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Instituto de Ciencias Naturales

CQU 310 Laboratorio de Bioqumica | Universidad de las Amricas



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LABORATORIO VIRTUAL
EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA EN REACCION ENZIMATICA

OBJETIVOS:

1. Determinar la velocidad de la hidrlisis del p-nitrofenil--D-glucopiranosido,
catalizada por la -glucosidasa, bajo diferentes condiciones de pH y
Temperatura.
2. Determinar el efecto del pH y de Temperatura sobre la velocidad de la
hidrlisis del p-nitrofenil--D-glucopiranosido, catalizada por la -glucosidasa


INTRODUCCION

La enorme variedad de reacciones bioqumicas que comprende la vida son
mediadas, casi todas ellas, por una serie de catalizadores biolgicos conocidos
como enzimas.

Las enzimas son protenas con actividad cataltica, es decir aumentan la velocidad
de una reaccin qumica, permitiendo as que el sustrato se transforme en
producto de manera ms rpida. La enzima se une al sustrato formando el
complejo Enzima Sustrato, una vez que se ha formado el nuevo producto, la
enzima se separa de este quedando libre para recibir a otro sustrato.


La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la
concentracin del producto o la disminucin de la concentracin del sustrato de la
reaccin en el tiempo.
Existen diferentes mtodos que permiten cuantificar la concentracin de reactantes
y/o productos. Entre los mtodos analticos fsicos destacan los pticos, que se
basan en la absorcin de radiacin electromagntica en la regin visible y
ultravioleta. Determinando el coeficiente de extincin de un compuesto se estima la
velocidad sobre la base de las medidas experimentales de absorbancia a un tiempo
dado. (Espectrofotometria, vase gua de laboratorio 1 y 2, CQU-310 UDLA, 2011)

Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores ms
importantes son: concentracin de enzima, concentracin de ligandos (sustratos,
productos, inhibidores y activadores), pH, fuerza inica y temperatura. (Vase clase
8, enzimas ll, Ctedra Bioqumica CQU-310, 2011)

La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En
general, son slo activas en un rango limitado de ste, observndose en la mayora
de los casos una zona de pH ptimo y una disminucin de la actividad a ambos
lados del pH ptimo. El efecto del pH en la actividad enzimtica se debe
fundamentalmente a cambios en el estado de ionizacin de los componentes del
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sistema; esto puede darse en la enzima libre, en el complejo E-S o en el sustrato. En
la zona de pH ptimo predomina la forma inica activa, a valores de pH menores y
mayores su proporcin disminuye, aumentando la proporcin de formas inicas no
activas; a causa de ello la curva de velocidad versus pH tiene aproximadamente la
forma de una campana. El pH no slo afecta la actividad de las enzimas, sino que
tambin la estabilidad, lo que contribuye a la disminucin de la actividad
generalmente a valores extremos de pH.

Las reacciones enzimticas estn fuertemente afectadas por la temperatura. Hay
dos factores determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes de
velocidad de la reaccin y el efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima.
Como es de esperar, un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la
reaccin; sin embargo, sobre cierta temperatura hay inactivacin de la enzima que
lleva a una disminucin en la velocidad. La zona de temperatura en la cual se
observa mayor actividad se conoce como temperatura ptima, sta tiene slo valor
operativo, ya que depende de una serie de factores, como el pH y el tiempo de
reaccin.
En este prctico se ver el efecto que produce en la actividad de la enzima
-glucosidasa de almendra dulce, los cambios de pH y temperatura. Se
determinar la velocidad de la hidrlisis de un sustrato artificial, el p-nitrofenil--D-
glucopiransido (pNPG), midiendo la formacin de un producto de la reaccin, el
p-nitrofenolato, que en un medio alcalino es de color amarillo y presenta un
mximo de absorcin alrededor de 405 nm
-Glucosidasa +
p-NPG p-nitrofenolato
(Amarillo)
Las -Glucosidasas son un grupo heterogneo y bien caracterizado dentro de las
enzimas glucosidasas. Estas enzimas, catalizan la reaccin de hidrlisis de
enlaces O--Glicosdicos del extremo terminal no reductor de de oligosacridos de
cadena corta, disacridos, liberando -D-glucosa
Las -glucosidasas estn extensamente distribuidas en la naturaleza.
Dependiendo del organismo del que proceden y de la especificidad de sustrato de
la enzima, las -glucosidasas estn implicadas en diferentes funciones fisiolgicas.
En bacterias y hongos, las -glucosidasas se encuentran fundamentalmente
formando parte de complejos o sistemas multienzimticos denominados celulasas,
los cuales se encargan de la degradacin de la celulosa.


