GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS

PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA












ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ















PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA
BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005




GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS
PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA








ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ





MONOGRAFIA

Presentado como requisito parcial
Para optar el título de
ESPECIALISTA EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA






DIRECTOR

Dra. DIANA PATIÑO C. M.Sc

CODIRECTOR

Dra. MARIA CLAUDIA ORTEGA. MD. Esp.









PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA
BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005










































“Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y conclusiones anotadas,
son de responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la “Pontificia
Universidad Javeriana”
(Artículo 9.18 del reglamento de trabajos de grado y
de investigación. Agosto de 1989)

GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS
PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA









ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ









Dra. DIANA PATIÑO C. M.Sc
DIRECTORA











DRA. MARIA CLAUDIA ORTEGA. MD. Esp
CODIRECTORA







PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA
BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005
GUIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS
PRIMARIAS POR EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA










ANGELA PATRICIA FONSECA GUTIERREZ













Dra. Diana Patiño C. M.Sc.
COORDINADORA ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE
INMUNOLOGÍA CLÍNICA











PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA CLÍNICA
BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2005


































A Dios que siempre esta a mi lado guiándome.
A mis padres al igual que a mis hermanos y a Sofí.
A Ricardo porque sin todo su amor y apoyo nunca lo hubiera
logrado..
AGRADECIMIENTOS



A la Doctora Diana Patiño por permitirme trabajar con ella y brindarme siempre su
apoyo y amistad incondicional y a la Doctora Maria Claudia Ortega por su gran
ayuda y paciencia durante el desarrollo de este trabajo. A todas las personas del
laboratorio de Inmunológia y Hematología de la facultad de ciencias por toda su
colaboración.





























7
INDICE DE TABLAS


Pág.


Tabla 1. Prevalencia de IDP en Antioquia Colombia 1994-2002. 8


Tabla 2. Inmunodeficiencias ligadas a X. 9


Tabla 3. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, Asociadas a
inmunodeficiencia combinada severa. 10


Tabla 4. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas
a inmunodeficiencia combinada severa. 11


Tabla 5. Alteraciones en el extendido de sangre periférica
observadas en las inmunodeficiencias primarias . 24


Tabla 6. Deficiencias Inmunitarias que presentan resultados negativos
para la prueba de hipersensibilidad retardada. 31

















8
INDICE DE FIGURAS



Pág.



Figura 1. Distribución de inmunodeficiencias primarias en 1428
pacientes reportados por la LAGID 7

Figura 2. Relación entre el sistema NADPH oxidasa que esta
afectado en los pacientes con granulomatosis crónica 13

Figura 3. Flujograma para el diagnostico de IDP Universidad
de Antioquia Colombia 22

Figura 4. Patrón de electroforesis para hipogammaglobulinemia 25

Figura 5. Fundamento de la Citometría de Flujo 29

Figura 6. Análisis de puntos de LB (CD19+) por Citometría de Flujo 30


Figura 7. Análisis de subpoblaciones de LT (CD4+/CD8+) por
Citometría de Flujo. 32

Figura 8. Prueba de liberación de cromio 34

Figura 9. Análisis de células NK (CD16+/CD56+) por Citometría
de Flujo.

Figura 10. Quimiotaxis en filtro. 38










9
TABLA DE CONTENIDO
Pág


1. Definición del problema 1

2. Justificación 3
3. Objetivos 4
3.1 Objetivo General 4
3.2 Objetivos específicos 4
4. Marco Teórico 5
4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias 5
4.1.1 Epidemiología 6
4.2 Clasificación de las inmunodeficiencias primarias 9
4.3 Aspectos Clínicos de las inmunodeficiencias Primarias 12
4.3.1 Ligadas a X 12
4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crónica (EGC) 12
4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton) 13
4.3.1.3 Síndrome de Hiper IgM 14
4.3.1.4 Síndrome de Wiskott Aldrich 15
4.3.2 Autosomicas recesivas 16
4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa 16
4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA) 17
4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP) 17
4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2 18
4.3.2.5 Deficiencia de Zap70 18
4.3.2.6 Deficiencia de Jak3 19
4.3.2.7 Deficiencia de Adhesión leucocitaria 19

4.3.2.8 Síndrome de Chediak Higashi 20

4.3.2.9 Síndrome linfoproliferativo autoinmune 20
10
4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia 21
4.4 Pruebas diagnosticas 22
4.4.1 Pruebas de primera etapa 23

4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa 26
4.4.2.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos 26
4.4.2.1.1 Cuantificación de Inmunoglobulinas 26
4.4.2.1.2 Medición de subclases de inmunoglobulinas 27

4.4.2.1.3 Isohemaglutininas 28

4.4.2.1.4 Producción de anticuerpos IgG específicos 28

4.4.2.1.5 Cuantificación de LB por citometría 28

4.4.2.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT 30
4.4.2.2.1 Hipersensibilidad cutánea retardada 30
4.4.2.2.2 Subpoblaciones de LT por citometría 31
4.4.2.2.3 Cuantificación de moléculas de superficie por citometría 32
4.4.2.2.4 Citotoxicidad mediada por LT CD8+ y NK 33
4.4.2.2.5 Cuantificación de células NK 34
4.4.4.3 Pruebas para medir la función de las células fagocíticas 35
4.4.4.3.1 Reducción de NBT 36
4.2.2.3.2 Medición de radicales libres de oxigeno 36

4.2.2.3.4 Quimiotaxis 37
4.2.2.3.5 Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrófilos 38

4.2.2.3.6 Adherencia 39

4.2.2.4 Pruebas para medir sistema del complemento 39

4.2.2.4.1 Cuantificación de C3 y C4 39

4.2.2.4.2 Complemento hemolítico 50 (CH50) 40

11
4.2.2.4.3 CD59 en eritrocitos 40

4.2.3 Pruebas de tercera etapa 41

4.2.3.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos 41

4.2.3.1.1 Producción de anticuerpos in Vitro 41

4.2.3.1.2 Western blot para BtK, BLNK, NEMO 41

4.2.3.1.3 Análisis de polimorfismos conformacionales (SSCP) 42

4.2.3.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT 42

4.2.3.2.1 Linfoproliferación con mitógenos 42

4.2.3.2.2 Cuantificación de la producción de citocinas In Vitro 43

4.2.3.2.3 Western blot para ZAP-70, JAK3 y STAT-1 43

4.2.3.3 Pruebas para medir la función de células fagocíticas 44

4.2.3.3.1 Western blot para proteínas del sistema NADPH oxidasa 44

5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 45

6. BIBLIOGRAFIA 46
















12

1. Definición del problema

Las inmunodeficiencias primarias son un grupo heterogéneo de desordenes
generalmente hereditarios que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T) y
humoral (Linfocitos B) especifica o los mecanismos de defensa no específicos del
huésped (Células fagocíticas, citocinas, proteínas del complemento, entre otros).

En la mayoría de los casos se manifiestan en el primer año de vida, no obstante,
pueden presentarse a cualquier edad incluyendo adultos (Lim, 2004). Afectan
individuos de ambos sexos. Sin embargo, en los menores de cinco años se
presenta más en los varones con una relación 5:1 con respecto a las mujeres,
mientras que en los adultos la frecuencia es muy similar (Montoya, 2004).

La incidencia de las inmunodeficiencias primarias se ha incrementado de 10 casos
reportados en 1969 a 1 en 10.000 nacidos vivos (Lim, 2004) y varia dependiendo
del tipo especifico de inmunodeficiencia primaria y de otros factores como la etnia
y la endogamia (Montoya, 2004).

Las inmunodeficiencias primarias han sido clasificadas de acuerdo al defecto
molecular que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X e inmunodeficiencias
autosomicas recesivas (Jones, 2000). Hasta el momento se han definido unas 100
enfermedades por deficiencia inmunológica. Pero, esta cifra puede ser aún mayor,
si se tiene en cuenta que de los 40.000 genes estimados en el hombre, entre
1.000 y 10.000 podrían estar involucrados en el desarrollo y la función de las
células del sistema inmune (Montoya, 2004).

Las manifestaciones clínicas de las inmunodeficiencias primarias pueden ser muy
variadas en función del defecto inmunológico, muchos niños inmunodeficientes
pueden desarrollar síntomas como erupciones y alteraciones en la pigmentación
13
de la piel, anomalías en el desarrollo de la cara, del sistema esquelético y del
corazón, entre otros. Los defectos que implican alguna alteración en la función de
la célula de B dan lugar a infecciones pulmonares recurrentes que a menudo y
según el compromiso de la respuesta humoral pueden terminar en septicemia
bacteriana. La carencia de la producción de anticuerpos puede también aumentar
la susceptibilidad a infecciones por enterovirus dando por resultado meningitis viral
crónica y giardiasis entre otras. Las células T son esenciales para el control de la
enfermedad viral y fúngica, no obstante, también proporcionan la función de
colaboración a las células B mediante la liberación de citocinas como activadoras
de la respuesta inmune de tipo humoral garantizando así, una respuesta
adecuada y efectiva. Enfermedades como la inmunodeficiencia combinada severa
(IDSC) de LT y LB da como resultado susceptibilidad aumentada a enfermedades
por patógenos virales, fúngicos y bacterianos. Los pacientes con desórdenes de
granulocitos son susceptibles a las enfermedades por Estaphylococcus y a
infecciones por microorganismos Gram negativos (Lim, 2004).

Como se puede observar los pacientes con algún tipo de inmunodeficiencia
primaria, en especial los niños, son un blanco fácil para el desarrollo de
infecciones recurrentes por diferentes tipos de patógenos (bacterias, virus, hongos
y parásitos). Dado que el tratamiento de elección para el control de infecciones
recurrentes es el uso de antibióticos se ha observado la generación de altas
resistencias a los mismos (Lim, 2004).







