LAPORAN PRAKTIKUM PENGECATAN GRAM

Oeh : Osha Ombasta Tanggal Praktikum Asisten Praktikum Tanggal Disetujui Nilai Paraf 0706275731 : 12 November 2009 : Edithia Ruth : : :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN DEPERTEMEN SIPIL FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA DEPOK 2009

Pengecatan Struktur Sel Mikroorgnisme

1.1 Tujuan Praktikum Pengecatan mikroba dilakukan untuk memperjelas perbedaan antara bentuk mikroba dengan material yang ada di sekitarnya sehingga memudahkan untuk proses pengamatan yang lebih detil. Pada praktikum kali ini, pengecatan gram bertujuan untuk identifikasi dan klasifikasi mikroba. 1.2 Teori Dasar • Pengecatan Gram Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yng dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi dan klsifikasi mikroba. Morfologi mikroskopik mikroba yang diperiksan dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan sebagai identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cept dan biaya murah serta dalam kasus tertentu dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan Gram pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negative berdasarkan reaksi atau sifat bakteri tersebut terhadap kandungan yang berrada di dalam pewarna yang digunakan pada pengecatan Gram. Reaksi dan sifat bakteri ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan yang terjadi pada bakteri Gram negatf dan positif pada proses pengecatan Gram. Yang pertama adala teori Salton. Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20%) di dalam dinding sel bakteri Gram negative. Zat lipid ini kan larut selama pencucian dengan alkohol. Poripori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna. Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucin dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks Kristal yodium yang berwarn ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu. Teori yang kedua adalah teori permeabilitas dinding sel. Didasarkan tebal-tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidodlikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks Kristal yodium tidak dapat keluar. Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1-2 lapisan dan susuna selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks Kristal yodium. Dari kedua teori dapat disimpulkan bahwa perbedaan mendasar pada kedua jenis bakteri adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodine terperangkap antara dinding sel dan membrane sitoplasma bakteri Gram positif. Sementara itu, penghilangan atau pelepasan zat lipida dari dinding sel bakteri Gram negatif terjadi akibat pencucian dengan alkohol. Bakteri Gram positif memilik membrane tunggal yng dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidohlikan yang tipis (1-3nm)

Jenis cat yang digunakan pada pengecatan Gram Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D. Masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut :  Cat Gram A Cat ini terdiri atas : Kristal violet : 2 gram Etil alkohol 95 : 20 ml Ammonium oksalat : 0,8 gram Akuades : 80 ml Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.  Cat Gram B Cat ini terdiri atas : Yodium : 1 gram Kalium Yodida : 2 gram Akuades : 300 ml Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).  Cat Gram C Cat ini terdiri atas : Aseton : 50 ml Etil alkohol 95 % : 50 ml Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan : Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.  Cat Gram D Cat Gram D terdiri atas : Safranin : 0,25 gram

Etil alkohol 95 % : 10 ml Akuades : 90 ml Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan : 1. Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D. 2. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Perbedaan sifat bakteri Gram-negatif dan positif Perbedaan sifat antara bakteri Gram positif dan negatif dapat dirangkum pada table di bawah ini: Sifat Komposisi dinding sel Ketahanan penisilin Bakteri Gram Positif Kandungan lipid rendah Bakteri Gram Negatif Kandungan lipid tinggi Lebih tahan Kurang dihambat Relatif sederhana Kurang tahan

terhadap Lebih sensitive

Penghambatan warna Lebih dihambat basa Kebutuhan nutrient Kompleks

Ketahanan terhadap Lebih tahan perlakuan fisik

Struktur dinding sel bakteri gram negative dan positif dapat dilihat pada gambar dibawah:

