Trigonela foenum-graceum L. (Fabaceae),
Allium cepa y A. sativum (Liliaceae).
M. charantia es la planta ms ampliamente
estudiada en el mundo. Su efecto hipoglucmico agudo
y crnico, as como sus efectos toxicolgicos in vivo e
in vitro, se han estudiado a nivel experimental y clnico;
y a partir de sus fores, frutos y hojas. Adems, varias
sustancias han sido propuestas como las responsables
de su actividad, tal como la charantina (Ali et al. 1993;
Tennekoon et al. 1994).
De Chataranthus roseous, a partir de la cual se
aislaron los conocidos alcaloides antineoplsicos
vincristina y vinblastina, se han aislado ya varias
sustancias hipoglucemiantes.
De Tecoma stans se han aislado los alcaloides
tecomina y tecostanina (Hammouda y Amer 1960;
Hammouda et al. 1964) y de T. foenum-graceum,
adems de estudiar sus propiedades antidiabticas, se
ha estudiado su utilidad como hipocolesterolemiante
(Abdel et al. 1997; Molham y Amala Raman 1998).
Marles y Farnsworth (1994) tambin reportan la
naturaleza qumica de los compuestos hipoglucemiantes
que ms frecuentemente se han aislado de plantas
antidiabticas. Dentro de los principales se mencionan
carbohidratos (sacridos o glcidos), alcaloides,
glucopptidos, terpenoides, pptidos y aminas,
favonoides, esteroides y algunos otros compuestos de
naturaleza lipdica.
Es importante subrayar que ms del 10% de las
plantas reportadas en el mundo como antidiabticas
existen en Mxico. Sin embargo, a pesar de que estas
plantas representan una alternativa viable en el control
de la DM al alcance de la mayora de la poblacin y de
que representan tambin una fuente potencial de materia
prima para la obtencin de nuevos medicamentos
hipoglucemiantes orales, su investigacin experimental
y clnica en nuestro pas es reciente.
Plantas antidiabticas en Mxico
Las investigaciones etnobotnicas realizadas en
Mxico reportan el uso emprico de 269 plantas
antidiabticas, varias de las cuales se han usado
30
desde tiempos ancestrales y otras fueron incorporadas
al saber tradicional apenas durante el siglo XX
(Martnez 1969; Aguilar et al. 2002; Hernndez et al.
2002a). Cabe sealar que la mayora de las especies
antidiabticas mexicanas son especies endmicas y
aproximadamente el 12 % de ellas estn incluidas en
las 1,200 plantas reportadas por Marles y Farnsworth
(1995).
De acuerdo con Aguilar y Xolalpa (2002), as como
Hernndez et al. (2002), entre las familias botnicas
que contribuyen con ms especies antidiabticas
mexicanas se encuentran Asteraceae, Leguminosae y
Cactaceae (Figura 1).
Las especies vegetales con mayor nmero de
citas bibliogrfcas, de investigaciones etnobotnicas
realizadas en diferentes localidades del pas que hacen
referencia a su uso como remedio antidiabtico y que
se pueden considerar como las ms ampliamente
utilizadas por la poblacin mexicana en el control
emprico de la DM (Hernndez et al. 2002a) son Opuntia
sp, Tecoma stans y Aloe barbadensis (Figura 2).
Como se indic anteriormente, las plantas
mexicanas ms ampliamente investigadas hasta 1990
eran nicamente el nopal Opuntia streptacantha y la
tronadora Tecoma stans. Es apenas en los ltimos 12
aos que varios investigadores de diversas instituciones
y universidades del pas (Instituto Mexicano del
Seguro Social, Universidad Autnoma Metropolitana,
Universidad Nacional Autnoma de Mxico, entre
otras) se abocaron al diseo de modelos adecuados y
a la realizacin de estudios dirigidos hacia la validacin
experimental y clnica de las plantas antidiabticas
mexicanas.
En estos ltimos 12 aos, las investigaciones en
Mxico se han centrado hacia los siguientes objetivos
generales:
1. Validar el efecto antihiperglucmico de plantas
reportadas como antidiabticas.
2. Estudiar el mecanismo de accin hipoglucemiante de
las plantas con mayor efecto antihiperglucmico.
3. Iniciar el aislamiento y la caracterizacin qumica de
los principios activos.
A continuacin se comentan algunos de los resultados
ms sobresalientes obtenidos dentro de las actividades
de investigacin del Laboratorio de Farmacologa
de la Universidad Autnoma Metropolitana, unidad
Iztapalapa, en el cumplimiento de estos tres objetivos.
1. Validacin del efecto antihiperglucmico de
plantas reportadas como antidiabticas.
Con base en la informacin etnobotnica se
seleccionaron las 62 plantas antidiabticas ms
citadas y que estuvieran ampliamente distribuidas en
el pas, dando prioridad a las especies endmicas,
as como a las comestibles. El modelo experimental
para la evaluacin de estas plantas consisti en un
modelo in vivo de conejos con hiperglucemia temporal,
la cual fue inducida mediante la administracin de dos
inyecciones subcutneas de solucin glucosada al
50%, al inicio del experimento y 60 minutos despus. Es
decir, se realizaron pruebas subcutneas de tolerancia
a la glucosa con doble carga, previa administracin
intragstrica de las preparaciones tradicionales de las
plantas antidiabticas seleccionadas. Como controles
se us agua y tolbutamida. La signifcancia de las
diferencias entre las medias de los grupos control y los
tratados con plantas antidiabticas fueron evaluadas
mediante un anlisis de varianza, usando la Nueva
Prueba de Amplitud Mltiple de Duncan y un nivel
mnimo de signifcancia del 95%. En el cuadro 1 se
enlistan las 62 plantas antidiabticas estudiadas en
este modelo experimental (Romn et al. 1991, 1992a,
1995; Alarcn et al. 1998).
Figura 1. Familias botnicas que contribuyen con el mayor
nmero de especies antidiabticas en Mxico.
0
5
10
15
20
25
30
35
Familia
Figura 2. Plantas antidiabticas mexicanas ms ampliamen-
te citadas.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Especies
31
De estas 62 plantas se ha logrado convalidar actividad
en 33. En la Figura 3 se muestra el porcentaje de
disminucin del rea bajo la curva producido por las 21
plantas ms efcaces.
Como se puede observar, las plantas ms efcaces,
con descensos del rea bajo la curva de tolerancia a
la glucosa que oscilaron entre un 20 y un 32% fueron:
Guaiacum coulteri, Cucurbita fcifolia, Psacalium
Cuadro 1. Plantas estudiadas en conejos con hiperglucemia temporal.
No. NOMBRE CIENTFICO FAMILIA NOMBRE POPULAR PARTE USADA
1 Acourtia thurberi (Gray.) Rev. Et King. Asteraceae Matarique Raz
2 Aloe bardabensis Mill. Liliaceae Zbila Tallo
3 Allium cepa L. Liliaceae Cebolla Bulbo
4 Allium sativum L. Liliaceae Ajo Bulbo
5 Artemisia mexicana Willd. Asteraceae Estafiate Planta completa
6 Astianthus viminalis H.B.K. Bignoniaceae Azuchil Hojas
7 Bauhinia divaricata Linn. Leguminosae Pezua de vaca Hojas
8 Bidens pilosa L. Asteraceae Aceitilla Planta completa
9 Brassica oleracea L. Cruciferae Col Hoja
10 Brassica oleraceae L. var. botrytis Cruciferae Coliflor Inflorescencia
11 Buddleia americana Linn Loganiaceae Tepozn Hojas
12 Calea zacatechichi Schltdl. Asteraceae Prodigiosa Hoja, tallo y raz
13 Cecropia obtusifolia Bertol. Moraceae Guarumbo Hojas
14 Citrus aurantium L. Rutaceae Naranja agria Fruto fresco
15 Cnidoscolus multilobus (Lex.) L.M. Euphorbiaceae Chaya Hojas
16 Coix lachryma -jobi Linn. Gramineae Lgrimas de San Pedro Hoja, tallo y raz
17 Crataegus pubescens (H.B.K.) Steud. Rosaceae Tejocote Raz
18 Cucumis sativus L. Cucurbitaceae Pepino Fruto
19 Cucurbita ficifolia (L.) Bouch. Cucurbitaceae Chilacayote Fruto
20 Cuminum cyminum L. Umbelliferae Comino Semilla
21 Cynodon dactylon (L.) Pers. Gramineae Grama Hoja, tallo y raz
22 Eriobotrya japonica (Thund) Lindl. Rosaceae Nspero Hojas
23 Eucaliptus globulus Labill. Myrtaceae Eucalipto Hojas
24 Euphorbia preslii Euphorbiaceae Golondrina Planta completa
25 Euphorbia prostata Aiton. Euphorbiaceae Golondrina Planta completa
26 Exostema caribaeum (Jacq.) Roem. & Schult. Rubiaceae Quina Corteza
27 Eysenhardtia polystachya (Ortega) Sarg. Leguminosae Palo dulce Tallo
28 Guaiacum coulteri A. Gray Zygophillaceae Guayacn Tallo
29 Guazuma ulmifolia Lam. Sterculiaceae Guacima Hojas
30 Jatropha dioica Sess ex Cerv. Euphorbiaceae Sangre grado Raz
31 Lactuca sativa L. var. Romna. Asteraceae Lechuga Romna Hojas
32 Lepechinia caulescens (Ort.) Epl. Labiatae Salvia Flores, hojas y tallo
33 Mangifera indica L. Anacardiaceae Mango Hojas
No. NOMBRE CIENTFICO FAMILIA NOMBRE POPULAR PARTE USADA
34 Marrubium vulgare Linn. Labiatae Marrubio Hoja, tallo y raz
35 Mentha piperita L. Labiatae Hierbabuena Planta completa
36 Musa sapientum L. Musaceae Pltano Flores frescas
37 Olea europaea L. Oleaceae Olivo Hojas
38 Opuntia ficus indica (L.) M. Cactaceae Nopal Tallo fresco
39 Opuntia streptacantha Lemaire. Cactaceae Nopal-Xoconostle Tallo
40 Parmentiera edulis D.C. Bignoniaceae Chote Fruto fresco
41 Pavonia schiedeana Steud. Malvaceae Cadillo Hoja y tallo
42 Persea americana (L.) Mill. Lauraceae Aguacate Semillas
43 Phaseolus vulgaris Linn. Leguminosae Frijol Vainas
44 Physalis philadelphica Brot. Solanaceae Tomate verde Cscara
45 Psacalium decompositum (Gray) . Asteraceae Matarique Raz
46 Psacalium peltatum (H.B.K.) Cass. Asteraceae Matarique Raz
47 Psidium guajava L. Myrtaceae Guayaba Fruto
48 Randia echinocarpa Moc. & Sess Rubiaceae Granjel Fruto
49 Rauwolfia tetraphylla L. Apocynaceae Paulillo Hojas
50 Rhizophora mangle L. Rizophoraceae Mangle rojo Tallo
51 Salpianthus macrodonthus Stand. Nyctaginaceae Catarinilla Raz, hojas
52 Senna skinneri Benth. Leguminosae Paracata Hojas
53 Serjania triquetra Radlk. Sapindaceae Palo de 3 costillas Tallo
54 Solanum verbascifolium Linn. Solanaceae Malabar Hoja y tallo
55 Spinacea oleracea L. Chenopodiaceae Espinaca Hojas
56 Taraxacum officinale Weber. Asteraceae Diente de len Completa
57 Tecoma stans (L.) H.B.K. Bignoniaceae Tronadora Hoja y tallo
58 Teucrium cubense Jacq. Labiatae Agrimonia Hoja y tallo
59 Trigonella foenum graecum L. Leguminosae Fenogreco Semillas
60 Tournefortia hirsutissima L. Boraginaceae Lgrimas de San Pedro Tallo
61 Turnera diffusa Willd Turneraceae. Damiana Hojas
62 Urtica dioica Wedd. Urticaceae Ortiga Hojas
32
peltatum, Lepechinia caulescens, Marrubium vulgare,
Opuntia streptacantha, Guazuma ulmifolia, Solanum
verbascifolium y Phaseolus vulgaris. Todas ellas
causaron descensos altamente signifcativos (P<0.05)
con respecto a los datos del control (agua) e incluso
fueron superiores a los producidos por la tolbutamida
(Figura 3).
Las cuatro primeras fueron seleccionadas para
continuar con el estudio dirigido hacia la dilucidacin
de su mecanismo de accin hipoglucemiante, es decir,
el siguiente de nuestros objetivos generales.
Vale la pena mencionar que rastreos farmacolgicos
de este tipo, en los que se usa un modelo experimental
para evaluar el efecto sobre la glucemia de varias
plantas medicinales, slo se han realizado dos: usando
conejos con hiperglucemia temporal y usando ratones
sanos y diabticos. En este ltimo modelo se estudi
el efecto hipoglucmico de 20 plantas antidiabticas
mexicanas, convalidndose actividad en la mayora
(Prez et al. 1984).
2. Estudio del mecanismo de accin
hipoglucemiante de las plantas con mayor efecto
antihiperglucmico.
Los animales de experimentacin empleados
para esta parte del trabajo fueron conejos y ratones
(Romn et al, 1992b; Alarcn, 1997). En ambas
especies se indujo diabetes experimental mediante
la administracin intraperitoneal de aloxana, frmaco
que destruye de manera selectiva las clulas beta del
pncreas de estos animales. El diseo experimental
consisti en la administracin del lioflizado obtenido a
partir de las preparaciones tradicionales de Cucurbita
fcifolia, Guaiacum coulteri, Lepechinia caulescens y
Psacalium peltatum a conejos y ratones sanos, con
diabetes moderada (glucemias en ayuno de 150 a
350 mg/dl) y con diabetes grave (glucemias en ayuno
superiores a 350 mg/dl). Estas plantas mostraron
descensos signifcativos de la glucemia en conejos
sanos con hiperglucemia temporal, tanto en el pico
hiperglucmico como en el rea bajo la curva de
tolerancia a la glucosa (Figura 4). Por su parte, en
animales con diabetes moderada, las cuatro plantas
mostraron evidente efecto hipoglucmico (Figura
5). As, tanto en ratones sanos como en ratones con
diabetes moderada estas cuatro plantas produjeron
reducciones signifcativas de la glucemia, de manera
similar a las reducciones producidas por la tolbutamida.
Sin embargo, en animales con diabetes grave, ni la
tolbutamida, ni las plantas antidiabticas estudiadas
lograron reducir la hiperglucemia (Figura 6).
Figura 4. Curvas de tolerancia a la glucosa en conejos sa-
nos, despus de la administracin intragstrica de las plantas
antidiabticas con mayor actividad (*diferencia signifcativa
con respecto al control, P<0.05).
Figura 5. Curvas glucmicas en conejos con diabetes mo-
derada, despus de la administracin gstrica de las plantas
antidiabticas con mayor actividad (*diferencia signifcativa
con respecto al control, P<0.05).
Figura 3. Porcentaje de disminucin del rea bajo la curva
de las 21 plantas ms efcaces. Con respecto al control con
agua, todas mostraron descensos estadsticamente signif-
cativos (P<0.05).
P
la
n
t
a
s

e
s
t
u
d
ia
d
a
s
Porcentaje de disminucin
0 5 10 15 20 25 30 35
G
lu
c
e
m
ia

(
m
g
/
d
l)
Tiempo (min)
Agua Tolbutamida C.ficifolia G.coulteri L.caulescens P.peltatum
0
0
50
150
100
200
300
250
60 120 180 240 300
G
lu
c
e
m
ia

(
m
g
/
d
l)
Tiempo (min)
Agua Tolbutamida C.ficifolia G.coulteri L.caulescens P.peltatum
0
0
50
150
100
200
300
250
60 120 180 240 300
33
El extracto acuoso obtenido de las tres especies
result ser el ms activo por lo que se procedi a su
fraccionamiento y a la separacin de los compuestos
que lo conforman. Con los datos obtenidos hasta
ahora se puede decir que la naturaleza qumica de los
principios activos es del tipo de los carbohidratos. Sin
embargo, la estructura qumica de los mismos an no
se ha dilucidado. A este respecto, cabe sealar que de
13 especies mexicanas con propiedades antidiabticas
se han propuesto 17 agentes hipoglucemiantes
potenciales (Cuadro 2) (Hammouda y Amer 1960;
Hammouda et al. 1964; Inman et al. 1999; Alarcn et
al. 2000a, 2000b; Andrade et al. 2000; Prez 1997;
Perez et al. 2000a, 2000b; Meckes et al. 2001; Andrade
y Wiedenfeld, 2001; Romn et al. 2001; Perez y Vargas
2002; Alarcn et al. 2003b).
Resultados similares se han obtenido en ratones
con diabetes moderada y grave para estas plantas
(Alarcn 1997). Debido a que las plantas antidiabticas
slo muestran actividad en animales con diabetes
moderada, es decir en animales que an contienen
clulas funcionales beta, pero no en animales carentes
de dichas clulas, se puede deducir que estas plantas
requieren de la presencia de insulina para poder ejercer
su accin hipoglucemiante. Aunque an no es posible
afrmar que las plantas antidiabticas aumentan la
sntesis y secrecin de insulina, o si incrementan la
sensibilidad de los receptores a esta hormona, estos
resultados dejan entrever que el uso de estas plantas
en el control de los pacientes con DM debe restringirse,
previos estudios toxicolgicos, nicamente a aqullos
con diabetes tipo 2.
3. Aislamiento y caracterizacin qumica de los
principios activos.
Tres de las plantas con mayor actividad fueron
seleccionadas para cumplir con el tercero de
nuestros objetivos generales: iniciar el aislamiento y
la caracterizacin qumica de los principios activos.
Las plantas estudiadas fueron P. decompositum, P.
peltatum y L. caulescens (Romn et al. 2001; Alarcn
et al. 2000a, 2000b; Contreras et al. 2002).
Con algunas variantes, la metodologa empleada
en esta parte del trabajo consisti en la obtencin
de extractos con disolventes de polaridad creciente
(hexano, cloruro de metileno, metanol y agua),
fraccionamiento por cromatografa en columna y/o
capa fna del extracto con mayor actividad y separacin
de los compuestos activos por cromatografa en capa
fna usando placas preparativas (Figuras 7 y 8).
Figura 6.Curvas glucmicas en conejos con diabetes grave,
despus de la administracin gstrica de las plantas antidia-
bticas con mayor actividad. Las plantas no mostraron activi-
dad hipoglucemiante en este modelo.
Figura 7. Metodologa empleada para la obtencin de los ex-
tractos orgnicos y acuoso.
Figura 8. Metodologa empleada para el anlisis cromatogr-
fco de los extractos por CCF.
G
lu
c
e
m
ia

(
m
g
/
d
l)
Tiempo (min)
0
0
100
300
200
400
600
500
60 120 180 240 300
Agua Tolbutamida C.ficifolia G.coulteri L.caulescens P.peltatum
Obtencin de los extractos
1 Kg de planta seca
Maceraciones sucesivas con solven-
tes de polaridad creciente
(Hexano, diclorometano, metanol y
agua)
Evaporacin en un rotavapor
Resuspensin en solucin salina o
aceite de maz
Anlisis cromatogrfco del extractor por ccf
Re suspensin del extracto en metanol
Fraccin acuosa
Anlisis cromatogrfco
por ccf con grupo amino
Separacin cromatogrfca
por ccf preparativa con
grupo amino
Recuperacin de las
muestras
Re suspensin
Fraccin metanlica
34
Como resultado de este anlisis general, podemos
decir que de las 269 plantas antidiabticas reportadas
en Mxico y de las 80 que han sido estudiadas,
alrededor de 40 han mostrado efecto hipoglucmico
importante y que el resto muestra resultados negativos
o contradictorios. Con los datos obtenidos hasta ahora
no se puede afrmar de manera categrica la ausencia
de efecto hipoglucmico en este ltimo grupo de
plantas, ya que en la mayora de los experimentos
se ha evaluado nicamente el efecto hipoglucmico
agudo. No se descarta la posibilidad que el efecto
hipoglucmico de algunas de estas plantas slo se
pueda apreciar en estudios crnicos, como es el
caso de Aloe barbadensis (Ali-Ajabnoor 1990). A este
respecto, cabe sealar que apenas en el 5% de las
80 plantas estudiadas se han realizado estudios con
administracin crnica de la planta.
Por otro lado, nicamente en el 10% de las plantas
estudiadas se han efectuado estudios clnicos, lo
que refeja, a su vez, el mnimo nmero de estudios
realizados en los que se han valorado los probables
efectos toxicolgicos producidos por estas plantas en
el mbito experimental (slo en tres especies). Por
su parte, en cuanto al aislamiento y caracterizacin
qumica de las sustancias responsables de la actividad
hipoglucemiante, en poco ms del 16 % se ha propuesto
un agente hipoglucemiante potencial.
A continuacin se hace una breve descripcin de
algunas otras investigaciones que actualmente se
estn llevando a cabo con cinco plantas antidiabticas
mexicanas que han mostrado efectos farmacolgicos
importantes.
Cuadro 2. Agentes hipoglucemiantes potenciales que se han propuesto de plantas antidiabticas mexicanas.
FAMILIA NOMBRE
CIENTFICO
NOMBRE
POPULAR
PARTE
USADA
SUSTANCIA ACTIVA REFERENCIAS
Asteraceae Brickellia
veronicaefolia
Gray.
Hierba dorada Hojas 5,7,3-trihydroxi-3,6,4-
trimetoxiflavona (flavonoi-
de).
Perez et al. 2000b
Asteraceae Psacalium decom-
positum (Gray).
Matarique Raz Cacalol (furoeremofilano)
y una fraccin acuosa
(polisacrido).
Inman et al. 1999,
Alarcn et al.
2000a, 2000a
Cactaceae Opuntia fcus-
indicaL.
Nopal Cladiodos Polisacrido Alarcn et al.
2003b
O. streptacantha Nopal Cladiodos Polisacrido Alarcn et al.
2003b
Bignoniaceae Astianthus vimina-
lis H.B.K.
Azuchil Hojas Iridioides Meckes et al. 2001
Bignoniaceae Parmentiera edu-
lis D.C.
Cuajilote Fruto Lactucin-8-O-metilacrilato
(guaianolida).
Perez et al. 2000a
Bignoniaceae Tecoma stans (L.)
H.B.K.
Tronadora Hoja Tecomina y tecostanina
(alcaloides).
Hammouda y Amer
1960; Hammouda
et al. 1964.
Equisetaceae Equisetum myrio-
chaetum Schlecht.
Cola de
Caballo
Tallo Caemferol-3-O-soforo-
sida-4-O--D-glucsido
(glucsido)
Andrade et al.
2000
Ericaceae Agarista mexicana
(Hemsl) Judd.
Palo santo Hojas 23,24 dimetil-24-etil-stig-
mast-25-ene y 12-ursene
(triterpenos)
Perez y Vargas
2002
Labiatae Lepechinia cau-
lescens (Ort) Epl.
Salvia Flores Fraccin acuosa Romn et al. 2001
Moraceae Cecropia obtusifo-
lia Berthold.
Guarumbo Hojas Isoorientin (flavonoide)
y 3-cido cafeoilquinico
(cido clorognico).
Andrade y
Wiedenfeld 2001
Nyctaginaceae Salpianthus are-
narius (H.B.K.) G.
Ort.
Catarinilla Flores Saliriol. Prez 1997.
Palmae Acrocomia mexi-
cana Karw.
Cocoyol Raz Coyolosa. Prez 1997.
35
Investigaciones con otras plantas
antidiabticas mexicanas
Cucurbita fcifolia Bouch (Cucurbitaceae). La planta
es conocida popularmente como chilacayote y se cultiva
principalmente por sus frutos comestibles, aunque
tambin se usan como medicinales (Xolalpa 1990).
La planta se encuentra reportada para el tratamiento
de heridas, febre y hemorroides (Hernndez 1959;
Esteyneffer 1978), pero el uso ms actual es para el
tratamiento de la DM tipo 2. C. fcifolia ha mostrado
actividad hipoglucemiante en conejos con hiperglucemia
temporal, en conejos con diabetes inducida con aloxana
y en pacientes con diabetes tipo 2 (Romn et al. 1991,
1992b; Acosta-Patio et al. 2001). Sin embargo, en los
estudios previos realizados en conejos se us el jugo
fresco de la pulpa obtenida de frutos maduros, mientras
que en los estudios realizados en humanos se evaluaron
frutos inmaduros. El efecto hipoglucmico agudo del
lioflizado obtenido del jugo de frutos maduros de C.
fcifolia fue tambin estudiado en ratones sanos y con
diabetes inducida con aloxana (Alarcn et al. 2002a).
La administracin intragstrica e intraperitoneal de esta
preparacin produjo disminuciones signifcativas de
la glucemia de manera dosis dependiente en ratones
sanos. En ratones diabticos, la administracin de C.
fcifolia tambin mostr efecto hipoglucmico agudo.
Adems, la administracin intragstrica diaria de
esta preparacin a ratas diabticas tambin mostr
reducciones altamente signifcativas de la glucemia
despus de 14 das de tratamiento. Sin embargo, el
lioflizado del jugo obtenido del fruto maduro de C.
fcifolia produjo signos de toxicidad en estos animales
(Hernndez et al. 2002b). As, es necesario continuar
con la investigacin toxicolgica de esta preparacin
para determinar su seguridad en el control de la
diabetes tipo 2. Adems, es necesario iniciar los
estudios dirigidos al aislamiento y caracterizacin
qumica de las sustancias hipoglucemiantes y hacia la
dilucidacin de su mecanismo de accin.
Ibervillea sonorae Greene (Cucurbitaceae) (Syn.
Maximowiczia sonorae S. Wats.). Es una planta usada
como medicinal por varias etnias del Norte de Sinaloa
y Sonora, conocida en Mxico como guareke (Lopez
& Hinojosa 1988, Xolalpa 1994). En la actualidad, su
uso en el control de la diabetes tipo 2 se encuentra
muy difundido en nuestro pas. La administracin oral
del lioflizado de la decoccin de la raz de I. sonorae
no mostr descensos signifcativos de la glucemia en
ratones sanos. Sin embargo, su administracin por
va intraperitoneal produjo descensos signifcativos de
la glucosa de manera dosis dependiente. El extracto
tambin redujo la glucemia de ratas con diabetes
moderada pero no de ratas con diabetes grave
(Alarcn et al. 2002b). Es necesario remarcar que la
investigacin qumica, farmacolgica y toxicolgica
de I. sonorae se debe continuar para fundamentar
su uso en el control de la diabetes mellitus. Adems,
debido al uso indiscriminado de la raz de esta planta,
lo que merma indiscutiblemente la distribucin de la
especie, es importante iniciar programas dirigidos a
la preservacin y mejoramiento de este importante
recurso medicinal.
Opuntia fcus-indica L. y Opuntia streptacantha
Lem. (Cactaceae). Estas dos especies vegetales son
las ms ampliamente usadas en el control de la diabetes
tipo 2 en Mxico y son tambin las ms estudiadas,
tanto a nivel experimental como a nivel clnico. Diversas
preparaciones tradicionales de ambas especies han sido
evaluadas en conejos con hiperglucemia temporal, en
conejos con diabetes inducida por aloxana, voluntarios
sanos y pacientes con diabetes tipo 2 (Ibaez y Romn
1979; Frati et al. 1991; Alarcn et al. 1998; Ramos et
al. 2000). En estos estudios, los resultados parecen
sugerir que el efecto producido por O. fcus-indica
podra ser explicado por un mecanismo que reduce
la absorcin intestinal de glucosa (efecto fbra). Por
su parte, el mecanismo de accin hipoglucemiante
sugerido para O. streptacantha parece estar asociado
con la existencia de una sustancia hipoglucemiante
que produce su actividad por absorcin. A pesar de que
estas acciones han sido estudiadas convenientemente,
la naturaleza de los compuestos hipoglucemiantes no
se ha establecido.
En 1999 se aislaron dos polisacridos, uno de O. fcus-
indica (POLOF) y otro de O. streptacantha (POLOS).
Aunque ambos mostraron importantes diferencias en
cuanto a la composicin de monosacridos, los dos
fueron descritos como polmeros altamente complejos
(Zempoaltecatl 1999). En la actualidad, la actividad
hipoglucemiante de ambos polisacridos se est
estudiando en diferentes modelos experimentales y, al
parecer, los resultados son alentadores (Alarcn et al.
2003b).
Psacalium decompositum (Gray.) Rob. et Brett.
(Asteraceae) (Syn. Cacalia decomposita A. Gray).
Es una de las plantas antidiabticas mexicanas ms
importantes que forma parte del complejo Matarique
(Bye 1986; Aguilar et al. 1994). La planta ha mostrado
actividad en conejos con hiperglucemia temporal, en
ratones sanos y en ratones con diabetes experimental
(Alarcn et al. 1997). Estudios ftoqumicos muestran que
los principales constituyentes de la raz son de naturaleza
36
sesquiterpnica, tales como cacalol, cacalona, maturina,
maturinona y maturona (Correa y Romo 1966). Aunque
el efecto hipoglucmico de algunos de estos compuestos
ya fue evaluado, los resultados han sido contradictorios.
Estos compuestos no mostraron efecto hipoglucmico
en ratones sanos (Alarcn et al. 2000a), pero s en
ratones diabticos obesos genticamente alterados,
designados C57BL/61-ob/ob (Inman et al. 1999).
Adems, dos polisacridos obtenidos de la raz tambin
han mostrado actividad en ratones sanos (Alarcn et al.
2000a, 2000b). An son necesarios estudios qumicos
y farmacolgicos para determinar la estructura de estos
polisacridos y evaluar su actividad hipoglucemiante
en animales diabticos. Por otro lado, tambin se ha
reportado la existencia de alcaloides pirrolizidnicos en la
raz de P. decompositum, los cuales son hepatotxicos,
mutagnicos y carcinognicos (Sullivan 1981; Plaa 1991).
As, es necesario realizar tambin estudios de toxicidad,
principalmente con los extractos impuros.
Conclusin
Tomando en cuenta que ms de las dos terceras partes
de la plantas usadas empricamente en Mxico an no
se han estudiado, se considera importante continuar
con la investigacin de sus propiedades antidiabticas y
toxicolgicas no slo a nivel agudo, sino tambin a nivel
crnico. Esto permitir fundamentar su estudio y su uso
clnico, con la fnalidad, no slo de lograr un mejor control
de los pacientes con DM tipo 2 que tratan de controlar su
padecimiento usando plantas medicinales, sino tambin
para tratar de prevenir el desarrollo de la enfermedad
en sujetos con alta predisposicin para desarrollarla
(con obesidad, resistencia a la insulina, alteracin en la
glucosa de ayuno, intolerancia a la glucosa, etctera)
(Alarcn et al. 2003a). Adems, conjuntamente con
investigaciones dirigidas al aislamiento, purifcacin y
caracterizacin qumica de las sustancias responsables
de su actividad hipoglucemiante, es tambin primordial
iniciar programas biotecnolgicos dirigidos al cultivo,
conservacin y mejoramiento de estas especies
vegetales.
Agradecimientos
This research was partially supported by the International
Foundation for Science, Stockholm, Sweden, and the
Organization for the Prohibition of Chemical Weapons,
The Hague, The Netherlands, through a grant to
Francisco Javier Alarcn-Aguilar PhD. Research Grant
Agreement No. F/3338-1.
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41
Chemical composition and cytotoxic activity of
Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling (Lamiaceae)
Composicin qumica y actividad citotxica de
Lepechinia speciosa(St. Hill) Epling (Lamiaceae)
Patricia Fontes Esteves
1
, Ricardo Machado Kuster
2
, Nancy dos Santos Barbi
3
, Fabio de Sousa Menezes
4
1
Laboratrio de Estudo Qumico de Espcies de Lamiiforeae, Centro de Cincias e da Sade, Universidade Federal do Rio
de Janeiro (UFRJ), Brasil.
2
Laboratrio de Fitoqumica de Plantas Medicinais, Centro de Cincias e da Sade, Universidade
Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil.
3
Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas, Centro de Cincias e da Sade,
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil.
Autor para correspondencia: Fabio de Sousa Menezes
School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Trinity College Dublin, University of Dublin, Dublin 2, Ireland.
Tel.: +353851645266 Fax: +35318962810.
E-mail: desouzaf@tcd.ie
Abstract.
In this study we report the chemical composition of
the Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling (Lamiaceae)
fractions, as well as their effects on cytotoxic evaluation
and anti-proliferative activity. The results have shown
that the dichloromethane (FD) and ethyl acetate
(FAE)fractions were the best in both assays. From
those fractions it was possible to identify oleanolic,
ursolic and palmitic acid from FD and rosmarinic acid
and verbascoside from FAE. The next step of this
research will be to test the isolated compounds from
these fractions.
Keywords: Lepechinia speciosa; Lamiaceae;
Cell viability; Triterpene Acids; Rosmarinic acid;
Verbascoside.
Resumen
En este estudio se informa de la composicin qumica
de fracciones de Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling
(Lamiaceae), as como sus efectos en la evaluacin
citotxica y actividad anti-proliferativa. Los resultados
mostraron que las fracciones diclorometano (FD) y etil
acetato (FAE) fueron las mejores en ambos ensayos.
De estas fracciones fue posible identifcar en FD: los
cidos oleanlico, urslico y palmtico y de FAE; cido
rosmarnico y verbascsido. El siguiente paso de esta
investigacin ser ensayar los compuestos aislados de
estas fraccciones.
Palabras clave: Lepechinia speciosa; Lamiaceae;
viabilidad celular; cidos triterpenos; cido rosmarnico;
verbascsidos.
Introduction
The Lamiaceae family is comprised approximately
of 224 genera and 5,600 species distributed across
the world. One of these genera is Lepechinia, which
comprises 40 species that are mainly distributed in
South America and Mxico [1; 2].
Plants of the genus Lepechinia are used in
traditional medicine for the treatment of uterine
infections, uterine tumours, stomach ailments, diabetes
mellitus control and diarrhoea [3, 4; 1; 5-7]; in addition,
previous investigations showed that species of this
genus are used for its hypoglycaemic, vasorelaxant,
insulinomimetic, antispasmodic, antimicrobial, cytotoxic
and antioxidant activities [8; 6; 9; 10; 3; 11; 12; 5].
Some species belonging to the family Lamiaceae
also exhibit cytotoxic activities, such as Lamium album
[13], Salvia miltiorrhiza [14], Marrubium cylleneum [15],
Marrubium velutinum [15], Glossocarya calcicola [16]
and Lepechinia bullata [12], and diterpenes are the
main responsible for this activity.
Phytochemical studies indicate that plants of this
42
genus are sources of tricyclic diterpenes, favonoids
and pentacyclic triterpenes [1]. Oleanolic and ursolic
acids are common constituents of plants, principally
in the Lamiaceae family [17; 18; 19; 20; 21], and may
occur in the free acid form or as aglycones of saponins.
These triterpenes are mentioned simultaneously
because they have similar structural features and
pharmacological activities [22; 23]. Previous studies
have pointed out their pharmacological effects, such
as anti-infammatory [17; 18; 20; 24], anti-tumour [25;
26], antimicrobial [27], hepatoprotective [18], gastro-
protective [18; 28], hypoglycaemic [29], anti-HIV [30]
and antifungal [31] effects, as well as many others,
which may explain the interest in isolating them. Despite
these triterpenes possess pharmacological importance
and wide distribution in the Plant Kingdom; the literature
contains little information about distribution of these
tritepenes.
Rosmarinic acid and verbascoside are common
constituents of the Lamiaceae family. Several biological
activities have been reported for rosmarinic acidand
verbascoside. Rosmarinic acid has adstringent, anti-
infammatory, antibacterial, antioxidant and antiviral
activities. The extracts of Melissa offcinalis containing
rosmarinic acid are used in the therapy of herpes
simplex infection. Phenolic substances like rosmarinic
acid can provide protection against cancer [32; 33].
Due to absence of phytochemical and biological
studies on Lepechinia speciosa, a medicinal plant
widespread in Brazil, we investigated the cell viability
on rat basophilic leukaemia cells (RBL-2H3), the anti-
proliferative activity on human breast adenocarcinoma
cells (MCF-7) and analysed the chemical composition
of the bioactive fractions, contributing to the limited
scientifc knowledge relating to Lepechinia speciosa.
The authors believe this information may stimulate
further scientifc studies into this natural resource.