14
2. Justificación

En Colombia actualmente existen muy pocos laboratorios que realicen pruebas
inmunológicas especificas para el diagnostico de pacientes con
inmunodeficiencias primarias. Razón por la cual los pacientes se ven sometidos a
estar por largos periodos en instituciones hospitalarias debido a las múltiples
infecciones que presentan y que ponen en riesgo su vida.

Esto se debe en gran parte a la poca información sobre la presentación clínica de
las inmunodeficiencias primarias, al limitado acceso a las pruebas diagnosticas y
a los pocos laboratorios especializados que existen actualmente en el país.

El acceso a las pruebas especializadas de laboratorio permite al personal medico
establecer un diagnostico acertado que podría prevenir o por lo menos disminuir la
estancia de los pacientes en las instituciones hospitalarias, evitando así los altos
costos con relación a la demora en el diagnostico y manejo adecuado, tanto para
las entidades prestadoras de salud al igual que para el paciente y sus familiares

Las razones previamente expuestas nos llevan a revisar cuáles son las pruebas
de laboratorio que existen actualmente que puedan ser útiles para la confirmación
diagnostica temprana por parte del personal medico que acompaña a pacientes
con algún tipo de inmunodeficiencia primaria y de esta manera proporcionar una
herramienta de consulta para llevar a cabo un diagnostico mas certero.






15
3. Objetivos

3.1 Objetivo General:

Realizar una revisión de la literatura científica lo más actualizada posible sobre las
pruebas del laboratorio de inmunología clínica útiles en el diagnostico de pacientes
con inmunodeficiencias primarias.

3.2 Objetivos específicos

1. Describir los aspectos clínicos más relevantes de las inmunodeficiencias
primarias.
2. Revisar y definir cuáles son las pruebas de primera etapa que debe solicitar
el medico para aproximarse al diagnostico cuando hay sospecha de
inmunodeficiencia primaria.
3. Definir cuales son las pruebas de segunda etapa útiles para llegar a un
probable diagnostico de acuerdo al componente inmunológico que se
presume se encuentra alterado.
4. Describir las pruebas de tercera etapa para llegar a un diagnostico
molecular confirmado de los pacientes con inmunodeficiencia primaria.









16
4. Marco Teórico

4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias

Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son un grupo heterogéneo de desordenes
generalmente de origen hereditario que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T)
y humoral especifica (Linfocitos B) o los mecanismos de defensa no específicos
del huésped (células fagocíticas, citocinas, proteínas del complemento, entre
otras). Estos desordenes en el sistema inmune causan una incrementada
susceptibilidad a las infecciones y posible desarrollo de enfermedades autoimunes
(Lim, 2004). En la mayoría de los casos se manifiestan en los cinco primeros años
de vida (90%), no obstante, pueden presentarse a cualquier edad incluyendo
adultos. Con respecto a su distribución por sexo casi todos los registros
demuestran gran predominio masculino (60-80%) (Oleastro, 2001). Se estima que
1 de cada 10.000 niños nacidos vivos presentan a lo largo de su infancia algún
tipo de inmunodeficiencia primaria (Lim, 2004).

Las inmunodeficiencias primarias han sido clasificadas de acuerdo al defecto
molecular que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X e inmunodeficiencias
autosomicas recesivas (Jones, 2000). Hasta el momento se han definido unas 100
enfermedades por deficiencia inmunológica. Sin embargo, esta cifra puede ser aún
mayor, si se tiene en cuenta que de los 40.000 genes estimados en el hombre,
entre 1.000 y 10.000 podrían estar involucrados en el desarrollo y la función de las
células del sistema inmune (Montoya, 2004).

Las manifestaciones clínicas de las inmunodeficiencias primarias pueden ser muy
variadas en función del defecto inmunológico, en algunos niños se presenta
desmedro en el crecimiento y en el desarrollo como consecuencia de las
17
infecciones que presentan a repetición. Otros síntomas que podrían estar
asociados a las inmunodeficiencias primarias son; erupciones y alteraciones en la
pigmentación de la piel, anomalías en el desarrollo de la cara, del sistema
esquelético y del corazón. Los defectos que implican alguna alteración en la
función de los linfocitos B dan lugar a infecciones pulmonares recurrentes, a
menudo relacionados con septicemia bacteriana. La carencia de la producción de
anticuerpos puede también aumentar la susceptibilidad a las infecciones por
enterovirus dando como resultado el desarrollo de meningitis viral crónica y
giardiasis gastrointestinal. Las células T son esenciales para el control de la
enfermedad viral y fúngica ya que colaboran con las células B mediante la
liberación de citocinas que promueven una respuesta inmune adecuada y efectiva.
Así, desórdenes como la inmunodeficiencia combinada severa de LT y LB da
como resultado una mayor susceptibilidad a los patógenos virales, fúngicos y
bacterianos (Lim, 2004).

4.1.1 Epidemiología:

La prevalecía de pacientes con inmunodeficiencias primarias se ha incrementado
de un caso reportado en 1969 a 1 por cada 10.000 nacidos vivos, este incremento
se puede deber particularmente a que son enfermedades de las cuales se
sospecha más en la actualidad y al mejoramiento de las pruebas utilizadas en la
detección de anormalidades inmunológicas. Algunas de estas pruebas permiten la
identificación de algunas mutaciones en los genes responsables de estos
desordenes lo que permite detectar mas fácil y rápidamente a este tipo de
pacientes (Lim, 2003).

En la mayoría de los casos las inmunodeficiencias primarias se manifiestan en los
primeros cinco años de vida (90%), pero pueden presentarse a cualquier edad
incluyendo adultos. Con respecto a su distribución por sexo casi todos los
registros demuestran gran predominio masculino (60-80%) (Oleastro, 2001).
18
19

En cuanto a la prevalencia de inmunodeficiencias primarias se encuentran
diferentes reportes como el publicado por la asociación latinoamericana de
inmunodeficiencias primarias LAGID en 1998 en el que se encontró que las
inmunodeficiencias primarias por defectos en los anticuerpos son las más
frecuentes (Zelazko, 1998).



Figura 1. Distribución de inmunodeficiencias primarias en 1428 pacientes reportados por la
LAGID (Zelazko, 1998)


En Colombia actualmente los únicos datos de prevalencia de inmunodeficiencias
primarias, son los publicados por el Grupo de Inmunodeficiencias Primarias de la
Universidad de Antioquia, en este estudio se tomaron pacientes a los cuales se les
hizo seguimiento por varios años, obteniéndose que las deficiencias de
anticuerpos son las mas predominantes en nuestro país seguidas por las
Anormalidades
asociadas
a defectos en los
granulocitos
(8%)
Desordenes de
fagocitos
(9%)
Inmunodeficiencia
combinada severa
(5%)
Deficiencias de
Complemento
(2%)
Deficiencia de
anticuerpos
(58%)
Síndromes
asociados con
otras
anormalidades
(18%)
deficiencias combinadas, estos datos concuerdan con los encontrados
mundialmente en otros estudios como los de LAGID en 1998. (Tabla 1)

Tabla 1. Prevalencia de IDP en Antioquia Colombia 1994-2002 (Montoya, 2002)
Fenotipo Predominante Hombres Mujeres Total

Deficiencias predominantes de anticuerpos

Hipoagamaglobulinemia transitoria de la infancia
10 4 14
Inmunodeficiencia común variable
2 9 11
Agamaglobulinemia congénita
8 0 8
Déficit de IgA
2 1 3
Síndrome de hiper IgM
1 1 2
Deficiencia de anticuerpos con Ig normales
0 0 1
Inmunodeficiencia común variable con timoma
1 0 1
Subtotal (%)
40 (40.8)
Deficiencias combinadas

Inmunodeficiencia Combinada severa
5 8 13
Inmunodeficiencia combinada no severa
2 0 2
inmunodeficiencia celular con Igs normales
1 5 6
Subtotal (%)
21 (21.5)
Deficiencias celulares y de anticuerpos asociadas
con otros defectos mayores

Candidiasis mucocutanea crónica
4 2 6
Síndrome de Wiskott Aldrich
4 0 4
Ataxia Telangiectasia
1 1 2
Anomalía de DiGeorge
0 2 2
Enanismo con extremidades cortas
1 0 1
Subtotal (%)
15 (15.3)
Síndromes de inmunodeficiencia asociados con
disfunción de los fagocitos

Síndrome de hiper IgE con infecciones recurrentes
6 4 10
Síndrome de Chediak Higashi
2 3 5
Subtotal (%)
15 (15.3)
Defectos Primarios de las células fagocíticas

Enfermedad Granulomatosa Crónica
4 0 4
Neutropenia Congénita Severa
1 1 2
Subtotal (%)
6 (6.1)
Deficiencias del complemento

Edema angioneurotico hereditario
0 1 1
Subtotal (%)
1 (1.0)
Total
55 43 98 100%



20
4.2 Clasificación de las inmunodeficiencias primarias
El aumento reciente sobre el conocimiento de los defectos moleculares de muchas
de las inmunodeficiencias primarias ha llevado a grandes avances en el
diagnóstico y manejo de estas patologías permitiendo clasificarlas de acuerdo al
tipo de defecto genético que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X (Tabla
2) e inmunodeficiencias autosomicas recesivas que a su vez se subclasifican en
inmunodeficiencia combinada severa Tabla 3) y en no asociadas a
inmunodeficiencia combinada severa (Tabla 4)

Tabla 2. Inmunodeficiencias ligadas a X (Jones, 2000)
Desorden (año de
definición del defecto
molecular)
Localización
cromosomica
Gen Defecto Prueba diagnostica
Enfermedad granulomatosa
crónica ligada a X (1986)
Xp21 gp91phox
Componente de
fagocitosis NADPH
Nitro azul de tetrazolio
(NBT), inmunoblot para
gp91phox, análisis de
mutaciones
Agamaglobulinemia ligada a
X (1993)
Xq22
Tirosin Kinasa
de Bruton
Vía de señalización
intracelular esencial para
la maduración de células
pre-B
Inmunoblot para Btk o
análisis por citometría de
flujo, análisis de
mutaciones
Inmunodeficiencia
combinada severa ligada a X
(1993)
Xq13
Cadena
común γ
Componentes de los
receptores para IL-2, IL-4,
IL-7, IL-9, IL-15,
desarrollo de células T y
NK, función de células T y
B
Expresión de CD154
sobre LT activados por
citometría de flujo, análisis
de mutaciones
Síndrome de Hyper-IgM
(deficiencia de CD40L)
(1993)
Xq26
CD40L
(CD154)
Cambio de Isotipo,
función de LT
Expresión de CD145
sobre LT activados por
citometría de flujo, análisis
de mutaciones
Síndrome de Wistkott-Aldrich
(1994)
Xp11 WASP
Formación del
citoesqueleto, movilidad y
trafico de células inmunes
Expresión de WASP por
inmunoblot, análisis de
mutaciones
Síndrome linfoproliferativo
ligado a X (Síndrome de
Duncan) (1998)
Xq25 SAP
Regulación de la
respuesta de LT a EBV y
otras infecciones virales
Análisis de mutaciones,
Expresión de SAP
Deficiencia de properdina
(1992)
Xp21 Properdina
Componente terminal del
complemento
Niveles de Properdina
21
Tabla 3. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, Asociadas a inmunodeficiencia
combinada severa (Jones, 2000)

Desorden (año de definición
del defecto molecular)
Localización
cromosomica
Gen Defecto Prueba diagnostica
Deficiencia de adenosin
deaminasa (ADA) (1983)
20q12-13
Adenosin
deaminasa
Enzima en la vía de las
purinas, acumulación de
metabolitos tóxicos
Niveles de ADA y
metabolitos en eritrocitos,
análisis de mutaciones
Deficiencia de la fosforilasa de
purina (PNP) (1987)
14q11
Fosforilasa
de purina
Enzima en la vía de las
purinas, acumulación de
metabolitos tóxicos
Niveles de PNP y
metabolitos en eritrocitos,
análisis de mutaciones
Deficiencia del gen de
activación de la recombinasa
(RAG 1 y 2) (1996) Síndrome
de Omenn
11p13
RAG1 y
RAG2
Defectos en la
recombinación de DNA
afectando inmunoglobulinas
y el gen del receptor de de
LT
Análisis de las mutaciones
en RAG1 y RAG2
Deficiencia en el receptor de LT
(1987)
11q23 CD3γ/CD3ε
Función y señalización del
receptor de LT
Intensidad de fluorescencia
de CD3, análisis de
mutaciones
Deficiencia de Zap70 (1994) 2q12 Zap70
Función de LT, selección de
LTCD8+ durante el
desarrollo del timocito
Expresión y activación de
Zap70, análisis de
mutaciones
Deficiencia de JAK3 (T-B+NK-
SCID) (1995)
19p13 JAK3
Receptor de señalización
de Il-2, Il-4, IL-7, IL-9, IL-15,
desarrollo de LT y NK,
Función de LT y LB
Activación y expresión de
JAK3, análisis de
mutaciones
Deficiencia en el receptor de IL-
7 (1998)
5p13
Receptor α
de IL-7
Rol esencial en desarrollo y
función de LT
Expresión de IL-7α por
citometría, análisis de
mutaciones
22
Tabla 4. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas a inmunodeficiencia
combinada severa (Jones, 2000)

Desorden (año de
definición del defecto
molecular)
Localización
cromosomica
Gen Defecto Prueba diagnostica
Deficiencia de adhesión
leucocitaria tipo I (1987)
21q22 CD11/CD18
Defectos en la adhesión y
migración de leucocitos
Análisis de la expresión de
CD18/CD11 por
citometría, análisis de
mutaciones
Enfermedad granulomatosa
crónica (1990)
(1990)
(1988)

7q11,
1q25,
16p24
p47phox,
p67phox,
p22phox
Defectos en la bolsa
respiratoria y muerte
intracelular de fagocitos
Expresión de p47phox,
p67phox, p22phox por
inmunoblot, análisis de
mutaciones
Síndrome de Chediak
Hisgashi (1996)
1q42 LYST
Anormalidades en los
microtubulos mediado por
las proteínas lisosomales
circulantes
Inclusiones gigantes en
los granulocitos, análisis
de mutaciones
Deficiencia de MHC clase II
(1993)
(1998)
(1995)
(1997)

16p13,
19p12,
1q21,
13q13
CIITA
(MHC2TA),
RFXANK,
RFX5,
RFXAP
Defecto en la regulación
transcripcional de la
expresión de la
moléculas de MHCII
Expresión de MHCII,
análisis de mutaciones
Deficiencia de MHC clase I
(1994)
(1999)

6p21
6p21

TAP2
TAP1
Defecto en el ensamblaje
del péptido y en la
presentación de las
moléculas de MHCI
Expresión de MHCI
Síndromes autoinmunes
Linfoproliferativos (ALPS)
(1995)

10q24
APT1 (Fas)
Defectos en la apoptosis
de Linfocitos
expresión de Fas,
ensayos de apoptosis,
análisis de mutaciones
Ataxia telangiectasia (1995)
11q22 ATM
Control del ciclo celular y
respuesta de daño de
DNA
Sensibilidad del DNA a la
radiación, análisis de
mutaciones
Susceptibilidad inherente a
micobacterias
(1996)
(1998)
(1998)

6q23
5q31
19p13
Receptor de
Interferón
γ, IL-12
p40,
Receptor β1
de IL-12
Defecto en la producción
de Interferón γ y en la
función de señalización
Expresión del receptor de
Interferón γ, expresión de
IL-12, Expresión del
receptor de IL-12, análisis
de mutaciones
23
4.3 Aspectos Clínicos de las inmunodeficiencias Primarias

4.3.1 Ligadas a X

4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crónica (EGC)

La Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC) es la inmunodeficiencia primaria
por deficiencia de fagocitos más comúnmente diagnosticada, con una mayor
prevalencía en hombres que en mujeres (Cooper, 2003). La EGC es causada por
un defecto funcional en varios componentes de sistema NADPH oxidasa de los
fagocitos (Lim, 2004). Existen dos patrones de herencia: el primero ligado al sexo,
por mutación en el gen de la phox 91 (Xp21.1), representa la forma más frecuente
(65%), de comienzo más temprano y curso más severo y el segundo; autosómico
recesivo por mutaciones en los genes de la phox 22 (16q24), phox 47 (7q11.23) y
phox 67 (1q25) (Lim, 2004).

Las manifestaciones clínicas comprenden infecciones recurrentes severas y
supurativas; abscesos del tejido subcutáneo, el hígado y los pulmones,
gingivoestomatitis, periodontitis, adenitis piógena supurativa, osteomielitis
multifocal y enfermedad diarreica recurrente. La mala regulación en la respuesta
inflamatoria lleva a la formación de granulomas en muchos órganos que pueden
producir obstrucción de los aparatos digestivo y genitourinario (Rugeles, 2004).

El defecto molecular de la EGC es una deficiencia en la bolsa respiratoria. Los
componentes estructurales de sistema oxidativo NADPH se requieren para la
generación de superoxido y otras especies reactivas importantes en la fagocitosis
de microorganismos. El sistema NADPH se compone de cuatro componentes, 2
de ellos (phox 91 y phox 22) ubicados en la membrana plasmática del fagocito
formando el citocromo b558 y otros dos (phox 47 y phox 67) ubicados en el
citoplasma. La activación del sistema requiere la movilización de los componentes
24
citoplasmáticos hacia la membrana y su acople al citocromo. La ausencia o
disfunción de alguno de estos componentes imposibilita el correcto funcionamiento
enzimático


Figura 2. Relación entre el sistema NADPH oxidasa que esta afectado en los pacientes con
granulomatosis crónica (Mackay, 2000).


4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton)

La Agamaglobulinemia ligada a X fue la primera inmunodeficiencia primaria
identificada en 1952 por Bruton, por lo que también es llamada
agammaglobulinemia de Bruton, en esta enfermedad hay ausencia de células B
en sangre periférica y órganos linfoides debido a un defecto molecular que
imposibilita la supervivencia de la célula B (Rugeles, 2004). Esta enfermedad
afecta exclusivamente a varones, inicia sus manifestaciones clínicas más
tempranamente que otras formas de deficiencias de anticuerpos. Las principales
25
manifestaciones clínicas son las infecciones recurrentes, pero además de ellas los
pacientes pueden presentar cuadros de artritis crónica o cuadros semejantes a
dermatomiocitis. Las infecciones virales son controladas normalmente en su
mayoría con excepción de infecciones por enterovirus del sistema nervioso central
(meningoencefalitis crónica). El examen físico muestra la ausencia de ganglios
linfáticos superficiales y amígdalas. Las inmunoglobulinas séricas son
indetectables o están francamente disminuidas (por lo general la IgG es menor de
200 mg/dl) y los linfocitos B en sangre periférica están ausentes o muy
disminuidos (menor al 2 %). La inmunidad celular no está afectada (Oleastro,
2001).

Esta deficiencia está determinada por una alteración en la proteína kinasa Btk
(Bruton tirosin kinasa), proteína relacionada con la maduración y proliferación del
linfocito B. La falta de actividad de esta proteína como consecuencia de
mutaciones en el gen que la codifica genera un bloqueo en la maduración a nivel
del estadio de células pre-B (Jones, 2000).

4.3.1.3 Síndrome de Hiper IgM

Se caracteriza por presentar tanto niveles normales como muy elevados de IgM
con marcada hipogammaglobulinemia IgG e IgA. Además de las infecciones
recurrentes por gérmenes extracelulares encapsulados, los pacientes suelen
presentar infecciones por Pneumocystis carinii, episodios de neutropenia,
manifestaciones de autoinmunidad (citopenias hemáticas, artritis) y mayor
predisposición a las neoplasias de estirpe linfoide (linfomas y leucemias). Estos
pacientes comúnmente presentan adenomegalias, hipertrofia amigdalina y
hepatoesplenomegalia. El recuento de linfocitos B circulantes es normal y la
inmunidad celular generalmente está conservada (Oleastro, 2001).

26
La falla molecular responsable se ubica en el ligando de CD40, molécula
normalmente expresada en linfocitos T activados, imprescindible para el cambio
de isotipo de IgM a IgG e IgA. Mutaciones en el gen de esta molécula condicionan
la falta de síntesis o la síntesis de una molécula no funcional (Jones, 2004).

4.3.1.4 Síndrome de Wiskott Aldrich

El síndrome de Wiskott Aldrich (WAS) es una enfermedad recesiva ligada al sexo
con una incidencia mundial de 4 enfermos por cada millón de niños varones
nacidos vivos (Chien, 2004). Se manifiesta por eczema, infecciones recurrentes y
trombocitopenia (Lim, 2004). Las manifestaciones suelen aparecer durante el
primer año de vida. El eczema adquiere las características de una dermatitis
atópica con gran tendencia hemorrágica. Las infecciones se localizan
principalmente en el tracto respiratorio tanto superior (conjuntivitis, sinusitis, otitis
media) como inferior (bronquitis, neumonías). Los gérmenes responsables son
especialmente microorganismos piógenos (Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae). Las infecciones virales por herpes simple o por varicela
zoster suelen ser severas y condicionar una alta morbimortalidad. El cuadro clínico
puede completarse con manifestaciones de autoinmunidad como vasculitis,
glomerulonefritis o anemias (Lim, 2004).

Las concentraciones de IgM en suero son reducidas, mientras que las
concentraciones de IgA e IgE son elevadas y la IgG se encuentra normal (Lim,
2004). En algunos casos se puede encontrar un déficit de las subclases de IgG2 e
IgG4. La formación de anticuerpos, especialmente a polisacáridos capsulares
bacterianos se encuentra defectuosa, además los pacientes presentan una pobre
respuesta a antígenos de tipo proteico (Lim, 2004) como isohemaglutininas y
anticuerpos anti-neumococo (Oleastro, 2001).

27
El gen responsable del síndrome del Wiskott Aldrich codifica para la proteína
WASP localizada en el cromosoma Xp11.22-p11.23, se han identificado diferentes
mutaciones localizadas a través del gen, pero la más común envuelve la
sustitución de nucleótidos. La interacción entre la proteína WASP el Cdc42 de la
familia GTPasa Rho y el complejo organizador del citoesqueleto Arp2/3 es muy
importante en la transducción de señales que cuando presentan algún tipo de
alteración se refleja en problemas a nivel de señalización, polarización, movilidad y
fagocitosis de las células (Chien, 2004).

4.3.2 Autosomicas recesivas

4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa

Esta forma se presenta solamente en varones y se debe a la falta total de
diferenciación de precursores linfoides pretímicos. Como consecuencia de ello se
observa una marcada linfopenia con ausencia de linfocitos T maduros. Los
linfocitos B, que se encuentran presentes en número normal o incluso aumentado;
son funcionalmente deficientes (agammaglobulinemia). Las células NK están
ausentes o francamente disminuidas con pobre actividad citotóxica (Bonilla,
2003).

El defecto molecular responsable se encuentra en la cadena gamma común,
cadena que comparten los receptores para varias citocinas (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e
IL-15). Esta cadena se encuentra asociada a la tirosina kinasa JAK3, unión
necesaria para transmitir la señal de activación celular hacia el interior de la célula.
Mientras que la disfunción de los receptores para IL-2 e IL-7 genera el bloqueo en
el desarrollo de LT, la alteración del receptor para la IL-15 sería la responsable de
la deficiencia de células NK. Diferentes tipos de mutaciones en el gen que codifica
para la cadena gamma del receptor de IL-2 generan alteraciones en la
transcripción necesaria para una síntesis proteica normal (Lim, 2004).
28

4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA)

La deficiencia de adenosina deaminasa (ADA), representa aproximadamente el 20
% de todos los casos de Inmunodeficiencia combinada severa (IDCS) y el 40 % de
los de transmisión autosómica recesiva. ADA, es una enzima que interviene en el
metabolismo de las purinas, transforma reversiblemente la adenosina en inosina y
2' - deoxiadenosina (dAdo) en 2' deoxiinosina. La acumulación de adenina y dAdo
tiene efectos tóxicos sobre los linfocitos, especialmente en estadíos inmaduros
(timocitos). Además, Ado es fosforilado en dATP, el cual ejerce un efecto
inhibitorio sobre la ribonucleótido reductasa, enzima requerida para la síntesis del
ADN. La enzima S-adenosil – homocisteína hidrolasa (SAH hidrolasa), enzima
necesaria para la normal metilación del ADN, también se ve inactivada por la
acumulación de estos sustratos.

En el 85 % de los casos de deficiencia de ADA las manifestaciones clínico-
inmunológicas corresponden a una IDCS. Se observa una alta incidencia de
alteraciones neurológicas y, en el 50 % de los casos, una displasia osteocondral
visible radiológicamente. Estos individuos presentan una marcada linfopenia con
compromiso variable de las células NK. El diagnóstico se establece documentando
una actividad enzimática deficiente en eritrocitos y linfocitos y/o midiendo las altas
concentraciones de dATP (Jones, 2004).

4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP)

La fosforilasa de purina (PNP) juega un papel importante en la vía salvaje de
purina, la deficiencia de PNP es una enfermedad autosomica recesiva que causa
una deficiencia severa de LT con deficiencias variables en la inmunidad humoral,
los pacientes con deficiencia de PNP presentan infecciones bacterianas, virales y
fúngicas recurrentes usualmente en los primeros años de vida
29

4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2

Se hereda en forma autosómica recesiva y resulta de un defecto en el proceso de
recombinación de los fragmentos VDJ en la recombinación genética de las
inmunoglobulinas, a consecuencia de esto se interrumpe totalmente la
diferenciación de linfocitos T y B. La diferenciación de células NK no se ve
afectada por lo cual el número y la funcionalidad de estas células se encuentra
conservado (Jones, 2004).

Rag1 y Rag2 (recombinase-activating gene 1 ó 2) forman un complejo con
actividad endonucleasa requerido para iniciar el proceso de recombinación de los
genes VDJ durante la formación de los receptores para antígenos tanto de los
linfocitos T (TCR) como de los B (BCR). Estos receptores son necesarios para
transmitir señales de sobrevida en precursores linfoides durante el desarrollo de
las células T y B. Distintas mutaciones en los genes Rag1 o Rag2 son
responsables del desarrollo de la enfermedad (Jones, 2004).

4.3.2.5 Deficiencia de Zap70

Esta deficiencia se transmite en forma autonómica recesiva. La proteína ZAP 70
(zeta associated protein 70), proteína kinasa expresada exclusivamente en
linfocitos T y células NK, juega un papel esencial en el proceso de selección
positiva y negativa durante la maduración tímica de los linfocitos T, principalmente
para los linfocitos que expresan el marcador CD8. Se encuentra unida a la cadena
ζ del complejo CD3 interviniendo en la señalización de estas células.

Mutaciones en el gen ZAP 70 (o SRK) generan un cuadro de inmunodeficiencia
celular variable en cuanto a su severidad. Es Característico encontrar en los niños
valores normales de linfocitos T CD3+ con predominio de CD4+ y ausencia o
30
disminución marcada de los CD8+. A pesar de encontrarse en número total normal
o incluso elevado, estos linfocitos CD4+ son incapaces de responder a la
estimulación in vitro frente a mitógenos específicos o células alogénicas. Los
linfocitos B y las células NK son normales tanto en número como en función (Lim,
2001).

4.3.2.6 Deficiencia de Jak3
Esta enfermedad se transmite con un patrón de herencia autosómico recesivo. El
defecto molecular se encuentra en la proteína kinasa JAK 3 (Janus associated
kinase 3), proteína asociada al dominio intracelular de la cadena gamma común
que interviene en la transducción de la señal generada tras la unión de las
citocinas a sus respectivos receptores, señal necesaria para que se complete el
desarrollo de linfocitos.

4.3.2.7 Deficiencia de Adhesión leucocitaria

Esta enfermedad de se debe a la falta de expresión de un grupo de proteínas
expresadas en la superficie celular denominadas moléculas de adhesión (LAD-1 y
LAD-2). LAD-1, de herencia autosómica recesiva, comprende defectos en las
cadenas β (CD18) de las moléculas LFA1 (CD11a-CD18), CR3 (CD11b-CD18) y
glucoproteína 150-95 (CR4 o CD11c-CD18). La edad de comienzo de las
manifestaciones clínicas y su gravedad dependen del grado de expresión de las
moléculas. Las formas severas (menos del 1% de expresión) presentan sus
primeras manifestaciones en el período neonatal con retardo en la caída del
cordón umbilical y posterior onfalitis, piodermitis necrotizantes, neumonía o sepsis
por S. aureus, Pseudomonas aeruginosa o Escherichia coli. Las formas
moderadas (expresión entre 10-20%) se presentan en edades más avanzadas con
otitis media aguda, fístulas de tejido celular subcutáneo (especialmente
perianales) y periodontitis. Es típico encontrar lesiones carentes de pus y a nivel
hematológico se encuentra una marcada neutrofilia.

