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Manipulacin Gnica

En la clase anterior comenzamos a


describir el proceso de introduccin de genes
dentro de un organismo eucaritico,
principalmente un eucarionte inferior, tal como
lo es la levadura.
La razn por la que se escoge este tipo
de organismo y no otro radica en que no
siempre una bacteria es un hospedero adecuado
para producir una protena, bsicamente porque
la protena codificada por el gen que queremos
expresar, posee modificaciones post-
traduccionales las cuales en una bacteria no se
pueden realizar, por ejemplo glicosilaciones,
esta es una modificacin bastante extendida en
protenas eucariontes y que no puede ser
realizada por una bacteria. Entonces una
alternativa es transferir el gen a expresar a
clulas de levadura que puedan realizar dichas
modificaciones.
Para este propsito se usa un vector
distinto que el que se usa tradicionalmente
cuando se manipulan bacterias, a pesar que las
caractersticas bsicas del vector van a ser
prcticamente las mismas, las cuales son:
Primeramente un origen de replicacin,
este elemento es absolutamente imprescindible
el origen de replicacin es una molcula de
DNA que va a permitir que la construccin
gentica que est dentro de la clula pueda
propagarse en forma estable (divisin estable).
Este debe replicarse cada vez que la clula se
divida as las clulas hijas van a tener la
construccin gentica en su interior. En este
caso el origen de replicacin lo debe de un
elemento de un plasmidio de 2 micrones el cual
es un origen de replicacin especfico para
levadura. Se debe recordar que en el caso de un
plasmidio bacteriano se va usar el origen de
replicacin que se llama Cole 1 que funciona en
E.Coli.
Como segundo requisito debemos tener
un gen marcador el cual va a permitir
distinguir entre clulas trasformadas, es decir
adoptaron la construccin gentica desde afuera
y aquellas que no lo hicieron. Ya que todos
estos procesos tienen un porcentaje de eficiencia
relativamente bajo, al incubar esta construccin
gentica con las clulas de levadura, solo una
pequea fraccin de ellas se va a trasformar, al
ser solo estas las de inters debo eliminar las
clulas no trasformadas y ah radica el rol de
este marcador.
Recordando el caso bacteriano ese gen
marcador es usualmente la resistencia a algn
antibitico, principalmente ampicilina y en ese
caso cuando el vector ingresa a la clula
bacteriana la clula se hace resistente a la
ampicilina y de esa forma la puedo seleccionar,
pero en este caso no tengo esa posibilidad
porque la levadura es naturalmente resistente a
antibiticos sin embargo lo que se va a hacer es
utilizar unas cepas de levadura que son las que
se llaman Auxotrofos, la cuales son clulas de
levadura que tienen mutaciones en su genoma.
En este caso puedo usar un mutante que
se llama URA3
-
, en esta cepa no funciona un
gen que codifica una enzima para la sntesis de
uridina, en consecuencia este mutante no puede
sintetizar uridina y como no sintetiza uridina no
puede sintetizar UTP y por lo tanto no puede
sintetizar RNA. Si a esta levadura la coloco en
un medio de cultivo que se le llama medio
mnimo que contiene una fuente de fosfato
(NaH
2
PO
4
/Fosfato Monosdico), glucosa como
fuente de carbono y una fuente de nitrgeno
(NH
4
Cl/Cloruro de Amonio), esa levadura no va
a crecer, porque en este medio no hay uridina y
la levadura no tiene como sintetizarla. Otro
mutante que se usa habitualmente es un mutante
de Leu2
-
y en este caso el concepto es el mismo
pero el gen que est afectado se ubica en una
enzima que codifica para la ruta de biosntesis

de leucina, por ende en esta zona no se realiza
este proceso, esta levadura mutante tampoco
crece en un medio que carezca de leucina.
Al usar el primer tipo de mutante como
receptor en un experimento de transformacin
entonces puedo colocar el gen URO3 normal y
usarlo como marcador, lo colocar en una
secuencia de DNA obtenido a travs de RNA
mensajero que no contiene secuencias
intrnicas, agregar adems una secuencia de
terminacin y un promotor que pueden ser:
1. Un promotor que es activo en levaduras
como el gen del alcohol
deshidrogenasa por ejemplo que lo
podra utilizar en este caso. La enzima
alcohol deshidrogenasa es muy
abundante en levaduras pues estas
realizan mucha fermentacin alcohlica
entonces este gen se expresa muy
eficientemente por ende su promotor se
activa de forma eficaz.
2. Un promotor PGAL-1 que viene del
gen K que codifica una enzima
relacionada con el metabolismo de la
galactosa y el promotor de este gen se
enciende solo cuando hay galactosa lo
que me permite controlar la activacin
de este promotor, genera que se pueda
realizar un control.