Experimental
Plant material
Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling (Lamiaceae)
was collected in Parque Nacional de Itatiaia, Rio de
Janeiro, Brazil, in February 2004. Voucher specimens
were deposited and registered in the Herbarium of the
Departamento de Botnica da Universidade Federal do
Rio de Janeiro (Brazil) with n RFA-28365.
Extract preparation
The dried and powdered aerial parts (574g) were
extracted with ethanol at room temperature for at
least 24h (20 x 400ml). Thereafter, the crude ethanol
extract (ET) was fltered, dried under reduced pressure
(68.21g, extraction yield 11.88% (w/w) of dry weight).
This crude extract was redissolved in water (300ml)
and ethanol (200ml) and submitted to a liquid-liquid
extraction with n-hexane (10 x 100ml); from this an
n-hexane fraction (FH) was obtained. This fraction
was dried under reduced pressure (12.34g, extraction
yield 18.09% (w/w) of ET), and a residue extract
(RE1) (31.34g, extraction yield 45.94% (w/w) of ET)
was obtained. The residual crude extract (RE
1
) was
partitioned with dichloromethane (10 x 100ml), obtaining
a dichloromethane fraction (FD), which was dried under
reduced pressure (6.49g, extraction yield 20.71% (w/w)
of RE
1
), yielding another residual extract (RE
2
) (16.48g,
extraction yield 52.58% (w/w) of RE
1
). The residual
crude extract (RE
2
) was partitioned with ethyl acetate
(10 x 100ml), obtaining an ethyl acetate fraction (FAE).
This fraction was dried under reduced pressure (5.6g,
extraction yield 33.4% (w/w) of RE
2
), and a residual
extract (RE
3
) (9.72g, extraction yield 58.9% (w/w) of
RE
2
) was obtained. The residual crude extract (RE
3
)
was partitioned with n-butanol (10 x 100ml), obtaining a
butanolic fraction (FB), which was dried under reduced
pressure (5.48g, extraction yield 56.38% (w/w) of RE
3
),
and an aqueous fraction (FAQ), which was freeze-dried
(3.25g, extraction yield 33.44% (w/w) of RE
3
).
Acid-base extraction
An aliquot (50mg) of the dichloromethane fraction (FD)
was dissolved in CHCl
3
(50ml), treated (x 5) with 5%
Na
2
CO
3
(20ml) and fltered after each treatment. The
aqueous fraction was treated with concentrated HCl,
and the pH was measured. Thereafter, the fraction was
extracted (x 10) with CHCl
3
(10ml). The chloroform
fraction (91mg) was treated with ethereal CH
2
N
2
.
Fractionation and isolation
The ethyl acetate fraction (FAE) (1.4g) was fractionated
by CC over silica gel, eluted with a solvent gradient
from dichloromethane to methanol. The fractions
obtained were analyzed by thin-layer chromatography
(TLC) using a mixture of EtOAc, acetic acid and water
(10:2:3) as developing solvent and grouped according
to their chromatographic profle. Fractions 6-12 (eluted
with dichloromethane-methanol 5%) were purifed
by CC over silica gel, eluted with dichloromethane to
methanol. The fractions obtained were analyzed by
thin-layer chromatography (TLC) using a mixture of
EtOAc, acetic acid and water (10:2:3) as developing
solvent and grouped according to their chromatographic
profle. Fractions 30 and 31, eluted with EtOAc:MeOH
(6:1), were combined, dried and yielded rosmarinic acid
(69.5mg). Fraction 28, eluted with EtOAc:MeOH (6:1)
43
contained verbascoside (4.3mg). Purifcation of these
fractions led to the pure compounds (Fig.1).
GC-MS
The GC-MS analysis was carried out in a Hewlett-
Packard HP 5890 SII gas chromatograph coupled to a
mass spectrometer model Hewlett-Packard HP 5973,
with a capillary column DB-1 (30m x 0.20mm). Helium
was used as the carrier gas at 2ml min-1, and the
temperature was programmed from 50 to 270C at 4C/
min. The electron impact ionization was set to 70eV.
The volume injected was 1.0l. The injector, detector
and column temperatures were 240C.
NMR-Analyses
The dichloromethane fraction (FD) (50mg) has been
treated with active charcoal and analyzed by
1
H and
13
C-NMR (also APT technique). Mainly two triterpene
acids were found in FD extract (Fig.2). The structural
elucidation of rosmarinic acid and verbascoside was
carried out by comparison of experimental values from
1
H-NMR with values previously reported [34; 35].
Ursolic and oleanolic acids:
13
C-RMN (50MHz, DMSO
d
6
/ TMS) data: see Table 1.
Rosmarinic acid:
1
H-RMN (200 MHz, CDCL
3
/TMS)
data: see Table 2.
Verbascosdeo:
1
H-RMN (200MHz, CDCL
3
/TMS) data:
see Table 3.
HO
COOH
(3) Oleanolic acid
HO
COOH
(4) Ursolic acid
O
OH
(5) Palmitic acid
Fig. 1. Chemical structure of the main compounds identifed
within the dichloromethane fraction from Lepechinia specio-
sa: (1) oleanolic acid; (2) ursolic acid; (3) palmitic acid.
Fig. 2. Chemical structure of the compounds isolated of the
ethyl acetate fraction from Lepechinia speciosa: (4) rosmari-
nic acid; (5) verbascoside.
HO
HO
HO HO HO
OH
OH
OH
OH
O
O
O
O
O
O
HO
HO
O
O
O
OH
OH
HO
2
1
7
8
8'
7'
1'
2'
3'
3''
2''
1''
6''
1'''
2'''
3'''
5'''
6'''
4'''
6'
4'
5'
1'
1
2
3
4
5
6
3' 2'
5''
4''
6'
9'
5'
4'
9
4
3
5
6
(1) Rosmarinic acid (2) Verbascoside

''

''
Table 1. 13C-NMR spectral data for compound 1, 2 (50MHz, DMSO-D6) and data from literature [40; 41].
C 1
a
2
a
1 2
3
12
13
28
78.7
122.1
143.4
181.0
78.8
125.5
138.0
177.7
78.6
122.0
143.5
178.4
78.6
125.1
138.2
177.9
a
Data taken from

literature (50MHz, CDCl
3
)
Table 2. 1 HNMR spectral data for compound 4 (200MHz, CD3OD J values (Hz) are given in parentheses), and
data from literature [35].
H 4
a
4
2 7.03 (d) 7.03 (d, J 1.7Hz)
5 6.76 (d) 6.77 (d, J 8Hz)
6 6.92 (dd) 6.92 (dd, J 1.7 and 8Hz)
7 6.25 (d) 6.26 (d, J 16Hz)
8 7.50 (d) 7.52 (d, J 16Hz)
2 6.77 (d) 6.67 (sl)
5 6.67 (d) 6.66 (d, J 8.1Hz)
6 6.62 (d) 6.51 (dd, J 1.7 and 8.1Hz)
7 3.10 (dd) 3.02 (m)
7 2.93 (dd) 3.02 (m)
8 5.09 (dd) 4.3 (m)
a Data taken from literature (50MHz, CD3OD)
44
Cytotoxicity
Cell culture
Rat basophilic leukemia cells (RBL-2H3) were cultured in
a Eagles minimum essential medium supplemented with
10% fetal bovine serum (FBS) and 100U/ml penicillin-
streptomycin at 37C in 5% CO
2
/humidifed air.
Human breast adenocarcinoma cells (MCF-7) were
cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10%
fetal bovine serum (FBS) and maintained at 37C in a
5% CO
2
/humidifed air.
LDH assay
The cytotoxic effect of L. speciosa fractions was
determined by lactate dehydrogenase released method
(LDH). The extracts and fractions of L. speciosa were
tested on rat basophilic leukaemia cells (RBL-2H3),
dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 10mg/ml and
diluted in Dulbeccos Modifed Eagles Medium (DMEM)
to concentration of 100g/ml. Two-fold serial dilutions of
the extract or fractions (100l) were added to triplicate
wells containing 100l of cells per well (2 x 10
6
cell/ml).
The cells were incubated at 37C with 5% CO2 and 90%
humidity for 24h. For the positive control, which permitted
the maximum LDH release, 100l/well Triton X-100
solution (2% in assay medium) were added to triplicate
wells containing 100l of cells per well. For the cytotoxic
standard, 50l/well terfenadine (100mM) were added to
triplicate wells containing 100l of cells per well. For the
background control, 200l assay medium were added
to triplicate wells, and for low control 100l/well assay
medium were added to triplicate wells containing 100l
of cells per well. The plate was centrifuged at 250g for
10min, and 100l/well of supernatant were removed and
transferred to a 96-well fat bottom plate. To determine
the LDH activity in these supernatants, 100l of assay
medium from ELISA kit (reaction mixture) were added
to each well and incubated for up to 30min at 20C.
Finally, the absorbance of the samples was measured at
490nm using an ELISA reader. The test was performed
in triplicate on different days.
Percent cytotoxicity values were calculated using Eq.
(1). Data are represented as mean values + standard
deviation.
Sulphorhodamine B (SRB) assay
The antiproliferative activity was determined using
sulphorhodamine B (SRB) assay. This is a sensitive,
reproducible and simple assay. The dichloromethane
Cytotoxicity (%) = (experimental value low control)
(positive control low control)
x 100
(1)
Table 3. 1 HNMR spectral data for compound 5 (200MHz, CD3OD J values (Hz) are given in parentheses), and
data from literature [34].
H 5
a
5
2 6.72 (sl) 6.70 (sl)
5 6.55 (d) 6.6 (sl)
(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl 6 6.71 (d) 6.65 (d, J 5Hz)
2.77 (m) 2.97 (d, J 8.8Hz,CH
2
-)
1 4.39 (d) 4.4 (d, J 7.8Hz, H anomeric-glycose)
2
3 3.85 (t) 3.12-4.26 (CH
2
- and H from
rhamnose and glycose)
Glycose 4 4.95 (t) 4.76 (m)
5
6 3.12-4.26
2 7.09 (s) 7.03 (d, J 1.2Hz)
5 6.80 (d) 6.80 (d, J 1.2Hz)
Caffeoyl 6 6.94 (d) 6.92 (dd, J 1.2 and 7.6Hz)
6.29 (d) 6.26 (d, J 16Hz)
7.6 (d) 7.51 (d, J 16Hz)
Rhamnose 1 5.24 (sl) 5.23 (d, J 2.2Hz,
H anomeric-rhamnose)
6 1.12 (d) 1.2 (d, J 6.8Hz, Me-Rha)
a Data taken from literature (50MHz, CD3OD)
45
and ethyl acetate fractions showed signifcant cytotoxic
effect against rat basophilic leukaemia cells (RBL-2H3),
suggesting us to test both fractions against human
breast adenocarcinoma cells (MCF-7). The samples
were dissolved in DMSO and further diluted with cell
culture medium in different concentrations (1, 5, 10,
25 and 50g/ml). For antiproliferative activity, 100l of
MCF-7 cells (6.0 x 104) were inoculated onto 96-well
plates and incubated at 37C in 5% CO
2
/humidifed air.
After 24h, 100l of L. speciosa fractions were added
and incubated for 48h. Posteriorly, the cells were fxed
with 50l of 50% trichloroacetic acid (TCA) for 1h at
4C. The plates were washed in distilled water and dried
at room temperature. The coloration was acquired by
addition of 0.4% sulphorhodamine B (50l) dissolved in
1% acetic acid for 30min. The plates were incubated at
4C, washed with 1% acetic acid, four times, and dried
at room temperature. The bound SRB was solubilised
by addition of unbuffered Tris Base (10mM, pH 10.5)
(100l) and shaken for 5min.
The absorbances were read at a wavelength of
515nm (Labsystems Multiscan EX plate reader). The
extracts producing a SRB absorbance lower than
25% that of the time zero control value in the cell line
were considered to be cytotoxic. The dose response
curves and IC50 values (concentration that induce 50%
inhibition of cell growth) were calculated.
Results and Discussion
Extraction and isolation of the compounds.
The dichloromethane fraction was methylated with ethereal
diazomethane to obtain the methyl ester derivatives and
for analysis by gas chromatography coupled to mass
spectrometry (GC-MS). The chromatographic analysis
of the dichloromethane fraction is presented in Table 4,
while the mass spectrometry result is presented in Table
5. As it can be seen from Table 4, the fraction contained
triterpene acids (oleanolic and ursolic acids) and fatty
acid (palmitic acid). In this mixture it was possible to
identify two major components: ursolic acid (37.08%,
RT=49.3min) followed by oleanolic acid (16.53%,
RT=46.2min) and one minor component: palmitic acid
(1.18%, RT=19.61min). The mass spectrum obtained for
these compounds showed a molecular ion at m/z 270,
compatible with the molecular formula C
17
H
34
O
2
and in
accordance with the structure of palmitic acid methyl
ester; the molecular ion at m/z 470 corresponding to the
molecular formula C
31
H
50
O
3
and in accordance with the
structure of oleanolic acid methyl ester; the molecular
ion at m/z 470, compatible with the molecular formula
C31H50O3 and in accordance with the structure of
ursolic acid methyl ester (Table 5).
Characterization of the constituents of this fraction
was simplifed by the assignment of the carbon atoms
in the
13
C-NMR. As the chemical shift of a sp2 carbon
atom is very characteristic for each triterpenoid
skeleton,
13
C-NMR spectroscopy is frequently employed
for the structural analysis of triterpene mixtures [36].
To distinguish carbon types (multiplicity), the APT
(attached proton test) was used. The last step of this
mixture resolution before the confrmation by GC/MS
was the comparison of the attributed signals of
13
C-
NMR spectra obtained for the mixture with previously
published data [37].
All the signals obtained in the
13
C-NMR stated
for the presence mainly of two triterpenoid acids:
oleanolic (compound 1) and ursolic acids (compound
2)(Fig. 1). This has been confrmed by GC/MS where
it was also possible to fnd out the identity of a minor
component in the extract: palmitic acid (compound
3)(Fig. 1). Analysis of the
13
C-NMR (50MHz, DMSO-D
6
)
spectrum of oleanolic and ursolic acids and comparison
with literature data showed characteristic signals for
triterpenoids skeleton at (ppm): 177.9 (C-28, C=O,
ursolic acid); 178.4 (C-28, C=O, oleanolic acid); 138.2
(C-13, ursolic acid); 143.5 (C-13, oleanolic acid); 125.1
(C-12, ursolic acid); 122.0 (C-12, oleanolic acid) and
78.6 (C3, CHO ursolic and oleanolic acids) (Table 1).
Methyl ester
of acid
Retention time
(minutes)
% total of area
Oleanolic 46:243 16.53
Ursolic 49:370 37.08
Palmitic 19:608 1.18
Table 4. Data of the chromatographic analysis of the
dichloromethane fraction of L. speciosa.
Molecular Formula Compound name
470 C
31
H
50
O
3
Methyl ester of oleanolic
acid
470 C
31
H
50
O
3
Methyl ester of ursolic
acid
270 C
17
H
34
O
2
Methyl ester of palmitic
acid
Table 5: Results of mass spectrometry; shown here are
the molecular ion, molecular formula and its correspond-
ing methyl ester.
46
Oleanolic and ursolic acids are triterpenes that may
occur as aglycones of saponins and as free acids.
Several studies have reported their occurrence in various
medicinal plant families, specially in the Lamiaceae
family, as well as their important pharmacological
effects [22].
Previous investigations showed signifcant anti-
infammatory effect of ursolic acid isolated from organic
extracts of species belonging to the Lamiaceae family
[17; 20]. The mechanisms of the anti-infammatory effect
of ursolic acid have been attributed to the inhibition of
histamine release from mast cells and to the inhibition
of complementary activity [38; 39].
The ethyl acetate fraction was fractionated by silica gel
column chromatography, yielding an ester of caffeic acid,
rosmarinic acid (compound 4), and a phenylpropanoid
glycoside, verbascoside (compound 5)(Fig. 2). Analysis
of the
1
H-NMR (200MHz, CDCl
3
) spectrum of rosmarinic
acid showed signals at (ppm): 3.02 (m) relative to 7H,
4.3 (m) relative to 8H and two double signals: 6.26 (d)
and 7.52 (d) respecting to hydrogen of double bond (7H
and 8H), with coupling constant of J 16Hz, characteristic
of trans bond (Table 2).
Rosmarinic acid commonly occurs in species of
the Boraginaceae and is restricted to the subfamily
Nepetoideae of the Lamiaceae family. This compound
has several biological activities, such as antiviral,
antioxidant, anti-infammatory, antibacterial and
antimutagen [33].
Analysis of the
1
H-NMR (200MHz, CDCl
3
) spectrum
of verbascoside has shown a caffeic acid and a (3,4-
dihydroxyphenyl)ethyl moieties. The presence of glucose
was verifed through the signal of anomeric hydrogen at
(ppm): 4.44 (1H, d, J 7.8Hz), bonded to phenylethyl
part of molecule under form. It was determined by
coupling constant that indicate a proton axial, because
the coupling constant for form is J 3.5Hz [34]. It was
possible to observe the presence of rhamnose due the
signal of anomeric hydrogen at (ppm): 5.23 (1H, d, J
2.2Hz) and 1.2 (6H, d, J 6.8Hz) relative to methylic
hydrogen of C-6. The signal at (ppm): 4.76 (4H, m) is
characteristic of the substitution with caffeic acid in the
C-4 of glycose. The derivative part of caffeic acid was
evidenced by signals at (ppm): 6.26 (H, d, J 16Hz)
and 7.51 (H, d, J 16Hz), both with coupling constant
of 16Hz, typical of trans hydrogen bonded to carbon of
double bond. The presence of caffeoyl at (ppm): 6.80
(5 H, d, J 1.2Hz,), 6.92 (6H, dd, J 1.2 and 7.6Hz,)
and 7.03 (2H, d, J 1,2Hz,) and phenylethyl at (ppm):
6.60 (5H, sl), 6.65 (6H, d, J 5Hz) and 6.70 (2H, sl) were
confrmed by the presence of two signal groups relative
to hydrogens of aromatic systems with meta, orto-meta
and orto coupling types (Table 3).
Cytotoxicity
LDH assay
The effect of the L. speciosa fractions and extract was
studied in the rat basophilic leukaemia cell culture
(RBL-2H3) and the effect of them on the cell viability
was examined by measuring the cell membrane
integrity through the lactate dehydrogenase released
method (LDH). This is a colorimetric method for the
quantifcation of cell death and lysis, which is based on the
measurement of lactate dehydrogenase (LDH) activity
released from the damaged cells into the supernatant.
All fractions and extract were tested at concentration of
100g/ml. The results were measured as percentages
and compared against a positive control, Triton X-
100 2% solution, and a standard cytotoxic compound,
terfenadine. All the fractions and extract increased
the release of LDH from the cells into the surrounding
culture medium signifcantly, being the release higher
than the one promoted by terfenadine. However, the
strongest effects were observed for FAE and FD with
94.5% and 91.2% of LDH release, respectively, while
the terfenadine showed 66.43% (Fig. 3).
Previous results guided us to test both
dichloromethane and ethyl acetate fractions against
human breast adenocarcinoma cells (MCF-7).
Sulphorhodamine B (SRB) assay
When the human breast adenocarcinoma cells (MCF-
7) were treated for 48h with the Lepechinia speciosa
fractions and extract, the antiproliferative activity was
estimated using sulphorhodamine B (SRB) assay, which
measures the proliferation of cells. The SRB assay
is the second major technique for testing cytotoxicity
Fig.3. The released of LDH from rat basophilic leukemia cells
(RBL-2H3)(2 x 10
6
cell/ml) after 24h of treatment with L. spe-
ciosa fractions and extract (100g/ml). For the positive con-
trol was utilized Triton X-100 solution (2% in assay medium)
and as cytotoxic standard, terfenadine (100mM).
0
20
40
60
80
100
ET
FH
FD
FAE
FB
FAQ
terdenadine
triton x 2%
L
D
H

R
e
l
e
a
s
e

(
%
)
47
and it is based on the uptake of the negatively charged
pink aminoxanthine dye by basic amino acids in the
cell. When the cells are lysed, the released dye gives a
more intense colour and greater absorbance. As shown
in Fig. 4, both fractions showed growth inhibition in a
dose-dependant way, but the dichloromethane fraction,
with higher concentration of triterpene acids, showed
95% of growth inhibition at concentration of 50g/ml
(IC
50
=1.990.06g/ml), although the ethyl acetate
fraction has shown a very good result as well, 85% of
growth inhibition in the maximum tested concentration
(IC
50
= 5.14 0.23g/ml).
Similar to the results obtained for the FD of L.
speciosa, diterpenes isolated from the dichloromethane
fraction of two species of Lamiaceae (Marrubium
cylleneum and Marrubium velutinum) exhibited cytotoxic
effect against human tumour cell lines of breast, cervix,
melanoma and leukemia [15].
The diterpenes obtained from the methanol fraction
of Lepechinia bullata and Glossocarya calcicola also
showed cell inhibition on nasopharyngeal carcinoma,
leukaemia cells, ovarian carcinoma, hepatocyte
carcinoma, prostate adenocarcinoma and gland
adenocarcinoma [12; 16].
These studies indicate that mainly the ethyl
acetate and dichloromethane fractions or substances
isolated from these fractions of plants belonging to the
Lamiaceae family are responsible for the signifcant cell
inhibition in several cancerous cell lines.
The current study provides preliminary data on
cytotoxic activity of Lepechinia speciosa fractions. The
results showed that the dichloromethane and ethyl
acetate fractions possess strong cytotoxic effect on
rat basophilic leukaemia cells (RBL-2H3), therefore,
our study of antiproliferative activity with human
breast adenocarcinoma cells (MCF-7) confrms the
signifcant cytotoxic activity of the dichloromethane and
ethyl acetate fractions. The dichloromethane fraction
predominantly contained a mixture of two triterpene
acids (ursolic and oleanolic acids) besides one fatty
acid (palmitic acid) and the ethyl acetate fraction led
to isolation of an ester of caffeic acid, rosmarinic acid,
and a phenylpropanoid glycoside, verbascoside. The
next focus will be to test the isolated compounds from
these fractions. This information can be helpful when
estimating the benefcial properties of Lepechinia
speciosa fractions or other plant fractions as valuable
medicinal raw plant materials to be used for drug
development.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge CNPq for fnancial
support and Prof Regina Braga de Moura, Faculdade
de Farmcia da Universidade Estcio de S, for
identifcation of the plant material.
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Fig.4. The growth inhibition on human breast adenocarcino-
ma cells (MCF-7)(6.0 x 104) after 48h of treatment with L.
speciosa dichloromethane and ethyl acetate fractions.
0
25
1.0 5.0 10.0 25.0 50.0
50
75
100
Dichloromethane
Ethyl Acetate
H
t
n
o
r

G

o
f

(
%
)
Concentration of the extracts
(ug/ml)
48
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49
ACTIVIDAD HEMATOPOYTICA DE
Amphipterygium adstringens (Cuachalalate)
IN VITRO E IN VIVO
HEMATOPOIETIC ACTIVITY OF
Amphipterygium adstringens (Cuachalalate)
IN VITRO AND IN VIVO
*
1
Rodolfo Velasco-Lezama,
2
Catalina Pliego-Villanueva,
1
Rafaela Tapia-Aguilar, 1Elisa Vega-vila y
1
Rubn Romn-Ramos.
1
Departamento de Ciencias de la Salud. Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud Iztapalapa.
Universidad Autnoma Metropolitana.
2
Licenciatura en Biologa Experimental. Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud-Iztapalapa.
Universidad Autnoma Metropolitana.
Autor para correspondencia: Rodolfo Velasco Lezama
Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autnoma Metropolitana
San Rafael Atlixco 186, Iztapalapa, DF, Mxico 09340
Tel. +55-58046482, Fax. +55-58044727
Correo electrnico: velr@xanum.uam.mx
Resumen
Amphipterygium adstringens (Anacardiaceae) se
emplea contra el cncer, lcera gstrica y la anemia.
Dosis de 40, 20, 10 y 5 mg/mL de los extractos hexnico,
clorofrmico, metanlico y acuoso de la corteza de este
rbol se adicionaron a cultivos mdula sea y de bazo
de ratones sanos. Se administr tambin una dosis del
extracto acuoso por va oral (20, 10, y 5 g/kg) durante
tres das consecutivos a grupos de 10 ratones, 48 horas
despus se les realiz una citometra hemtica. Los
resultados mostraron que en cultivo de mdula sea,
slo el extracto acuoso increment la concentracin
celular. En cultivo de bazo las dosis de 40 y 20 mg/ml
de los extractos acuoso y metanlico incrementaron de
3 a 6 veces la concentracin celular. En los ensayos in
vivo se observaron incrementos en la concentracin de
leucocitos y plaquetas con las dosis de 0.2 y 0.1 g/mL.
El extracto acuoso mostr la presencia de saponinas,
taninos y favonoides.
Palabras clave: Amphipterygium adstringens,
Cuachalalate, hematopoyesis.
Summary
Amphipterygium adstringens (Anacardiaceae) is used
against cancer, gastric ulcer and anaemia. Hexane,
chloroform, methanol and aqueous watery extracts of
the bark of this tree (40, 20, 10 and 5 mg/mL) were
added to cultures of bone marrow and spleen cells
from healthy mice. Also, during three consecutive days
the aqueous extract was orally administered (20, 10,
and 5 g/kg) to groups of 10 mice/each. After 48 hours
a cytometric determination was performed. Results
showed that in bone marrow cells culture only aqueous
extract increased the cell concentration. Doses of 40
and 20 mg/mL of aqueous and metanolic extracts
increased 3 to 6 fold the cell concentration in spleen
cells cultures. In vivo assays, doses of 0.2 and 0.1 g/kg
signifcantly increased the concentration of leukocytes
and platelets. The aqueous extract shown to have
saponins, tannins and favonoids.
Key Words: Amphiperygium adstringens, Cuachalalate,
hematopoiesis.
50
Introduccin
Las clulas sanguneas se originan a partir de una
clula precursora comn de la mdula sea llamada
clula tallo (stem cell, denominacin en ingls), con
capacidad de autorreplicacin y de diferenciacin hacia
las lneas linfoide y mieloide de la sangre. Este proceso
es dinmico y complejo para mantener constante la
concentracin de dichas clulas a lo largo de la vida
del individuo, debido a la vida media relativamente
corta de las clulas sanguneas estas requieren de
renovacin continua, (Orkin, 2000).
La hematopoyesis puede ser modifcada por
agentes fsicos, qumicos o infecciosos, provocando
alteraciones graves de la proliferacin de la mdula
sea como la anemia aplstica (AA), que se
manifesta como pancitopenia (baja generalizada
de clulas sanguneas). La AA provoca en los
enfermos infecciones, cncer o sangrados graves que
frecuentemente causan la muerte a la mayora de los
adultos que la padecen (Brodsky, 2005).
El tratamiento ms exitoso en la medicina moderna
para esta patologa es el transplante de mdula sea
(Brunstein, 2006). Sin embargo, debido a su costo elevado
es inaccesible para la gran mayora de los pacientes de
pases en desarrollo, quienes utilizan como alternativa
teraputica plantas con propiedades medicinales,
que supone un tratamiento de bajo costo econmico,
respaldado por el conocimiento y la tradicin popular.
Para el presente trabajo se seleccion a Amphipterygium
adstringens por ser una planta frecuentemente citada
para el tratamiento de sta y de otros tipos de anemia
refractarios a los tratamientos establecidos en la
medicina moderna (Aguilar, 1998, NAPRALERT, 2006).
Amphipterygium adstringens es un rbol endmico de
Mxico que alcanza hasta los 10 metros de altura, habita
en clima clido, semiclido y templado. En nuestro pas
se le encuentra en los estados de Puebla, Oaxaca,
Jalisco, Morelos y Michoacn (Martnez, 1967). Este
rbol de la familia Anacardiacea se conoce popularmente
como cuachalalate, cuachal, volador, entre otros. La
corteza del rbol es utilizada desde la poca colonial
para deshacer tumores (Baytelman, 1993). En nuestros
das la corteza se emplea para endurecer las encas y
el polvo se aplica de manera local para curar heridas,
hemorroides y llagas. La decoccin de la corteza es
tomada como agua de uso contra la lcera gstrica,
cncer gastrointestinal, tifoidea y contra diversos tipos
de anemia (Argueta, 1994). Experimentalmente se ha
demostrado que el extracto metanlico de la corteza tiene
actividad antitumoral en ratones con adenocarcinoma
mamario (Gonzlez, 1962), es protector gstrico y
antiulcerognico (Navarrete, 2005).
Se ha reportado que la corteza tiene triterpenos
(Domnguez, 1985), aldehdos y cidos anacrdicos
(Mata, 1993; Aguilar, 2003). Pese al uso frecuente
de esta planta contra la anemia, no existen estudios
cientfcos in vitro o in vivo que apoyen las propiedades
hematopoyticas de Amphiterygium adstringens
El propsito del presente estudio es determinar
si los extractos de la corteza de Amphiterygium
adstringens estimulan la proliferacin de las clulas
hematopoyticas de ratn in vitro e in vivo.

Materiales y mtodos
Material Vegetal
La planta fue colectada en Yautepec, Morelos, Mxico
en febrero de 2006. El material fue identifcado por el
Dr. Jorge Santana del Herbario Ramn Riba de la
Universidad Autnoma Metropolitana.
Animales de Experimentacin
Se utilizaron ratones macho CD1 de 8 a 12 semanas de
edad proporcionados por el bioterio de la Universidad
Autnoma Metropolitana Iztapalapa, mantenidos a
temperatura promedio de 24C con periodos alternados
de luz y oscuridad de 12 h, con ingesta libre de agua
y alimento, de acuerdo con los Estatutos del CICUAL
(Comit Institucional para el Uso y Cuidado de los
Animales de Laboratorio) de la Norma Ofcial Mexicana,
para la produccin y mantenimiento de animales de
laboratorio NOM-062-200-1999.
Preparacin de los extractos
La corteza de la planta se dej secar a temperatura
ambiente protegida de la luz solar directa y del polvo, se
moli manualmente (Victoria, Colombia). Se colocaron
500 g del polvo de la planta en 3 litros de hexano,
cloroformo, metanol (JT Baker, USA) o agua. En cada
disolvente se calent a refujo durante tres horas,
despus se fltr con papel Whatman del No. 42. Los
disolventes orgnicos se eliminaron en un evaporador
rotatorio a presin reducida (Bchi, Switzerland). En
el caso del extracto acuoso, el agua se elimin por
lioflizacin (Labconco, USA).
Preparacin de las diluciones de los extractos de
prueba
Los extractos acuoso y metanlico se disolvieron en
medio mnimo esencial (MEM) complementado con
10% de suero de caballo inactivado. Los extractos
clorofrmico y hexnico se disolvieron con suero de
caballo y se prepararon disoluciones de 0.4, 0.2, 0.1,
0.05 g/mL, las cuales se esterilizaron por fltracin en
51
membranas Millipore de 0.45 y 0.22 m, se verifc la
esterilidad en caldo de infusin de cerebro-corazn
(BHI).
Ensayos in vitro
Cultivo de mdula sea de ratn
Se sacrifc un ratn macho CD
1
de 8-12 semanas
de edad por dislocacin cervical, el fmur se separ
en condiciones de esterilidad y se inyect a travs
del canal medular 1 ml de medio de Leibovitz L-15-
(Gibco-BRL, USA), complementado con 10% de suero
de caballo (In Vitro, Mex.). La suspensin celular se
homogeneiz mediante pipeteo y se llenaron pipetas de
Thomas hasta la marca de 0.5 y se llev hasta la marca
de 11 con solucin de Turk (dilucin 1:20), se contaron
las clulas nucleadas en un hemocitmetro (Boeco,
Germany) mediante microscopia de luz en campo claro.
Adems, se determin la viabilidad celular con azul de
tripano al 0.4% (Vives, 1997). La suspensin celular
se ajust a 4.0 X 105 clulas viables/mL con solucin
salina fsiolgica (SSF) y 0.1 ml de esta suspensin se
adicion a una mezcla de 0.6 ml de medio de Leibovitz,
0.2 ml de suero de caballo y 0.1 ml del extracto de prueba
(concentracin fnal de los extractos en los cultivos (40,
20, 10 y 5 mg/mL). Posteriormente, 0.5 ml de la mezcla
anterior se depositaron en placas multipozos (Nunc) de
132 X 88 mm e incubaron durante tres das a 37oC en
una incubadora con humedad relativa de 90% y 5%
de CO2, las clulas se cosecharon y contaron en un
hemocitmetro por microscopia de luz en campo claro
(Jackson, 1990).
Cultivo de bazo de ratn
Un ratn macho CD
1
de 8-12 semanas de edad se
sacrifc por dislocacin cervical, se extrajo el bazo en
condiciones de esterilidad, se disgreg mecnicamente
sobre una malla metlica y se lav con medio mnimo
esencial (Alfa-MEM) fro y con pH 6.8 y 290 mOsm, las
clulas se recibieron en un tubo de plstico de 15 x 100
mm y se centrifugaron dos veces a 2500 rpm durante
15 minutos.
El botn celular se resuspendi en 10 ml de medio
Alfa-MOPS y se centrifug nuevamente a 2500 rpm
durante 15 minutos. Finalmente, el botn celular se
resuspendi en 5 ml de medio alfa-MEM, se determin
la viabilidad con azul de tripano al 0.4%, se ajust la
concentracin celular con medio alfa-MEM a 4.0 X
10
5
clulas viables/mL y 0.1 ml de esta suspensin se
adicion a un sistema de cultivo con 0.6 ml de medio
alfa-MEM, 0.2 ml de suero de caballo y 0.1 ml del
extracto de prueba (concentracin fnal de los extractos
40 y 20 mg/mL). Se colocaron 0.5 ml de la mezcla
anterior en placas multipozos Nunc de 132 X 88 mm
y se incubaron 48 horas a 37oC con humedad relativa
de 90% y 5% de CO
2
(Nakeff, 1981). Las clulas se
recuperaron con pipeta Pasteur y se contaron en un
hemocitmetro por microscopia de luz en campo claro
(Vives, 1997). En todos los casos se incluyeron cultivos
testigos libres de extracto, cada ensayo se realiz al
menos cinco veces. La cuenta celular de los cultivos
testigos se consider como el 100% de proliferacin y
contra ellos se compararon los cultivos de prueba. Los
resultados se expresan como la media de la cuenta
celular error estndar. La comparacin entre los
grupos fue realizada usando el anlisis de varianza
(ANOVA) y la prueba LSD de Fischer. Un valor de p
<0.05 fue considerado estadsticamente signifcativo.
Evaluacin de la actividad hematopoytica de las
plantas in vivo
Se emplearon ratones macho CD
1
de 8-12 semanas
mantenidos con ingesta libre de agua y alimento hasta
8 horas antes de la administracin oro-esofgica de una
dosis diaria durante tres das consecutivos de 40, 20 y
10 g//kg del extracto acuoso disuelto en solucin salina
fsiolgica (SSF). Cada dosis se administr a grupos
de 10 ratones. Se utiliz un grupo testigo de 10 ratones
que recibi slo SSF. Cuarenta y ocho horas despus
de la ltima dosis todos los ratones se anestesiaron con
ter y se sangraron por puncin cardiaca. La sangre se
colect en tubos con EDTA al 0.1% y se les realiz una
citometra hemtica.
Anlisis ftoqumico preliminar
Despus de los bioensayos se realiz un estudio
ftoqumico preliminar del extracto acuoso para conocer
las familias de compuestos qumicos que se encuentran
en el extracto mediante la formacin de complejos
coloridos o formacin de precipitado (Alarcn-Aguilar,
2006).
Saponinas
Se coloc una porcin del extracto en un tubo de ensaye
y se disolvi en agua destilada. La solucin obtenida
se agit vigorosamente y se form espuma de ms
de 1.0 cm, la que permaneci por ms de 10 minutos
(Alarcn-Aguilar et al, 2006). Posteriormente se realiz
la prueba de Rosenthaler (Domnguez, 1985) para lo
cual se coloc en dos tubos de ensaye 0.5 ml de la
disolucin y se le adicion a uno de ellos 0.1 ml de
una solucin de vainillina al 0.1% y 2 gotas de H
2
SO
4
.
La formacin de un color violeta indica la presencia de
saponinas terpnicas.
52
Taninos
Se disolvi una porcin del extracto en 10 ml de cloruro
de sodio al 0.85 % y despus se fltr. Se colocaron
alcuotas de 4 ml en dos tubos de ensaye. Al tubo 1 se
le adicion 0.2 ml de una solucin de gelatina al 1.0%
en cloruro de sodio 0.85% (Martnez-Vzquez et al,
1999). Al tubo se le adicion 0.2 ml de una solucin de
cloruro frrico al 1.0% en cido clorhdrico concentrado.
La formacin de precipitado en el tubo 1 indica la
presencia de taninos. La formacin de un complejo
soluble de color verde (tubo 2) indica la presencia de
taninos condensados.
Flavonoides
Se disolvi una porcin de extracto en etanol y
posteriormente se fltr. Se coloc en un tubo de
ensaye una alcuota de 4.0 ml de esta solucin, 0.2
ml de cido clorhdrico concentrado y unas virutas de
magnesio (Martnez-Vzquez et al, 1999). La formacin
de un complejo soluble de color anaranjada, roja, roja
azulosa o violeta indica la presencia de favonas,
favononas, favonoles, favononoles o xantonas
(prueba de Shinoda). En un segundo tubo se coloc
una porcin del extracto y se solubiliz con cido
sulfrico concentrado. La formacin de un complejo
soluble de color amarillo indica la presencia de favonas
y favonoles (Domnguez, 1985).
Resultados
De cada 500 g del material pulverizado se obtuvieron
48, 22, 12 y 1 g de los extractos acuoso, metanlico,
clorofrmico y hexnico, respectivamente, lo que
representa un rendimiento de 9.6, 4.4, 2.4 y 0.2%. En
el anlisis ftoqumico del extracto acuoso de detect
la presencia de saponinas triterpenoides, taninos
condensados y favonas/favonoles (favonoides).
Actividad hematopoytica de Amphipterygium
adstringens in vitro
En los cultivos de mdula sea slo el extracto acuoso
estimul la proliferacin celular causando incrementos de
2.3, 1.7, 3.1 y 2.9 veces en la cuenta de clulas a las dosis
de 40, 20, 10 y 0.05 mg/mL, respectivamente (Figuras 1
y 2). En todos los casos los incrementos en el nmero de
clulas fueron estadsticamente signifcativos (p<0.025).
Respecto al cultivo de clulas de bazo, los extractos
acuoso y metanlico estimularon la proliferacin celular
a las dosis de 40 y 20 mg/mL (Figura 3). Con la dosis
de 40 mg/mL el extracto acuoso increment 5.8 veces
la cuenta celular. Sin embargo, el extracto metanlico
mostr menor efecto estimulante (2.26 incrementos),
mientras que con la dosis de 20 mg/mL. La actividad
hematopoytica de ambos extractos fue similar.
Figura 1. Actividad hematopoytica de los extractos acuoso
y metanlico de A. adstringens en cultivo de mdula. Media
Error estndar, (n=10).
0
5 Testigo
20
20 40
10
10
40
30
60
50
80
70
Extracto Acuoso
Extracto Metanlico
Solucin Salina Fisiolgica
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
5 Testigo 20 40 10
Extracto Clorofrmico Extracto Hexnico Solucin Salina
0
5
Testigo
20
25
0.4 g/mL 0.2 g/mL
10
15
40
45
30
35
Extracto Acuoso Extracto Metanlico
Solucin Salina Fisiolgica
Figura 2. Actividad hematopoytica de los extractos cloro-
frmico y hexnico de A. adstringens en cultivo de mdula
sea.
Figura 3. Actividad hematopoytica de los extractos acuoso
y metanlico de A. adstringens en cultivo de clulas de bazo
de ratn.
Clulas X 10
4
/mL
* *
* * * *
*
Clulas X 10
4
/mL
Clulas X 10
4
/mL
*
*
*
*
mg/mL de extracto
53
Actividad hematopoytica de Amphipterygium
adstringens in vivo
Los ratones inoculados con el extracto acuoso de A.
adstringens no presentaron variacin en la concentracin
de eritrocitos o en los parmetros eritroides valorados
(Cuadro 1). Sin embargo, con las dosis de 40 y 20 g/kg
de peso corporal se increment de manera signifcativa
la cuenta de leucocitos y de plaquetas con respecto
al grupo testigo o al grupo tratado con las dosis de 10
g/kg (Cuadro 1).
Los resultados son expresados como la media
+ error estndar. La comparacin entre los grupos
se realiz con el anlisis de varianza (ANOVA) y la
prueba LSD de Fisher R:RAO. Valores p<0.05 fueron
considerados estadsticamente signifcativos.
Discusin
En los resultados de los anlisis ftoqumicos de
la planta se han reportado la presencia de varios
ismeros del cido masticadienico, los cidos
instipolincico, cuachallico y alquianacrdicos.
(Olivera, 1999). Adems, se han aislado -sitosterol y
una saponina (Soriano, 1987; Aguilar, 2003). Los cidos
instipolincico y cuachallico se han relacionado con
la actividad antiulcerosa e hipocolesterolemiante de la
planta (Domnguez, 1985; Lara, 1996).
Considerando que se trabaj con extractos crudos
no es posible atribuir a algn compuesto o grupo
de compuestos la actividad hematopoytica de la
mayora de los extractos in vitro. Sin embargo, al
revisar la composicin qumica reportada y nuestro
anlisis ftoqumico, las saponinas se encuentran como
componentes constantes de la planta (Watson, 1987,
Navarrete, 1989).
Es conocido que las saponinas esteroidales o
triterpnicas son solubles en agua, metanol y otros
disolventes polares y como lo muestra el anlisis
ftoqumico, las segundas estn presentes en los
extractos acuoso y metanlico evaluados en este
estudio. As, el efecto hematopoytico de nuestros
extractos podra atribuirse a compuestos perteneciente
a estas familias qumicas, las cuales podran actuar
al menos por dos mecanismos. Uno de ellos, por
interaccin entre las saponinas y la membrana celular
que causa cambios transitorios en la estructura
de la membrana, cuyos efectos dependen de la
concentracin y de la estructura de la saponina. Sin
embargo, la interaccin especfca entre las saponinas
y la membrana celular an se desconoce (Walthelm,
2001). Melzing y colaboradores (2001) adicionaron
diferentes saponinas comerciales a cultivos de clulas
endoteliales y demostraron la acidifcacin celular
expresada como hidrlisis de ATP, liberacin de los
productos de la gluclisis incluyendo cido lctico
y concluyeron que el componente carbohidrato de
la saponina desempea un papel relevante en la
interaccin saponina-membrana. Este autor considera
que las saponinas que interaccionan con colesterol
y con otros componentes de la membrana deben
tener una estructura especfca. En tanto que Mimaki
y colaboradores (1996) mencionan que el efecto de
las saponinas sobre la proliferacin celular se debe
a la creacin de canales que permiten el trnsito a
diferentes compuestos los cuales estimulan o inhiben la
proliferacin celular y que la capacidad de las saponinas
para inhibir el crecimiento de clulas transformadas
(citotoxicidad) o estimular a la proliferacin de clulas
no transformadas no depende slo de la clase de
sapogenina (saponina sin carbohidrato), si no ms bien
del residuo carbohidrato que llevan.
Cuadro 1. Actividad hematopoytica del extracto acuoso de Amphipterygium adstringens in vivo
Dosis
g/kg
Eritrocitos
X10
12
/L
Hematcrito
(%)
Reticulocitos
(%)
Leucocitos
X10
9
/L
Plaquetas
X10
12
/L
0.40 11.9 0.8 45 4 0.59 0.12 *19 3 *1.9 0.03
0.20 12.4 0.4 54 6 0.60 0.15 *18 2 *1.7 0.32
0.10 12.2 0.6 48 8 0.47 0.05 10 2 1.6 0.20
Control 13.8 0.4 56 8 0.58 0.13 12 4 1.5 0.21
Media error estndar, (n=8). *p<0.05 respecto al grupo testigo.
54
En apoyo al papel de las saponinas para reconocer
los receptores membranales y actuar como mitgenos
est el hecho de que un extracto de Phytolacca
americana que contiene saponinas triterpnicas es
usado para estimular la proliferacin de linfocitos en
la produccin de interfern, factores de crecimiento
hematopoytico y citocinas (Sparg, 2004).
En los cultivos de mdula sea la cuenta de clulas
present en promedio un incremento de 2.5 veces con
el extracto acuoso, mientras que en los cultivos de
bazo fue de 5.0 veces. En los cultivos testigos tambin
se observ diferencia entre la mdula sea y el bazo, la
primera increment su poblacin 1.7 veces respecto a
la concentracin inicial, mientras que en el bazo, dicho
incremento fue de 4.1 veces. Estos resultados muestran
que las condiciones para el desarrollo de ambos tipos
de clulas fueron adecuadas, ya que an en ausencia
de los extractos pudieron multiplicarse, pero lo hicieron
con mayor intensidad en presencia de stos.
Por otra parte, los ensayos in vivo con el extracto
acuoso slo incrementaron la concentracin absoluta
de leucocitos y plaquetas, lo cual podra deberse a que
el extracto fue administrado por va oral y as expuesto
al ataque de enzimas de la saliva, del tracto digestivo
o plasma sanguneo causando la prdida de actividad
hematopoytica (Murray, 2001).
La capacidad de A. adstringens para estimular la
proliferacin de linfocitos como lo reportamos aqu,
sugiere una actividad inmunolgica de la planta, aunque
el papel como inmunoestimulante es desconocido.
Nuestros resultados in vivo pueden explicar el uso
etnomdico de esta planta en el tratamiento de las
hipoplasias medulares, particularmente las que
provocan leucopenia o trombocitopenia, ya que las
dosis de 40 y 20 g/kg estimulan la produccin de
leucocitos y de plaquetas, Cuadro 1.
Aunque la concentracin de eritrocitos no se
modifca, se observa disminucin en el hematcrito,
lo que se interpreta como disminucin en el volumen
celular, dando origen a microcitos, lo que concuerda
con la actividad hemoltica de las saponinas (Apers,
2001), misma que no fue total por el tipo de saponinas
que se encuentran o las dosis empleadas.
En el presente trabajo, los extractos acuoso y
metanlico estimularon la proliferacin in vitro de las
clulas del bazo de ratones sanos, el 80% de esta
poblacin son linfocitos T y B. Este resultado abre
un campo de estudio acerca de los posibles efectos
inmunoestimulantes an no descritos para esta planta.
El presente estudio respalda el conocimiento y uso
popular de esta planta contra la anemia y constituye un
recurso teraputico de bajo costo, que se encuentra en el
entorno de los pacientes y cuyo uso podra contrarrestar
la leucopenia, trombocitopenia e hipoplasia medular.
Adems de profundizar en el conocimiento de uno de
los recursos vegetales con los que cuenta el pas.
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,
2
, Rubn Romn-Ramos
3
, Enrique Jimnez-Ferrer
2
, Jaime Tortoriello-Garca
2
.
1
Doctorado en Ciencias Biolgicas, Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud. Universidad Autnoma Metropolitana,
Mxico, DF
2
Centro de Investigacin Biomdica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social. Argentina 1, Xochitepec,
Morelos, Mxico.
3
Departamento de Ciencias Biolgicas, Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud.
Universidad Autnoma Metropolitana - Iztapalapa, DF, Mxico
Autora para correspondencia: Ofelia Romero Cerecero
Centro de Investigacin Biomdica del Sur, IMSS, Argentina 1, Xochitepec, Morelos, Mxico
62790. Telfono: +777 3612155; Fax: +777 3612194
Direccin electrnica: orcerecero@yahoo.com.mx
Resumen
Las plantas medicinales representan una importante
fuente potencial para el aislamiento de nuevos agentes
antiinfecciosos. En Mxico, diversas plantas son em-
pleadas en el tratamiento de enfermedades cutneas de
origen mictico. La investigacin de plantas con activi-
dad antifngica recorre un camino desde los estudios et-
nobotnicos hasta investigaciones de laboratorio y clni-
cas. En el presente trabajo se revisan diversos estudios
que emplearon tcnicas bien establecidas de validacin
de la actividad antifngica como i) la difusin en agar,
ii) dilucin y iii) bioautografa. Se analiz la informacin
disponible en revistas indizadas publicadas durante el
periodo 1992 al 2008. Los resultados mostraron que se
ha encontrado actividad antifngica en 251 especies
vegetales. Las especies estudiadas se clasifcaron en
dos grupos, el primero con actividad antifngica grande
y el segundo con actividad moderada. Se identifcaron
numerosas plantas con actividad antifngica, algunas
de las cuales no tienen antecedentes de utilizacin tera-
putica en la comunidad. En la mayor parte de los casos
se requieren estudios adicionales para poder utilizar de
manera teraputica estas plantas.
Palabras clave: actividad antifngica, plantas medici-
nales, actividad antimicrobiana.
Abstract
The medicinal plants represent an important potential
resource for the isolation of new antiinfective drugs. In
Mxico, a variety of medicinal plants are employed for
the treatment of cutaneous illnesses elicited by fungi.
The investigation of plants with antifungal activity be-
gins with ethnobotanical studies and move along re-
search in laboratory and clinical settings. The aim of
this study was to search scientifc literature validating
the antifungical activity of medicinal plants through
techniques such as i) agar diffusion, ii) dilution and iii)
bioautography. For this purpose, information available
in indexed journals published in the period 1992 2008
was analyzed. Results showed 251 species has been
found to hold antifungal activity. The species studied
were classifed in two groups, the frst one with large
antifungal activity and the second with moderate activ-
ity. Numerous plants with antifungal activity do not have
antecedents of therapeutic utilization in the community.
In most of the cases additional studies are required
before making feasible the clinical utilization of these
medicinal plants.
Key words: Antifungal activity, medicinal plants, anti-
microbial activity
58
Introduccin
Debido al frecuente desarrollo de resistencia a los me-
dicamentos convencionales que producen los agentes
patgenos causantes de infecciones humanas, las
plantas representan un fuerte potencial en el descu-
brimiento de nuevos agentes antiinfecciosos (Ojala et
al., 2000). En algunas regiones la importancia de las
plantas medicinales es an mayor debido a que las es-
pecies medicinales no slo son empleadas dentro de
la medicina herbolaria, si no que en algunos pases las
incluyen dentro de su sistema formal de salud (Valsa-
raj et al., 1997). Las plantas medicinales son utilizadas
para el tratamiento de un variado nmero de padeci-
mientos, sin embargo las infecciones en la piel son de
los padecimientos que con mayor frecuencia son trata-
dos con plantas. En el estado de Chiapas de Mxico se
identifcaron 249 especies que son utilizadas en forma
emprica para tratar enfermedades de la piel, as como
tambin se evidenci que la mazamorra, como se co-
noce popularmente a la tia de los pies (padecimiento
producido por hongos), se encuentra dentro de los diez
padecimientos dermatolgicos ms frecuentes (Zurita,
Zolla., 1986).
Para la realizacin de investigaciones cientfcas
que aborden el estudio de especies vegetales con
propiedades antifngicas se siguen las mismas
estrategias que normalmente se utilizan para buscar
otras propiedades teraputicas. La investigacin
se basa en estudios previos como son: a) el estudio
documentado inicial etnobotnico de la fora medicinal;
b) la evaluacin etnofarmacolgica preliminar
utilizando la informacin publicada sobre la ftoqumica
y la farmacologa. Una vez teniendo los antecedentes
bsicos, se contina con los pasos siguientes: 1) rastreo
en el laboratorio de las propiedades microbiolgicas
de las plantas, 2) estudio ftoqumico de las plantas
con mayor actividad y, fnalmente, 3) la evaluacin
farmacolgica y toxicolgica de la planta (Heinrich
et al., 1992). En la mayora de los casos se toma el
antecedente de reportes de investigaciones previas
de la especie de inters y se contina con modelos
farmacolgicos establecidos y estandarizados con
los que es factible evaluar, y en su caso demostrar, la
actividad biolgica atribuida (Grosvenor et al., 1995).
Es importante seguir esta secuencia debido a que en la
mayora de los pases que cuentan con una medicina
tradicional, existe un amplio trabajo etnobotnico en los
que se da cuenta de un nmero importante de especies
vegetales de inters y que no han sido estudiadas en
forma sistemtica (Marston et al., 1993). Otra razn
que justifca el estudio de las plantas medicinales es la
variabilidad de los compuestos dentro de los rganos
que conforman una planta. Se ha demostrado que la
parte til de la planta identifcada por la etnobotnica
puede variar, por lo que es importante considerar la
fuente de la informacin, las condiciones geoclimticas
y la poca del ao en que se realiza la colecta. Por esta
razn, algunos cientfcos optan por evaluar diferentes
partes de una misma planta y utilizan para su extraccin
disolventes de diferente polaridad (Cceres et al.,
1993). Es importante sealar que no siempre se sigue
un criterio basado en la etnomedicina y que en algunas
ocasiones, especialmente en aqullas en las que
existen metodologas farmacolgicas para realizar un
rastreo sistemtico como el caso de la microbiologa,
se hacen tamizajes con pruebas antifngicas con la
fnalidad de identifcar actividad en una variedad de
plantas, que incluso pueden pertenecer a diferentes
gneros o familias (Vlietinck et al., 1995). Dentro de
las especies vegetales se encuentran algunas que son
utilizadas con mayor frecuencia para tratar otro tipo de
padecimientos de naturaleza infecciosa y, una vez que
se identifca su actividad antibacteriana, se intensifca
su estudio y se incluye la evaluacin de actividad
antifngica (Baba-Moussa et al., 1999).
En ocasiones los resultados no son muy alentadores
debido a que a pesar de haber realizado una adecuada
seleccin de la planta basada en un criterio etnobotnico,
incluso a travs de la extraccin utilizando diferentes
disolventes, los resultados de la evaluacin antifngica
no demuestran este tipo de actividad. Algunos autores
reportan que este evento se da en una baja proporcin
de plantas (Desta, 1993; Khafagi, Dewedar., 2000;
Armes et al., 2002) y, otros sostienen que la proporcin
es muy alta (Cos et al., 2002).
Existen factores que pueden infuir en el resultado
que se obtiene al evaluar la actividad antifngica de una
planta, es importante tener en consideracin algunos
aspectos como la forma de extraccin, considerando
el tiempo, el nmero de veces que se realiza y la
temperatura. Son aspectos capaces de modifcar
la capacidad inhibitoria del crecimiento microbiano
de un extracto vegetal y son capaces de producir
discrepancias entre resultados obtenidos por diferentes
autores con la misma planta (Masika y Afolayan, 2002;
Somchit et al., 2003).
El estudio cientfco de las plantas en ocasiones tiene
como objetivo proveer de informacin til sobre sus
cualidades teraputicas, especialmente, a poblaciones
alejadas o marginadas en las que no existen otras
formas de atencin a la salud (Taylor et al., 1995;
Taylor et al., 1996). Es por esta razn necesario que
los pases en donde se cuenta con diversidad vegetal,
la documentacin de plantas medicinales sea tratada
como materia de extrema importancia (Srinivasan et al.,
59
2001). Algunos autores promueven adems, que otros
pases, en donde se cuenta con recursos econmicos
sufcientes, se realicen los estudios de las plantas y se
compruebe la actividad que se les atribuye (Locher et
al., 1995; Al-Fatimi et al., 2007). Esto, con el fn de que
una vez demostrada su actividad antifngica puedan
proporcionar informacin valiosa para el avance en el
desarrollo de nuevos agentes antifngicos o contribuyan
con la estandarizacin de los ftomedicamentos (Jones
et al., 2000). Es importante mencionar que para algunos
cientfcos el estudio de las especies con propiedades
antifngicas, no slo se realiza con la fnalidad de
proveer nuevas sustancias con aplicacin clnica, si no
adems, para despertar el inters hacia la investigacin
de la etnobotnica y la etnofarmacologa (McCutcheon
et al., 1994).
El estudio de las plantas en preparados no
industrializados, en algunos casos ha experimentado
un interesante avance, se han identifcado trabajos en
los que, con la fnalidad de establecer un tiempo de
caducidad del material vegetal obtenido de una especie
en particular, se han realizado pruebas con plantas que
han sido almacenadas por largos periodos (Griggs et
al., 2001).
A travs de la ftoqumica se ha demostrado que las
plantas tienen una cantidad importante de metabolitos
denominados secundarios. Estos compuestos que no
forman parte estructural de la planta, y que la planta los
produce como herramientas de subsistencia, forman
un reservorio de compuestos orgnicos formados
principalmente de molculas de bajo peso molecular
que suelen tener efectos sobre las funciones biolgicas y
pudieran ser el origen de productos farmacuticos (Lentz
et al., 1998). Estos compuestos estn representados
por grupos como los favonoides, terpenos, saponinas,
compuestos sulfurados, antocianinas y otros glucsidos
fenlicos (Quiroga et al., 2001). Adems de los
productos del metabolismo secundario, se han aislado
diversas protenas, pptidos y lactosas insaturadas con
actividad antifngica, que pudieran ser desarrollados
en respuesta a un complicado mecanismo de defensa
contra hongos ftopatgenos (Dahot., 1999).
En todo el material bibliogrfco que se revis se
emplearon tcnicas ya establecidas y ampliamente
validadas para buscar la actividad antifngica en una
planta como son:
A] Difusin en agar: consiste en aadir una cantidad
conocida del extracto vegetal en el en un reservorio
formado en el medio de cultivo slido, que entonces
se pone en contacto con el microorganismo inoculado
pudiendo inhibir su crecimiento y formando un halo de
inhibicin que puede ser cuantifcado.
B] Dilucin: en este caso, el extracto vegetal se mezcla
en el medio de cultivo apropiado y posteriormente, una
vez solidifcado se siembra el microorganismo. Con esta
tcnica es posible determinar la concentracin mnima
inhibitoria (CMI), que es la concentracin ms baja que
inhibe el desarrollo visible del microorganismo.
C] Bioautografa: tcnica moderna que combina la
cromatografa en placa fna y la microbiologa. En este
caso se cultiva en un medio apropiado y sobre la placa
cromatogrfca desarrollada, un microorganismo y se
identifca la inhibicin de crecimiento que se produce
sobre determinado grupo de compuestos separados
identifcables en la cromatografa (Marston et al., 1993;
Vlietinck et al., 1995; Lentz et al., 1998; Duraipandiyan
et al., 2207).
En algunos estudios se combin la bioautografa
con cualquiera de las otras dos tcnicas.
Fuente de informacin
Los datos que se reportan fueron tomados de revistas
indizadas con difusin mundial y que revisan especial-
mente aspectos de etnomedicina. El periodo de anli-
sis comprendi del ao 1992 al 2008.
Resultados
En el anlisis realizado se encontr un total de 251
especies vegetales que presentaron actividad antifn-
gica. Los estudios se realizaron en su mayora en fri-
ca, Asia, Norteamrica (Canad, Estados Unidos de
Amrica y Mxico) y Sudamrica. En esta revisin se
reportan nicamente las plantas que de acuerdo al m-
todo de difusin en agar (20 mm de halo de inhibicin o
ms), dilucin (CMI 100 g/ml o menos) o bioautografa,
mostraron una importante inhibicin en el crecimiento
de cepas de dermatoftos que correspondieron a cual-
quiera de los tres gneros: Trichophyton, Microsporum
y Epidermophyton (Arenas, 1993; Amado, 2001), asi
como de levaduras como Candida spp. La descripcin
de estas especies puede ser consultada en el Anexo 1.
Sin embargo, otras especies que presentaron actividad
moderada (por el mtodo de difusin en agar 15 mm
de halo de inhibicin, dilucin (CMI > de 100 g/ml sin
llegar a 500 g/ml, bioautografa), se describen en el
Anexo 2.
Dentro de este nmero de plantas activas se
identifcaron especies con efcacia antifngica
demostrada en ms de una ocasin y fueron: Artemisia
ludovisiana, Anemona obtusiloba, Corydalis longipides,
Didymocarpus primulifolius, Drymaria diandra,
Elephantopus scaber, Elsholtzia blanda, Elsholtzia
60
fava, Hypericum aledoides, Lygodium japonicum,
Macaranga pustulata, Maesa macophyla, Micromeria
bifora, Pavetta ternifolia, Pogostemon benhgalensis,
Sibbadlismicropetala (todas presentaron actividad
moderada) y Lantana trifolia con actividad antifngica
leve. De este grupo de plantas, ninguna cuenta con el
antecedente etnomdico como antifngico.
Discusin
En el mundo se considera que la incidencia de der-
matomicosis (micosis superfciales) es alta, particular-
mente en pases como Mxico, donde constituye entre
el 70 y el 80% de las enfermedades producidas por
hongos. A pesar de lo anterior, son padecimientos a los
que se les otorga poca importancia clnica y terapu-
tica; razn primordial que promueve la evolucin del
cuadro patolgico a estadios graves en los cuales las
lesiones llegan a resultar incapacitantes y, consecuen-
temente, a disminuir la calidad de vida de las personas
que lo padecen (Lpez Martnez et al., 2000; Amado,
2001; Arenas, 2002; Ruiz, et al 2003).
Los primeros tratamientos que se utilizaron
para las dermatomicosis datan del siglo XIX, pero
estuvieron basados en compuestos poco efcaces y no
especfcos. En el siglo XX, en el ao 1944 apareci el
primer medicamento antimictico de sntesis derivado
de los imidazoles y en 1958 apareci la griseofulvina.
A partir de entonces surgi un nmero importante de
medicamentos, siendo los productos de administracin
tpica los ms empleados. Pero a pesar de esto, los
padecimientos dermatolgicos producidos por hongos,
an en estos das, siguen teniendo una presencia
importante y universal debido a la rapidez con la
que los microorganismos desarrollan resistencia a
los medicamentos o al aumento de personas con
inmunosupresin (Snchez et al., 1999; Molina et al.,
2000; Del Palacio et al., 2002). Estos antecedentes,
aunados al renovado inters por las plantas medicinales,
son los que motivan a los cientfcos a realizar el rastreo
de numerosas plantas con la fnalidad de identifcar las
propiedades antifngicas en ellas.
A travs de esta revisin se identifcaron numerosas
plantas que han sido incluidas en procedimientos
experimentales orientados a explorar dicha actividad,
especies, que independientemente de tener el
antecedente emprico de ser utilizado en padecimientos
de la piel producidos por hongos, fueron sometidas
a rastreos utilizando diferentes extractos, partes de
la planta y tambin diferentes cepas de hongos. Es
importante destacar que de las especies estudiadas,
aproximadamente la mitad tuvieron actividad antifngica,
de las cuales, el 47.8% present pobre actividad, 38.2%
moderada y el 13.9% muy buena. En este anlisis
se identifc una proporcin baja de especies que
pueden contribuir al desarrollo de productos tiles para
el tratamiento de las enfermedades producidas por
hongos. Sin embargo, hay que sealar que no todas
las plantas estudiadas fueron seleccionadas a partir de
su uso mdico tradicional. En los procedimientos de
rastreo farmacolgico se utilizan 3 diferentes criterios
para seleccionar las plantas que ser incluidas: 1)
el aleatorio donde se incluyen todas las plantas que
se encuentren disponibles, asi como sus rganos;
2) qumico-taxonmico donde se seleccionan las
especies que corresponden a gneros o familias en
las que se han identifcado compuestos qumicos que
han mostrado poseer la actividad farmacolgica que se
pretende; y 3) el etnobotnico en el cual se seleccionan
las especies vegetales y los rganos que son utilizados
en las prcticas mdicas tradicionales.
Se ha demostrado que el criterio etnobotnico
suele ser el ms acertado en la seleccin de especies
vegetales tiles. Si siempre se utilizara este criterio o
sea el conocimiento mdico tradicional para seleccionar
los candidatos vegetales para el rastreo, seguramente
la proporcin de resultados favorables se incrementara
considerablemente.
Conclusin
Las especies seleccionadas con actividad antifngica
debern ser estudiadas por grupos multidisciplinarios
que orienten sus recursos, conocimientos y habilidades
al desarrollo de nuevos medicamentos tiles basados
en extractos vegetales. La investigacin de las plantas
medicinales no debe tener como nica meta el desarro-
llo de conocimiento, sta deber contribuir al desarrollo
de nuevos ftomedicamentos. Estos se debern estan-
darizar farmacolgica y teraputicamente, de manera
que puedan ser dosifcables y sus resultados sean re-
producibles. Adems debern demostrar seguridad y
efcacia. Tambin los nuevos ftomedicamentos debe-
rn ser producidos a partir de material vegetal desarro-
llado a travs de tcnicas controladas de cultivo y sin
afectar las especies en su hbitat natural.