31
El diagnóstico se confirma demostrando por citometría de flujo la ausencia o
disminución de la expresión de la molécula CD18 en la superficie celular. Las
formas severas tienen un curso fatal en los primeros años de vida por lo cual
deben ser sometidas a un transplante de medula ósea alogénico. Para LAD-2 se
ha visto un número reducido de pacientes con manifestaciones similares a LAD 1,
acompañadas de talla baja y retardo mental, en los que se ha encontrado
deficiencia de otra molécula denominada Sialil-Lewis X (CD15s) (Oleastro, 2001).

4.3.2.8 Síndrome de Chediak Higashi

Es un desorden autosomico recesivo de todos los gránulos lisosomales contenidos
en las células con características clínicas que envuelven los sistemas
hematopoyeticos y neurológicos (Mackay, 2000). Esta enfermedad es transmitida
como un rasgo autosomico recesivo que se origina por mutaciones del gen chs1
que codifica para la proteína LYST, esta proteína es muy importante para la
regulación del transporte lisosomal y la función del citoesqueleto. Este defecto
impide la formación normal de los fagolisosomas y de los melanosomas, vesículas
importantes en el proceso de fagocitosis (Rugeles, 2004).

Las características clínicas de este síndrome son infecciones bacterianas
recurrentes especialmente por S. aureus y estreptococos β-Hemolíticos, defectos
en los nervios periféricos, retardo mental, albinismo ocular y cutáneo parcial,
disfunción plaquetaria y enfermedad periodontal severa (Mackay, 2000).

4.3.2.9 Síndrome linfoproliferativo autoinmune

Se origina por mutaciones en el gen que codifica para la proteína adaptadora
SH2D1A que acopla moléculas que se encuentran en la superficie de los
leucocitos e interviene en las vías de señalización intracelular. La función principal
de esta molécula parece ser la regulación negativa de las señales de activación de
los linfocitos T, por lo tanto en estos pacientes se describe una proliferación
linfocitaria descontrolada.
32

La enfermedad se manifiesta generalmente antes de los 5 años, los niños
afectados no presentan sintomatología hasta que desarrollan alguna infección por
microorganismos intracelulares como el virus de Epstein Barr el desencadenante
mas común de la sintomatología (Rugeles, 2004).

4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia

La ataxia telangiectasia es una enfermedad de transmisión autosómica recesiva
caracterizada por presentar ataxia cerebelosa, telangiectasias oculo- cutáneas e
infecciones recurrentes. Estas últimas se presentan por lo general en forma de
otitis, bronquitis purulentas o neumonías. La ataxia que suele hacerse evidente
cuando el niño empieza a caminar, tiene curso progresivo llevando a una gran
incapacidad. Las telangiectasias aparecen a edades variables, por lo general
antes de los 5 años de edad en conjuntiva bulbar y/o pabellones auriculares
(Oleastro, 2001).

Es característico encontrar la α-feto proteína elevada en un 95 % de los casos. La
IgG puede encontrarse dentro de los valores normales o incluso estar disminuida,
y puede estar asociada o no a deficiencias de IgG2 o IgG4. En la gran mayoría de
los casos la IgA esta ausente al igual que la IgE. La IgM puede estar normal o
elevada. La inmunidad celular, inicialmente poco afectada, va mostrando con el
tiempo una franca linfopenia (Oleastro, 2001).

Una característica muy particular de este cuadro es la hipersensibilidad a las
radiaciones ionizantes y la falla en los mecanismos normales de reparación del
ADN responsables de rupturas cromosómicas que involucran particularmente a los
genes que codifican para los receptores para el antígeno en el linfocito T y para
las inmunoglobulinas de superficie en los linfocitos B. El pronóstico es
desfavorable y actualmente no se cuenta con un tratamiento adecuado. Los
33
pacientes suelen fallecer en la segunda década de sus vidas por secuelas
pulmonares o enfermedad linfoproliferativa (Lim, 2001).

4.4 Pruebas diagnosticas

La valoración de la inmunocompetencia en un individuo con sospecha de
inmunodeficiencia primaria requiere de un análisis cuantitativo, cualitativo o
estructural y de estudios funcionales que permitan detectar alteraciones en sus
mecanismos de defensa. De acuerdo con el mecanismo de defensa que se quiere
evaluar existen diferentes estudios que se pueden organizar por niveles de
complejidad (Figura 3) (Rugeles, 2004)

Paciente con sospecha
De padecer Inmunodeficiencia
Evaluación clínica + Pruebas de primera etapa
Estudios de segunda etapa
Deficiencias en la
producción de
anticuerpos
Deficiencias en la
Inmunidad mediada
por LT
Deficiencias en las
células Fagocíticas
Deficiencias del
complemento
•Dosificación de Igs
•Determinación de LB y LT CD19
•Isohemaglutininas
•Subclases IgG
•Producción de Antcs Específicos
•Descartar Infección por VIH
•Hipersensibilidad retardada cutánea
•Subpoblaciones de linfocitos: MHC, CD25
•Dosificación de Inmunoglobulinas
•Reducción NBT en placa
•Explosión respiratoria por citometría
•Beta 2 integrinas en granulocitos
•Quimiotaxis en agarosa
•C3 y C4 Séricos
•CH50
•Inhibidor de C1 estereasa
•CD59 en eritrocitos
Estudios de tercera etapa
Estudios de tercera etapa
Estudios de tercera etapa
• Producción anticuerpos in Vitro
• Westren blot: Btk, etc
•SSCP y Secuenciamiento
• Proliferación y citocinas In Vitro
•Determinar enzimas: ADA, PNP
•Westren blot: ZAP-70, JAK3, etc
•SSCP y Secuenciamiento
• Westren blot: Proteínas NADPH oxidasa
•SSCP y Secuenciamiento
Paciente con sospecha
De padecer Inmunodeficiencia
Evaluación clínica + Pruebas de primera etapa Evaluación clínica + Pruebas de primera etapa
Estudios de segunda etapa Estudios de segunda etapa
Deficiencias en la
producción de
anticuerpos
Deficiencias en la
Inmunidad mediada
por LT
Deficiencias en las
células Fagocíticas
Deficiencias del
complemento
•Dosificación de Igs
•Determinación de LB y LT CD19
•Isohemaglutininas
•Subclases IgG
•Producción de Antcs Específicos
•Descartar Infección por VIH
•Hipersensibilidad retardada cutánea
•Subpoblaciones de linfocitos: MHC, CD25
•Dosificación de Inmunoglobulinas
•Reducción NBT en placa
•Explosión respiratoria por citometría
•Beta 2 integrinas en granulocitos
•Quimiotaxis en agarosa
•C3 y C4 Séricos
•CH50
•Inhibidor de C1 estereasa
•CD59 en eritrocitos
Estudios de tercera etapa Estudios de tercera etapa
Estudios de tercera etapa Estudios de tercera etapa
Estudios de tercera etapa Estudios de tercera etapa
• Producción anticuerpos in Vitro
• Westren blot: Btk, etc
•SSCP y Secuenciamiento
• Proliferación y citocinas In Vitro
•Determinar enzimas: ADA, PNP
•Westren blot: ZAP-70, JAK3, etc
•SSCP y Secuenciamiento
• Westren blot: Proteínas NADPH oxidasa
•SSCP y Secuenciamiento

Figura 3. Flujograma para el diagnostico de IDP Universidad de Antioquia Colombia
(Rugeles, 2004)

34
4.4.1 Pruebas de primera etapa


Adicional a los datos de la historia clínica y el examen físico, los análisis
paraclínicos básicos aportan información valiosa para orientar los estudios
posteriores. Los estudios de primera etapa para estudiar inmunocompetencia son:
Cuadro hematico con velocidad de sedimentación globular, frotis de sangre
periférica (FSP) con recuento plaquetario, electroforesis de proteínas sericas y
estudios imagenológicos (Rugeles, 2004).

El FSP es el estudio de las células sanguíneas por medio de la observación en un
microscopio de preparaciones coloreadas, ha sido uno de los exámenes más
antiguos e importantes en el laboratorio clínico y su práctica es de gran utilidad en
hematología ya que permite visualizar la morfología celular, estimar el número de
células en sangre periférica y determinar la eventual presencia de elementos
atípicos. Los resultados obtenidos con este estudio son un reflejo del
funcionamiento de la médula ósea y de los factores que influyen en las diferentes
poblaciones celulares. Este método permite la evaluación del estado de
maduración, las características tintoriales, el contenido de los gránulos, las
inclusiones y formas celulares, todo lo cual se correlaciona con la fisiopatología de
ciertas enfermedades, y puede proporcionar una adecuada orientación en la
evaluación de la respuesta inmune y un manejo inicial simplificado de los
pacientes.