Al colocar el promotor en la levadura estas
levaduras transformadas crecern solo en el
medio que les brinde los sustratos especficos
dependiendo del gen a utilizar por lo siguiente
estas levaduras podrn sintetizar las diferentes
enzimas y podrn fabricar UTP y estas se
denominarn clulas de levadura positivas para
la transformacin cuyo nombre ahora ser
URA3
+
(las clulas de levadura no
transformadas seguirn siendo URA3
-
).

Con las clulas positivas puedo generar un
cultivo y una vez este tenga un tamao
considerable puedo agregar al medio de cultivo
galactosa que activar el promotor PGAL-1 y
este una vez activado se sintetizar el RNA
mensajero. Este RNA mensajero no tiene seal
de unin al ribosoma esto porque la levadura es
un eucarionte y estas no necesitan seal de
unin, para que esta unin se realice puedo
agregar un trozo de RNA que codifique para un
pptido seal. Usualmente se usa un pptido
seal para estos fines denominado Factor Alfa
que logra este cometido. La protena codificada
tendr este pptido seal en su extremo amino
eso significa que va a entrar en la ruta de
secrecin de protenas de la levadura y por lo
tanto la protena producida a partir de este gen
forneo, va a ser puesta en el exterior de la
clula.
No siempre es posible obtener los resultados
que uno espera cuando involucra una levadura,
porque la levadura es un organismo eucarionte
inferior y no existen necesariamente los
procesos de codificacin post-traduccional que
son realizados por una clula de un mamfero
(eucariota superior), supongamos, el tipo de
glicosilacin no siempre es el mismo.
Por consiguiente se presentan algunas
situaciones en que la levadura no es funcional
para esta transformacin por lo tanto se debe
cambiar el hospedero directamente a una clula
eucarionte superior (clula animal).
No abordaremos las clulas vegetales, ya
que todos los procesos son ms complicados,
pero s hablaremos sobre clulas animales en
cultivo donde la teora es la siguiente:
Sabemos que las clulas de un organismo
pueden estar desde el punto de vista de divisin,
en tres categoras: en divisin activa (Mitosis),
en reposo proliferativo (G
0
) o pueden haber