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La -glucosidasa de almendra, presenta pH ptimo de catlisis, entre pH 4 y pH 5;
y el rango de temperatura ptima abarca desde los 15 hasta los 50C,
presentando la mayor actividad a 40C. Presenta una alta eficacia cataltica al usar
pNPG.
Para la obtencin de velocidad de la reaccin se considera la concentracin de
producto formado (p-Nitrofenol) en funcin del tiempo.
De la misma manera que determin concentracin en las muestras problemas en
los prcticos 1 y 2 usando la ley de Lambert-Beer, puede calcular la concentracin
de p-Nitrofenol:
A A
0

C = ------------
l

Pero a esta debe agregar el tiempo de reaccin para obtener la velocidad. Como
se indica en la siguiente formula:

1





t
A A
v
o

=
l

A = Absorbancia
A
o
= Intercepto curva de calibrado
l = pendiente curva de calibrado

t = tiempo (minutos)

El valor de Coeficiente de Extincin a considerar para p-Nitrofenol medido a
405 nm es 18,45 (mM*cm)
-1
, por tanto la unidad de velocidad quedara en
mM/min

Una unidad enzimtica que suele usarse es la Unidad Internacional (UI) de enzima
y se define como la cantidad que cataliza la formacin de 1 mol de producto por
minuto en condiciones definidas de ensayo.
















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PARTE EXPERIMENTAL

Ensayo de Actividad Enzimtica: Determinacin de la Actividad -
Glucosidasa (Mtodo Discontinuo):


0,9 ml de p-nitrofenil--D-glucopiransido (pNPG) 2 mM disuelto en el
tampn apropiado se pre incuba durante 3 min., a 40 C, o a la temperatura
indicada, luego se inicia la reaccin al adicionar 0,1 ml de extracto enzimtico. La
reaccin se detiene despus de 5 minutos con 2,0 ml de Na
2
CO
3
1M. El p-
nitrofenolato producido se lee a 405 nm y se determina su concentracin en una
curva estndar (calibrado) de p-nitrofenolato.


CURVA DE CALIBRADO

Para este anlisis se utilizar el valor de Coeficiente de extincin de 18,45
(mM*cm)
-1
para realizar los clculos.



A) EFECTO TEMPERATURA: Prepare tres tubos con concentraciones
constantes de enzima y sustrato, a un valor de pH apropiado (pH = 5,0) e
incbelos a diferentes temperaturas un tiempo determinado de acuerdo con la
tabla indicada a continuacin.

Nota:

1.- Preincube los tubos slo con sustrato por 3 minutos a la temperatura
correspondiente.

2.- Controle la temperatura del ambiente.

Transcurrido el tiempo de incubacin, detenga inmediatamente la reaccin,
agregando el carbonato de sodio, mida la absorbancia de cada tubo a 405 nm.


Tubos PnPg
2mM
Pre-
Incubacin
Enzima Incubacin Na
2
CO
3

Estndar 25C 0,9 ml 3 min 0,1 ml 5 min 0,2 ml
M.P.1 40C 0,9 ml 3 min 0,1 ml 5 min 0,2 ml
M.P.2 100C 0,9 ml 3 min 0,1 ml 5 min 0,2 ml

BLANCO: Se prepara con 0,9 ml de sustrato ms 2,0 ml de Na
2
CO
3
y por ltimo
0,1 ml. de enzima. Ocupe el blanco para calibrar el espectrofotmetro.

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B) EFECTO pH: Prepare los tubos que contengan concentraciones
constantes de enzima y sustrato a diferentes pH; incbelos a la
temperatura determinada como ptima por 5 min. Detenga la reaccin agregando
a cada tubo 2,0 ml de carbonato de sodio 1,0 M. Lea la absorbancia a 405 nm
en el espectrofotmetro.

Tubos PnPg 2mM Preincubacin Enzima Incubacin Na
2
CO
3

pH 3.0 0,9 ml 3 min. 0,1 ml 5 min. 0,2 ml
pH 5.0 0,9 ml 3 min. 0,1 ml 5 min. 0,2 ml
pH 7.0 0,9 ml 3 min. 0,1 ml 5 min. 0,2 ml


BLANCO: Se prepara con 1 ml de sustrato ms 2,0 ml de Na
2
CO
3
y por ltimo, 0,1
ml de enzima. Para cada pH debe preparar un blanco.



CALCULOS:
Con los resultados obtenidos y utilizando el coeficiente de extincin
milimolar, calcule la velocidad de la reaccin en las diferentes condiciones.