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en la medicina tradicional de Mxico. Boletn de
la Ofcina Sanitaria Panamericana 1986; 101:
339-345.
63
Anexo 1. Plantas medicinales utilizadas de manera emprica para el tratamiento problemas de salud y que pre-
sentaron buena actividad contra cepas de hongos.
Especie Familia Hongo con crecimiento
inhibido
Pas donde se realiz estudio/
Parte de la planta / Usos
Albertisia villosa Menispermaceae A.. niger frica
Raz
Malaria
(Lohombo-Ekomba et al., 2004)
Annona muricata L. Annonaceae P. oxalicum Mxico
Corteza
Diarrea
Anogeissu leiocarpus (DC.)
Guill. et Perr. (L.)
Combretacea T. mentagrophytes
M. gypseum
T. rubrum
A.. fumigatus
M. Nahum
Togo
Hojas
Infeccin en el estomago
(Batawila et al., 2005)
Cassia alata L. Fabaceae C. albicans Malasia
Hojas y corteza
Antifungico,diurtico
antibacterial,problemas uterinos
Cassia fistula L. Leguminaceae T. rubrum
M. gypseum
P. marneffei
India
Semilla
*
Combretum caffum Kuntze Combretaceae A.alternaria
M. hiemalis
S. commune
A. nige
P. notatum
Sudfrica
Corteza
*
Citrullus colocynthis (L.)
Schrad.
Curcubitaceae T. mentagrophytes Egipto
Partes areas
Prurito, mordedura de
vibora, dermatitis por pelo
de camello
Clematis hirsuta Per. et Guill.
var. hirsuta
Ranunculaceae T. rubrum
E. floccosum
C.albicans
M.canis
Ruanda
Hojas
*
Combretum hispidum
C. Lawson
Combretaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
frica
Tallos
*
Combretum nigricans Lepr. Combretaceae E. floccosum
M. gypseum
T.mentagrophytes
T. rubrum
frica
Tallos, raz
*
Diospyros usambarensis
F. White
Ebenaceae C. cucumerinum frica
Races
*
Epilobium angustifolium L. Onagracea Candida glabrata
Candida lusitaniae
Saccharomyces cerevisiae
Canad
Raz
*
Fragaria virginiana Dchesne Rosacea Candida krusei
Candida glabrata
Candida lusitaniae
T. rubrum
T.mentagrophytes
A. flavus
Canad
Hojas
*
(Webster et al., 2008)
Garcinia livingstonei
T. Anderson.
Gutiferae C.cucumerinum
C. albicans
frica
Raz
*
Glaucium oxylobum Boiss. &
Buhse
Papaveraceae M.canis
M. gypseum
T. mentagrophytes
E. floccosum
Iran
Partes areas
Laxante, hipntico,
antidiabtico,
problemas de la piel
(Morteza-Semnani et al., 2003).
Indigofera oblongifolia Forsk Fabaceae A.fumigatus
A.niger
A. flavus
P. expansum
Pakistan
Tallos
*
Leonurus sibiricus L. Labiatae P. oxalium Mxico
Partes areas
Dolor gastrointestinal
P. aduncum L. Piperaceae T. mentagrophytes
S. cerevisiae
Honduras,
Fruto, tallos, hojas.
Dolor, astringente,
problemas de aparato
reproductor femenino
P. alopecuroides (Lam) D.C Asteraceae T. rubrum
T. mentagrophytes
Brasil
Partes areas
Problemas de la piel
(Stein et al., 2005)
64
Piper methysticum Forst Piperaceae M. canis
E. floccosum
Hawai,
Tallos, hojas, raz.
Infecciones urinarias,
Tranquilizante
Potentilla simples Michx. Rosaceae Candidad glabrata Canad
Tallos, hojas
*
Psychotria hawaiiensis Gray Rubiaceae E. floccosum Hawai
Corteza, hojas
Golpes, heridas
Pteleopsis suberosa Engl. &
Diels
Combretaceae T.mentagrophytes
T. rubrum
M. gypseum
C. albicans
E. floccosum
frica
Brotes y corteza de tallo
*
Rosamarinus officinalis L. Lamiaceae T.mentagrophytes Egypto,
Partes areas
*
Salix capensis Thunb Salicaceae A..alternaria
M. hiemalis
P. notatum
S. commune
Sudfrica
Corteza
Reumatismo fiebre
Scaevola sericeae Forst Goodeniaceae M. canis
E. floccosum
Hawai
Hojas
Heridas,cataratas
piel escamosa, punzadas
Schotia latifolia Jacq. Caesalpinioideae A..alternaria
M. hiemalis
S. commune
Sudfrica
Conteza
Cardialgia, diarrea
Solanum incanum L. Solanaceae T. rubrum
Fonseca predosoi
C.neoformans
C.albicans
C.guilliermondii
Alemania
Fruta
Problemas de la piel,
antiseptico de los dientes
dolor de cabeza
Solanum nger L. Solanaceae T. rubrum
M. canis
E. floccosum
Hawai
Corteza
Problemas respiratorios
Erupciones cutneas
Heridas, golpes
Terminalia avicennioides L. Combretaceae T.mentagrophytes
T. rubrum
M. gypseum
C. albicans
E. floccosum
frica
Hojas,corteza de raz
*
Terminalia bellerica Roxb. Combretaceae A. .nger
C. albicans
India
Cascara de la fruta
*
Terminalia glaucescens
Planch. ex Benth.
Combretaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
T. rubrum
A. fumigatus
M. Nahum
Togo
Hojas
Malaria, problemas de la
piel, ecsema, candidiosis y
dermatitis
( Batawila et al., 2005)
Terminalia triflora
(Grises.) Lillo
Bonaginaceae .T. mentagrophytes
T. rubrum
Argentina
Partes areas
Antifungico
(Muschietti et al., 2005)
Trachyspermum ammi
(L.) Sprague
Compositae A..nger
C.albicans
India
Fruta
*
Waltheria americana L. Esterculaceae C.cucum
P. oxalium
Mxico,
Partes areas
Purgativo, fiebre, escabiasis,
Tos
* No se reportan ms datos de la especie.
Anexo 2. Plantas medicinales utilizadas empricamente para tratar problemas de salud y que presentaron activi-
dad moderada contra cepas de hongos.
Especie Familia Hongo con crecimiento
inhibido
Pas donde se realiz el estudio/parte
de la planta
Acacia catechu (L. f.)
Brandis
Fabaceae A. niger
C. albicans
India
Tallos
Achyrates aspera L. Amaranthaceae C. albicans Etiopia
Flores
Infecciones nasales
Adansonia digitata L. Bombacaceae T. rubrum
M. canis
E. floccosum
Hawai
Flores
Alargium salviifolium
Wangerin
Alangiaceae A. niger
C. albicans
India
Raz
*
Alkanna orientalis (L.)
Boiss.
Boraginaceae T. mentagrophytes
M. canis
C. albicans
Egypto
Toda la planta
65
Allium cepa L. Liliaceae C.albicans
A.niger
A. flavus
A.fumigatus
India
*
Anemona obtusiloba (Hook) G.
Don.
Ranunculceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Raz
Tos, resfriado
Anogeissis latifolia Wall. ex.
Guill. & Perr.
Combretacea T. rubrum
A. falus
C. albicans
India, problemas de
Estomago y piel
(Govindarajan et al., 2006)
Artocarpus elasticus Reinw. ex
Blume.
Moraceae Fusarium oxysporum Isla de Sumatra
Corteza
Disenteria
Artemisia herba- alba var.
Laxiflora Boiss.
Asteraceae T. mentagrophytes Egipto
Toda la planta
Gripa, tos, antidiarreico
Artemisia ludoviciana ssp.
mexicana Nutt.
Compositae C. cucumerinum Mxico
Hojas
Dolor de estmago, vmito
A. rohituka Wight & Arn. Meliaceae Curvularia lunata
B. theobtomae
Bangladesh
Corteza, tallos
*
(Chowdhury, Rashid., 2003)
Asplenium trichomanes
(Burn. f. ) Kaulf.
Apocynaceae C. albicans Etiopia
Races
Lepra
Azima teracantha Lam. Salvadoraceae C.albicans
T. mentagrophytes
A. fumigatus
C. maltosa
C. krusei
Absidia corymbifena
Alemania
Fruta
Reumatismo, tos
Barringtonia asatica (L.) Kurz Lecythidaceae M. canis Hawai
Flores
Golpes, quemaduras
Byrsonia crassifolia H.B.K. Malpighiaceae E.floccosum
T. rubrum
Guatemala
Tallo
Infecciones en boca, leucorrea
Calotropis procera (Aiton) R. Br. Asclepiadaceae C. albicans Etiopia
Latex
lceras tropicales
Calpunea aurea (Ait) Benth. Leguminosae C. albicans Etiopia
Semilla
Abcesos
Cammiphora resinflua Martelli Burseraceae C. albicans Etiopia
Raz
Lesiones de la piel
Cammiphora sp. Burseraceae C. albicans Etiopia,
Raz
Lesiones en cuero cabelludo
Cassia cf. nodosa Buch.-Ham Fabaceae Fusarium oxysporum Isla de Sumatra
Raz
Dolor de cabeza
Centipeda minima (L.) Br. &
Asch.
Asteraceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Partes aereas
Tos, resfriado
Chymaphila umbellata (L.) W.
Bart
Pyloraceae C.albicans
T. mentagrophytes
M. gypseum
Canad
Toda la planta
*
Clausena obyssinica Engl. Retaceae C.albicans Etiopia
Hojas
Lesiones en piel
Clematis sinesis Fresen. Ramunculaceae C.albicans Etiopia
Hojas
Lesiones en piel
Cleome droserifolia (Forssk.)
Delile
Capparidaceae T. mentagrophytes Egipto
Toda la planta
Picaduras de insectos
Clerodendron myricoides
(Hochst.) R. Br. Ex Vatke
Verbenaceae C.albicans
T. mentagrophytes
Ruanda
Tallos, hojas
*
Combretum glutinosum Perr.
ex DC
Combretaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
T. rubrum
E. floccosum
C.albicans
frica
Hojas
*
Commelina benghalensis L. Commelinaceae C.albicans Etiopia
Hojas
Neumona
Corydalis longipes DC. Fumariaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Toda la planta
Tifoidea
Cucumis prophetarum L. Cucurbitaceae C.albicans Etiopia
Raz
Antrax
Cyathula uncinulata (Schrad.)
Schinz
Amaranthaceae E. floccosum Rwanda
Hojas, tallo, raz
*
Didymocarpus primulifolius
D.Don
Gesneriaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Toda la planta
Gripa
66
Dioscorea sp. Dioscoreaceae C.albicans Etiopia
Hojas
Sinusitis
Dissochaetagracilis (Jack) Bl. Melastomataceae Fusarium oxysporum Isla de Sumatra
Hojas, tallos
Diarrea
Dodonae viscosa (L.) Sapindaceae C.albicans Etiopia
Hojas
Lesiones en piel
Drymaria diandra (Sw.) Macfad. Caryophylaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Toda la planta
Tos, gripa
dolor de cabeza, fiebre,
indigestin
Echinops sp. (Benth.) Benth Composiatae C.albicans Etiopia
Raz
Fiebre
Elephantopus scaber L. Asteracea T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Raz,
Afrodisiaco, gripa
tuberculosis, tos,
lesiones por sifilis
Elsholtzia blanda (Benth.) Benth. Lamiaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Tallos
Gripa, tos , fiebre, escabiasis
Elsholtzia flava (Benth.) Benth. Lamiaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Raz
Fiebre
Elsholtzia fruticosa (D. Don)
Rehder
Lamiaceae T. mentagrophytes Nepal
Raz
Fiebre
Embelia schimperi Vatke Myrsinaceae C.albicans Etiopia
Fruta
Gonorrea
Epilobium angustifolium L. Onagraceae T. mentagrophytes
M. gypseum
C.albicans
Canad
Raz
*
Epilobium sp. Onagraceae C.albicans Etiopia
Hojas
Lesiones en piel
Erigenon breviscapus (Vant.)
Hand-Mazz
Asteraceae C.albicans
C. tropicales
C. parapsitosis
A. penicilloides
A. candidus
China
Toda la planta
*
Geum macrophyllum Willd. Rosaceae C.albicans
A. flavus
A. fumigatus
Fusarium tricuictum
M. cookerri
T. mentagrophytes
M. gypseum
T. viridae
British Columbia
Raz
*
Glaucium arabicum Fres. Papaveraceae C.albicans
M.canis
T. mentagrophytes
Egypto
Toda la planta
Piel, ojos
Gliricidia sepium Kunth ex Steud. Fabaceae E. floccosum
T. rubrum
Guatemala
Raz
Gastroenteritis,
tpica para
efermedades exantemticas,
lceras, tia
Gymnosperma glutinosum
(Spreng.) Less.
Asteraceae T. mentagrophytes
A. niger
Mxico
Partes areas
Diarrea
(Canales et al., 2007).
Gynoglassum caeruleum Hochst.
Ex DC.
Boraginaceae C.albicans Etiopia
Hojas
Infeccin en odos
Hypericum elodeoides Choisy Hyperaceae T. mentagrophytes Nepal
Raz
Fiebre
Hypericum cordifolium Choisy Hyperaceae T. mentagrophytes Nepal
Tallos,
Desordenes de la
menstuacin,
picadura animales
ponzoosos, diarrea
Harpephyllum caffrum
Bernh. Lithraea Miers ex Hook.
& Arn.
Anacardiaceae C.albicans Sudfrica
Tallos
Gonorrea
(Buwa, Staden., 2006)
Ipomea congesta R. Br. Convolvulaceae E. floccosum
M.canis
Hawai
Tallos
Purgante, para las fracturas
Lygodium japonicum
(Thunb.) Sar.
Lygodiaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Partes areas
Herpes
67
Macaranga pustulata King ex
Hook. f.
Euphorbiaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Corteza
Heridas infectadas, remover pus
Maesa macrophylla Wall. A. DC. Myrsinaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Corteza,
Escabiasis, difteria
Malpighia glabra L. Malpighiaceae E. floccosum
T. rubrum
Guatemala
Hojas
*
Micromera biflora
(Buch.-Ham. Ex D. Don) Benth.
Lamiaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Toda la planta
Gripa, tos, sinusitis, epistaxis
Monodora myristica (Gaertn.)
Dunal
Annonaceae A. flavus Camern
Fruto
Tos, bronquitis, diarrea
esterilidad femenina
Morinda tinctoria Roxb. Meliacea A. niger Sri Lankan
Hojas, corteza
Reumatismo,
Diarrea, heridas
(Jayasinghe et al., 2002)
Frankenia resoluta Forsk. Euphorbiaceae T. mentagrophytes Egypto
Toda la planta
Diarrea
Ocimum forskolei Benth Lamiaceae T. rubrum
C.albicans
C. guilliermondii
Fonseca pedrosoi
C. neoformans
Alemania
Hierba
Infecciones en piel,
fiebre, cosmtico
Origanum syriacum var Bevanii
Ietsw.
Compositae T. mentagrophytes Egypto
Toda la planta
*
Pavetta ternifolia (Oliv.)
Hiern
Rubiaceae T. mentagrophytes
M.canis
Ruanda
Hojas
*
P. crispum (P. Mill.) Apiaceae S. cerevisiae Filandia
Toda la planta
*
Phagnalon rupestre (L.) DC. Compositae T. mentagrophytes Egypto
Toda la planta
Tos, gripa
Phlomis aurea T. mentagrophytes Egypto
*
Pipturis albidus Gray Urticaceae M.canis
Principia utilis
Hawai
Corteza, tallos, hojas,
debilidad, purificar la sangre, en mujeres
embarazadas
Plumbago indica L. Plumbaginaceae C.albicans
A. niger
India
Hojas
*
Pogostemon benghalensis (Burm.
f.) Kuntze
Lamiaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Toda la planta, raz
Catarro,tos, indigestin
Principia utilis Rosaceae T. mentagrophytes Nepal
*
Psoralea crorylifolia (Roxb. ex
DC.)
Fabaceae T. ment agrophyt es E.
E.floccosum
T. rubrum
M. gypseum
India
Semillas
Problemas en piel y estmago
Psychotria hawaiiensis Fosberg
o Gray es otro autor
Rubiaceae M.canis
T. rubrum
Hawai
Hoja, fruto
Heridas
Retama raetam (Forssk.) Webb
& Berthel.
Leguminosae T. mentagrophytes Egypto
Toda la planta
Heridas, lceras abierta
Rhus tripartita (Ucria) Grande Anacardiaceae T. mentagrophytes Egypto
Toda la planta
Tos, gripa
Rubus regidus Smith Rosacea C.albicans
M.canis
T.mentagrophytes
Ruanda
Hojas raz
Antibacterial,antifungica
Rumex hastatus D. Don Polygonaceae T.mentagrophytes Nepal
Raz
Dolor de cuello
Scindapus officinalis Araceae T.mentagrophytes Nepal
Fruto
Disenteria, diarrea
Senecio gigans Vatke Compositae C.albicans Etiopia
Hojas
Tifo
Sibbadlia micropetala
(D. Don) Hand.-Mazz.
Rosaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Toda la planta
Diarrea, disenteria
Solanum xanthocarpum Schrad.
& H. Wendl.
Solanaceae A.fumigatus
A.niger
A. flavus
India
Toda la planta
Repelente
(Dabur et al., 2004)
Solenostemma oleifolium Bullock
& E. A. Bruce
Asclepiadaceae T. mentagrophytes Egypto
Toda la planta
Ojos, piel, infeccin de nariz
68
Spilanthes acmella (L.) Murray Compositae C.albicans Etiopia
Hojas
Tonsilitis
Terminalia alata Heyne ex Roth Combretaceae T. mentagrophytes
C.albicans
A. fumigatus
Nepal
Corteza
Diarrea, disenteria
Tetradenia riparia (Hochst)
Codd.
Lamiaceae C.albicans Ruanda
Hojas, tallo, raz
*
Thunbergia alata Boj. Ex. Sims. Acanthaceae M.canis
T.mentagrophytes
Ruanda
Partes areas y raz
*
Toona ciliata M.J. Roem. Meliaceae Curvularia lunata
B. theobtomae
Bangladesh
Tallos, corteza
Antifungico
(Chowdhury, Rashid., 2003)
Trewia polycarpa Benth. Euphorbiaceae C.albicans
A. niger
C. neoformans
Penicilium sp.
India
Raz
Reumatismo gota, hinchazn,
flatulencia, flema
(Chamundeeswari et al., 2004)
Tridax procumbers L. Asteraceae T. mentagrophytes
C.albicans
A. fumigatus
Nepal
Partes areas
Heridas, cortadas
Valeriana jatamansii Jones Valerianaceae T. mentagrophytes
M. gypseum
Nepal
Raz
Infeccion en ojos
Verbascum sinaiticum Benth. Scrophulariaceae T. mentagrophytes Egypto
*
Vernonia amygdalina Delile Asteraceae C.albicans Etiopia
Hojas
Lesiones de cuero cabelludo
Ziziphus joazeiro Mart. Rhamnaceae T. rubrum
C. guilliermondii
Brasil
Toda la planta
Micosis
(Cruz et al., 2007)
* No se reportan ms datos de la especie.
69
Antioxidant activity of isoquercetin and
Hyptis fasciculata on yeast cells
Actividad antioxidante de isoquercetina e
Hyptis fasciculata en levaduras
Carmelita Gomes da Silva
1
, Raul Raulino
1
, Debora Malta Cerqueira
2
, Marcos Dias Pereira
1
, Anita Dolly Panek
1
,
Joaquim Francisco Mendes da Silva
3
, Elis Cristina de Araujo Eleutherio
1
, Fabio de Sousa Menezes
4
1
Departamento de Bioqumica, Instituto de Qumica, UFRJ, 21949-900, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
2
Instituto de Biofsica Carlos
Chagas Filho, ICB, UFRJ, 21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
3
Departamento de Qumica Orgnica, Instituto de Qumica,
UFRJ, 21949-900, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
4
School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Trinity College Dublin. Panoz
Institute. 23, Westland Row, Dublin 2, Ireland.
Corresponding author: Fabio de Sousa Meneses
School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Trinity College Dublin.
Panoz Institute. 23, Westland Row, Dublin 2, Ireland.
Phone/Fax: 00 353 1 896 3317
E-mail: desouzaf@tcd.ie
Abstract
Reactive oxygen species (ROS) are thought to un-
derline the process of ageing and the pathogenicity
of various diseases, such as neurodegenerative dis-
orders and cancer. The use of traditional medicine is
widespread and plants still present a large source of
natural antioxidants that might serve as leads for the
development of novel drugs. In this paper, the alcoholic
extract from leaves of Hyptis fasciculata, a Brazilian
medicinal plant, and isoquercetin, a favonoid identifed
in this species, showed to be active as 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl (DPPH) radical scavengers. The extract
of Hyptis fasciculata and isoquercetin were also able
to increase tolerance of the eukaryotic microorganism
Saccharomyces cerevisiae to both hydrogen perox-
ide and menadione, a source of superoxide. Cellular
protection was correlated with a decrease in oxidative
stress markers, such as levels of ROS, protein carbon-
ylation and lipid peroxidation, confrming the antioxidant
potential of Hyptis fasciculata and isoquercetin.
Keywords: isoquercetin, Hyptis fasciculata, antioxidant
activity, Brazilian plants, oxidative stress
Resumen
Se piensa que las especies reactivas de oxgeno (ROS,
siglas en ingls) subyacen tras el proceso de envejeci-
miento y en la patogenicidad de varias enfermedades
como los trastornos degenerativos y el cncer. El em-
pleo de la medicina tradicional es extenso y las plantas
representan una fuente importante de antioxidantes
naturales que pueden servir de base para el desarrollo
de nuevos medicamentos. En este trabajo, el extrac-
to alcohlico de hojas de Hyptis fasciculata mostr ser
tan activo como el 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH,
siglas en ingls) como neutralizador de radicales libres.
El extracto de Hyptis fasciculata e isoquercetina fueron
tambin capaces de aumentar la tolerancia al perxido
de hidrgeno y la menadiona una fuente de supe-
rxido- del microorganismo eucarionte Saccharomyces
cerevisiae. La proteccin celular se correlacion con
una disminucin de los marcadores de estrs oxidativo
como ROS, carbonilacin de protenas y peroxidacin
de lpidos, esto confrm el potencial antioxidante de
Hyptis fasciculata e isoquercetina.
Palabras clave: isoquercetina, Hyptis fasciculata, acti-
vidad antioxidante, plantas brasileas, estrs oxidativo.
70
Introduction
Plants can produce a remarkably diverse range of low-
molecular-weight natural products, also known as spe-
cial metabolites [1]. This rich diversity results in part from
an evolutionary process driven by selection for acquisi-
tion of an improved defense against microbial or insect
attacks [1]. Special metabolites constitute important ac-
tive molecules which differ widely in terms of structure
and biological properties [2]. According to The World
Health Organization about 65-80% of the population in
developing countries depends upon medicinal plants
as the unique form of access to basic health treatments
[3]. However, a profound scientifc study and standard-
ization of these plants, as phytotherapeutics, is neces-
sary to guarantee safety in their utilization by the public
health system. Brazilian biodiversity has signifcantly
contributed to the discovery of new pharmacologically
active molecules from medicinal plants [4].
In this paper, an extract from the Brazilian species
Hyptis fasciculata and a favonol identifed in this plant,
called isoquercetin, were analyzed for their antioxidant
activity. In the last two decades, more attention has
been paid to the antioxidant activity of plant extracts or
isolated substances from plants [4], because reactive
oxygen species (ROS) are implicated in aging and
in the etiology of several disease processes such as
atherosclerosis, neurodegenerative disorders, some
cancers, cirrhosis, fbrosis, infammation and diabetes
[2]. ROS can be produced from both endogenous
and exogenous sources. Potential endogenous
sources include mitochondria, cytochrome P450
metabolism, peroxisomes and infammatory cell
activation. Mitochondria have long been known to
generate signifcant quantities of superoxide radicals
and hydrogen peroxide, the most abundant ROS in
vivo [5]. ROS production is counteracted by an intricate
antioxidant defense system that includes enzymatic
scavengers, such as superoxide dismutases and
peroxidases, and some antioxidants, like glutathione,
ascorbate, favonoids and carotenoids. When ROS
production exceeds cellular antioxidant capacity, the
consequences are modifcation to cellular proteins,
lipids and DNA, which can lead to cell death or to
acceleration in ageing and age-related diseases. [6].
H. fasciculata of the Lamiaceae family is used in
phytomedicine, in the treatment of different pathologies
[4]. Popularly known as marroio-do-brasil, this spe-
cies is a widely spread perennial plant found in south-
ern countries of South America and its dried leaves and
stems have been used for treatment of gout, spasms,
fever and as expectorant [7,8]. Some chemical con-
stituents in the aerial parts of H. fasciculata were re-
cently isolated and studied: two labdane diterpenoids,
15-methoxyfaciculatin and 15-methoxyfaciculatin
[7]; the favonoids cirsilineol, cirsimaritina, aurantiamide
acetate, aurantiamide benzoate, methoxynepetaefolin
and isoquercetin [8;9].
Quercetin (3,3,4,5,7-pentahydroxyfavone) is the
major favonol found in the plant kingdom and it may be
a powerful bioactive constituent of the human diet due
to excellent free radical scavenging activity [10]. Its an-
tioxidant properties have been extensively investigat-
ed: quercetin protected glial cells from oxidative stress
[11], decreased atherosclerosis [10] and showed anti-
infammatory [10)], anticancer and anti-aging activities
[12,13]. The favonol isoquercetin (quercetin 3-O--D-
glucopyranoside), which is typically found in onions, is
a quercetin moiety substituted by a glucose molecule
on C3 of the favonoidic nucleus [14]. This favonol was
isolated in some plant species as Crataegus sp. [15],
Argemone platyceras [14] and was characterized for
the frst time in the genus Hyptis [9].
We used two complementary approaches to analyze
the antioxidant activity of H. fasciculata and isoquercetin:
evaluation of the capacity of the extract of H. fasciculata
and isoquercetin to scavenge free radicals in vitro, and
analysis of their potential in protecting Saccharomyces
cerevisiae cells against oxidation. The use of this lower
eukaryote as a model system for the study of oxidative
stress responses in vivo is particularly attractive:
about 30% of the human disease-associated genes
signifcantly match yeast genes; in contrast to humans,
yeast genes can be easily manipulated; and no less
important, the use of animals in toxicology tests is
falling into disuse, today, for both ethical and scientifc
reasons [4,16].
Material and methods
Chemicals and Reagents. H
2
O
2
was purchased
from Merck. Menadione, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH), catechin, isoquercetin and quercetin were ob-
tained from Sigma Chemicals. Media components were
obtained from Difco.
Plant Material. Commercial Ginkgo biloba
(GBE 761) were obtained from Tanakan as a 40 mg
(concentration) oral solution. Aerial parts from H.
fasciculata were collected and classifed by Dr. S.A.L.
Bordignon (Luteran University of Brazil- RS). A voucher
sample has been deposited in the Botanical Department
Institute of Biosciences, Federal University of Rio
Grande do Sul, Brazil.
Sample Preparation. Aerial parts of H. fasciculata
were dried, minced 792g and then, extracted by
71
maceration with absolute ethanol at room temperature.
Ethanol was evaporated under reduced pressure and
the extract 98.3g was stored at -20C. The ethanol
extract of H. fasciculata was partitioned in different
solvents obtaining fractions with crescent polarities;
the n-butanol fraction was used in this work. The dried
extracts were dissolved in ethanol to an approximate
fnal concentration of 120 mg/mL.
DPPH photometric assay. Samples were
evaluated in terms of hydrogen donation or radical
scavenging ability using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
radical (DPPH), which is purple at room temperature
[4]. Ethanol solutions of the samples, at different
concentrations, were mixed with 0.3 mM DPPH ethanol
solution. Absorbance was measured at 518 nm after
30 min of reaction at 25C. The results were expressed
as IC
50
, which means the concentration of sample
necessary to decrease the absorbance of DPPH in
50%.
Phenolic Compound Content. The sample solution
(1 mL) was mixed with 1 mL of diluted Folin-Ciocalteu
reagent (1 N) in a test tube. After 3 min of reaction, 2
mL of 35% Na
2
CO
3
was added and the mixture was
incubated for 30 min at room temperature. Absorbance
was measured at 700 nm and catechin was used as
standard [17].
Yeast strains, media and growth conditions. Wild
type strain BY4741 (MATa, his3, leu2, met15, ura3) and
its isogenics mutants sod1 and ctt1, harboring the
genes SOD1 (cytosolic superoxide dismutase) and
CTT1 (cytosolic catalase), respectively, interrupted
by the gene KanMX4, were acquired from Euroscarf,
Germany. Stocks of these strains were maintained
on solid YPD medium (1% yeast extract, 2% glucose,
2% peptone and 2% agar); in the case of the mutant
strains, the medium also contained 0.02% geneticine.
Cells were grown up to the middle of frst exponential
phase (106 cells/mL) in liquid YPD medium, using an
orbital shaker at 28C and 160 rpm, with 5/1 of fask
volume/medium ratio.
In vivo antioxidant analysis. Cells were directly
stressed with 2 mM hydrogen peroxide or to 20 mM
menadione for 1h at 28C/160 rpm, or previously treated
with 5 mg/mL of either plant extract (H. fasciculata or
G. biloba) or 10 g/mL of favonols (isoquercetin or
quercetin) for 1h at 28C/160 rpm before being stressed.
To choose the doses of plant extract/favonol used in the
adaptive treatments, cells were exposed to increased
concentrations of H. fasciculata extract or isoquercetin
and then spotted adjacently on YPD agar plates
incorporating peroxide or menadione. The concentration
chosen was the lowest which could improve cell growth
compared to cohorts exposed to stress without being
treated with plant extract/isoquercetin. Cell viability
was analyzed by plating, in triplicate, on solid YPD
medium, after proper dilution. Plates were incubated at
28oC for 72 h and the colonies counted. Tolerance was
expressed as percentage of survival [18].
Biomarkers of Oxidative Stress. For lipid
peroxidation assays, 50 mg of cells were harvested by
centrifugation and washed twice with 20 mM Tris/HCl
buffer, pH 7.4. The pellets were re-suspended in 500 L
of the same buffer, containing 10 % trichloroacetic acid,
and 1.5 g of glass beads were added. The samples were
disrupted by 3 cycles of one minute agitation on a vortex
mixer followed by one minute on ice. The supernatants
obtained after centrifugation were mixed with 0.1 mL of
0.1 M EDTA and 0.6 mL of 1 % w/v thiobarbituric acid
in 0.05 M NaOH. The reaction mixture was incubated
in a boiling water bath for 15 min and, after cooling,
absorbance was measured at 532 nm [19].
The 2,7-dichlorofuorescein diacetate probe,
sensitive to oxidation, was used to measure the
level of intracellular oxidation. Fluorescence was
measured using a (Photo Technology International PTI)
spectrofuorimeter set at an excitation wavelength of
504 nm and an emission wavelength of 524 nm. A fresh
5 mM stock solution of the probe dissolved in ethanol
was added to the culture to a fnal concentration of
10 M and incubation at 28C continued for 15 min
to allow uptake of the probe. Cells, treated or not with
antioxidants, were stressed as described previously
and, subsequently, about 50 mg of cells were harvested
by centrifugation and washed twice with water.
Disruption of samples was performed according to
[18]. After centrifugation at 25.000 g for 5 min, the
supernatant solutions were diluted 6-fold with water
and fuorescence measured [20].
Extracts for protein carbonyl determinations were
obtained by disruption of cells with glass beads in 0.1M
TrisHCl buffer, pH 7.0 [6]. Protein samples were mixed
with 10 mM DNPH (dinitrophenylhydrazine) in 2 N HCl,
or in 2 N HCl without DNPH, at room temperature for 1
h with agitation every 15 min. Proteins were precipitated
with 20% trichloroacetic acid (w/v), centrifuged (13,000
x g for 3 min) and the supernatant was discarded.
Samples were washed three times with 1 ml ethanol-
ethyl acetate (1:1 v/v). The precipitate was re-dissolved
in 1 ml of 6 M guanidine HCl in 20 mM potassium
phosphate adjusted to pH 2.3 with trifuoroacetic acid,
and left for 30 min. at 37C to redissolve. Any remaining
insoluble material was removed by centrifugation
(13,000g for 1 min) and the absorbance measured at
360 nm. The carbonyl content was calculated, using
the molar absorption coeffcient of 22,000 M-
1
cm-
1
for
aliphatic hydrazones [21].
72
Catalase and superoxide dismutase activities.
Extracts were obtained by disruption of cells with
glass beads [18]. The supernatants obtained after
centrifugation at 25,000 x g were used for enzymatic
determination. Catalase and superoxide dismutase
activities were measured according to [22] and [23],
respectively. Protein was determined according to
Stickland [24].
Statistical Analyses. Results were expressed
as mean standard deviation of at least three
independent experiments. Statistical differences were
tested using ANOVA followed by Tukey-Kramer multiple
comparisons test. The latter denotes homogeneity
between experimental groups at p < 0.05. In the fgures,
the asterisk means values statistically not considered
as different.
Results and discussion
In Vivo and in Vitro Antioxidant Activity of H. fas-
ciculata and Isoquercetin. Polyphenols are a large
and diverse class of compounds, many of which occur
naturally in a wide range of food and plants. The fa-
vonoids are the largest and best-studied group among
polyphenols. A range of plant polyphenols is, either
being actively developed or already currently sold as
dietary supplements and/or herbal-derived medicines.
Although, these compounds play an unknown role in
nutrition (non-nutrients), many of them have properties
including antioxidant, anti-mutagenic, anti-estrogenic,
anti-carcinogenic and anti-infammatory effects that
might potentially be benefcial in preventing disease
and protecting the stability of the genome [25].
The antioxidant potential of polyphenols has been
correlated to the capacity of donating hydrogen radicals.
The number and the confguration of H-donating hydroxyl
groups are both important structural features infuencing
the antioxidant capacity of phenolic compounds [26].
Initially, it was analyzed the reactivity of H. fasciculata
extract and isoquercetin with DPPH, a stable free radical.
As DPPH picks up one electron in the presence of a
free radical scavenger, the absorption decreases and
the resulting discoloration is stechiometrically related
to the number of electrons gained [4]. Results of DPPH
reduction by extracts are shown in Table 1. The favonoid
isoquercetin exhibited a low IC
50
value (11.8 g/mL) being
an excellent DPPH scavenger, lower than quercetin
IC
50
, used as standard. The extract of H. fasciculata
also showed an outstanding DPPH scavenger activity,
comparable to G. biloba extract, used as standard due to
its well established antioxidant activity [27]. However, as
far as total phenolic content is considered, H. fasciculata
showed a 3.5-fold lower value than that observed for a
G. biloba, indicating that non-phenolic compounds could
play an important role in the in vitro antioxidant activity of
H. fasciculata extract.
Characterizing antioxidants only on the basis of ability
to scavenge free radicals is inadequate. It is important
to verify if compounds that are excellent antioxidants
in vitro work as such in vivo. Thus, we also evaluated
the antioxidant activity of H. fasciculata extract and
isoquercetin using the yeast S. cerevisiae. Exponentially
growing cells are very sensitive to oxidants due to
catabolic repression exerted by glucose on antioxidant
defense system [18]. However, a previous treatment
with an antioxidant would increase cell tolerance to an
oxidative stress. We tested different oxidative stresses,
generated by hydrogen peroxide or menadione, a
source of superoxide radical. Menadione and H
2
O
2

can generate hydroxyl radical, the most reactive and
toxic ROS [13, 18]. H
2
O
2
and hydroxyl radical exhibit
high redox potential and have been shown to damage
biomolecules in vitro and in vivo. Menadione can also
cause an oxidative stress by forming a complex with
glutathione, the main antioxidant thiol [5, 13].
Samples IC
50
(g/mL)
Phenolic compound
concentration (mg/ mL)
Relative SOD activity
G. biloba 26.6 0 61.1 0 ND
Quercetin 65.6 0.6 ND* ND
Isoquercetin 11.8 1.1 ND 1.4 0.1
H. fasciculata 35.0 0.3 17.5 0.2 0.8 0.1
*ND = not determined
Table 1. DPPH radical scavenging activity was expressed as IC50. The IC50 values were obtained by linear regression
and showed a very good coeffcient of determination (r2 0.97). Statistical analysis (ANOVA) of data from the three sepa-
rate tests showed that all experiments made with each sample were statistically equivalent (p < 0.05). Phenolic compound
content was determined only in plant extracts as described in Methods. Activation of SOD produced by antioxidants was
expressed as a ratio between activity of cells treated with antioxidants and activity of non-treated cells.
73
Accordind to Fig. 1A, H. fasciculata extract and
isoquercetin increased tolerance to H
2
O
2
stress in both
wild-type strain and in the mutant defcient in cytosolic
catalase (ctt1 strain). The rise in tolerance in the wild-
type strain was similar to the antioxidant standards G.
biloba and quercetin. This result indicates that the the
active compounds present in H. fasciculata as well as
isoquercetin itself could be considered able to inactivate
hydrogen peroxide effects even in the absence of
its catabolic enzyme. Corroborating this hypothesis,
neither H. fasciculata nor isoquercetin treatments were
able to increase catalase activity (results not shown).
Regarding the superoxide stress induced by menadione,
H. fasciculata extract and isoquercetin increased the
survival of wild-type in levels higher than the respective
standards (Figure 1B). Although isoquercetin was able
to recover 100% of survival in wild-type, it showed no
protection in the mutant strain defcient in cytosolic
superoxide dismutase, indicating that the mechanism
of action of isoquercetin could be dependent on this
antioxidant enzyme. Hyptis fasciculata also was unable
to increase the tolerance of sod1 strain.
A compound might exert antioxidant actions in
vivo by inhibiting generation of reactive species, or by
directly scavenging them. An additional mechanism
by which an antioxidant might act in vivo is by raising
the levels of endogenous antioxidant defenses, e.g.,
by up-regulating expression of the genes encoding
superoxide dismutase. Interestingly enough the
treatment with isoquercetin enhanced SOD activity up
to 40% (Table 1), confrming that the antioxidant effect
of this favonoid is SOD-dependent. On the other hand,
H. fasciculata extract, a source of isoquercetin, was not
able to increase SOD activity (Table 1) although it had
been capable to induce tolerance to menadione (Figure
1B). The inability of the H. fasciculata of inducing SOD
activity could be explained by the low concentration of
isoquercetin present in the extract or by the negative
synergism among the other compounds present in
the extract thus interfering with the benefc action of
isoquercetin [28].
Protection against Oxidative Damage. It is
possible for an antioxidant to protect in one biological
system, but to fail to protect (or even sometimes to
promote damage) in others. For example, antioxidant
inhibitors of lipid peroxidation may not protect other
molecular targets (such as protein) against oxidative
damage.
The polyunsaturated fatty acyl side chains,
because of their susceptibility to oxidative damage in
membrane phospholipids, pose a constant threat to
cellular integrity and function, mainly due to the loss
of membrane properties, for example, selectivity [28,
29]. This process, called lipid peroxidation, leads to
malondialdeyde (MDA) as the fnal product, which
is mutagenic in bacterial and mammalian cells and
carcinogenic in rats [5].
Our results showed that, H. fasciculata and
isoquercetin reduced lipid peroxidation levels after
the action of both stressful agents (Figure 2A). Lipid
oxidation levels induced by menadione were reduced
to control levels, when yeast cells were treated with
both antioxidants. A variety of plant extracts and
isolated compounds is effective in reducing of lipid
peroxidation. Euryale ferox seeds, dose-dependently,
reduce lipid oxidation levels after oxidative damage
induced by H
2
O
2
, in hamsters [29]. Diverse favonoids
such as, quercetin, rutin, ginkgettin, amentofavone and
tetra-O-methylamentofavone isolated from Araucaria
angustigolia also decrease, in a dose-dependent
form, lipid peroxidation levels in phosphatidylcholine
lipossomes [30]. Interactions of favonoids with
membranes may reduce the incorporation into the bi-
layer of hydrophobic compounds that can affect, either
directly or indirectly, the integrity of the membranes
[31]. Induction of SOD activity produced by isoquercetin
(Table 1) might also contribute to its protective effect
against lipid oxidation.
Results shown in this paper strongly point towards
the antioxidant capacity of both the extract and favonoid
in protecting yeast cells against the toxic effect of ROS
produced by hydrogen peroxide and menadione stress.
To determine whether these extracts and isoquercetin
are in fact responsible for the increase in cellular viability
by decreasing ROS levels, we analyzed intracellular
oxidation. The assay was carried out using a fuorescent
probe, 2,7-dichlorofuorescein diacetate (DCF). This
probe is absorbed and trapped inside the cells after
cleavage of the diacetates by an intracellular esterase,
and thereafter, is no longer able to leave the cell. Once
inside the cell, it becomes susceptible to attack by ROS,
producing a more fuorescent compound [18]. According
to Figure 2B, the stress induced by H
2
O
2
increased
fuorescence signifcantly in relation to the control (13-
fold), while the increase caused by menadione was less
signifcant (2.5-fold). In spite of that, H. fasciculata and
isoquercetin were able to reduce intracellular oxidation
to basal levels during the stress with peroxide. After the
stress with menadione, both antioxidants decreased
the fuorescence to lower levels than the control (Figure
2B).
74
Oxidative damages to proteins, lipids or DNA may all
be seriously deleterious and may occur concomitantly.
However, proteins are possibly the most immediate
vehicle for inficting oxidative damage on cells because
they are often catalysts rather than stoichiometric
mediators [24]. Superoxide anions cause the release
of iron-sulfur clusters of several enzymes leading to
their inactivation. Stadtman and co-workers described
that oxidatively modifed proteins (measured as protein
carbonylation) accumulate as a function of cell age
in human erythrocytes and fbroblasts. Oxidative
modifcation of proteins has been associated to aging-
related pathologies such as Alzheimers disease [32].
Grape seed extract showed an improvement of 30%
on memory, in aged rats after 4 days of treatment, and
decreased the protein carbonyl levels in 44% in the brain
regions after 30 days of treatment [33]. As can be seen
in Figure 2C, H. fasciculata and isoquercetin reduced
the levels of protein carbonylation below those of the
control when yeast cells were stressed with hydrogen
peroxide. Whereas when the stress was induced by
menadione, only isoquercetin was able to reduce
carbonylation down to basal levels. H. fasciculata did
not have as signifcant effect as isoquercetin (Figure
2C). In a recent paper, also using yeast cells as a
model, quercetin was shown to be decrease 5-6-fold
the H
2
O
2
-induced dihydrorhodamine fuorescence.
Quercetin also decreased the constitutive levels of
oxidized proteins and lipids against oxidative damages
induced by H
2
O
2
[13].
In conclusion, our results indicate that the n-butanol
fraction of the aerial parts of Hyptis fasciculata and
the favonoid isoquercetin identifed in this species
showed outstanding antioxidant activity in yeast cells.
They seem to be able to increase cellular survival by
reducing intracellular lipid and protein oxidation levels,
or either as ROS scavengers. Superoxide dismutase
activity seems be induced by isoquercetin, however this
favonoid was not dependent upon catalase in order to
increase survival of cells. The results antioxidant activity
in vitro were corroborated by the results we obtained
using Saccharomyces cerevisiae suggesting that its
use is appropriate for the in vivo investigation of natural
antioxidant sources.
Acknowledgements
This work was supported by grants from FAPERJ,
CAPES, CNPq and FAPESP (grant 04-10067/6).
Figure 1. Effect of plant extracts and favonoids on cell viability after
stress with 2 mM hydrogen peroxide (A) and 20 mM menadione (B).
Control (wild type) and ctt1 mutant cells, harvested in frst exponential
phase, were directly stressed (black bar) or were previously submit-
ted to 5 mg/mL GBE 761 (dotted bar) and HF (white bar); 10 g/
mL of Q (striped bar) and IQ (gray bar). * Values not considered dif-
ferent.
Figure 2. Effect of Hyptis fasciculata extract and of isoquercetin on
lipid peroxidation (A), on fuorescence from cells treated with 10 M
2, 7-dochlofuorescein (B) and on carbonylation of proteins (C), after
a stress with 2 mM hydrogen peroxide and with 20 mM menadione.
Control cells (wild type), harvested in frst exponential phase, were
directly stressed (black bar) or were previously submitted to 5mg/mL
of HF (white bar) and 10 g/ mL of IQ (gray bar). The results were
expressed as a ratio between stressed cells, treated or not with HF or
IQ and non-stressed cells. * Values not statistically different.
0
5
20
ctt 1
Wild - type
*
*
A
%