salido absolutamente del ciclo de replicacin
(Fase D/Diferenciacin).
Por ejemplo las clulas precursoras de la
medula sea que estn generando clulas
hematopoyticas, es decir, estn en constante
divisin. Hay otras clulas que se dividen bajo
estmulos por ejemplo las clulas epidermales,
que se dividen cuando se produce una herida
por medio de Factores de Crecimiento
Epidermal que actan sobre clulas en reposo y
estimulan su divisin. Por ltimo encontramos
clulas que ya salieron del ciclo de divisin
porque tienen un estado de diferenciacin
avanzado, por ejemplo las neuronas, las cuales
una vez que se diferencian ya no pueden volver
a dividirse.
Las clulas que uno puede encontrar en
cultivo estn dentro de la categora de clulas
que estn divisin en permanente o en la
categora de clulas que estn en reposo
proliferativo y pueden ser inducidas a la
divisin; por tanto tenemos medios de cultivo
mnimos contiene o a los que es necesario
adicionar los factores de crecimiento adecuados.
Como caso especial tambin se pueden
cultivar clulas transformadas, principalmente
clulas que provienen de un tumor, porque una
de las caractersticas de estas es que han perdido
su capacidad de regular el ciclo y estn
permanentemente en divisin. De hecho, hay un
grupo de clulas humanas que se usan
corrientemente en experimentos, que se llaman
Clulas Hela stas clulas son una lnea de
cultivo que viene del ao 53 y corresponden a
clulas que fueron obtenidas de una seora con
cncer, quien ms tarde falleci. Estas clulas
son tumorales y como su ciclo no est regulado
continuaron dividindose indefinidamente.
Existen diferencias entre lo que pasa en
las bacterias o en las levaduras y las clulas
animales en cultivo. La primera es que se
dividen menos, un ciclo completo de divisin en
una clula animal toma unas 24hrs
aproximadamente, por contraparte a lo que
sucede en las bacterias donde cada generacin
se produce en 30 min. y en una levadura en 90
min.
Lo segundo es que, si son clulas normales
(no tumorales) estas presentan una caracterstica
denominada inhibicin por contacto por lo
que clulas que se encuentran en divisin y
confluyen en un punto tocndose dejan de
dividirse, esto limita en buena parte la cantidad
de clulas que se pueden obtener a partir de un
cultivo celular, siendo uno de los problemas a
los cuales se enfrenta.
Aparece un problema en relacin a los
vectores, pues si se desea transferir genes hacia
clulas animales, necesitamos disponer de un
vector que nos permita transferir el gen al
interior de la clula y en este caso se distinguen
dos situaciones; un tipo de vector para
transposicin transitoria y otro tipo
denominado transposicin estable.
1. Transposicin Transitoria:
Se podr expresar un gen dentro de una
clula animal, pero funcionar durante pocos
das, unas cuantas generaciones. Al vector se le
aplica un ORI (origen de replicacin), el origen
que usualmente se utiliza es el SV-40 que
infecta clulas humanas. (Si se desea producir
una protena dentro de clulas humanas el ORI
del virus SV-40 nos sirve, pues este infecta
humanos y por lo tanto es capaz de replicarse en
clulas humanas o de mono).




La transposicin transitoria no sirve para
que una lnea celular se produzca
permanentemente, en laboratorios se utiliza este
experimento porque es muy rpido de hacer.
Debemos recalcar que para fines de produccin
de la protena o biotecnolgicos esta no es la
estrategia adecuada, debido a que estas clulas
se multiplican por divisin celular, cuando hay
mitosis existe una etapa en que las fibras del
huso mittico se conectan por el centrmero del
cromosoma por lo que se segrega al momento
de la divisin, son las cromtidas del
cromosoma doble y NO la regin de DNA del
vector, ya que no presenta centrmero y no se
une al huso mittico, por lo que al momento de
la divisin celular, no existe un mecanismo de
segregacin que asegure que las ambas clulas
hijas se lleven lo que les corresponde desde el
punto de vista de esa molcula de DNA.
A medida que se dividen estas clulas,
aparecen clulas hijas que no contienen la
misma construccin gentica, debido a que el
proceso de transposicin funciona slo un
tiempo determinado.
2. Transposicin Estable:
Si se tiene un cromosoma o DNA
cromosomal de la clula que se est infectando
y un cDNA que est dentro de un vector, para
que ste se integre al cromosoma de la clula
infectada. Una vez estando dentro de la clula
infectada, una vez que est dentro del
cromosoma de la clula manipulada, pasa a ser
un gen ms de ese cromosoma, va a ser
replicado cada vez que el cromosoma de la
clula infectada se replique y ser segregado
entre dos clulas hijas al momento de la mitosis,
ya que va dentro de los cromosomas que sern
segregados.
Se necesita ahora poner un vector que
asegure que el cDNA se va a integrar al
cromosoma de la clula que se est
manipulando. El vector debe saber cules de las
clulas efectivamente integraron el cDNA y
cules no, es decir, necesito un gen marcador.
Entonces hay que disear un vector que tenga
gen marcador, que no va a tener origen de
replicacin, porque no necesita origen de
replicacin. Se tiene que tener un mecanismo
que permite que este gen que est afuera se meta
dentro del cromosoma de la clula manipulada y
ese gen se va a propagar establemente porque se
va a replicar junto con el cromosoma. Entonces
este es un vector distinto del que hemos estado
hablando.
Si recordamos un poco a los retrovirus,
tenemos que el genoma retroviral que es RNA
asociado con molculas de la transcriptasa
reversa. Estos son un grupo de virus envueltos,
por fuera de esto tienen envoltura y esta
envoltura tiene una bicapa lipdica. Y dentro
inserta dentro de la bicapa, hay un grupo de
protenas que son denominadas las protenas de
la envoltura o tambin llamadas partculas de la
envoltura. Estas protenas (partculas virales)
son lo ms externo que tiene el virus.