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya pada teori pengecatan Gram, bakteri terbagi dua atas susunan dinding selnya. Bakteri Gram positif (gambar kiri) memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan berada pada lapisan terluar dari dinding selnya. Pada bakteri Gram negatif (gambar kanan) lapisan peptidoglikan merupakan lapisan yang tipis dan terletak di antara membran sitoplasmik dan membran kedua yang disebut membran luar, bagian ini disebut sebagai ruang periplasmik. Berikut penjelasan tentang beberapa bagian yang berpengaruh pada pengecatan Gram: 1. Peptidoglikan. Merupakan polimer dari alternating N-acetylmuramic acid (NAM) dan N-acetylglucosamine (NAG). Untaian panjang dati alternating polimer ini dihubungkan oleh L-alanine, D-glutamic acid, L-lysine, D-alanine tetrapeptides to NAM. Gram-positive cells mempunyai lebih banyak struktur peptidoglikan crosslinked daripada Gram-negative cells. Peptidoglikan juga merupakan “target” dari aktivitas antimikroba. Contoh, penisilin dengan enzim-enzim menggangu biosintesis peptidoglikan sementara lysozyme secara fisik memecah ikatan NAMNAG. 2. Lipoteichoic acids: Lipoteichoic acids (LTA) hanya ditemukan pada bakteri Gram-positif. Polisakarida ini berada di seluruh lpisan peptidoglikan dan muncul pada permukaan dinding sel. Struktur ini dapat bertindak sebagai determinan antigenic. 3. Lipopolysaccharides. Lipopolysaccharides (LPS) hanya ditemukan pada bakteri Gram-negatif. Struktur ini terdiri dari lipid A, yang mengikat LPS dengan membran luar dan merupakan bagian endotoxic dari molekul. Sebagian dari polysaccharide muncul pada permukaan sel, dan bertindak sebagai determinan antigenic ("O antigen"). Lipi A pada LPS ini-lah yang apabila terkena alcohol aseton akan luruh dan melepaskan Kristal yodium sehingga bakteri kehilangan warnanya.

Gambar lain dari struktur dinding sel bakteri:

Ket: Gram Negatif (kiri), Gram Positif (kanan). LPS (merah), peptidoglikan (kuning), protein (ungu), lipoteichoic acid (hijau), phospholipid (cokelat).

Pengklasifikasian hasil pengamatan pengecatan gram.  Gram positif Gram-positive cocci Clusters: Merupakan karakteristik dari Staphylococcus spp., seperti S. aureus Tebal: Merupakan karakteristik dari Clostridium spp., seperti C. perfringens, C. septicum, C. tetanomorphum

Rantai: Merupakan karakteristik dari Streptococcus spp., seperti S. pneumoniae, B group streptococci

Tipis: Merupakan karakteristik dari Listeria spp.

Tetrad: Merupakan karakteristik dari Micrococcus spp.

Branched: Merupakan karakteristik dari Actinomycetes and Nocardia , seperti A. israelii Note: Mycobacteria tidak bercabang, dan sering menghasilkan warna samar denga Gram stain. Beberapa mycobacteria terlihat seperti Gram-positive rods, tidak seperti diptheroids, beberpa yang lain seperti Gram-positive beading.

Gram positive bacilli

Gram negatif

Gram-negatif cocci Diplococci: Merupakan karakteristik dari Neiseria spp., seperti N. meningitidis Sebagai tambahan, Moraxella spp. dan Acinetobacter spp.are sering memiliki morpologi diplococci. Acinetobacter bisa berbentuk pleomorphic, and terkadang terlihat sebagai Gram-positive cocci. Coccobacilli: merupakan karakteristik dari Haemophilus spp., seperti H. influenzae

Curved merupakan karakteristik dari Vibrio spp.; Campylobactor spp., seperti V. cholerae C. jejuni Coccobacilli: merupakan karakteristik dari Acinetobacter spp., yang dapat menjadi Gram-positive atau Gram-negative, dan sering merupakan Gram-variable. Bentuk jarum tipis: merupakan karakteristik dari Fusobacterium spp.