S
u
r
v
i
v
a
l
10
15
0
sod 1
Wild - type
B
%

S
u
r
v
i
v
a
l
20
40
60
80
100
120
4
3
2
1
0
14
12
10
8
6
4
2
2
0
0
1
Medadione H
2
O
2
* *
* *
A
B
C
F
o
l
d

i
n
c
r
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a
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C
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b
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y
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p
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o
x
i
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77
Resumen
Plantago major L. (llantn) es una planta que se emplea
en la medicina tradicional mexicana como antitumoral, an-
tiinfamatoria, antidiarreica, antibitica y antisptica. Las
semillas se emplearon para obtener el extracto hexnico,
que se prob sobre cultivos de las bacterias Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Shigella
fexneri, Proteus mirabilis y Salmonella typhimurium. Se
emple como control positivo una mezcla de penicilina-
estreptomicina. El extracto inhibi en un 54 a 66% el
crecimiento de todas las bacterias probadas. El extracto
present compuestos de tipo terpenoide.
Palabras clave: Plantago major L. llantn, actividad
antibacteriana, terpenos.
Summary
Plantago major L (llantn) a plant employed in Mexi-
can traditional medicine is claimed to have antitumoral,
anti-infamatory, antidiarrhoeal, antibiotic and antisep-
tic activities. The seeds were employed to prepare the
hexanic extract that was assessed over bacterial cul-
ture of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Sal-
monella typhi, Shigella fexneri, Proteus mirabilis and
Salmonella typhimurium. Penicillin- streptomycin solu-
tion was used as positive control. The extract inhibited
bacterial growth in all assays in 54 to 66%. The hexanic
extract showed to have terpenoids-like compounds.
Key Words: Plantago major L. llantn, antibacterial ac-
tivity, terpenoids.

Introduccin
Las enfermedades infecciosas intestinales y de vas
respiratorias son las dos principales causas de muerte
en la poblacin infantil mexicana de 1-4 aos, mien-
tras que en la poblacin total las infecciones intestina-
les y las respiratorias son la sptima y quinta causa de
muerte, de manera respectiva (SINAIS, 2007).
Las bacterias Escherichia coli, Salmonella typhi y
Shigella fexneri son las bacterias que ms frecuentemente
se asocian con infecciones gastrointestinales en el hombre.
Por otra parte Staphylococcus aureus origina una amplia
variedad de infecciones supurativas e infecta heridas y
rganos internos. Se asocia tambin a la intoxicacin
alimentaria debida a las toxinas que libera. Este patgeno
tambin infecta a animales (Tortora et al, 2004).
Actividad antibacteriana de las semillas de
Plantago major L.
Antibacterial activity of Plantago major L SEEDS.
*
1
Elisa Vega-vila,
2
Shindu Irais Gmez-Covarrubias,
1
Rafaela Tapia-Aguilar,
3
Jorge Santana-Carrillo
y
1
Rodolfo Velasco-Lezama.
1
Laboratorio de Hematologa Experimental. Departamento de Ciencias de la Salud.
Universidad Autnoma Metropolitana-Iztapalapa.
2
Licenciatura en Biologa Experimental. Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud-Iztapalapa.
Universidad Autnoma Metropolitana.
3
Herbario Ramn Riba. Departamento de Biologa.
Universidad Autnoma Metropolitana-Iztapalapa.
Autora para correspondencia: Elisa Vega Avila
Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autnoma Metropolitana
San Rafael Atlixco 186, Iztapalapa, Mxico DF 09340
Tel. +55-58046482, Fax. +55-58044727
Correo electrnico: evegavila@yahoo.com.mx
78
A pesar de que en la antigedad no se conoca
la existencia de los microorganismos y su papel en
la generacin de infecciones ya se empleaban las
plantas Melissa offcinalis, Allium sativum y Melaleuca
alternifolia para el tratamiento de enfermedades
infecciosas comunes y en la actualidad se reconocen a
estas plantas como agentes antimicrobianos de amplio
espectro (Heinrich et al, 2004).
La medicina tradicional participa de manera activa
en el sistema mdico mexicano y se relaciona con el
40% de los servicios de salud; se estima que un 25%
(aproximadamente 20 millones de personas) an
dependen de las plantas con propiedades medicinales
para el tratamiento de enfermedades (Hernndez et al,
2003).
En la investigacin etnobotnica realizada por Aguilar
y Camacho (1984) se agrupan las plantas del Herbario
del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSSM) de
acuerdo a su accin en los aparatos y sistemas. Esta
clasifcacin permiti proponer al IMSSM una lista de
las especies vegetales ms usadas en Mxico para los
padecimientos de los aparatos digestivo y respiratorio.
De acuerdo a la informacin registrada en dicho
herbario, el 60% de las especies se relacionan con el
tratamiento de las afecciones del aparato digestivo, piel
y aparato respiratorio (Aguilar et al, 1996). Plantago
major L. (llantn) es una de las plantas empleadas para
el tratamiento de enfermedades asociadas al aparato
digestivo.
Plantago major L. es una planta cosmopolita de
distribucin mundial. Es anual o perenne con una
altura 10 a 30 cm con hojas en forma de roseta que
envuelven parte del tallo. Sus fores estn dispuestas
en espigas y son blanco verdosas. Sus semillas son
de color caf. En la medicina tradicional mexicana se
emplea como antiinfamatoria, en infecciones vaginales,
diarrea, disentera y carminativa (Argueta et al, 1994).
Se aplica para quitar manchas de la piel, es antisptica
y antibitica (Mrquez et al, 1999).
Estudios previos en nuestro grupo de trabajo
mostraron que el extracto hexnico de las partes reas
de P. major inhibe el crecimiento de E. coli (Velasco et
al, 2006), en el presente trabajo evaluamos la actividad
antibacteriana in vitro del extracto hexnico de las
semillas de esta planta.
Material y mtodos
Preparacin del extracto hexnico
La planta se adquiri en el Mercado de Sonora del Dis-
trito Federal de Mxico durante el mes mayo de 2008.
La planta fue identifcada por especialistas del herbario
Ramn Riba de Universidad Autnoma Metropolitana
donde se deposit un ejemplar de la planta con el regis-
tro UAMIZ52718. Se separaron las espigas, se dejaron
secar a temperatura ambiente, se recuperaron las se-
millas manualmente y se molieron en la licuadora (Phi-
llips). Al material molido se le adicion hexano (JT Baker,
USA) y se calent la mezcla a refujo durante 4 horas.
Se separ el material slido por fltracin y se concentr
el extracto a presin reducida en un rotavapor.
Microorganismos empleados
Se emplearon las cepas bacterianas; Escherichia
coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538,
Salmonella typhi ATCC 6539, Shigella fexneri ATCC
29003, Proteus mirabilis NCTC 2896 y Salmonella
typhimurium ATCC 13311.
Preparacin de los sensidiscos
Se prepararon soluciones del extracto en concentracio-
nes de 1.5, 0.15 y 0.015 mg/ml de DMSO al 10% (JT
Baker, USA) y se aplicaron 50 l de cada una de estas
soluciones para impregnar discos estriles de 6.0 mm
de dimetro (Whatman No. 1), de manera tal que la
concentracin fnal del extracto en los discos fue de 75,
7.5 y 0.75 g. Se emple un control negativo impregna-
do con 50 l del DMSO al 10%. Como control positivo
se emplearon sensidiscos impregnados con 50 l de
una mezcla de penicilina-estreptomicina (Sigma, USA)
en concentracin de 100 UI-100 g/ml de manera tal
que el control positivo tuvo 5 UI de penicilina-5 g de
estreptomicina.
Evaluacin de la actividad antibacteriana
La actividad antibacteriana se evalu por el mtodo de
difusin en disco (Vanden Berghe and Vlietinck, 1991).
Los microorganismos se sembraron en agar cerebro y
corazn (BHI) (Bioxon) y se incubaron 24 horas a 37
C. Se seleccion una colonia de cada uno de los mi-
croorganismos empleados y se subcultivo en caldo BHI
24 horas a 37C. Los cultivos se ajustaron con solucin
salina estril (para obtener una turbidez estndar del
tubo No. 1 del nefelmetro de Mac Farland (108 unida-
des formadoras de colonias). Se depositaron 0.30 ml
de la suspensin bacteriana y se sembraron por disper-
sin con una varilla acodada en placas de Agar Me-
ller-Hinton (Bioxon). Las placas sembradas se dejaron
en reposo a temperatura ambiente al menos 30 minu-
tos para que se absorbieran las bacterias sembradas,
posteriormente se colocaron sobre los cultivos los dis-
cos impregnados previamente y se incubaron durante
24 horas a 37C. La actividad antibacteriana en cada
disco se valor midiendo el halo de inhibicin del creci-
miento alrededor del disco. La actividad de la solucin
79
de antibiticos (control positivo) se consider como el
100% de inhibicin y contra ella se compar la activi-
dad del extracto de prueba. Esta prueba se realiz por
triplicado en tres ocasiones distintas.
Anlisis ftoqumico preliminar
El extracto obtenido fue de color amarillo con consis-
tencia grasosa y en base a la consistencia el anlisis
ftoqumico se orient a la bsqueda de compuestos
terpenoides usando la reaccin de Lieberman-Buchar-
dt (Alarcn-Aguilar et al, 2006). Se disolvi una porcin
del extracto en cloroformo (JT Baker, USA) a la que
se le aadieron anhdrido actico (JT Baker, USA) y
unas gotas de cido sulfrico concentrado (JT Baker,
USA), dando la formacin de un anillo de color rojo en
la interfase por lo que se consider positiva la prueba.
Posteriormente se aplic una porcin del extracto di-
suelto en cloroformo sobre una placa de slica gel 60
F254 (Merck) y se resolvi con una mezcla de hexano:
diclorometano (9:1), fnalmente se revel con luz ultra-
violeta de onda corta y con yodo.
Resultados
En la concentracin de 75 g/disco, el extracto hex-
nico de las semillas inhibi el crecimiento de las bac-
terias (55.0 66.7%). Con las concentraciones de 7.5
y 0.75 g/disco se inhibi un 6.3% el crecimiento de P.
mirabilis. En el caso de Salmonella typhimurium se in-
hibi el crecimiento en 4.2% a la concentracin de 7.5
g/disco (Cuadro 1).
En el anlisis ftoqumico se detect la presencia
de compuestos terpenoides. El anlisis cromatogrfco
mostr 6 manchas que corresponden a 6 compuestos
diferentes.
Discusin
En este trabajo encontramos que el extracto hexnico
de las semillas, dosis de 75 g/disco inhibe ms de un
50% el crecimiento de todas las bacterias probadas. El
grupo de compuestos presentes en el extracto son del
tipo de los terpenoides/esteroles y la placa de croma-
tografa mostr seis manchas por lo en este extracto
existen al menos seis compuestos diferentes.
Dentro del grupo de compuestos que conforman
a los terpenos encontramos a los monoterpenos,
sesquiterpenos, diterpenoides, triterpenos y
carotenoides (Harbone, 1998).
Entre los monoterpenos con actividad contra
Staphylococcus se encuentran -terpineno, -tepineol,
terpinen-4-ol y linalol los cuales presentan concentraciones
mnimas inhibitorias (MIC, siglas en ingls) en el rango
de 0.125 -0.25%. Estos monoterpenos se aislaron de
Melaleuca alternifolia y el compuesto terpinen-4-ol fue el
compuesto ms activo contra bacterias gram-negativas
(Gibbons, 2004). Se aisl de Artemisia asiatica el 1,8-
cineol, monoterpeno activo contra Staphylococcus (MIC
= 2 l/ml), E. coli (MIC=3 l/ml) y P. aeruginosa (MIC=3
l/ml) (Kalemba et al 2000).
Las sesquiterpenlactonas 6-O-metilacrililplenolina,
6-O-isobutiroilplenolina y 6-O-angeloilplenolina se
aislaron de Centipeda minima, planta empleada en la
medicina tradicional de Nepal para tratar infecciones
y las tres mostraron actividad contra Bacillus subtilis,
Staphylocococcus aureus (Taylor & Towers, 1998).
Los dieterpenos constituyen el grupo ms grande de
compuestos de origen natural que presentan actividad
contra los Staphylococcus (Gibbons, 2004) y entre
estos se encuentra el isopimarano que tambin acta
sobre B. subtilis (MIC=4 g/ml) y se sugiere que daa
la membrana, aunque se desconoce el mecanismo
de accin especifco (Woldemichael, 2003). El cido
Extracto/
Control
Cepas bacterianas empleadas
g/disco S. thyphimurium E.coli S.typhi S. fexneri P.mirabilis S. aureus
75 56.43 66.66 55 59.99 62.50 65.0
7.5 --4.16 -- -- -- 6.25 --
0.75 --- -- -- -- 6.25 --
DMSO 10% 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Penicilina-
estreptomicina
5 UI/5 g
100 100 100 100 100 100
Cuadro 1. Actividad antibacteriana del extracto hexnico de P.major y penicilina-estreptomicina. Porcentaje de inhibicin
(n=9).
80
beyerenico es un diterpeno aislado de Viguiera
hypargyrea, posee actividad contra Staphylococcus
aureus y Enterococcus faecalis (MIC=12 g/ml),
(Zamilpa et al, 2002).
Entre los triterpenos existen 2 nor-friedelanos
aislados de Crossopetalum gauneri con una potencia
excelente contra S. epidermis (MIC=0.54 -1.11 M) ya
que son ms potentes que el cloranfenicol (MIC= 12.4
M) (Ankli et al, 2000).
Dado que P. major ha sido usado para diferentes
propsitos en la medicina tradicional mundial, se han
estudiado y demostrado diversas actividades biolgicas
de la planta. La mayora de las pruebas se han realizado
con extractos crudos sin examinar la naturaleza de
los compuestos activos (Samuelsen, 2000). Entre las
actividades evaluadas se encuentra la antibacteriana de
los extractos, metanlico, etanlico al 50% y etanlico
al 70%, determinada por el mtodo de difusin en
disco. El extracto metanlico fue el ms activo contra
S. typhimurium y present la actividad dbil contra S.
aureus resistente a la meticilina y Mycobacterium phlei
(McCutcheon et al, 1992). El extracto etanlico al 50%
fue activo contra S. aureus, B. subtilis, S. dysenteriae
y E. coli (Cceres et al, 1987). El extracto obtenido
con etanol al 70% fue ms efcaz contra S. fexneri
(Moskalenko 1986) y present actividad dbil contra S.
aureus (Cceres et al, 1990), S. sonnei, (Moskalenko
1986) y E. coli (Cceres et al, 1990). Debido a que los
extractos se obtuvieron empleando disolventes polares,
se esperara que los metabolitos activos no son de tipo
terpenoide, siendo este trabajo el primero que reporta
actividad antibacteriana de las semillas en solventes
no polares
Con la planta completa de P. major se prepararon
extractos con etanol, metanol y agua y se probaron sobre
S. aureus, B. subtilis, E. coli, C. albicans y C. tropicalis
y fueron los extractos obtenidos con metanol los que
tuvieron actividad antimicrobiana contra bacterias Gram
positiva y Gram negativa tales como el S. aureus (MIC
= 100 mg/ml), E. coli (120 mg/ml). El extracto etanlico
tambin mostr actividad contra S. aureus (MIC=200
mg/ml) y E. coli (140 mg/ml). Se observ, mediante
microscopia electrnica de barrido, que despus de
exponer a E. coli y S. aureus en presencia de 200 mg/
ml del extracto metanlico y etanlico la pared celular
de S. aureus se deform produciendo ondulaciones en
las clulas las que tambin se pegaron. (Sharifa et al,
2008).
De las partes areas de P. major se ha aislado
la aucubina que es un iridoide glucosilado y es el
aglicn de la aucubina, la aucubigemina, compuesto
que presenta actividad antimicrobiana y antifngica
(Samuelsen, 2000). La aucubigemina es un principio
activo importante y es durante su catabolismo por
hidrlisis, se forma un dialdehdo que acta como
bactericida ya que desnaturaliza las protenas de ciertos
microorganismos (Blanco et al, 2008). La actividad
bactericida del extracto hexnico no se atribuye a
la aucubina ya que esta sustancia se extrae en los
extractos obtenidos con metanol.
Conclusin
En el presente trabajo mostramos que el extracto hex-
nico de las semillas de Plantago major L. inhibi en una
concentraron baja el crecimiento de las seis bacterias
probadas, algunas de ellas consideradas como los
agentes causales de infecciones gastrointestinales. Por
lo que consideramos que el presente estudio respalda
el conocimiento y uso popular de esta planta contra las
infecciones bacterianas del aparato digestivo, y propor-
ciona nuevo conocimiento de las propiedades qumicas
de esta planta.