Figura: Retrovirus con su RNA y la
transcriptasa reversa.
Usualmente los mecanismos defensivos
de una clula contra una infeccin por virus es
generar anticuerpos contra las partculas virales,
pero el rol tiene que ver con el mecanismo de
infeccin. Entonces supongan ustedes lo
siguiente: en la membrana de la clula hay una
protena R y esa protena es la que interacta

con la estructura donde est el virus y es una
interaccin reversible entre partcula viral y el
receptor que est en la clula.

Figura: protena R de la clula interactuando
con retrovirus.
Se debe aclarar que la clula no tiene
receptor para virus, son solo protenas que estn
en la superficie y que tienen otra funcin. Pero,
el virus se aprovecha de esta protena para
interactuar as con este receptor. En esta
interaccin especifica entre virus y protena-
Rc, el virus reconoce la clula de esa protena y
esa protena que est en la superficie reconoce
solo a los virus que tienen una determinada
partcula. Por lo tanto, la interaccin es
especfica, es como una interaccin entre una
hormona y un receptor o un neurotransmisor
con un receptor.
Una vez que esto sucede, se produce un
ingreso de este virus, el cual es endocitado por
la clula. Dentro de la clula toda la estructura
externa del virus es degradada y finalmente este
RNA es transportado al ncleo celular y ese
RNA tiene una estructura: secuencia U5 y U3
(Secuencia nica en el extremo 5 y 3). Dentro
de este RNA hay s o si algunos ORFs, entre
ellos GAG, POL, ENV.

Figura: Esquema de Estructura de RNA.
U5: Secuencia nica del extremo 5.
U3: Secuencia nica del extremo 3.
ORFs:
GAG: Contiene los genes para las protenas
de la cpside viral.
POL: Codifica para la Transcriptasa
Reversa.
ENV: Codifica para las protenas de la
envoltura.

Figura: Estructura de RNA (igual al
esquema anterior)
Continuando con el proceso la
transcriptasa reversa utiliza el RNA como
molde para codificar cDNA viral de doble
hebra. Los virus pueden promover el desarrollo
de tumores, si se posicionan cerca de un gen
llamado B-Onc.
Dentro de un Retrovirus, existen LTRs,
las cuales son secuencias terminales repetidas,
y se ubican a ambos lados del gen. Son
secuencias altamente similares entre s. La
funcin de estas secuencias es permitirle al
retrovirus insertarse al cromosoma de la
clula infectada, obtenindose:
Figura: Insercin de DNA Viral.
Esto es parte del mecanismo de
transferencia replicativa de un gen. En la
regin LTR izquierda existe un Promotor de
Transcripcin Viral. En el RNA, est
localizado en la parte U3. La finalidad del virus
es replicarse, es decir, producir ms copias de
l, que sean eliminadas de la clula que infect,
para llegar a otras clulas y propagarse. Para
esto, se utilizar un mRNA que es una copia del
retrovirus, el cual se sintetiza a partir del

promotor, siendo una copia idntica al
retrovirus. El promotor, al ser muy eficiente,
lleva a una reproduccin del genoma viral, es
decir, se amplifica el genoma del virus (se hacen
ms virus). Los mRNAs generados pueden ser
traducidos, sintetizando las protenas GAG,
POL y ENV. Esto va a ser importante para
construir la estructura de sobrevivencia del
virus.
Cmo usaremos esto para el propsito?