El FSP es una herramienta de gran valor en la evaluación del paciente con
infección recurrente, sus hallazgos cualitativos y cuantitativos son claves para la
orientación diagnóstica inicial de una IDP (Tabla 5) (Castaño, 2003)




35
Tabla 5. Alteraciones en el extendido de sangre periférica observadas en las
inmunodeficiencias primarias (Castaño, 2003)
Neutropenia
* Enfermedad de Kostman
* Síndrome de Schwachman
* Neutropenia cíclica
* Neutropenia familiar benigna
* Mielokatexis
* Síndrome Chediak-Higashi
* Hipoplasia cartílago-pelo
* Agamaglobulinemia ligada al X
* ID común variable
* Síndrome Hiper-IgM
* Deficiencia de adhesión leucocitaria
* Tipo III
Linfopenia
* ID combinada severa
* Síndrome de DiGeorge completo
* Hipoplasia cartílago-pelo
* ID común variable
* Ataxia telangiectasia
* Agamaglobulinemia ligada al X
DISMINUCIÓN
Trombicitopenia
* Síndrome Wiskott-Aldrich
* ID común variable
* Síndrome de Schwachman
* Síndrome Hiper-IgM ligado al X
* Agamaglobulinemia ligada al X
* Síndrome Chediak-Higashi
Neutrofilia
* Deficiencias de adhesión leucocitaria tipos 1,2,4
* Infecciones bacterianas recurrentes asociadas a las ID
con producción normal de fagocitos
Linfocitosis
* Enfermedad proliferativa ligada al X
* Síndrome de Omenn
Monocitosis
* Neutropenia familiar benigna
* Enfermedad de Kostmann
Eosinofilia
* Síndrome de Omenn
* Síndrome de Job
* Síndrome Wiskott-Aldrich
* Síndrome Nezelof
* ID combinada severa
AUMENTO
Trombocitosis
* Infecciones recurrentes asociadas a las diferentes
inmunodeficiencias
Aumento
* Anemia megaloblástica y células blásticas asociadas a
defectos en la maduración o carencia de cofactores
enzimáticos (vitaminas del complejo B)
Disminución
* Anemia microcíticas por infecciones crónicas y recurrentes
o pérdidas sanguíneas crónicas (Wiskott-Aldrich)
Microtrombocitos: Wiskott-Aldrich
ALTERACIONES EN EL
NÚMERO DE CÉLULAS
TAMAÑO
Inclusiones
citoplasmáticas
* Granulaciones tóxicas asociadas a infecciones
* Síndrome de Chediak-Higashi
36
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente
eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y
carga eléctrica, a través de una matriz gelatinosa
(www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electrof
oresis.html). Es muy útil en el diagnóstico de trastornos humanos paraproteínicos
como mieloma múltiple y algunas inmunodeficiencias primarias.

En algunas ocasiones se puede detectar con esta técnica una notable disminución
en las concentraciones de gamma globulinas sericas como en el caso de la
hipogammaglobulinemia (Figura 4). Por este método no se puede detectar la
reducción de IgA o IgM a valores muy bajos, ya que representan una fracción
relativamente pequeña del total de inmunoglobulinas sericas (Stites, 1999).
.
Albúmina α1 α2 β
γ
Albúmina α1 α2 β
γ
Albúmina α1 α2 β
γ

Alb α1 α2 β γ Alb α1 α2 β γ

Figura 4. Patrón de electroforesis para hipogammaglobulinemia (Stites, 1999)


37
4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa

4.4.2.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos

Existe un número de defectos bien definidos en las células que participan en la
respuesta inmune humoral, ciertas características como son el desarrollo de
infecciones en las primeras etapas de la vida y fallas en la respuesta adecuada a
estas, aún después de un tratamiento farmacológico, hacen pensar en algún tipo
de deficiencia de linfocitos B. La deficiencia de linfocitos B puede ser relativamente
moderada y no presentar síntomas mayores o puede llevar a una deficiencia
severa con una completa pérdida en la síntesis y secreción de anticuerpos (Folds,
2003).

La evaluación en la producción de anticuerpos incluye varias pruebas de
laboratorio, como: cuantificación de los niveles sericos de inmunoglobulinas,
medición de subclases en los isotipos que las presentan, producción de
anticuerpos específicos y cuantificación de linfocitos B entre otras.

4.4.2.1.1 Cuantificación de Inmunoglobulinas

El estudio de las principales clases de inmunoglobulinas A, G y M, es de especial
interés en el laboratorio de inmunología. La determinación de estas
inmunoglobulinas contribuye significativamente al diagnóstico de diversas
enfermedades como inmunodeficiencias, gammapatías monoclonales,
enfermedades infecciosas crónicas y agudas entre otras. Sus cifras séricas
dependen de diversos factores del desarrollo, genéticos y ambientales. Éstos
incluyen: características étnicas, edad, sexo, antecedentes de alergia, o
infecciones recidivantes y factores geográficos (Ramos, 2004). Habitualmente en
el laboratorio se cuantifican los niveles de IgG, IgM e IgA, los niveles de IgD e IgE
no se realizan de rutina.

38
Se han estandarizado varios métodos para la cuantificación serica de las
inmunoglobulinas. El clásico es la inmunodifusión radial que fue utilizada en por
varios años. Actualmente el método más usado para la cuantificación de
inmunoglobulinas es la turbidimetria, esta técnica es la medida de la turbidez de
una solución o suspensión en la que la cantidad de luz transmitida se cuantifica
con un espectrofotómetro o se estima mediante comparación visual con
soluciones de turbidez conocida (www.iqb.es/diccio/t/tu.htm).

4.4.2.1.2 Medición de subclases de inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas se han agrupado en diferentes subclases de acuerdo a
diferencias que se encuentran en las cadenas pesadas. La IgG se subdivide en
IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (Roit, 2000).

Una deficiencia en las subclases de IgG puede resultar en la producción alterada
de ciertos tipos de anticuerpos. La deficiencia selectiva de anticuerpos más
frecuentemente identificada, es una respuesta defectuosa a antígenos de
polisacáridos, como los presentes en la cápsula de neumococo, meningococo y
Hemophilus influenzae tipo B. Dado que la IgG2 es el isotipo de anticuerpo
predominante en respuesta a determinados polisacáridos, niveles disminuidos de
esta subclase de IgG es la razón de una pobre respuesta a infecciones por
bacterias encapsuladas. Su cuantificación en el laboratorio se hace principalmente
por la técnica de nefelometría (Hernandez, 2004).

La nefelometría se utiliza principalmente para medir las reacciones antígeno-
anticuerpo, la determinación nefelométrica de los antígenos se lleva a cabo por la
adición de cantidades constantes de antisuero específico a diversas cantidades de
antígeno. Los reactantes resultantes de antígeno y anticuerpo se colocan en un
recipiente bajo un rayo de luz y el grado de dispersión de la luz se mide en una
celda fotoeléctrica como densidad óptica (Stites, 1999).

39
4.4.2.1.3 Isohemaglutininas

Dependiendo de la edad del paciente y su grupo sanguíneo es posible medir la
presencia de anticuerpos naturales o isohemaglutininas anti-A y anti-B, estos
anticuerpos son predominantemente de clase IgM dirigidos contra antígenos del
grupo sanguíneo. Es una prueba útil en casos de inmunodeficiencias con falla
selectiva para la formación de IgM por ejemplo el síndrome de Wiskott Aldrich.

4.4.2.1.4 Producción de anticuerpos IgG específicos

Otra prueba funcional es la medición de anticuerpos post-vacúnales, con vacunas
de bacterias encapsuladas como Haemophilus influenzae y Neumococo. La
presencia de anticuerpos producidos en respuesta a estas vacunas son indicativos
de una buena respuesta inmune de tipo humoral; sin embargo, cuando existe
fallas a este nivel no se encuentran anticuerpos, especialmente de tipo IgG, contra
estos microorganismos y se asocia a una inmunodeficiencia primaria por
deficiencia de anticuerpos específicos (Folds, 2003).

Los métodos de cuantificación de anticuerpos específicos circulantes se realizan
en su mayoría utilizando análisis inmunoenzimaticos (ELISA) (Zielen, 2000;
Neldya, 1998; Wernette, 2003; Kolibab, 2005). En esta técnica el componente de
fase sólida es un antígeno, el anticuerpo por detectarse se une al antígeno y luego
se agrega un anti-anticuerpo unido a una enzima, posteriormente se agrega el
sustrato de la enzima y al reaccionar se forma un producto colorido que se mide
espectofotométricamente (Stites, 1999). La técnica de ELISA es una prueba
altamente sensible y especifica (Folds, 2003).

4.4.2.1.5 Cuantificación de LB por citometría

Los LB expresan diversas moléculas de superficie que se pueden detectar por
medio de anticuerpos monoclonales. Las células B maduras expresan CD19,
CD20 y HLA-DR. Las células B inmaduras pueden expresar moléculas adicionales
40
como CD10. Los anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos se utilizan
para detectar células que tienen los marcadores de LB (Stites, 1999).

La cuantificación de los LB se realiza mediante citometría de flujo. La Citometría
de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo
fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente
células) alineadas por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada
célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes
parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos
convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán
digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una
misma célula. Estos parámetros son:
- Parámetros relacionados con características intrínsecas de la célula, como su
tamaño y la complejidad de su núcleo y citoplasma.
- Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula
(inmunofenotipo).
Por lo tanto, la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus
características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y
complejidad (Figura 5) (www.citometriadeflujo.com).



Figura 5. Fundamento de la Citometría de Flujo (www.citometriadeflujo.com)

41
La representación grafica de las poblaciones celulares usualmente se realizan
utilizando diagramas de puntos. Estos diagramas son usados habitualmente tanto
en la adquisición celular como en su análisis y se presentan sobre un eje de
coordenadas X/Y. Las poblaciones celulares, representadas por agrupaciones
homogéneas de puntos, se situarán dependiendo de sus características físicas de
dispersión (SSC/FSC) y antigénicas (Figura 6) (www.citometriadeflujo.com).


Figura 6. Análisis de puntos de LB (CD19+) por Citometría de Flujo. Cortesía de Angela
Fonseca, Universidad Javeriana

4.4.2.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT

4.4.2.2.1 Hipersensibilidad cutánea retardada

La prueba de hipersensibilidad cutánea retardada es considerada como una
correlación In Vivo de la inmunidad mediada por células, puede ser usada como
método de monitoreo para defectos en la inmunidad mediada por células. El
procedimiento de esta prueba consiste en la inoculación intracutanea de una
cantidad definida de un antígeno conocido como PPD (derivado proteico
purificado) o Candida Albicans. El sitio de la inyección se observa por
42
aproximadamente 48-72 horas, observando la aparición de una pápula, si esta
pápula tiene un diámetro mayor de 2 mm se considera positiva (Folds, 2003).

La mayoría de individuos inmunocompetentes presentan una prueba positiva a por
lo menos uno de los dos antígenos, mientras que los individuos con algún tipo de
inmunodeficiencia presentan resultados negativos (Tabla 6) (Stites, 1999).

Tabla 6. Deficiencias Inmunitarias que presentan resultados negativos para la prueba de
hipersensibilidad retardada (Stites, 1999)
Deficiencias inmunitarias
Congénitas
Deficiencias combinadas de inmunidad celular y humoral
Ataxia-telangiectasia
Síndrome de Nezelof
Inmunodeficiencia combinada severa
Síndrome de Wiskott-Aldrich
Celulares
Síndrome de DiGeorge
Candidiasis monocutanea
Adquirida
Síndrome de inmunodeficiencia adquirida
Sarcoidoisis
Leucemia linfocitica crónica
Carcinoma


4.4.2.2.2 Subpoblaciones de LT por citometría

Los linfocitos T, poseen dos subgrupos que pueden distinguirse por dos proteínas
de superficie especificas para cada uno; los linfocitos T ayudadores expresan en
su superficie la molécula CD4 y los linfocitos T citotóxicos expresan CD8. La
mayor parte de los LT CD8+ tienen actividad citotóxica es decir, tienen la
propiedad de destruir células que expresen moléculas extrañas en su superficie,
43
estos linfocitos son muy importantes en la defensa contra infecciones virales. Los
linfocitos CD4+ funcionan como células cooperadoras promotoras de la
proliferación, maduración y función inmunitaria de otros tipos celulares mediante la
secreción de citocinas (Stites, 1999).
Aproximadamente el 70% de los linfocitos T de sangre periférica son CD4+ o
CD8+ (Stites, 1999) y su cuantificación se realiza principalmente por la técnica de
citometría de flujo (Figura 7).

R1 R1 R1

Figura 7. Análisis de subpoblaciones de LT (CD4+/CD8+) por Citometría de Flujo. Cortesía
Dra. Adriana Cuellar. M.Sc, Universidad Javeriana

4.4.2.2.3 Cuantificación de moléculas de superficie por citometría

Los LT expresan en su superficie diversas moléculas como moléculas de adhesión
entre las que se encuentran las Caherinas, la súper familia de las
inmunoglobulinas, las Integrinas, Selectinas y el Proteoglicano. También se
encuentran receptores como el TCR y los receptores tipo Toll al igual que
44
moléculas coestimuladoras como el CD28. Todas estas moléculas pueden ser
identificadas mediante citometría de flujo, siempre que exista el anticuerpo
monoclonal específico para cada una.

4.4.2.2.4 Citotoxicidad mediada por LT CD8+ y NK
La citotoxicidad celular constituye uno de los mecanismos efectores de algunas
poblaciones celulares especializadas del sistema inmune. Consiste en la
capacidad para interaccionar con otras células y destruirlas. Este mecanismo de
respuesta interviene en la defensa frente a infecciones víricas y células
neoplásicas, así como en la destrucción de células alogénicas en transplante de
órganos. Se consideran como prototipos de las células especializadas en dicha
función a los linfocitos T CD8+ y a las células natural killer (Lozano,
http://www.uco.es/grupos/inmunologiamolecula).
La prueba de citotoxicidad por liberación de cromio se describió hace más de dos
décadas y ha sido la técnica de mayor uso para la determinación de LT CD8+
específicos de antígeno. Sin embargo, presenta una limitada sensibilidad y el uso
de un isótopo radiactivo (51 Cr) puede ser complicado. El principio básico de la
prueba de citotoxicidad radica en la capacidad de los LT CD8+ de lisar la célula
blanco mediante la liberación de perforina. La célula blanco que a su vez presenta
el antígeno esta marcada con cromio. Una vez el complejo peptido/CMH es
reconocido por la célula efectora en este caso el linfocito T CD8+ se induce la lísis
mediada por perforina con la liberación del 51Cr al medio. El sobrenadante es
recuperado y leído en un contador gama, el resultado se obtiene en cuentas por
minuto (Figura 8) (Herrera, 1999).
45


Figura 8. Prueba de liberación de cromio (Herrera, 1999).

4.4.2.2.5 Cuantificación de células NK

Las células NK son un componente importante del sistema inmune innato, son
capaces de lisar las células infectadas por virus o células tumorales y son la fuente
de una gran variedad de citocinas, cuando se presentan defectos en este tipo de
células se incrementa la posibilidad de presentar mayor susceptibilidad a
infecciones virales.

La cuantificación de las células NK se realiza por citometría de flujo, estas células
coexpresan en su superficie las moléculas CD16/CD56 por lo que es bastante
sencilla su cuantificación en sangre periférica (Figura 9) (Folds, 2003).

46

Figura 9. Análisis de células NK (CD16+/CD56+) por Citometría de Flujo. Cortesía Dra.
Adriana Cuellar.M.Sc, Universidad Javeriana.

4.4.4.3 Pruebas para medir la función de las células fagocíticas

Los neutrófilos son leucocitos derivados de la medula ósea con una vida media
finita, que tienen una función principal en la defensa contra infecciones
ocasionadas por diferentes microorganismos. El neutrófilo desempeña una función
principal como célula efectora o asesina. Sin embargo, en el flujo sanguíneo y en
los espacios extravasculares, los neutrófilos ejercen efectos antimicrobianos a
través de interacciones con anticuerpos, complemento y factores quimiotacticos
(Stites, 1999).

Los defectos en la función de los neutrófilos se pueden clasificar como
cuantitativos o cualitativos. En los trastornos cuantitativos el número total de
neutrófilos de función normal se encuentra bastante disminuido. En los trastornos
cualitativos el numero total de neutrófilos se encuentra normal pero no pueden
ejercer sus funciones microbicidas normales (Stites, 1999).
47
Para poder evaluar el tipo de defecto que presentan estas células existen varias
clases de pruebas de laboratorio como la reducción de NBT, la medición de
radicales libre de oxigeno y la expresión de beta-2 integrinas, entre otras.

4.4.4.3.1 Reducción de NBT

La muerte de un microorganismo después de su fagocitosis se debe a la
producción de iones superoxido, que ayudan a la muerte del microorganismo. En
algunas enfermedades la fagocitosis no tiene ningún problema pero la producción
de sustancias toxicas para el microorganismo no ocurre eficientemente, por lo que
la destrucción no se lleva a cabo correctamente.

El azul de tetrazolio nitrado (NBT) es un compuesto claro, amarillo y soluble en
agua que al reducirse forma el formazan, tinción de color azul oscuro. Los
neutrófilos pueden reducir el colorante después de la ingestión de látex u otras
partículas, subsecuente a la descarga metabólica abrupta generada por la vía
derivada del monofosfato de hexosa. (Stites, 199).

La reducción del NBT es una prueba útil para analizar la integridad metabólica de
los neutrófilos ya que la falla en la reducción del colorante se asocia con
enfermedad granulomatosa crónica por lo tanto los neutrófilos de estos pacientes
no pueden dar muerte a ciertos microorganismos intracelulares ni generar
radicales superoxido (Stites, 1999).

4.2.2.3.2 Medición de radicales libres de oxigeno

El desbalance en la producción de especies reactivas de oxígeno y la defensa
antioxidante provoca un daño oxidativo conocido como estrés oxidativo, que lleva
a una gran cantidad de cambios fisiológicos y bioquímicos, los cuales provocan el
deterioro y muerte celular. Se puede medir este tipo de daño mediante métodos
directos e indirectos.
48

Entre los métodos directos está la medición de la concentración de agentes
oxidantes, que es muy difícil debido a su corta vida media. El uso de la
espectrometría de la resonancia de rotación (espín) de electrones, es la única
técnica analítica que mide directamente las especies oxígeno reactivas, pero
debido a su costo y complejidad su aplicación en el ser humano es difícil. Los
métodos indirectos se realizan mediante la determinación de los productos finales
de la acción oxidante sobre algunas moléculas biológicas tales como los lípidos,
ácidos nucleicos y proteínas. Los métodos para medir peróxidos lipídicos son el
patrón de oro, cuando se trata de probar el papel de los oxidantes en algún tipo de
daño celular. Es posible medir los dienos conjugados derivados del ácido
araquidónico mediante espectrofotometría UV, los hidroperóxidos lipídicos
mediante cromatografía líquida de alta presión (Gastell)

4.2.2.3.4 Quimiotaxis

La locomoción direccional de los neutrófilos hacia diversos estímulos
quimiotacticos se cuantifican mediante el uso de la cámara de boyden. Las células
por analizar se colocan en la parte superior y se separan de la cámara inferior que
contiene la sustancia quimiotatica mediante una membrana de filtro de poro
pequeño. Los neutrófilos pueden atravesar el filtro, pero se atrapan en el tránsito
hacia la membrana y luego de un periodo de incubación, el filtro se tiñe y se
observa al microscopio (Figura 10) (Stites, 1999).










49

Cámara inferior con
agente quimiotáctico
Filtro
Cámara superior con
células fagocíticas

























Figura 10. Quimiotaxis en filtro. Cortesía Dra. Diana Patiño C. M.Sc. Pontificia Universidad
Javeriana.


4.2.2.3.5 Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrófilos

La ingestión de microorganismos por neutrófilos es un proceso que requiere la
producción de energía por parte de la célula fagocítica. La internación de
microorganismos recubiertos de anticuerpos y complemento se presenta muy
rápido después del contacto con neutrófilos ya que los procesos intracelulares
subsecuentes dependen del éxito de la fagocitosis. Las pruebas para fagocitosis
proporcionan un método rápido y relativamente simple para evaluar el proceso
fagocítico en general (Stites, 1999).



50
4.2.2.3.6 Adherencia

En el proceso de fagocitosis es importante el mecanismo de adhesión de las
células fagocíticas al endotelio vascular, ya que se sabe que el neutrófilo se
encuentra en un estado de “patrullaje” permanente y que el mecanismo de
adherencia esta mediado por una serie de citocinas y factores químicos que lo
inducen a llevar a cabo el proceso de fagocitosis.

4.2.2.4 Pruebas para medir sistema del complemento

El sistema del complemento trabaja en asocio con otros componentes del sistema
inmune innato y adaptativo, proporcionando vías y mecanismos para la
destrucción de microorganismos o células dañadas. Esta conformado por más de
40 glicoproteinas que trabajan en cascada y existen en el plasma en forma de
precursores.

La mayoría de las proteínas del complemento son codificadas por genes
autosomicos. Sin embargo, individuos con defectos heterocigóticos usualmente
son asintomáticos, en contraste los pacientes que presentan condición homocigota
son sintomáticos y pueden ser detectados mediante la realización de pruebas
funcionales. Las pruebas de laboratorio especificas para los componentes del
complemento incluyen: CH50, cuantificación de C3 y C4 e inhibidor de C1
estereasa entre otros (Folds, 2003).


4.2.2.4.1 Cuantificación de C3 y C4

Muchas de las proteínas del complemento pueden ser cuantificadas por métodos
inmunoquimicos como nefelometría, inmunoprecipitación, turbidimetria, RIA y
ELISA (Wen, 2004). Actualmente la técnica más utilizada es la turbidimetria.



51
4.2.2.4.3 Complemento hemolítico 50 (CH50)

La prueba de CH50 esta basada en un ensayo hemolítico, en el que un complejo
inmune es formado por la adición de anticuerpos que interactúan con antígenos de
la superficie de los glóbulos rojos de carnero.
Cuando el complemento es activado por los anticuerpos que se encuentran fijados
sobre la superficie de los glóbulos rojos, estos son lisados y la hemoglobina es
liberada. Los resultados son expresados en base a la última dilución del suero que
causa lisis del 50% de las células.


4.2.2.4.4 CD59 en eritrocitos

El antígeno CD59 es un regulador fisiológico de la activación del complemento, se
encuentra disminuido o ausente en ciertas poblaciones de las células sanguíneas,
condicionando una mayor susceptibilidad a hemólisis intravascular, mediada por
complemento.

La técnica de citometría de flujo es la más utilizada para El empleo de anticuerpos
monoclonales fluorescentes específicos y su detección por citometría de flujo
permite la demostración de deficiencias, aún cuando las poblaciones celulares
afectadas sean escasas. Por ello, es común que en pacientes con esta
enfermedad, la citometría de flujo sea diagnóstica, aun cuando las pruebas
tradicionales de hemólisis en medio ácido o en presencia de inulina, que requieren
de abundancia de células deficientes, arrojen resultados negativos (Argüelles,
2002)








52
4.2.3 Pruebas de tercera etapa

4.2.3.1 Pruebas para medir la producción de anticuerpos


4.2.3.1.1 Producción de anticuerpos in vitro

La activación de los LB por antígenos o mitógenos genera cantidades pequeñas,
pero detectables de inmunoglobulinas policlonales. Después de 7-10 días de
cultivo, estos productos se miden mediante RIA o ELISA (Stites, 1999). El RIA es
una técnica de análisis en el que una pequeña cantidad de sustancia marcada
radiactivamente, es desplazada de su unión específica por otra similar no marcada
que va a competir con la sustancia marcada radiactivamente. Al sistema de
fijación elegido se le agrega una cantidad indeterminada de antígeno marcado,
posteriormente se le agrega una cantidad de antígeno sin marcar o sea el suero
problema, así se establece la competencia por los sitios de unión del anticuerpo,
sigue la incubación a 37 grados Celsius, procediendo a los lavados mediante los
cuales se realiza la separación del antígeno unido y del libre, de la cantidad de
antígeno marcado fijado a diferentes concentraciones se hace una curva que
permite encontrar cualquier concentración de antígeno no marcado que sea
desconocido (Arano, 2002). Sin embargo, esta prueba ya no se realiza de rutina
en el laboratorio.
4.2.3.1.2 Western blot para BtK, BLNK, NEMO


Las Btk, BLNK y NEMO, están relacionadas con la maduración y proliferación del
linfocito B, y se pueden determinar por Western Blot.
En la prueba de Western blot primero se debe hacer una electroforesis en gel de
duodecil sulfato sodico poliacrilamida (SDS-PAGE), luego las proteinas obtenidas
se transfieren a una matriz de soporte por ejemplo nitrocelulosa donde se emplea
un anticuerpo primario para localizar la proteína de interés en este caso Btk, BLNK
o NEMO, un segundo anticuerpo marcado con una enzima y contra la especie en
53
la que se produjo el anticuerpo monoclonal que usualmente es ratón. El anticuerpo
secundario se puede marcar de diversas formas con el fin de producir una señal
detectable, que va a ser observada como bandas en el papel de nitrocelulosa
(Stites, 1999)


4.2.3.1.3 Análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP)


SSCP es el método más simple y más usado para la detección de mutaciones. El
PCR se utiliza para amplificar la región del interés y el DNA resultante es separado
como una molécula de cadena sencilla por electroforesis en un gel de
poliacrilamida no denaturante. Cada uno de los filamentos de DNA migrara de
manera diferencial de los otros si presenta alguna mutación así sea de una sola
base, se cree que estos diferentes patrones de migración se deben a cambios en
la estructura terciaria del DNA. Estas mutaciones son detectadas como bandas
nuevas en los “autoradiogramas” (detección radiactiva) ya sea por tinción de plata
o por el uso de primers fluorescentes que posteriormente se analizaran en un
secuenciador automatizado (Youil, 1996)


4.2.3.2 Pruebas para medir la inmunidad mediada por LT


4.2.3.2.1 Linfoproliferación con mitógenos

En esta prueba se busca medir la habilidad de los linfocitos para proliferar en
respuesta a una variedad de estímulos como son los mitógenos. Se han empleado
diversas lectinas de plantas y otras sustancias como la fitohemaglutinina y la
concavalina A para evaluar la función de linfocitos humanos. En esta técnica se
obtienen linfocitos mediante gradiente de densidad Ficoll Hypaque y se establecen
cultivos por triplicado en microplacas a una concentración de 1x 10
6
linfocitos por
mililitro, se añaden los mitógenos a diversas concentraciones, los cultivos se
incuban a 37°C al 5% de CO
2
durante 72 horas. En este tiempo los mitógenos han
54
producido su efecto máximo sobre la síntesis de DNA. La síntesis de DNA se mide
mediante el marcaje de los cultivos con intermitencias de timidina tritiada (
3
H-Tdr),
este es un precursor de nucleósido que se incorpora en el DNA que se acaba de
sintetizar. La cantidad de
3
H-Tdr incorporada es relativa a la velocidad de síntesis
del DNA y se determina por la cuenta de centelleos en un espectrofotómetro de
líquido de centelleo (Stites, 1999).

4.2.3.2.2 Cuantificación de la producción de citocinas In vitro

Esta técnica consiste en el cultivo de células mononucleares de sangre periférica
con un antígeno especifico y anticuerpos coestimuladores, luego de
aproximadamente 6-8 horas se pueden medir las citoquinas en el sobrenadante
del cultivo. La proporción de citoquinas secretadas por las células en el cultivo se
puede determinar por ELISA, ELISPOT y mas recientemente por citometría de
flujo (Folds, 2003).
El ELISPOT o ensayo de inmunospot conjugado a actividad enzimática, esta
diseñado para cuantificar células individuales que están secretando una proteína
concreta in vitro. Está basado en el protocolo básico de ELISA, originalmente
diseñado para el análisis de células secretoras de anticuerpos determinados, se
ha adaptado para poder medir frecuencia de células produciendo y secretando
moléculas efectoras (citocinas), en estado de reposo, tras estimulación o en
estados patológicos.

4.2.3.2.3 Western blot para ZAP-70, JAK3 y STAT-1

La proteína ZAP-70 se encuentra expresada exclusivamente en linfocitos T y
células NK y juega un papel esencial en el proceso de selección positiva y
negativa durante la maduración tímica de los linfocitos T. la proteína kinasa JAK3
esta asociada al dominio intracelular de la cadena gamma común que interviene
en la transducción de la señal generada tras la unión de las citocinas a sus
respectivos receptores, señal necesaria para que se complete el desarrollo de
55
linfocitos, estas proteínas se encuentran alteradas principalmente en la
inmunodeficiencia combinada severa, por lo que su analisis se hace muy
importante en el diagnostico de esta patología. Su cuantificación se puede realizar
mediante la prueba de western blot utilizando anticuerpos monoclonales anti- ZAP-
70, JAK3 y STAT-1.


4.2.3.3 Pruebas para medir la función de células fagocíticas


4.2.3.3.1 Western blot para proteínas del sistema NADPH oxidasa

Para realizar la prueba de Western Blot para evaluar el sistema NADPH oxidasa
se realiza primero una electroforesis en gel de poliacriamida (SDS-PAGE) de la
membrana del neutrófilo y sus fracciones citosolicas. A las bandas obtenidas de
esta electroforesis se le agregan anticuerpos monoclonales del ratón contra
gp91phox, gp22phox, p47phox o p67phox y se detectan con un anticuerpo anti
IgG de ratón conjugada con fosfatasa alcalina (Boer,1998).


















56
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS



• En Colombia actualmente existen muy pocos laboratorios que realicen
pruebas inmunológicas especificas para el diagnostico de pacientes con
inmunodeficiencias primarias.

• Se halla poca información sobre las pruebas clínicas de laboratorio que
existen para un adecuado manejo de pacientes con inmunodeficiencias
primarias.

• El acceso a las pruebas especializadas de laboratorio permite al personal
medico establecer un diagnostico acertado que podría prevenir o disminuir
la estancia de los pacientes en las instituciones hospitalarias llevando a que
estos presenten una mejor calidad de vida.














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