Agradecimientos
Esta investigacin se realiz con el apoyo parcial de
PROMEP, en apoyo a los cuerpos acadmico, a travs
del convenio 907011-14610757.
Agradecimientos
Agradecemos del personal del Herbario de la Universi-
dad Autnoma Metropolitana Iztapalapa en la identif-
cacin de las muestras vegetales de Plantago major L.
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82
83
RESUMEN
Objetivo: Establecer si el tipo de placebo utilizado puede,
o no, infuir los resultados de ensayos clnicos de acu-
puntura.
Diseo: Meta-anlisis de los resultados segn el diseo
del placebo. Noventa publicaciones pudieron ser clasif-
cadas en uno de dos grupos: i) 45 ensayos clnicos con
seudo-acupuntura consistente en pinchar fuera del meri-
diano, pero cerca del acupunto clsico, clasifcados como
modelo energtico de placebo (EPM). ii) 45 estudios cuyo
placebo consisti en punzar en zonas distantes de los
puntos activos; clasifcados como modelo metamrico
o neurofsiolgico de placebo (MPM). En ambos grupos
de publicaciones, se evalu la proporcin de resultados
signifcativos y la distribucin de resultados de no-signi-
fcativos con alivio mayor de 35% en ambos grupos de
pacientes, mediante la prueba de Chi-cuadrado.
Resultados: La proporcin de resultados signifcativos fue
apreciablemente ms alta en el grupo MPM (73.33%), (p
<0,03). El grupo EPM, arroj 80% de resultados no-signi-
fcativos con alivio mayor de 35%. (p <0,05).
Conclusin: La falsa acupuntura (EPM) emergi tan acti-
va como acupuntura verdadera por tato es un pseudos-
placebo. Lo que sugieren que el procedimiento placebo
empleado s determina el resultado, -xito o fracaso- de
un ensayo clnico de acupuntura, para obtener diferen-
cias entre grupos comparables, aun cuando stas real-
mente existan.
Palabras claves: Meta-anlisis Acupuntura, acupuntura
sham, modelo de placebo neurofsiolgico o segmenta-
rio.
Does the Choice of Placebo Determine the Results of
Clinical Studies on Acupuncture?
Abstract
Objective: To establish whether the choice of the place-
bo treatment used may infuence the outcomes of clinical
trials on acupuncture or not.
Design: A meta-analysis of outcomes according to the
choice of the placebo of ninety publications classifed into
one of two groups: i) 45 clinical trials with sham-acupunc-
ture, (needling outside the meridian, but near to classical
acupoints) classifed as energetic placebo model (EPM).
ii) 45 studies whose placebo treatment was needling
within a zone far enough from the active points, classifed
as metameric placebo model (MPM). In both groups of
Determina el diseo del placebo los resultados de los
ensayos clnicos de acupuntura?
Meta-anlisis de 100 ensayos clnicos
Does determine results of the clinical outcomes of
acupuncture the design of the placebo?
Meta-analysis of 100 clinical assays.
Max Snchez-Araujo
Clnica Mdica de la Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda. Unidad de Investigacin de Terapias
Complementarias. Coro, Venezuela. Instituto de Investigacin de Salud y Teraputica, INSYT Caracas, Venezuela.
Autor para correspondencia: Max Snchez-Araujo
Instituto de Investigacin de Salud y Teraputica, INSYT
Av. Ro de Janeiro, Edif. San Jacinto, Ofc. 3, Las Mercedes,
Caracas 1060, Venezuela.
Direccin electrnica: maxsanchez@cantv.net
84
publications, the proportions of signifcant results and the
distribution of nonsignifcant results with improvements in
both groups of patients greater than 35% were assessed
by the chi-square test.
Results: The proportion of meaningful results was signi-
fcantly higher in the MPM group (73.33%), (p < 0.03). In
the EPM group 80% showed nonsignifcant results with
improvements greater than 35% in both groups of pa-
tients. (p <0.05).
Conclusion: Sham acupuncture (EPM) appears almost
as active as real acupuncture. Thus, these results su-
ggest that placebo procedures can determine the outco-
me, i. e. success or failure of a clinical trial of acupuncture
to obtain differences among compared groups, in case
they actually exist.
Key words: Meta-analysis, Acupuncture, sham acupunc-
ture, neurophysiologic o metameric placebo model.
Introduccin
En el ltimo cuarto de siglo se ha incrementado noto-
riamente la investigacin bsica y clnica de la acupun-
tura. En general, puede asumirse, que los mecanismos
bsicos de la acupuntura se han establecido sufcien-
temente; no obstante, su validacin clnica es todava
incipiente. Muchos trabajos conducen a conclusiones
contradictorias por meras fallas metodolgicas de diver-
sa naturaleza e importancia que diezman la calidad de
las publicaciones (1, 2). Dos meta-anlisis de acupun-
tura para el dolor crnico arrojaron resultados contra-
dictorios (1-4). Algunos autores llegan incluso a dudar
que sea posible evaluar los efectos de la acupuntura
mediante los procedimientos utilizados en los estudios
clnicos comparativos controlados, de acuerdo con las
reglas de Occidente (5, 6). Independientemente de la
calidad del diseo, se han podido identifcar tres gran-
des grupos de difcultades inherentes a la acupuntura,
a saber: a) no existe una regla clara y prctica para la
escogencia del tratamiento de acupuntura que se apli-
car al grupo experimental, el cual debe respetar los
principios de la teraputica con acupuntura y, al mismo
tiempo, debe ser equiparable de un sujeto a otro dentro
de dicho grupo (7, 8). b) Difcultades relativas a la for-
ma de enmascaramiento para mantener la posibilidad
de contrastar a los grupos en el curso del estudio y, en
fn, c) la falta de defnicin de un procedimiento placebo
adecuado para la acupuntura. Este ltimo aspecto pa-
rece de gran relevancia, pues las discrepancias en la
defnicin del placebo ideal para la acupuntura consti-
tuye, probablemente, la fuente ms importante de hete-
rogeneidad y contrastes en los resultados de los ensa-
yos clnicos de acupuntura, pues conduce a resultados
contradictorios (9). Existen dos grandes tendencias en
el diseo (10, 11), a saber: uno que sigue el modelo
energtico tradicional, que consiste en colocar la aguja
placebo cerca del punto activo (acupuntura real), pero
fuera del meridiano; el otro, concebido bajo un modelo
que podramos califcar de neurofsiolgico, porque, de
alguna manera, toma en cuenta la estructura neurol-
gica subyacente y el comportamiento funcional de las
metmeras o, simplemente, toma precauciones para
no activar el DNIC (12).
El impacto de la imaginacin, las creencias y
las emociones en el proceso de curacin ha sido
reconocido desde hace mucho tiempo (13, 14) Este
fenmeno sorprendente, capaz de modifcar el curso
de una enfermedad, es lo que se denomina efecto
placebo. Desde los aos cincuenta, mediante el empleo
de diferentes formas farmacuticas, inyecciones,
tabletas, cpsulas, grageas, ungentos, etctera,
se ha establecido que el efecto placebo proporciona
entre el 30 y 35% de la respuesta teraputica. (15) El
efecto de un tratamiento cualquiera viene dado por la
suma del efecto teraputico, ms el efecto placebo del
producto o procedimiento en cuestin, ms el efecto
de la interaccin paciente-terapeuta. As, la accin
del placebo es una mezcla de auto y heterosugestin
con componentes psicolgicos y socioculturales cuyos
efectos son impredecibles. (16) La imposibilidad de
predecir el efecto placebo hace necesario el diseo de
ensayos placebo controlados para la mayoras de los
estudios clnicos (17).
Dadas las evidencias que sealan la seleccin
del procedimiento placebo en los ensayos clnicos de
acupuntura como una eventual fuente de distorsin de
los resultados que origina controversia y frustracin, el
objetivo del presente trabajo es responder la pregunta:
Es determinante la forma en que se disea y ejecuta
el placebo en el resultado de los ensayos clnicos de
acupuntura?
Material y mtodos
Se revisaron los ensayos clnicos aleatorizados y con-
trolados con placebo de acupuntura en el tratamiento
de diversas afecciones dolorosas y no dolorosas toma-
dos a travs de una bsqueda on line en el MEDLINE
desde 1975 hasta 1989, combinada con bsquedas en
MEDLINE CD ROM y en la ACUBASE de la Universi-
dad de Montpellier desde 1989 hasta 1995 (Palabras
claves: acupuncture, clinical trial, sham acupuncture,
therapy, treatment). Adems se escudri en las re-
ferencias bibliogrfcas de los artculos mas importan-
tes.
85
A. Haciendo abstraccin de los otros aspectos
metodolgicos, se enfoc la atencin, exclusivamente,
en lo relativo al diseo del placebo. De acuerdo al
modelo de placebo utilizado, las publicaciones fueron
clasifcadas en dos grupos: a) grupo de publicaciones
con modelo energtico del placebo (MEP) y b) grupo
de publicaciones con modelo metamrico del placebo
(MMP). En el estudio no se acept como placebo los
procedimientos que obviaban la insercin de agujas.
Fueron descartados para evitar los sesgos relacionados
con el objeto de este trabajo: establecer si existe o no
diferencia en los resultados de ensayos en los que la
estimulacin nociceptiva de la piel se ejecuta fuera y
dentro del dermatomo donde se ubica el punto real.
B. Se denomin modelo energtico de placebo
(MEP) al procedimiento que empleaba como falso tra-
tamiento la aplicacin de las agujas fuera del meridiano,
en un sitio cercano al punto de acupuntura real (sham
acupuncture), puesto que se basa en el criterio de que
las agujas aplicadas fuera del meridiano, no tendrn
efecto, pues, al no interferir con el fujo de energa en
los canales, no pueden restablecer el equilibrio ener-
gtico.
C. El modelo metamrico o neurofsiolgico de
placebo (MMP) es el procedimiento de colocar las
agujas del grupo control en un dermatomo diferente y
sufcientemente alejado de los puntos activos usados
en el grupo experimental, porque toma en cuenta la
arquitectura metamrica del cuerpo y comportamiento
funcional de las metmeras.
En ambos grupos de publicaciones se estudi a)
la distribucin de resultados signifcantes de acuerdo
al tipo de placebo empleado y b) la distribucin de
resultados no signifcantes acompaados de una
tendencia a la mejora de los sntomas, en el grupo
tratado y en el grupo control. Para tal fn, en los trabajos
con este tipo de resultados, se precis, cuando fue
posible, si en los grupos comparados la proporcin
de sujetos con mejora de algunos de los criterios de
juicio era signifcativamente mayor del 35%; es decir,
superior a la esperable por el simple efecto placebo.
Con este objeto, se escudri en los resultados para
establecer si exista explcitamente esta informacin.
En su defecto, cuando era posible, se proceda a
explorar los datos para ver si esta informacin estaba
consignada de manera indirecta.
Anlisis estadstico
A. Se compar el porcentaje de resultados con diferen-
cias no signifcativas obtenidos en los dos grupos de
ensayos clnicos (MEP y MNP, de manera respectiva).
Se emple la siguiente hiptesis nula: ambos modelos
de placebo son equiparables, por tanto debe haber una
proporcin equivalente de buenos resultados en am-
bos grupos de publicaciones. El anlisis estadstico se
realiz mediante una prueba de Chi Cuadrada.
B. En ambos grupos de publicaciones, se compar
adems, la distribucin de resultados no signifcativos
asociados con una mejora de los sntomas superior
al 35% tanto en el grupo tratado como el de control.
En este caso se emple la siguiente hiptesis nula:
si ambos modelos de placebo son equivalentes, la
proporcin de trabajos con este gnero de resultados
ser similar entre los dos grupos de publicaciones. El
anlisis estadstico se realiz mediante la prueba de
Chi Cuadrada.
Resultados
Cumplieron los requisitos de inclusin 127 estudios
clnicos comparativos. Se observaron cuatro grandes
tendencias en el diseo de los ensayos clnicos: a)
estudios clnicos con modelo energtico del placebo
(MEP): 35,43 % (45/127); b) estudios clnicos con mo-
delo metamrico de placebo ( MMP): 35,43 % (45/127);
c) acupuntura comparada con un tratamiento de refe-
rencia: 21,26 % (27/127) y d) acupuntura comparada
con un grupo sin tratamiento: 7,87 % (10/127) Los gru-
pos c y d fueron descartados para este estudio. (En
total: 37 publicaciones c. Acupuntura vs. tratamiento de
referencia o Mock TENS o TENS apagado: 27 trabajos
y d) acupuntura versus no-tratamiento: 10 trabajos, ver
Figura 1.
En el grupo MEP slo se observaron diferencias
signifcativas en el 33.33 % (15 / 45); mientras que en
el grupo MMP se obtuvo diferencias signifcativas en
el 73.33 % de los trabajos (33 / 45), la prueba del X
2