Figura: Replicacin, Transcripcin y
Traduccin de Protenas Virales.
Las protenas de la envoltura tienen una
propiedad especial, la protenas de la membrana
se sintetizan con un mecanismo que involucra la
participacin de un pptido seal, es decir,
tienen una secuencia aminoacdica que es
equivalente al pptido seal que se encuentra en
protenas de exportacin, por consiguiente
cuando estas protenas se empiezan a traducir
aparece el pptido seal, el ribosoma que lo est
traduciendo esas protenas, lo ribosomas libres
en el citoplasma, es conducido sobre el retculo
endoplsmico por la chaperona SRP que lee la
seal y lo pega al RE y desde ese momento la
protena empieza a ser sintetizada hacia el
interior del retculo y entra en la ruta secretora
de protenas. Adems de esa seal que la
protena tiene en extremo amino, en extremo
carboxilo tiene otro pptido que hace que esta
protena quede atrapada en la membrana del
retculo endoplsmico, sigue sintetizndose
hasta que esta seal del extremo carboxilo la
detiene, y la deja puesta ah, porque del RE se
forman vesculas que llevaran esta protena
integrada en sus membranas, llegando al Golgi
que las enva a las membrana de las clulas que
terminan fusionndose con la membrana celular,
no logran salir de la clula, sino que quedan
atrapadas nuevamente, pero ahora en la
Membrana citoplasmtica de la clula

Las otras protenas GAG, POL
(Transcriptasa reversa, las de la cpside y el
RNA viral) ms otras se pueden ensamblar las
partes del virus y hacer muchas copias, que se
desplazarn a la membrana de la clula para
salir al exterior por exocitosis llevndose
consigo las protenas de la envoltura que
estaban en la membrana plasmtica
previamente.



Entonces nos damos cuenta que la doble
envoltura viral viene de la membrana plasmtica
o de una membrana de la clula infectada.
Todo nos sirve para saber qu debo hacer
para colocar un gen desde afuera dentro de una
clula viral, y que quede dentro del cromosoma
de forma estable.
Para que el cDNA del virus se integre al
cromosoma lo que yo necesito son los LTRs,
sern las que permitan que el cDNA viral se
integre dentro del cromosoma. Los genes virales
GAG, POL y ENV son importantes para el
retrovirus, no para lo que queremos hacer por
los que los debo reemplazar por el gen que me
interesa integrar, lo nico que voy a guardar son
las LTRs.
Ahora bien genticamente hablando
(sobre manipulacin gnica) como ya se seal
de esta estructura son de inters solamente los
LTR, no los genes virales. Entonces
tericamente yo puedo sacar y cortar el DNA y
retirar lo que est entre los LTR. Entonces ah
puedo reemplazarlo con el cDNA que proviene
de un mRNA y que se obtuvo a partir del gen
que se quiere que funcione dentro de la clula.

Se introduce lo que tenga que colocar entre
la LTR izquierda y LTR derecha. Entonces, voy
a hacer una especie de ampliacin y voy a
colocar un promotor entre las dos LTR. Pero,
este promotor es opcional.
Ahora bien en la LTR, hay un promotor
viral, por lo tanto en estricto rigor no necesito
colocar otro porque aqu hay un promotor.

Figura: Promotor despus de LTR.
Entonces si yo quiero poner un gen
dentro de una clula animal y quiero que ese
gen funcione en forma descontrolada, uso el
promotor viral. Pero si yo quiero que ese gen
funcione un poco ms controlado se puede
colocar un promotor adicional y ese promotor lo
selecciono yo. Solamente en clulas animales,
este promotor PGK (fosfoglicerato kinasa,
enzima de la glicolisis).
Se puede o no agregar una secuencia,
que se denomina con una letra griega Y
(Smbolo ). Esto es un enhancer pero
traduccional, no transcripcional, es decir, si un
mRNA contiene una secuencia de ese tipo, ese
mRNA se traduce con una muy alta eficiencia,
esto ocurre porque esa secuencia est presente
en los mRNA virales.
Figura: Promotor + Secuencia Y + cDNA
Propsito del virus: quiere que toda la
clula infectada funcione para su beneficio,
entonces, cuando se produce un RNA viral
dentro de una clula infectada, esta secuencia de
RNA es una especie de trampa para factores
iniciadores de la transcripcin, entonces los
atrae con harta afinidad, eso significa que el
puesto a elegir el sistema traduccional, elige
mRNA viral antes que traducir en mRNA
celular Y esto puede o no estar presente, pero lo
importante es que a continuacin de esto, yo
voy a colocar el cDNA y lo que quiero decir es

que este cDNA, puede provenir y puede ser
transcrito a partir de este promotor o si lo
coloco.
Siguiendo con esto, voy a poner un
segundo gen y este gen adquiere un nuevo
promotor y este promotor usualmente es la
fosfoglicerato quinasa y voy a poner un gen
llamado NeoR (neomisina fosfotransferasa) y
posterior a este voy a poner la otra LTR.


Figura: Vector para ser introducido en clula
blanco de mamfero.
Cuando se produce un RNA viral dentro
de la clula infectada. La secuencia de RNA es
una especie de trampa para factores de
transcripcin. Lo que quiere decir que el sistema
traduccional de la clula va a preferir mRNA
viral, antes que uno propio.
Esta secuencia Y, puede o no estar
presente, es un enhancer traduccional que
permite la eficacia en la traduccin de mRNA
viral. Luego de este se ubica el cDNA, el cual
puede ser transcrito a partir del promotor o a
partir del LTR. (Por ello es opcional poner el un
promotor).
Se coloca un segundo gen, que
corresponde al de NeoR. Antes de eso se pone
un promotor de fosfogliceratoquinasa. El gen
NeoR, es de origen bacteriano. Y para finalizar
se poner la otra LTR.
NeoR, codifica una enzima, llamada
neomicina fosfotransferasa, que otorga
resistencia a la neomicina. Pero las clulas
animales son insensibles a neomicina, pues los
antibiticos matan bacterias. Sin embargo existe
un compuesto txico para clulas animales
(G418), que las mata, pero puede ser fosforilado
convirtindose en algo inocuo. Esta
fosforilacin la puede hacer la neomicina
fosfotransferasa. Por tanto, el gen NeoR,
confiere resistencia a neomicina, pero en clulas
animales otorga resistencia a G-418, por ende se
convierte en un gen marcador.
Todo lo que est entre dos LTR se
integra al cromosoma. El vector se construye a
partir del RNA del retrovirus, se cortan los
genes GAG, POL y ENV con una enzima de
restriccin, para insertar entre las LTR, todos
los elementos mencionados.
Todos los vectores, ya sea levadura,
plantas o animales, tienen un segmento con el
gen de resistencia a ampicilina Amp
+
y el origen
de replicacin de COLE1 (ORI cole1). Y esto
porque antes de querer transformar una clula
de levadura, humana o planta, se debe hacer la
construccin gentica del vector, incluyendo,
pegar el cDNA al vector, el promotor, los genes
marcadores, etc. Y esto se comprueba en
bacterias. Primero se pega el cDNA de inters
en un vector, pero no todos los cDNA quedarn
ligados al vector, es por ello que para
seleccionar las molculas que s se ligaron, con
la mezcla se transforman bacterias, y se
seleccionan aquellas que tengan el vector, es
decir, aquellas bacterias (E. Coli) que tengan el
gen Amp
+
. Siguiente paso, es sacar el DNA de
la bacteria y comprobar que la secuencia que la
bacteria adquiri sea la que se necesita,
mandando la construccin gentica para que la
secuencien. As se corrobora que se tiene el gen
de inters, en el vector especfico.
Despus de esto, se puede hacer la
transformacin de una clula animal. Todos los
vectores sern funcionales tanto en E. Coli
como en Plantas (animales o levadura), pues es
de suma importancia corroborar el vector, antes
de iniciar el proceso de transformacin. Siempre
se trabaja con cDNA.