Gram-negative bacilli Batang tipis: merupakan karakteristik daro enterobacteriaceae, seperti E. Coli

1.1 Alat dan Bahan • • • • • • • • • • Biakan murni dalam medium NA yang telah berumur 24 jam Larutan Crystal Violet (zat pewarna utama/violet) Larutan Safranin (Zat warna tandingan/counter stain Larutan Alkohol aseton (decolorizer) Larutan Lugol’s iodine (zart warn penguat/mordant) Gelas objek (preparat) Kertas isap/tissue Jarum Ose Alkohol 70% Pembakar Spiritus

1.1 Cara Kerja • • • • • • • • • • Preparat yang telah diberi olesan bakteri disiapkan, dikeringkan dan difiksasi di atas nyala api selama beberpa waktu Larutan Crystal violet (pewarna utama) diteteskan pada olesan bakteri sebanyak dua tetes dan dibiarkan selama satu menit. Larutan Lugol’s iodine ditambahkan di atas perparat tersebut dan dibiarkan selama satu menit. Preparat dicuci dengan aquades lalu dikeringkan. Preparat ditetesi kembali dengan larutan alcohol aseton dan didiamkan selama 30 detik. Preparat dicuci kembali dengan aquades lalu dikeringkan. Selanjutnya preparat ditetesi kembali dengan larutan safranin dan didiamkan selama 30 detik. Preparat dicuci dengan aquades lalu dikeringkan dengan tissue. Setelah kering, preparat diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 40x atau 100x dengan menggunakan minyak imersi. Hasil pengamatan dicatat dan digambar.

1.1 Hasil Pengamatan Jenis Pewarna yang Ditambahkan Crystal Violet Lugol’s Iodine Alkohol Aseton Safranin Tampilan Warna Pada Gram Positif Violet Violet Violet Violet Tampilan Warna Pada Gram Negatif Violet Violet Merah

Pada praktikum kali ini, praktikan hanya mencoba pengecatan Gram pada bakteri Gram negatif saja. Terlihat a) Pada saat penambahan cat pertama, Crystal Violet, bakteri menjadi berwarna ungu (violet). Ini disebabkan crystal iodine bereaksi dengan lapisan LPS (Lipopolysaccharides) yang mengandung lipid A, dan gugus pembawa warna (chromoform) yang dibawa cat menempel pada LPS meyebabkan warna bakteri menjadi ungu. b) Penambahan Lugol’s Iodine sebagai cat penguat akan membentuk kompleks Crystal Iodine masih berada pada LPS, membuat warna ungu semakin menguat. c) Pada saat penambahan alcohol aseton sebagai decolorizer, lipid A pada LPS larut dengan alcohol sehingga mendestabilisasikan lapisan LPS dan dengan demikian melepas kompleks Crystal Iodine dan membuat warna ungu menghilang sehingga bakteri menjadi tidak berwarna. d) Terakhir, penambahan safranin yang berwarna merah sebagai counter stain akan menggantikan posisi kompleks crystal iodine pada dinding sel bakteri sehingga bakteri menjadi berwarna merah. Berikut foto hasil pengamatan pengecatan Gram pada bakteri Gram negatif:

Di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x terlihat bakteri sampel berwarna merah dan memiliki bentuk yang lonjong. Pada foto atas dapat diamati bahwa bakteri cenderung tidak berkoloni. 1.1 Analisis/Pembahasan • Analisa Praktikum Praktikum ini bertujuan untuk mengklasifikasikan bakteri sampel ke dalam dua katergori, gram-negatif dan gram positif. Hasil akan lebih baik apabila dapat secara spesifik menunjukkan spesies bakteri sampel. Praktikum dimulai dengan preparat dicuci dan difiksaisi terlebih dahulu. Ini dilakukan untuk memastikan sampel yang nantinya diamati bersih dari benda-benda asing dan untuk mempermudah prosedur-prosedur selanjutnya. Preparat harus ditangani dengan penggunaan pinset, kontak dengan tangan dihindari untuk mencegah minyak dan kotoran yaag ada di tangan menempel pada preparat dan mengacukan hasil praktikum. Namun pada kenyataannya, begitu sulit menangani preparat dengan penggunaan pinset logam, mungkin dikarenakan koefisien gesek antara permukaan kaca dan logam begitu kecil dan pinset logam tidak mempunyai permukaan yang cukup bergerigi/kasar serta bentuknya yang melengkung membuat hanya sebagian kecil dari pinset yang “memegang” preparat. Hasilnya, resiko penggunaan pinset menjadi lebih besar daripada penanganan preparat dengan tangan, yaitu preparat menjadi sangat tidak stabil dan kemungkinan jatuh dan pecah sangat besar. Mempertimbangkan hal ini, penanganan preparat kemudian diputuskan dengan dipegang bagian pinggirannya dengan tangan. Hal ini cukup berhasil dan tidak begitu beresiko mengacaukan pengamatan akhir. Preparat dicuci dengan aquades dan kemudian difiksasi dengan dilewati di atas nyala api dari pembakar spiritus dengan jarak sekitar 2 cm. Fiksasi preparat selalu dilakukan dengan tidak langsung membakar preparat tersebut tetapi dengan sedikit jarak antar preparat dengan api adalah untuk menghindari mikroba ikut terbakar. Setelah proses fiksasi preparat selesai, praktikum dialnjutkan dengan pengolesan bakteri pada preparat dengan bantuan jarum Ose. Jarum Ose terlebih dulu difiksasi

