Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche - AA 2008-2009 2008 2009

FISIOLOGIA GENERALE
Professor Vincenzo L b di P f Vi Lombardi

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Fisiologia: t di delle funzioni d li organismi viventi ai Fi i l i studio d ll f i i degli i i i ti i vari livelli di organizzazione (molecolare, cellulare, tissutale, cellulare tissutale di organo e di sistema) Fisiologia generale: studio delle funzioni in termini di meccanismi generali comuni a tutte le specie animali o a molte di esse Fisiologia comparata: studio di come lo stesso problema adattativo è stato risolto in maniera diversa dalle diverse specie Fisiologia umana: studio delle funzioni nella specie umana

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1. La relazione tra struttura e funzione

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La struttura del muscolo striato dal tessuto alle molecole

Principali proteine nella miofibrilla
Proteina Miosina Actina Tropomiosina Posizione Filamento spesso Filamento sottile Filamento sottile PM (*10-3) 500 42 66 % 44 22 5

Troponina TnC TnI TnT Titina

Filamento sottile

70 18 21 31

5

Dalla linea Z alla linea M

~2000

10

Nebulina

Filamento sottile

700

5

Proteina C Miomesina α-actinina

Filamento spesso Linea M Linea Z

135 170 190

2 2 2

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Relazione struttura funzione a livello subcellulare (sarcomero)
Relazione tra forza tetanica isometrica e lunghezza del sarcomero in una fibra muscolare La porzione discendente della relazione
mostra che la forza isometrica diminuisce linearmente con la riduzione del grado di sovrapposizione tra i filamenti e quindi del numero di teste attaccate all’actina. Questo dimostra che le teste sono generatori indipendenti di forza che agiscono in parallelo nell’emisarcomero. Definizione dell’unità funzionale del muscolo per la generazione di forza e per l’accorciamento

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Relazione struttura-funzione a livello di tessuto (A) e a livello cellulare (B)
A B

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Relazione struttura-funzione a livello molecolare
Il modello del working stroke per rotazione della testa della miosina (H.E. HUxley, 1969)

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Il modello cristallografico del working stroke nella testa (porzione S1) della miosina (Rayment et al., 1993) ( y , )

Una modifica conformazionale di pochi Å nel dominio catalitico (motore) è amplificato dal braccio di leva nel dominio delle catene leggere

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2. Omeostasi
• capacità d li organismi di mantenere una relativa ità degli i i t l ti stabilità interna. • “La costanza dell’ambiente interno è la condizione della vita libera” (Claude Bernard 1872) libera Bernard, 1872). • Negli organismi unicellulari l’omeostasi dipende dalla presenza di una membrana cellulare selettivamente permeabile • Negli organismi pluricellulari l’omeostasi dipende da meccanismi di regolazione a f d b k i i l i feed-back
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Feed-back negativo
(principio presente nei sistemi controllati)

L’omeostasi viene mantenuta grazie alla regolazione delle variabili mediante un sistema di controllo che annulla gli effetti di eventuali perturbazioni. I recettori sono gli elementi che segnalano gli effetti delle perturbazioni sulle variabili regolate. L’uscita dal recettore viene sottratta dal segnale di riferimento per generare un segnale d’errore, che viene amplificato e d errore, inviato come funzione di forza al sistema controllato.

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Esempio di feed-back negativo: controllo della pressione arteriosa

Le variazioni della PA sono registrate da diversi recettori che inviano afferenze al centro cardiovascolare bulbare (sistema di controllo) dove avviene il confronto con il valore di riferimento e viene generato il segnale di errore che agisce sugli effettori autonomi che regolano cuore e vasi sanguigni. 11

1. Membrana cellulare, diffusione e osmosi
Testi consultati: D’Angelo Peres: Fisiologia: Molecole, cellule e sistemi Randall: Fisiologia animale Aidley: The physiology of excitable cells, Cambridge Univ. Press

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La membrana cellulare e l’omeostasi (costanza dell’ambiente interno)

La membrana è una barriera selettiva che separa l’ambiente intracellulare da l ambiente quello extracellulare, garantendo il mantenimento di un ambiente interno costante e allo stesso tempo permettendo gli scambi di nutrienti, gas, energia e informazioni necessari alla vita cellulare cellulare.

Distribuzione dei principali elettroliti

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La membrana cellulare è costituita da un doppio strato lipidico in cui sono inserite le proteine integrali

Alcune prove sperimentali
Esperimento di Gorter e Grendel (1925)
L’area minima della superficie occupata dal monostrato formato dai lipidi estratti dalle membrane di globuli rossi di mammifero è il doppio dell’area della superficie delle cellule cellule.

acqua

Parametri fisici
Extracellular fluid

Cm/S = 10-6 F/cm2 Rm*S = 2 KΩ*cm2 Cm = ε0εrS/d con: ε0 = 8 8*10-14 F/cm 8.8 10 εr (lipidi) = 5.7 d = ε0εrS/Cm = 50*10-8cm

cytosol La capacità elettrica della membrana, è quella attesa da un doppio strato lipidico dello spessore di 50 Å

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Criodecappaggio + microscopia elettronica

La digestione enzimatica con un enzima proteolitico provoca la perdita progressiva di particelle immerse nella membrana, messe in evidenza con la tecnica del criodecappaggio

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D Digestion con en ne nzimi pro oteolitici

Le proteine si muovono nel doppio strato lipidico

lezione_membrana_1_frap.mp4

Esperimento di recupero della fluorescenza in mioblasti trattati con una proteina fluorescente in grado di legarsi alle glicoproteine di membrana membrana. La ricomparsa della fluorescenza in un’area circoscritta della membrana permette di definire la percentuale di glicoproteine mobili e la velocità con cui diffondono.

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Trasporti nella membrana cellulare

Trasporti in forma libera

Diffusione semplice Diffusione facilitata Migrazione nei canali Trasporti passivi

Trasporti mediati

Trasporto attivo primario Trasporto attivo secondario

Trasporti attivi

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Diffusione semplice
• causata dal moto browniano delle molecole in soluzione • movimento netto da regioni ad alta concentrazione verso regioni a b i t tt d i i d lt t i i i bassa concentrazione • il flusso netto (ds/dt) è proporzionale al gradiente di concentrazione (dc/dx) e all’area (A) della superficie attraverso cui la sostanza diffonde legge di Fick:

ds dc = −D ⋅ A ⋅ dt dx

dove D = cm2/ è il coefficiente di diff i d /s ffi i t diffusione. Nella membrana (spessore x = 50 Ǻ) dc/dx è dato da:
' dc C2 − C1' β (C2 − C1 ) = = dx d x x

dove β= C’/C è il coefficiente di ripartizione olio-acqua. Le sostanze possono attraversare le membrane mediante diffusione semplice se sono solubili nello strato li idi e l’ li l bili ll t t lipidico l’equazione di Fi k di i Fick diventa: t

ds β ⋅ ΔC = −D ⋅ A ⋅ = − P ⋅ A ⋅ ΔC dt x
dove P (= Dβ/x) = cm/s è il coefficiente di permeabilità della membrana • non mostra saturazione con l’aumentare del gradiente • non c’è competizione tra sostanze diverse (flussi indipendenti). 18

Diffusione e trasporto

Permeabilità agli anelettroliti

Permeabilità agli elettroliti
PK PNa Pacqua membrana 10-6 cm/s 10-8 cm/s 10-4 cm/s sol. acquosa 21 cm/s 16 cm/s 32 cm/s r (Å) a/i 1.33/1.88 0.98/2.91 19

La velocità di permeazione
Caso in cui la sostanza penetra dentro la cellula

Le curve mostrano come cresce la Ci delle sostanze A, B….F che attraversano la membrana con permeabilità decrescenti. La Ce è costante e la Ci iniziale è zero Le Ci crescono con legge decrescenti zero. esponenziale: Ci,t = Ce• (1-e-t/τ) dove τ = V/(A*Px), V = volume della cellula, A = area della membrana, Px = permeabilità alla sostanza x. La costante di tempo τ (il tempo necessario affinchè la Ci abbia raggiunto il 63% del valore finale) è inversamente proporzionale a P e direttamente proporzionale al rapporto volume/superficie (V/A). S t i l l t l / fi i (V/A) Sostanze con P più grande penetrano più iù d t iù velocemente nella cellula. Cellule con rapporto V/A più piccolo permettono un più rapido esaurimento delle differenze di concentrazione Esempio della cellula sferica: V= 4/3 π r3 A= 4 π r2 V/A= 1/3 r Una cellula sferica con raggio 1 μm ha un rapporto V/A 100 volte più piccolo di una sfera con raggio 100 μm e quindi una velocità di permeazione 100 volte più grande

Ruolo della dimensione e della forma della cellula

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Osmosi
Diffusione dell’acqua da una soluzione più dil ita ad una sol ione più diluita na soluzione concentrata (l’acqua segue il proprio gradiente di concentrazione). In p presenza di un g gradiente di acqua, il q , movimento dell’H2O cambia il volume e la pressione osmotica fino al raggiungimento dell’equilibrio osmotico
CELLULE ANIMALI: Variazione di volume (sistema a pressione costante) in relazione alla osmolarità del mezzo ) esterno.

2M g glucosio

1M glucosio

πV = nRT π= cRT Δπ = ΔcRT
Con: c= 1M e T= 273K:

Membrana semipermeabile 3/2 M glucosio 3/2 M glucosio

π= 1 mol/l • 0.082 l*atm/mol*K • 273K= 22.4 atm CELLULE VEGETALI: La parete di cellulosa impedisce aumenti di volume; l’ipertonicità del p p protoplasma è bilanciata da aumento p della pressione idrostatica.

0.9% NaCl 0.6% NaCl
Zea mays root cell

1.4% NaCl
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Turgore plasmalisi

Osmolarità e tonicità
Osmolarità: equivale al numero di particelle nell’unità di volume, non tiene conto delle caratteristiche di permeabilità della membrana. Tonicità: tiene conto della effettiva permeabilità della p membrana ai diversi soluti Una soluzione è isotonica con una data cellula quando ne mantiene invariato il volume è ipotonica se il volume cellulare aumenta è ipertonica se il volume cellulare diminuisce

Un soluto cui la membrana è permeabile non determina la tonicità del mezzo, ma solo effetti osmotici transitori

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Volume osmoticamente inerte (b)

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Effetti osmotici permanenti e transitori in un a fibra muscolare

etanolo

xilosio

Il soluto permeabile si distribuisce all’equilibrio secondo l’equazione: q Ci,t = Ce (1-e-t/τ) dove τ = V/(A*Px) (
glicerolo

V = volume della cellula A = area della membrana Px = permeabilità alla sostanza x p

urea

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Diffusione anomala (trasporto facilitato)
• • • • • Permeabilità inaspettatamente elevata per la presenza di proteine carriers che permettono il passaggio di sostanze che non possono diffondere lib t h diff d liberamente attraverso l membrana t tt la b Il movimento è secondo gradiente Saturazione quando la sostanza raggiunge elevate concentrazioni a causa del numero finito di proteine carriers L’interazione con il carrier è specifica Sostanze con caratteristiche affini competono per lo stesso carrier: KM (D-glucosio) = 0.007M; (L-glucoso) = 7M; KM (D-arabinoso) = 1.5M

La specificità dell’interazione degli zuccheri con il carrier è evidente dai valori di KM che sono minimi per il destrosio e crescono passando dagli aldoesosi (glucosio, mannosio, galattosio) agli aldopentosi (xilosio, arabinosio, ribosio, lixosio), e dalle forme D alle forme L. Il grado di inibizione reciproca dipende dall’affinità del carrier per lo zucchero, così in presenza di destrosio il trasporto di tutti gli zuccheri risulta fortemente inibito, 25 mentre il trasporto di destrosio risulta fortemente inibito dal mannosio, inibito in misura minore da galattosio, xilosio e arabinosio e indifferente alla presenza dei due chetosi sorbosio e levulosio.

Cinetica del trasporto facilitato
La velocità con cui il glucosio viene trasportato dal carrier specifico segue una cinetica di saturazione descritta dall’equazione di Michaelis Menten, in cui Vmax è il trasporto massimo e KM, la concentrazione q , p di glucosio alla quale la velocità di trasporto è ½ Vmax, è una stima dell’affinità del carrier per il glucosio

v0 = k3 [SA]; Vmax = k3 [A0]

[A]=[A0]-[SA] Modello del flip flop: la proteina trasportatrice, ancorata alla flip-flop: trasportatrice membrana ha un carattere bistabile, esiste cioè in due stati in cui i siti di legame per la molecola da trasportare sono esposti 26 alternativamente sui due versanti opposti della membrana.

Modello de ca e mobile: le molecole ca e s ode o del carrier ob e e o eco e carrier si legano alla molecola da trasportare su un versante della membrana, migrano sul versante opposto, dove liberano la molecola trasportata.

Trasporto del glucosio
Le diverse isoforme delle glucosio-permeasi sono adattate alla funzione delle cellule: g p l’isoforma presente nelle cellule nervose ha una KM bassa: nell’ambito fisiologico della glicemia il trasporto di glucosio nelle cellule nervose è sempre vicino al massimo, le cellule nervose non devono essere sensibili alle variazioni della glicemia; l’isoforma delle cellule β del pancreas ha una KM elevata: nell’ambito fisiologico della g p g glicemia il trasporto di glucosio varia significativamente, le cellule β secernono insulina (ormone ipoglicemizzante) in funzione della concentrazione extracellulare di glucosio.

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La membrana è la struttura responsabile del potenziale transmembranario

assoplasma: K+, A-

liquido di perfusione: K+, SO4=

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