Con el vector se transformar una clula,
pero que no es la definitiva, sino una
intermediaria, previamente infectada con un
retrovirus y por ende en ella estarn presente los
productos de RNA de este. Ya sea protena
GAG, Pol y en la membrana protenas ENV,
puesto que en uno de los cromosomas est
insertado un provirus o un retrovirus con el
RNA para la protena GAG, Pol y ENV que se
transcribe y se traduce generando dichas
protenas.
Cuando se inserta el plsmido fabricado, en el
DNA cromosomal queda con esta construccin:
Figura: Plsmido fabricado y mRNA de
inters.
A partir de esto se fabrican los mRNA,
entonces se tiene un RNA con 5-3 y proteinas
de la cpside viral. En conclusin, con este
RNA y las proteinas de la cpside se ensamblan
partculas virales, que son virus falsos, pues no
tienen el genoma viral, tienen el RNA que
proviene de la transcripcin de estas
construcciones.
A partir de esta clula se obtendrn
muchos virus que no contienen el genoma viral,
son pseudovirus. Con estos virus se puede hacer
una infeccin de la clula blanco, para as
transferir la construccin gentica al interior de
ella, a travs de un proceso de infeccin viral.
Estas clulas transformadas son
vendidas, donde es posible escoger un sistema
de empaque, existen 6 sistemas diferentes que
se distinguen en la protena de envoltura que se
producir, porque la infeccin entre un virus y
la clula blanco, depende de la interaccin entre
la envoltura y una protena receptora presente en
la superficie de esta ltima.
Por consiguiente, si se desea infectar una
clula humana, la envoltura del pseudovirus a
construir debe ser compatible con una proteina
presente en la superficie de dicha clula. Si esto
no sucede, es decir la envoltura no es
compatible con el receptor de la clula blanco,
la infeccin no se producir. Debido a lo
anterior, hay distintos tipos de sistemas de
empaque de clulas intermediarias, de acuerdo
al propsito del experimento, es decir depende
de que se quiera infectar.
Existen distintos tipos de clulas,
dependiendo del propsito del experimento a
realizar; por ejemplo si quiere infectar
mamferos, se necesita que en la superficie de la
clulas se coloque una protena de envoltura que
reconozca al receptor que est presente en clula
de mamfero; con lo que se quiere decir que
entre las seis posibilidades de empaque, hay que
escoger una clula intermediaria.
Existe un sistema que sirve para
trasformar lo que sea, porque utiliza una
protena de empaque que proviene del virus del
afta. Este virus es de una familia de virus que
producen el afta en humanos y la fiebre aftosa
en ganado.
Este virus es muy promiscuo, puesto que
puede inyectar lo que sea, ya que como
molcula receptora utiliza fosfatidil inositol, y
todas las membranas eucariticas tienen
fosfatidil inositol; por lo que si fabrico virus
falsos (pseudovirus) y a estos les coloco
protenas de envoltura, esta protena de
envoltura del virus se podr unir a cualquier
clula, pudiendo transferirlo a cualquier
organismo ya que poseen fosfatidil inositol, y
como la protena de envoltura se pega a este
fosfatidil inositol, se pegar por ende a esa
membrana, pudiendo esta ser infectada.

Respecto a clulas de cultivo; estas no
son organismos, sino que solo clulas de
cultivo, por lo que a estas clulas se les debe
mantener constantemente. Es por esto que,
suponiendo que, se quiere aumentar la
produccin de leche de una vaca, siendo la
prolactina la protena clave del proceso, se debe
aumentar los niveles de prolactina en esta vaca
para que aumente su produccin de leche.
Entonces el mRNA toma la prolactina, la toma y
genera DNA prolactina, con lo que luego se
obtiene una clula de vaca que tiene el gen de la
prolactina.
La clula de vaca no sirve por s sola,
por lo que, se necesita una planta, puesto que
desde una clula de planta se puede generar un
organismo completo, cosa que no sucede en los
animales. Es por esta razn que se debe escoger
la clula blanco, y si esta es una clula
embrionaria; esto se puede lograr; ya que esta
clula embrionaria es totipotencial, siendo esta
la clula que va a ser transcrita y trasformada.
Luego de esto viene todo el proceso
embriolgico.
Resumiendo esta clula transgnica
transformada se implanta en un ovocito que ser
transformado, el cual luego ser implantado en
el tero de una vaca, con lo que se obtendr,
luego del desarrollo, un animal con tejido
transgnico y otro no transgnico, es decir
algunos tejidos con prolactina y otros no.
Luego de varios cruces y selecciones
repetidas, se puede obtener un organismo
homocigoto para el gen de la prolactina en su
corazn, produciendo una gran cantidad de
hormona y gran cantidad de leche.
Eso sucede en los salmones que
sintetizan la hormona del crecimiento, los cuales
alcanzan su tamao ideal a edades muy
tempranas. Tambin pasa esto en el sper
conejo que tiene mucha hormona del
crecimiento, es decir que si manipulo bien las
cosas, se puede llegar a obtener un organismo
transgnico que, es decir genticamente
modificado, si se escogen bien los componentes,
tanto los genes, el vector la clula intermediaria
y la clula blanco.