agar bakteri mudah menempel pada saat diambil dengan jarum ini. Fiksasi dilakukan dengan membakar jarum Ose pada pembakar spiritus sampai ujung jarum Ose yang membentuk sebuah lingkaran berwarna merah membara.Jarum Ose yang telah merah membara dicelupkan kedalam alkohol sebelum digunakan untuk mengambil bakteri. Bakteri kemudian diambil dengan gerakan seperti mencongkel tepat pada bagian media dimana koloni bakteri tersebut berada. Jarum Ose yang telah ditempeli bakteri kemudian dioleskan pada perparat dengan gerakan zig-zag. Pada percobaan kali ini praktikan mengalami kesulitan pada saat pengambilan bakteri. Hal ini dirasakan setelah beberapa kali pengulangan prosedur fiksasi jarum sampai pengolesan masih tidak terlihat ada koloni bakteri yang menempel pada preparat walaupun koloni bakteri yang terdapat pada medium awal sudah kacau karena mengalami pencongkelan berkali-kali. Kemudian disadari bahwa penyebabnya adalah ujung jarum Ose yang lurus sehingga jarum tidak dapat mengait bakteri keluar dari medium awal. Ujung melingkar ini kemudian dibengkokkan ke arah dalam dan pengulangan prosedur dari fiksasi sampai pengolesan selanjutnya menunjukkan hasil yang cukup memuaskan. Prosedur-prosedur selanjutnya dijalankan dengan relatif lancar. Setelah dipastikan terdapat bakteri pada preparat, proses fiksasi preparat dimulai dengan cara yang sama seperti fiksasi awal. Preparat kemudian diteteskan Crystal Violet sebagai pewarna utama dan dibiarkan selama satu menit. Pendiaman selama satu menit dilakukan agar cat sempat bereaksi dengan dinding sel bakteri dan meninggalkan warna yang cukup jelas disana. Setelah satu menit preparat dicuci dengan aquades. Pencucian dilakukan agar kelebihan cat terbilas sehingga memngkinkan penambahan cat selanjutnya. Apabila pencucian tadak dilakukan maka cat berikutnya ada kemungkinan tidak dapat melakukan kontak langsung dengan dinding bakteri. Pada saat pencucian terlihat titik-titik bewarna ungu tetap ada pada preparat, menunjukkan memang ada bakteri yang menempel pada preparat. Prepara dikeringkan dengan pembakar spiritus dan tissue kemudian diteteskan Lugol’s iodine sebagai warna penguat dan didiamkan selama satu menit. Preparat dicuci kembali dengan aquades meninggalkan titik-titik yang semakin berwarna ungu. Setelah proses pengeringan preparat diteteskan alkohol aseton sebagai decolorizer. Setelah pencucian terlihat titik-tititk berwarna ungu menghilang, menandakan bakteri sampel kemungkinan besar adalah gram-negatif. Terakhir preparat diteteskan safranin yang berwarna merah sebagai zat warna tandingan dan didiamkan selama 30 detik. Pencucian menampakkan titik-titik merah bermunculan pada preparat. Praktikum dilanjutkan dengan pengamatan preparat dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x. Hasil pengamatan kemudian difoto dan digambarkan pada kertas jurnal. Pengamatan ini memakan waktu yang cukup lama karena untuk “mengunci” penglihatan pada objek mikroorganisme memerlukan ketelitian, kesabaran, serta keikhlasan dari pengamat. Disini praktikan menyadari betapa bergunanya pengecatan gram dalam proses pengamatan bakteri, menimbang bahwa mencari bakteri yang sudah berwarna kontras dengan preparat mebutuhkan waktu yang tidak sedikit, tidak terbayang berapa lama waktu yang harus dihabiskan untuk mencari dan mengamati bakteri yang tidak mengalami pengecatan sama sekali. • Analisis Hasil Hasil pengamatan yang didapatkan berupa bakteri berwarna merah, berbentuk batang tipis dan cenderung tidak berkoloni. Dari warna merah yang muncul, dapat diketahui bahwa bakteri tergolong ke dalam bakteri gram-negatif, dikarenakan warna merah berasal dari safranin yang ditambahkan setelah penambahan decolorizer (alkohol aseton) terlebih dahulu yang akan menghilangkan lapisan lipid bersamaan dengan hilangnya warna ungu pada bakteri gram negatif. Dari bentuk yang teramati,