seala una diferencia signifcativa (p <0.03) en ambos
grupos de publicaciones; es decir, el modelo energti-
co de placebo (MEP) fracasa ms frecuentemente en
discernir diferencias que el modelo metamrico (MMP)
(Figura 2). Por otra parte, en los trabajos con modelo
energtico (MEP) fue mas frecuente la situacin de re-
sultados no signifcantes con alivio signifcativo de los
pacientes de ambos grupos. (En el grupo MEP: 80 %
(24/30) y en grupo MNF: 20 % (6/30) con una diferen-
cia signifcativa: p < 0.05; lo que subraya que la colo-
cacin de agujas fuera del meridiano pero dentro de la
misma metmera tiene un efecto similar al del punto
clsico (Figura 3).
86
Discusin
Los resultados encontrados son consistentes con la
hiptesis de que la forma cmo se disea y ejecuta el
placebo s determina los resultados de la investigacin
clnica en acupuntura. Es decir, el diseo del placebo
puede defnir el xito o el fracaso de un ensayo clni-
co para obtener diferencias signifcantes entre el grupo
tratado y el grupo control. Esto sugiere que el efecto
producido por el punto fuera del meridiano pero en el
mismo dermatomo es muy similar al obtenido por es-
timulacin del punto real, debido a la arquitectura me-
tamrica del cuerpo. Por lo tanto, la aplicacin de las
agujas fuera del meridiano parece constituir un falso
placebo; en cambio la colocacin de las agujas placebo
fuera de la metmera afectada no acta sobre los sn-
tomas del paciente y constituye un verdadero placebo.
Desde hace mucho tiempo se haban identifcado
difcultades para la ejecucin del placebo para la
acupuntura (1-4). Por supuesto, desde el paradigma
energeticista, era lgico pensar que bastaba colocar las
agujas fuera del punto del meridiano (sham acupuncture),
porque se supona que este procedimiento, incapaz de
interferir con el fujo energtico, no tendra efecto alguno.
Por esta razn la sham acupuncture se convirti en el
placebo ideal para los cultores de la investigacin clnica
de la acupuntura y en una importante fuente de confusin
y controversias. As, Gaw et al. (18) en un riguroso estudio
clnico pionero, compararon acupuntura real y placebo-
acupuntura (sham Acupuncture) en pacientes con dolor
osteoartrtico en varias regiones del cuerpo. El placebo
consisti en la aplicacin de agujas en puntos cercanos
a los acupuntos reales, pero fuera del meridiano. Los
resultados mostraron una signifcativa mejora del dolor
y de la movilidad articular en ambos grupos, pero sin
diferencias signifcativas entre la acupuntura real y el
placebo. Desde entonces y de manera consistente,
los ensayos que comparan acupuntura con sham
acupunture han venido arrojando resultados similares. En
cambio, cuando se han empleado condiciones placebo
sin puncin, con mayor frecuencia se han reportado
resultados signifcativamente superiores con acupuntura
(19). De igual forma, otros autores, desconociendo
la estructura metamrica, han usado inyeccin de
agua destilada o lidocana como placebo, ignorando,
adems, que basta la perturbacin producida por una
aguja para desencadenar la respuesta de la metmera
(20). Actualmente, est bien establecido que inyectar
agua destilada o anestsico tiene un efecto al menos
tan potente que la aplicacin de agujas secas (21, 22).
En cambio, Duplan et al. (23) s obtuvieron diferencias
signifcantes usando sham-acupunture como placebo
en la citica aguda; pues al colocar las agujas fuera del
meridiano, en la regin lumbar (L4-L5) las aplicaron en
Figura 1. Grandes tendencias en el diseo de los
ensayos clnicos
Metameric
Placebo
35%
Metameric Placebo C D Energetic Placebo
Energetic
Placebo
36%
D
8%
C
21%
Metameric Placebo Energetic Placebo
Non Significant P<0,05
67% 33% 27% 73%
0
5
10
15
20
25
30
35
30
33
15
12
Metameric Placebo Energetic Placebo
RELIEF Rate >35% RELIEF Rate <35% NO INFORMATION
0
5
10
15
20
25
15
Figura 2. Distribucin de los resultados de acuerdo al
diseo del placebo
Figura 3. Resultados no significativos con notable
alivio en ambos grupos de pacientes.
87
una metmera diferente (D12-L1), lo cual explica el xito
de la acupuntura sham en esta caso. As mismo Luu et
al. (24), usando como placebo puntos colocados en las
extremidades inferiores obtuvieron diferencias altamente
signifcativas en el volumen espiratorio mximo en un
segundo entre los grupos.
Todo parece indicar que si no se toma en cuenta la
neurobiologa y la estructura metamrica del cuerpo, se
corre el riesgo de continuar desarrollando estudios que
utilizan la llamada sham acupunture como placebo y de
esta forma, sin proponrnoslo, sabotear los resultados de
los ensayos clnicos de acupuntura, como en el reciente
trabajo de Takeda y Wessel, (25), en el que se compar
acupuntura y sham acupuncture para el tratamiento del
dolor osteoartrtico de las rodillas y, al igual que Gaw,
19 aos antes, concluyeron errneamente, que la
acupuntura es equivalente al placebo.
Esta difcultad para obtener diferencias signifcantes
entre acupuntura real y acupuntura placebo, haba sido
interpretada de varias maneras: a) ambos tratamientos
ejercen su efecto a travs de factores placebo; b) la
acupuntura placebo es un tratamiento especfco
igualmente efcaz; la localizacin de los puntos es
irrelevante (26); c) existen pequeas diferencias entre
la acupuntura verdadera y la falsa, pero no ha sido
detectada por los investigadores por que se necesitaran
inusualmente grandes nmeros de sujetos en ambos
grupos y el empleo de instrumentos estadsticos
particularmente sensibles para poderlas discernir (27,
28). Sin embargo, los resultados del presente meta-
anlisis sugieren que el efecto producido por el punto
fuera del meridiano es muy similar al del punto de
acupuntura real, si est dentro de la metmera afectada,
lo cual ya haba sido observado por Chien-Ping (29).
Por lo tanto, para evitar el Error Tipo II, (que consiste
en descartar errneamente un tratamiento como falso,
cuando realmente es activo, por falta de robustez de la
prueba estadstica empleada), en lugar de un nmero
muy alto de sujetos y el empleo de instrumentos
estadsticos especiales para discernir el grado de
signifcacin, cuando la hubiere, puede resultar mucho
ms prctico y sencillo tomar en consideracin la
estructura metamrica del cuerpo y colocar las agujas
placebo en zonas separadas, al menos, por tres o
cuatro segmentos del dermatomo donde se aplican las
agujas del tratamiento real.
En otro lugar hemos sugerido que las zonas placebo
ideales del cuerpo estaran ubicadas en sitios donde
msculos voluminosos separan la piel de los paquetes
vasculares y nerviosos importantes; por ejemplo en la
regiones deltoidea y gltea (30). Estas zonas placebo
fueron validadas recientemente por Lux y Col., quienes
compararon electroacupuntura del dermatomo gstrico
con la electroestimulacin de la regin deltoidea y
no encontraron infuencia alguna de la manipulacin
placebo en la funcin gstrica (31).
Esta situacin no ha cambiado por que parece que
los investigadores Occidentales han sido proclives a
cambiar su propia metodologa que a poner en tela de
juicio el legado de los antiguos mdicos chinos. Todo
parece indicar que no podemos seguir aceptando como
algo defnitivamente acabado e inmutable, el legado del
pasado, de la tradicin, so pena de ser castigados.
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15: 268.
Nota
Versiones previas y en idioma ingls de este trabajo han
sido presentadas y publicadas de la siguiente manera:
a) 3er. Simposium Cientfco de Einsiedeln, Suiza, en oc-
tubre de 1997 y seleccionado para su publicacin.
b) Methods and Design of a Pragmatic Clinical Resear-
ch, Oriented towards Patient Beneft
3rd Scientifc Symposium of Einsiedeln
October 16-19, 1997 Einsiedeln, Switzerland
Editor Johannes G. Schmidt, Einsiedeln
c) Studien zu Placebo Studies on Placebo
M. Snchez Araujo Does the Choice of Placebo Deter-
mine the Results of Clinical Studies on Acupuncture?
Forschende Komplementrmedizin Vol. 5, Suppl. 1, 8-
11, 1998
d) Forschende Komplementrmedizin und Klassische
Naturheilkunde/Research in Complementary and Clas-
sical Natural Medicine 1998;5 (Suppl. 1):8-11 (DOI:
10.1159/000057100).
89
Resumen
Cualquier tratamiento mdico se encuentra enmarcado
en un contexto cultural y cosmovisin particulares que
contribuyen de manera importante en el resultado del
tratamiento. El efecto placebo es la mejora de la per-
sona enferma que se observa tras un tratamiento simu-
lado que no tiene elementos de un tratamiento activo.
El objetivo de este trabajo es examinar los mecanismos
del efecto placebo que son comunes con los cambios
orgnicos que se observan tras la administracin de
acupuntura.
Estudios recientes basados en neuroimagenologa
funcional han mostrado que la expectativa de dolor
genera cambios en la actividad de la corteza prefrontal
dorsolateral y orbitofrontal. Estos cambios se detectan
de manera anticipada antes de la experiencia dolorosa,
lo que sugiere que dichas estructuras pueden forma
parte de un sistema comprometido en el control
cognitivo del dolor. Una vez que el sujeto experimenta
el estimulo nociceptivo, diversos estudios han
mostrado que el placebo produce una reduccin de
actividad en regiones corticales que de manera clsica
se relacionan con el procesamiento nociceptivo, nsula
anterior y rea rostral del cngulo, principalmente. En
estas regiones la atenuacin del procesamiento del
dolor parece ser mediada por la liberacin de opioides.
En la analgesia por placebo se coordinan al menos dos
sistemas cerebrales anatmicamente diferenciados.
El mecanismo inductor parece estar localizado
prefrontalmente y activarse inicialmente. Este sistema
puede ejercer infuencia sobre otras regiones corticales
(cngulo e nsula) atenuando en estos niveles superiores
el procesamiento de informacin nociceptiva. De
manera semejante la acupuntura empleada con fnes
analgsicos se ha demostrado ejerce su accin a
travs de estos mismos mecanismos.
Palabras clave: efecto placebo, acupuntura, mecanis-
mos de la acupuntura, dolor
Abstract
Any medical therapy is framed in a cultural and cosmo-
vision context this view could contribute in an important
way in the result of the healing process. The placebo
effect is the improvement of the sick person observed
after a simulated treatment that does not any active
component. The objective of this work is to examine
the common mechanisms of the placebo effect and
the organic changes observed after the acupuncture
treatment. Recent studies based on functional neuro-
imagenology have shown that the expectation of pain
generates changes in the activity of the prefrontal dor-
solateral and orbitofrontal cortex. These changes are
detected before the painful experience, this fact sug-
gested that these structures could form part of a system
involved in the cognitive control of the pain. Once the
subject experiences nociceptive stimulus, diverse stud-
Efecto placebo y acupuntura:
mecanismos comunes en analgesia?
Placebo effect and acupunture:
shared mechanisms in analgesia?
Miguel J. Reyes-Campos, Livia G. Daz-Toral, Jos Luis Flores-Senz, Jos Federico Rivas-Vilchis
Departamento de Ciencias de la Salud, Especializacin en Acupuntura y Fitoterapia,
Universidad Autnoma Metropolitana Iztapalapa, Mxico.
Autor para correspondencia: Dr. Jos Federico Rivas-Vilchis
Especializacin en Acupuntura y Fitoterapia, Departamento de Ciencias de la Salud,
Universidad Autnoma Metropolitana - Iztapalapa
e-mail: jfrv@xanum.uam.mx
90
ies have shown that the placebo produced a decrease
of brain cortical regions activity usually related with the
nociceptive processing mainly in the insula and ros-
tral cingulated. In these regions the amiloration of the
pain processing seems to be elicited by the liberation
of opioides. In the analgesia by placebo at least two
different cerebral systems are coordinated. The trig-
ger mechanism seems to be located in the prefrontal
cortex and to be activated initially. This system can ex-
ercise infuence on other cortical regions (cingulo and
insula) reducing in that upper levels the processing of
nociceptive information. In similar way the acupuncture
treatment of pain has been shown to act through these
same mechanisms.
Key words: placebo effect, acupuncture, acupuncture
mechanisms, pain
Introduccin
La investigacin en el efecto placebo est en auge, en
parte debido a el inters en tratamientos complementa-
rios como la acupuntura (Vallance AK, 2006). Desde la
antigedad el hombre ha credo que recurrir a ciertas
prcticas mdicas puede ejercer una infuencia positiva
sobre su salud. Estas creencias y expectativas se re-
lacionan con su educacin, cultura y cosmovisin. Un
ejemplo actual de lo anterior es el efecto placebo. Para
comprender adecuadamente este fenmeno hay que
tener en cuenta que cualquier tratamiento -dentro de
un sistema mdico formal o informal- est rodeado por
un contexto psicosocial y cultural que puede infuir en
el resultado teraputico. Desde el punto de vista del
mtodo cientfco, para analizar el efecto especfco del
contexto que rodea al tratamiento se hace necesario
eliminar la accin producida por el tratamiento (p. ej.,
la administracin de un medicamento determinado) y
reproducir en todos los aspectos el contexto psicoso-
cial concreto. Lo anterior se lleva a cabo aplicando un
tratamiento simulado (es decir, un placebo). As, el pa-
ciente cree que el tratamiento que est recibiendo es
activo y espera una mejora clnica. El efecto placebo
es la mejora que se observa tras el tratamiento simula-
do. Por ejemplo, en el caso del dolor, el propio contexto
asociado al tratamiento puede aun sin la aplicacin de
medicamento analgsico alguno, reducir o eliminar el
procesamiento nociceptivo, alcanzndose una analge-
sia signifcativa (Colloca y Benedetti, 2005).
Diversos estudios han mostrado que el efecto placebo
es decir el contexto del tratamiento ms las creencias
y expectativas de los pacientes pueden producir un
efecto semejante a ciertos niveles de dosifcacin de
algunos medicamentos activos como la morfna. Y
se ha mostrado en estos mismos estudios que para
superar al efecto placebo es necesario agregar dosis
adicionales en este caso de morfna (Levine y Gordon,
1984; Levine et al., 1981). Por lo tanto, podemos afrmar
que el efecto placebo es un fenmeno psicobiolgico y
cultural. ste puede ser empleado como un modelo para
investigar como los procesos cognitivos de la actividad
mental relacionados a expectativas y creencias de
curacin y procesos de condicionamiento interactan
con los diferentes sistemas cerebrales para promover
respuestas fsiolgicas y conductuales de adaptacin
y respuesta a procesos nosgenos. Por otro lado,
este fenmeno debera ampliar nuestra concepcin
acerca de los lmites de las capacidades endgenas
de adaptacin de nuestro propio organismo. Ahora es
un tema importante de estudio el estudio de aspectos
subjetivos de la persona cuyas expectativas, creencias,
valores y condicionamientos son aspectos que son
posibles de investigar, y que existen mecanismos
neurales relacionados con estos procesos subjetivos
que a su vez pueden modular positivamente ciertos
aspectos homeostticos (Wager, 2005).
La investigacin actual del efecto placebo ha
mostrado que los constructos subjetivos como las
expectativas y los valores tienen bases fsiolgicas
identifcables que pueden actuar como moduladores
de procesos homeostticos (Benedetti et al., 2005). La
evidencia creciente publicada acerca del efecto placebo
como un fenmeno subjetivo legtimo acompaado de
cambios fsiolgicos medibles contradice de manera
importante la visin de que las respuestas placebo
refejan slo una respuesta distorsionada o errores
de metodologa de algunas publicaciones (Wager
et al., 2004; Petrovic et al., 2002). La evidencia ms
defnitiva de la existencia legtima del efecto placebo
proviene de trabajos experimentales que destacaron
el bloqueo qumico del sistema opioide endgeno
por medio de naloxona que puede revertir el efecto
placebo demostrado claramente de manera previa
(Benedetti y Amanzio, 1997; Benedetti, 1996; Amanzio
y Benedetti, 1999). De igual manera, se ha demostrado
experimentalmente que la naloxona es capaz de
bloquear la analgesia mediada por la acupuntura
(Mayer et al., 1977; Cheng y Pomeranz, 1980; Sjolund
y Eriksson, 1979; Han et al., 1986). En este artculo
revisamos algunos de los mecanismos biolgicos
relacionados con el efecto placebo y la aplicacin de
la acupuntura en el control del dolor y discutimos los
mecanismos fsiolgicos comunes que comparten
ambos fenmenos.
91
Estudio actual del efecto placebo
El trmino placebo proviene de una palabra latina que
signifca de manera literal complacer. Se empleo en a
partir del siglo XVIII para signifcar medidas mdicas
para complacer al paciente ms que lograr un bene-
fcio teraputico real (Cavannaa et al., 2007). El con-
cepto moderno de efecto placebo, signifca un cambio
real en el estado de la enfermedad inducido por el va-
lor simblico de la medicina ms que el resultado de
un efecto teraputico especfco. El efecto placebo se
comprende de manera actual en la comunidad mdica
como una respuesta teraputica inducida por proce-
dimientos verbales o de comportamiento que operan
por medio de las creencias de los pacientes en el po-
der teraputico del placebo (Szawarski, 2004)
El diseo tpico utilizado habitualmente para examinar
el efecto analgsico de cualquier procedimiento
farmacolgico o no farmacolgico es el doble ciego.
En este caso a un grupo de pacientes se les aplica el
tratamiento activo, mientras que a un segundo grupo
se les proporciona tratamiento placebo que es igual al
del primer grupo en todo, salvo en la sustancia aplicada.
Puesto que es un diseo doble ciego, ni el investigador
o los pacientes conocen que tratamiento recibe cada
grupo. A los pacientes se les dice que van a recibir el
tratamiento activo o el placebo, con una probabilidad del
50%. Para concluir que el tratamiento activo es efcaz,
sus efectos deben ser superiores a los obtenidos en el
grupo placebo. Sin embargo, para fnes del estudio del
efecto placebo, con este procedimiento no es posible
aislar de manera confable el efecto placebo. La nica
manera de apreciar dicho efecto es introduciendo un
segundo grupo control que recibe el tratamiento activo
de manera no evidente, sin que lo sepa el propio sujeto.
De esta manera se elimina especfcamente el contexto
psicosocial y las expectativas cognitivas de alivio del
paciente, dejando al frmaco administrado como nico
responsable de la mejora observada (Kiersch y Weixel,
1988).
Procesos subyacentes a la analgesia por
placebo
La analgesia placebo puede ser debida a la expectativa
del benefcio clnico y el condicionamiento pavloviano
con o sin intervencin de mecanismos opioides. Una
idea emergente es que los efectos placebo basados
en expectativas son mediados por opioides, pero los
efectos placebo condicionados son dependientes de
otros mecanismos (Wager et al., 2007. Se sabe que los
opioides endgenos tienen un papel fundamental en la
analgesia inducida por expectativa, pero sin embargo
el conocimiento respecto a estos fenmenos es esca-
so (Benedetti et al., 2003; Pollo et al., 2001; Stewart-
Williams y Podd, 2004). Un aspecto importante es el
referente a los diferentes mecanismos que median este
fenmeno y cuales son opioides o no opioides. Al pa-
recer los sistemas neuroqumicos subyacentes sern
opioides o no opioides cuando el efecto placebo est
relacionado con expectativa (Wager y Nitchke, 2005;
Benedetti et al., 2003) o condicionamiento clsico (Vo-
udoris et al., 1989; Stewart-Williams y Podd, 2004), de
manera respectiva.
El placebo activado por opioides endgenos y
generado por expectativas cognitivas de alivio del dolor
presenta una especifcidad somatotpica. En un estudio
en el cual se inyect capsaicina por va subcutnea,
que produce una sensacin dolorosa de quemazn,
simultneamente en cuatro puntos del organismo
(Benedetti et al., 1999). El placebo se indujo mediante
la aplicacin de crema sobre slo una de estas partes
del cuerpo, y se les hizo creer a los sujetos que era
un potente analgsico local. El efecto placebo se
manifest slo en la zona tratada y no sobre el resto de
las regiones tratadas con capsaicina. El efecto placebo
fue abolido de manera completa mediante la aplicacin
intravenosa de naloxona. De este estudio se concluye
que i) la expectativa de alivio dirigida sobre una zona
corporal concreta induce placebo opioide slo sobre
dicha zona; y ii) la accin de los opioides es especfca
y slo ejerce su accin en la regin corporal a la que se
dirigen las expectativas de analgesia.
Neuroanatoma funcional de la analgesia
inducida por placebo
El estudio de los mecanismos y estructuras que subya-
cen al efecto placebo y explican su efecto sobre el do-
lor est en auge. En este ltimo contribuye el desarrollo
de las tcnicas modernas de imagenologa funcional.
Se han distinguido dos grupos de sistemas funciones
cerebrales respecto al efecto placebo y dolor: los rela-
cionados con la inhibicin del procesamiento nocicepti-
vo en regiones cerebrales especfcas y aquellos impli-
cados con el desarrollo de las expectativas de analgesia
que pudieran activarse con anticipacin al dolor. Se ha
demostrado que durante la presentacin del estimulo
nociceptivo el placebo atenu de manera signifcativa
la actividad de una serie de estructuras clsicamente
implicadas en el procesamiento del dolor (Wager et al.,
2004) Entre estas se encontraban la zona ms rostral
de la corteza cingulada anterior, la nsula anterior y el
tlamo, fundamentalmente. Es interesante sealar que
92
estas mismas regiones se encuentran comprometidas
en la analgesia por placebo asociada al tratamiento
con acupuntura (Kong et al., 2006)
Por tanto, dado que la actividad en el cngulo
anterior y en particular en la nsula anterior se relaciona
con la experiencia subjetiva de dolor (Craig et al.,
2000) parece plausible suponer que la reduccin en la
percepcin del dolor producida por el placebo puede
ser explicada, al menos en cierto grado, por su efecto
sobre estas regiones corticales.
En relacin con las zonas activadas durante la fase
de anticipacin del dolor se ha observado (Wager et al.,
2004) que las expectativas de alivio del dolor produjeron
un aumento de actividad bilateral en amplias regiones
de la corteza prefrontal, principalmente en la corteza
prefrontal dorsolateral (reas 9 y 46 de Brodmann;
PDL) y en la corteza orbitofrontal (rea 11 de
Brodmann; POB). Este incremento se correlacionaba
positivamente con la respuesta placebo medida
conductualmente (reduccin del dolor comunicada por
los sujetos) y neuralmente (reduccin de la actividad
cerebral registrada en la corteza cingulada nsula
anteriores). Por tanto, las expectativas de reduccin
del dolor generadas por el placebo parecen depender
especialmente de la actividad prefrontal. Es importante
destacar que durante la fase de anticipacin el grupo
placebo tambin mostr un incremento de actividad
neural en las proximidades de la sustancia gris
periacueductal (SGP), regin que contiene una elevada
concentracin de receptores opioides y es el origen de
eferencias hacia la medula espinal (Craig et al., 2000).
El aumento en la actividad de la SGP se correlacion
positivamente con el efecto placebo conductual (reduc-
cin de dolor) y el neural (reduccin de actividad cere-
bral en cngulo anterior e nsula anterior). Asimismo, el
incremento de actividad detectada en la SGP se co-
rrelacion positivamente con el observado en la PDL y
POB, Curiosamente, durante esta fase de anticipacin
la regin rostral de la circunvolucin del cngulo ante-
rior (rea 24 de Brodmann) result tambin fuertemen-
te activada. Esta zona coincide con la regin que ex-
perimenta una reduccin de activacin durante la fase
de dolor, lo que sugiere que el cngulo rostral no slo
interviene en el procesamiento del dolor propiamente
dicho, si no que es parte tambin de la red neural com-
prometida en el control cognitivo del dolor.
Otro punto importante es la comprensin del
signifcado funcional de la activacin de la SGP
durante la fase de expectativa/anticipacin de placebo,
es bien conocido el control que ejerce esta regin
mesenceflica sobre circuitos espinales asociados a
la transmisin del dolor (Fields, 2004). Por otra parte,
la SGP recibe aferencias desde la nsula, la regin
rostral del cngulo (rea 24 de Brodmann), el ncleo
accumbens, la amgdala y la corteza frontal. De esta
manera, todos estos datos sugieren globalmente que
la activacin de las regiones prefrontales, entre otras,
pueden poner en funcionamiento, justo antes de la
aparicin de la estimulacin nociceptiva, un sistema
analgsico cerebroespinal que reducira el dolor a nivel
espinal.
En sntesis, la analgesia alcanzada por el placebo
parece depender de la accin conjunta de dos
mecanismos puestos en marcha, presumiblemente,
por la corteza prefrontal: primero, la activacin del
mencionado circuito cerebroespinal con origen
en la SGP; en segundo lugar, se producira una
atenuacin del procesamiento nociceptivo dentro del
propio encfalo (corteza cingulada anterior e nsula
anterior) en regiones asociadas fundamentalmente al
procesamiento del componente afectivo del dolor.
Liberacin de opioides endgenos en la
analgesia por placebo
La primera prueba que sugiri la participacin de los
receptores -opioides en la analgesia por placebo fue
aportada por Levine et al. (1978) obtenindose resul-
tados similares en aos siguientes con procedimien-
tos muy parecidos (Gracely et al., 1983; Levine et al.,
1978). En general en estos estudios la aplicacin de
placebo con expectativas de analgesia reduca signi-
fcativamente el dolor clnico o experimental inducido
en los sujetos; sin embargo, la inyeccin de naloxona,
abiertamente a la vista de los sujetos o subrepticia,
bloqueaba el efecto placebo, lo que sugiri claramente
una mediacin opioide endgena en dicho fenmeno.
El siguiente paso importante para la comprensin de la
base neuroqumica del efecto placebo se dio mediante
el empleo de la tomografa por emisin de positrones
(PET) (Petrovic et al., 2002), que permiti descubrir que
la administracin de remifentanilo (un agonista de los
receptores -opioides) y la aplicacin de placebo con
expectativas de analgesia activaban la misma regin
cerebral, concretamente la zona ms rostral de la cor-
teza cingulada anterior. En esta zona estudios recien-
tes realizados en seres humanos han demostrado una
alta concentracin de receptores -opioides (Casey et
al., 2000; Schlaepfer et al., 1998). Por tanto, el hecho
de que una de las regiones cerebrales ms activas por
el placebo coincida con una zona de alta concentracin
de receptores -opioides apoya la idea de un probable
vnculo funcional o mecanismo neural comn entre la
analgesia inducida por placebo y el sistema opioide en-
dgeno.
93
En otro estudio se demostr de manera directa
e in vivo la liberacin de opioides endgenos por la
utilizacin del efecto placebo en el cerebro de seres
humanos (Zubieta et al., 2005). En este estudio
se emple PET y carfentanilo (C11), un agonista
selectivo de los receptores -opioides. Bajo estas
condiciones la activacin in vivo de este sistema de
neurotransmisin es inferida a travs de la reduccin
del agonista radiactivo que se une a los receptores -
opioides. Se parte del supuesto de que en el grupo que
no recibe el tratamiento placebo no est funcionando
especfcamente este sistema de neurotransmisin, y
por lo tanto la ocupacin de los receptores -opioides
por el carfentanilo (C11) debera ser del 100%. De
diferente manera, en el grupo tratado con placebo
se supone que dicho sistema est activado y gran
parte de los receptores opioides estn ocupados por
la liberacin de opioides endgenos y por lo tanto se
reducir la cantidad de carfentanilo (C11) ligado a dichos
receptores, y la magnitud de dicha reduccin constituye
un ndice del grado en el que se ha activado el sistema
opioide endgeno durante el efecto placebo. Utilizando
este modelo experimental se encontr que el sistema
opioide se activaba signifcativamente ms durante la
aplicacin de placebo. Concretamente, las regiones en
las que se oper una liberacin signifcativa de opioides
fueron: la corteza prefrontal dorsolateral (rea 8 y 9 de
Brodmann), la corteza cingulada rostral (rea 24 y 25
de Brodmann), la corteza insular anterior y el ncleo
accumbens. Otra rea de menor actividad que las
anteriores, pero cercana a lo signifcativo, fue la corteza
insular posterior. Adems resultados de otros estudios
mostraron que algunas de las zonas cerebrales en las
que el placebo incrementa la neurotransmisin opioide
coinciden, como la corteza cingulada anterior e nsula
anterior, principalmente (Craig et al., 2000; Singer et
al., 2004; Talbot et al., 1991; Davis et al., 1995; Gelnar
et al., 1999)
Acupuntura y analgesia: mecanismos
comunes
Una mayora de los casos que son tratados en los ser-
vicios de atencin de primer nivel y por lo tanto en los
de acupuntura son padecimientos autolimitados (como
las lumbalgias); otros de ellos tienen periodos de remi-
sin espontneos (como la migraa o el asma) y casi
todos ellos se caracterizan por n cuadro clnico consti-
tuido principalmente por sntomas. Por lo tanto, la eva-
luacin de la efcacia de la acupuntura requiere casi
siempre la realizacin de estudios clnicos controlados
(ECA).
Este artculo se basa de manera predominante en
un anlisis de revisiones sistemticas realizadas por
Complementary and Alternative Medicine Field of the
Cochrane Collaboration. Tambin se incluyen ECA que
han sido publicados de manera reciente.
La acupuntura ha sido investigada de manera
extensa clnica y experimentalmente (Kaptchuk, 2002;
Cho et al., 1998; Pariente et al., 2005; Kong et al.,
2006; Ma, 2004); pero sus mecanismos de accin no
son del todo conocidos (Ma, 2004; Lewit et al., 2005;
Ernst, 2006; Lewith et al., 2006)
La cultura afecta en forma determinante la prctica
de la medicina como las creencias de los pacientes
(Moerman y Jonas, 2002). El empleo de la acupuntura se
da en un marco de creencias y rituales que la signifcan
como un remedio antiguo y natural, de esta manera la
acupuntura es en especial buena para inducir en los
pacientes creencias y expectativas. Las bases tericas
que subyacen al tratamiento con acupuntura no se
relacionan con la medicina moderna (Kaptchuk, 2002).
Esta divergencia flosfca y emprica de la medicina
moderna para explicar los patrones y ritmos de vida
permite a los pacientes tener creencias y elevadas
expectativas de este tratamiento.
Otro factor importante que contribuye a aumentar
las expectativas en la efcacia de la acupuntura es
que la mayora de los pacientes, por ejemplo con
dolor crnico, recurren a la acupuntura slo despus
de haber tenido experiencias fallidas con tratamientos
convencionales. Adems, la naturaleza invasora de la
acupuntura y la manera sofsticada en que se aplica
puede contribuir en gran medida en la creencias y
expectativas de los pacientes respecto a la efcacia de
la acupuntura (Liu, 2007).
La experiencia clnica ha mostrado que las creencias
y las expectativas juegan un papel fundamental en
la efcacia de la acupuntura y la magnitud de sus
efectos est determinada por como y en que grado el
paciente est involucrado en su contexto psicosocial:
la acupuntura parece ser ms efcaz en los pacientes
con expectativas y creencias mayores. Esta afrmacin
prob ser verdadera en un estudio reciente de
acupuntura y dolor que inform que las expectativas
y creencias de los pacientes (determinadas por la
asignacin evidente al grupo de acupuntura real o
placebo) tuvieron un mayor impacto en las metas del
tratamiento que el tratamiento en si mismo (Bausell et
al., 2005).
Dado el importante papel de expectativas y creencias
en la efcacia de la acupuntura, un estudio previo sugiri
que el proceso de consentimiento informado de hacerse
explcito en cuando informe publicado de estudios que
evalan la efcacia de la acupuntura, debido a que la
94
forma en que los pacientes son informados determina
en gran medida los niveles de creencias y expectativas,
y de all el resultado del tratamiento (Liu y Liu, 2006).
La atencin dirigida, miedo-ansiedad son factores
fundamentales en el tratamiento con acupuntura.
Durante la aplicacin de la acupuntura, la ansiedad
y miedo del paciente no siempre son evidentes, pero
se manifestan principalmente como una atencin
altamente focalizada, debido a que las percepciones
negativas respecto al tratamiento son superadas por
las expectativa de benefcios. Se ha sugerido en un
estudio previo que los mayores niveles de miedo y
ansiedad contribuyen a una focalizacin somtica
aumentada (Geers et al., 2006).
Conclusiones
La analgesia relacionada con procesos placebo, en la
que las creencias y expectativas acerca de recibir un
tratamiento ha mostrado ser efcaz para la reduccin
del dolor. El efecto placebo puede ser cuantifcado en
trminos conductuales y neurales. De esta manera, in-
vestigaciones recientes han mostrado que el placebo
produce un aumento en la actividad cerebral de la cor-
teza prefrontal dorsolateral y de regiones cercanas a la
SGP. Estos cambios se producen justo antes de la apli-
cacin del estmulo nociceptivo. El hecho de que es-
tas zonas se activen con anticipacin a la experiencia
de dolor sugiere que pueden controlar otras regiones
cerebrales esenciales implicadas directamente en el
procesamiento nociceptivo. De acuerdo con esta idea,
estudios recientes indican que la analgesia por place-
bo reduce la actividad nerviosa de la corteza anterior
del cngulo y de la nsula anterior, principalmente. Dado
que estas regiones estn asociadas al procesamiento
de aspectos afectivo-emocionales del dolor, lo anterior
hace pensar que al menos parte de la analgesia por
placebo se ejerce centralmente, reduciendo el proce-
samiento de informacin nociceptiva a nivel superior.
Por ltimo, datos muy recientes indican que el placebo
produce analgesia en estos niveles superiores debido
a la liberacin de opioides endgenos y a la activacin
de receptores -opioides.
Las expectativas y creencias positivas de los
pacientes siempre se espera que estn presentes
cuando se lleva a cabo un tratamiento, como es el
caso de la acupuntura. No obstante, en ocasiones
son tratados pacientes que tienen dudas acerca de
la efcacia de la acupuntura; en estos pacientes la
acupuntura puede no slo ser inefcaz si no inclusive
causar efectos inesperados e inexplicables que
pueden ser referidos como efectos adversos. En
algunos pacientes, estos efectos pueden durar durante
cierto tiempo y no desaparecen hasta que el paciente
se convence que la acupuntura no daa. Parece ser
que las creencias y expectativas de los pacientes
determinan en gran medida la orientacin de los efectos
de la acupuntura sentimiento positivos inducen
efecto teraputicos y por el contrario, efectos negativos
inducen efectos deletreos. La atencin insufciente del
papel del contexto social en la efcacia de la acupuntura
puede explicar en parte los dilemas que han surgido en
la investigacin de la acupuntura. Una revisin global
entre la asociacin de la acupuntura y el efecto placebo
puede contribuir a clarifcar el modo de accin de sta.
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Nota de Clarifcacin del Prrafo 29, agregada por la Asamblea General de la AMM,
Washington 2002
Nota de Clarifcacin del Prrafo 30, agregada por la Asamblea General de la AMM,
Tokio 2004
59 Asamblea General, Sel, Corea, octubre 2008
A. INTRODUCCION
1. La Asociacin Mdica Mundial (AMM) ha promulgado la Declaracin de Helsinki como una pro-
puesta de principios ticos para investigacin mdica en seres humanos, incluida la investigacin del
material humano y de informacin identifcables.
La Declaracin debe ser considerada como un todo y un prrafo no debe ser aplicado sin considerar todos
los otros prrafos pertinentes.
2. Aunque la Declaracin est destinada principalmente a los mdicos, la AMM insta a otros participan-
tes en la investigacin mdica en seres humanos a adoptar estos principios.
3. El deber del mdico es promover y velar por la salud de los pacientes, incluidos los que participan en
investigacin mdica. Los conocimientos y la conciencia del mdico han de subordinarse al cumpli-
miento de ese deber.
4. La Declaracin de Ginebra de la Asociacin Mdica Mundial vincula al mdico con la frmula velar
solcitamente y ante todo por la salud de mi paciente, y el Cdigo Internacional de Etica Mdica
afrma que: El mdico debe considerar lo mejor para el paciente cuando preste atencin mdica.
5. El progreso de la medicina se basa en la investigacin que, en ultimo trmino, debe incluir estudios en
seres humanos. Las poblaciones que estn subrepresentadas en la investigacin mdica deben tener un
acceso apropiado a la participacin en la investigacin.
6. En investigacin mdica en seres humanos, el bienestar de la persona que participa en la investigacin
debe tener siempre primaca sobre todos los otros intereses.
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7. El propsito principal de la investigacin mdica en seres humanos es comprender las causas, evolu-
cin y efectos de las enfermedades y mejorar las intervenciones preventivas, diagnsticas y terapu-
ticas (mtodos, procedimientos y tratamientos). Incluso, las mejores intervenciones actuales deben
ser evaluadas continuamente a travs de la investigacin para que sean seguras, efcaces, efectivas,
accesibles y de calidad.
8. En la prctica de la medicina y de la investigacin mdica, la mayora de las intervenciones implican
algunos riesgos y costos.
9. La investigacin mdica est sujeta a normas ticas que sirven para promover el respeto a todos los
seres humanos y para proteger su salud y sus derechos individuales. Algunas poblaciones sometidas a
la investigacin son particularmente vulnerables y necesitan proteccin especial. Estas incluyen a los
que no pueden otorgar o rechazar el consentimiento por s mismos y a los que pueden ser vulnerables
a coercin o infuencia indebida.
10. Los mdicos deben considerar las normas y estndares ticos, legales y jurdicos para la investigacin
en seres humanos en sus propios pases, al igual que las normas y estndares internacionales vigentes.
No se debe permitir que un requisito tico, legal o jurdico nacional o internacional disminuya o eli-
mine cualquiera medida de proteccin para las personas que participan en la investigacin establecida
en esta Declaracin.
B. PRINCIPIOS PARA TODA INVESTIGACION MEDICA
11. En la investigacin mdica, es deber del mdico proteger la vida, la salud, la dignidad, la integridad,
el derecho a la autodeterminacin, la intimidad y la confdencialidad de la informacin personal de las
personas que participan en investigacin.
12. La investigacin mdica en seres humanos debe conformarse con los principios cientfcos general-
mente aceptados y debe apoyarse en un profundo conocimiento de la bibliografa cientfca, en otras
fuentes de informacin pertinentes, as como en experimentos de laboratorio correctamente realizados
y en animales, cuando sea oportuno. Se debe cuidar tambin del bienestar de los animales utilizados
en los experimentos.
13. Al realizar una investigacin mdica, hay que prestar atencin adecuada a los factores que puedan
daar el medio ambiente.
14. El proyecto y el mtodo de todo estudio en seres humanos debe describirse claramente en un protocolo
de investigacin. Este debe hacer referencia siempre a las consideraciones ticas que fueran del caso
y debe indicar cmo se han considerado los principios enunciados en esta Declaracin. El protoco-
lo debe incluir informacin sobre fnanciamiento, patrocinadores, afliaciones institucionales, otros
posibles confictos de inters e incentivos para las personas del estudio y estipulaciones para tratar o
compensar a las personas que han sufrido daos como consecuencia de su participacin en la inves-
tigacin. El protocolo debe describir los arreglos para el acceso despus del ensayo a intervenciones
identifcadas como benefciosas en el estudio o el acceso a otra atencin o benefcios apropiadas.
15. El protocolo de la investigacin debe enviarse, para consideracin, comentario, consejo y aprobacin,
a un comit de tica de investigacin antes de comenzar el estudio. Este comit debe ser independiente
del investigador, del patrocinador o de cualquier otro tipo de infuencia indebida. El comit debe con-
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siderar las leyes y reglamentos vigentes en el pas donde se realiza la investigacin, como tambin las
normas internacionales vigentes, pero no se debe permitir que stas disminuyan o eliminen ninguna de
las protecciones para las personas que participan en la investigacin establecidas en esta Declaracin.
El comit tiene el derecho de controlar los ensayos en curso. El investigador tiene la obligacin de
proporcionar informacin del control al comit, en especial sobre todo incidente adverso grave. No se
debe hacer ningn cambio en el protocolo sin la consideracin y aprobacin del comit.
16. La investigacin mdica en seres humanos debe ser llevada a cabo slo por personas con la formacin
y califcaciones cientfcas apropiadas. La investigacin en pacientes o voluntarios sanos necesita la
supervisin de un mdico u otro profesional de la salud competente y califcado apropiadamente.
La responsabilidad de la proteccin de las personas que toman parte en la investigacin debe recaer
siempre en un mdico u otro profesional de la salud y nunca en los participantes en la investigacin,
aunque hayan otorgado su consentimiento.
17. La investigacin mdica en una poblacin o comunidad con desventajas o vulnerable slo se justifca
si la investigacin responde a las necesidades y prioridades de salud de esta poblacin o comunidad y
si existen posibilidades razonables de que la poblacin o comunidad, sobre la que la investigacin se
realiza, podr benefciarse de sus resultados.
18. Todo proyecto de investigacin mdica en seres humanos debe ser precedido de una cuidadosa com-
paracin de los riesgos y los costos para las personas y las comunidades que participan en la investi-
gacin, en comparacin con los benefcios previsibles para ellos y para otras personas o comunidades
afectadas por la enfermedad que se investiga.
19. Todo ensayo clnico debe ser inscrito en una base de datos disponible al pblico antes de aceptar a la
primera persona.
20. Los mdicos no deben participar en estudios de investigacin en seres humanos a menos de que estn
seguros de que los riesgos inherentes han sido adecuadamente evaluados y de que es posible hacerles
frente de manera satisfactoria. Deben suspender inmediatamente el experimento en marcha si obser-
van que los riesgos que implican son ms importantes que los benefcios esperados o si existen prue-
bas concluyentes de resultados positivos o benefciosos.
21. La investigacin mdica en seres humanos slo debe realizarse cuando la importancia de su objetivo
es mayor que el riesgo inherente y los costos para la persona que participa en la investigacin.
22. La participacin de personas competentes en la investigacin mdica debe ser voluntaria. Aunque
puede ser apropiado consultar a familiares o lderes de la comunidad, ninguna persona competente
debe ser incluida en un estudio, a menos que ella acepte libremente.
23. Deben tomarse toda clase de precauciones para resguardar la intimidad de la persona que participa en
la investigacin y la confdencialidad de su informacin personal y para reducir al mnimo las conse-
cuencias de la investigacin sobre su integridad fsica, mental y social.
24. En la investigacin mdica en seres humanos competentes, cada individuo potencial debe recibir in-
formacin adecuada acerca de los objetivos, mtodos, fuentes de fnanciamiento, posibles confictos
de intereses, afliaciones institucionales del investigador, benefcios calculados, riesgos previsibles
e incomodidades derivadas del experimento y todo otro aspecto pertinente de la investigacin. La
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persona potencial debe ser informada del derecho de participar o no en la investigacin y de retirar su
consentimiento en cualquier momento, sin exponerse a represalias. Se debe prestar especial atencin
a las necesidades especfcas de informacin de cada individuo potencial, como tambin a los mtodos
utilizados para entregar la informacin. Despus de asegurarse de que el individuo ha comprendido
la informacin, el mdico u otra persona califcada apropiadamente debe pedir entonces, preferible-
mente por escrito, el consentimiento informado y voluntario de la persona. Si el consentimiento no se
puede otorgar por escrito, el proceso para lograrlo debe ser documentado y atestiguado formalmente.
25. Para la investigacin mdica en que se utilice material o datos humanos identifcables, el mdico debe
pedir normalmente el consentimiento para la recoleccin, anlisis, almacenamiento y reutilizacin.
Podr haber situaciones en las que ser imposible o impracticable obtener el consentimiento para
dicha investigacin o podra ser una amenaza para su validez. En esta situacin, la investigacin slo
puede ser realizada despus de ser considerada y aprobada por un comit de tica de investigacin.
26. Al pedir el consentimiento informado para la participacin en la investigacin, el mdico debe poner
especial cuidado cuando el individuo potencial est vinculado con l por una relacin de dependencia
o si consiente bajo presin. En una situacin as, el consentimiento informado debe ser pedido por una
persona califcada adecuadamente y que nada tenga que ver con aquella relacin.
27. Cuando el individuo potencial sea incapaz, el mdico debe pedir el consentimiento informado del re-
presentante legal. Estas personas no deben ser incluidas en la investigacin que no tenga posibilidades
de benefcio para ellas, a menos que sta tenga como objetivo promover la salud de la poblacin repre-
sentada por el individuo potencial y esta investigacin no puede realizarse en personas competentes y
la investigacin implica slo un riesgo y costo mnimos.
28. Si un indivividuo potencial que participa en la investigacin considerado incompetente es capaz de
dar su asentimiento a participar o no en la investigacin, el mdico debe pedirlo, adems del consen-
timiento del representante legal. El desacuerdo del individuo potencial debe ser respetado.
29. La investigacin en individuos que no son capaces fsica o mentalmente de otorgar consentimiento,
por ejemplo los pacientes inconscientes, se puede realizar slo si la condicin fsica/mental que impi-
de otorgar el consentimiento informado es una caracterstica necesaria de la poblacin investigada. En
estas circunstancias, el mdico debe pedir el consentimiento informado al representante legal. Si dicho
representante no est disponible y si no se puede retrasar la investigacin, el estudio puede llevarse a
cabo sin consentimiento informado, siempre que las razones especfcas para incluir a individuos con
una enfermedad que no les permite otorgar consentimiento informado hayan sido estipuladas en el
protocolo de la investigacin y el estudio haya sido aprobado por un comit de tica de investigacin.
El consentimiento para mantenerse en la investigacin debe obtenerse a la brevedad posible del indi-
viduo o de un representante legal.
30. Los autores, directores y editores todos tienen obligaciones ticas con respecto a la publicacin de los
resultados de su investigacin. Los autores tienen el deber de tener a la disposicin del pblico los
resultados de su investigacin en seres humanos y son responsables de la integridad y exactitud de
sus informes. Deben aceptar las normas ticas de entrega de informacin. Se deben publicar tanto los
resultados negativos e inconclusos como los positivos o de lo contrario deben estar a la disposicin
del pblico..En la publicacin se debe citar la fuente de fnanciamiento, afliaciones institucionales y
confictos de intereses. Los informes sobre investigaciones que no se cian a los principios descritos
en esta Declaracin no deben ser aceptados para su publicacin.
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C. PRINCIPIOS APLICABLES CUANDO LA INVESTIGACION MEDICA SE COMBINA CON LA
ATENCION MEDICA
31. El mdico puede combinar la investigacin mdica con la atencin mdica, slo en la medida en que
tal investigacin acredite un justifcado valor potencial preventivo, diagnstico o teraputico y si el
mdico tiene buenas razones para creer que la participacin en el estudio no afectar de manera ad-
versa la salud de los pacientes que toman parte en la investigacin.
32. Los posibles benefcios, riesgos, costos y efcacia de toda intervencin nueva deben ser evaluados
mediante su comparacin con la mejor intervencin probada existente, excepto en las siguientes cir-
cunstancias:
El uso de un placebo, o ningn tratamiento, es aceptable en estudios para los que no hay una inter-
vencin probada existente.
Cuando por razones metodolgicas, cientfcas y apremiantes, el uso de un placebo es necesario para
determinar la efcacia y la seguridad de una intervencin que no implique un riesgo, efectos adversos
graves o dao irreversible para los pacientes que reciben el placebo o ningn tratamiento. Se debe
tener muchsimo cuidado para evitar abusar de esta opcin.
33. Al fnal de la investigacin, todos los pacientes que participan en el estudio tienen derecho a ser in-
formados sobre sus resultados y compartir cualquier benefcio, por ejemplo, acceso a intervenciones
identifcadas como benefciosas en el estudio o a otra atencin apropiada o benefcios.
34. El mdico debe informar cabalmente al paciente los aspectos de la atencin que tienen relacin con
la investigacin. La negativa del paciente a participar en una investigacin o su decisin de retirarse
nunca debe perturbar la relacin mdico-paciente.
35. Cuando en la atencin de un enfermo las intervenciones probadas han resultado inefcaces o no exis-
ten, el mdico, despus de pedir consejo de experto, con el consentimiento informado del paciente o
de un representante legal autorizado, puede permitirse usar intervenciones no comprobadas, si, a su
juicio, ello da alguna esperanza de salvar la vida, restituir la salud o aliviar el sufrimiento. Siempre que
sea posible, tales intervenciones deben ser investigadas a fn de evaluar su seguridad y efcacia. En to-
dos los casos, esa informacin nueva debe ser registrada y, cuando sea oportuno, puesta a disposicin
del pblico.
22.10.2008
Reproducida con permiso de la World Medical Association
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ANUARIO DE INVESTIGACIN
EN ETNOMEDICINA,
MEDICINAS COMPLEMENTARIAS
Y UTILIZACIN
DE PLANTAS MEDICINALES
ANUARIO DE INVESTIGACIN
EN ETNOMEDICINA,
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Jos Federico Rivas Vilchis, Ed.
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ISBN : 970-31-0546-7