yaitu batang tipis, bakteri ini mendekati karakteristik dari enterobacteriaceae, seperti E Coli. Maka bakteri bisa dikategorikan sebagai gram-negatif bacilli. Pengamatan lebih lanjut memberikan penemuan bakteri dengan bentuk diplococci yang merupakan karakteristik dari Neiseria spp., seperti N. meningitidis. Dan diasumsikan terdapat gram-negatif cocci pada sampel. Secara keseluruhan pengamatan preparat menunjukkan tidak begitu banyak bateri yang melekat pada preparat. Hal ini mungkin disebabkan kesalahan yang dilakukan pada langkah-langkah sebelumnya yang akan dibahas pada analisa kesalahan.

Analisa Kesalahan Beberapa kesalahan yang mungkin dilakukan praktikan pada praktikum pengecatan yang membuat hasil kurang memuaskan. Kesalahan tersebut antara lain:  Pada saat melakukan fiksasi, preparat terlalu dejat dengan api pembakar spiritus sehingga bakteri lemungkinan terbakar dan prosedur pengambilan bakteri harus diulang. Pada saat mengambil bakteri dengan jarum Ose, yang diambil bukan merupakan ujung akhir dari koloni bakteri mengakibatkan bakteri yang diambil terlalu banyak dan berkumpul sehingga pada saat proses pengamatan bentuk bakteri tidak dapat terlihat dengan jelas.

Berikut perbandingan antara hasil preparat pengamatan yang dilakukan as. Lab. dengan pengamatan yang dilakukan praktikan:

Foto sebelah kiri adalah hasil pengamatan dari as. Lab dan sebelah kanan adalah hasil pengamatan praktikan. Disini terlihat foto kiri memiliki populasi bakteri yang cukup banyak namun bentuk bakteri dapat terlihat dengan jelas. Populasi bahteri pada hasik praktikan terlihat sedikit, namun karena benruk bakteri terlihat cukup jelas, maka hasil ini telah mendekati tujuan praktikum.

1.1Kesimpulan dan Saran

1. Pengecatan gram merupakan cara yang cukup mudah dan sangat membantu untuk pengamatan mikroorganisme di bawah mikroskop dan sekaligus pengklasifikasian mikroorganisme. 2. Bakteri sampel adalah bakteri gram-negatif dan mendekati karakteristik dari enterobacteriaceae dengan kemungkinan besar bahwa bakteri tersebut adalah E. Coli. 3. Terdapat bakteri dengan bentuk diplococci yang merupakan karakteristik dari Neiseria spp. 4. Penggunaan pinset untuk penanganan preparat sama sekali tidak membantu. Mungkin ada baiknya mempertimbangkan penjepit kayu sebagai alat untuk menangani preparat. 5. Bentuk jarum Ose sangat mempengaruhi keberhasilan praktikum ini.

1.1 Lampiran-Lampiran • 2 lembar jurnal praktikum

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful