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BIOQ-121 Clase 4 Protenas I

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Protenas 1
En esta clase vamos a describir a las protenas y veremos la diferencia entre un pptido y protena.
Funciones biolgicas de las protenas;
Almacenamiento: Las protenas que sirven de almacn de aminocidos, son fuentes de
aminocidos, porque tiene todos los aminocidos esenciales y no esenciales que sirven para el
crecimiento rpido del embrin y en las primeras etapas de la vida. El organismo recurre a los
aminocidos como fuente de E cuando no hay ninguna otra fuente, es el ltimo recurso.
Transporte: La Albumina de la sangre, por ejemplo, es un transportador multifuncional, tiene
mltiples sitios de unin y es el transportador n uno de los p.a. de los medicamentos en la sangre,
es bien promiscuo como transportador, en el sentido de que une cualquier cosa.
Catalizador: Casi todas las enzimas son protenas, pero no todas, hay algunas enzimas que son
cidos nuclecos con actividad catalizadora. Las enzimas catalizan todas las reacciones y por eso
tienen su captulo aparte.
Coagulacin: Es una funcin extremadamente importante para evitar la prdida de sangre
Reg. Del pH: Actan como verdaderos tampones regulando otros sistemas tampones.
Anticongelante: Como en la Antrtida el agua tiene una elevada concentracin de sal, aunque este
a -2 o -3C, no se congelan. Pero los animales no tienen una alta [sal] por lo que estas protenas
cumplen una importante funcin anticongelante.
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Datos Moleculares de algunas protenas:
En esta tabla lo que se muestra es una correlacin entre el tamao de la protena y su peso
molecular y como esos parmetros dan cuenta de la gran variedad de protenas que podemos
encontrar.
Tenemos protenas pequeas como Citocromo C que tiene un P.M. de 13000 y 104 residuos de
aminocidos (o sea tiene 104 aminocidos, pero se le llama residuo, puesto que no es el
aminocido completo ya que perdi agua al formar el enlace pptidico) y constituido por una sola
cadena polipeptidica.
La Ribunucleasa A es una enzima que est en el pncreas. La Lisozima est en la clara del huevo,
pero tambin lo producen las clulas sanguneas especialmente en la lnea blanca donde tiene una
actividad antibacteriana (es capaz de romper la pared de la bacteria)
La Apolipoprotena B, es parte del LDL (Lipoproteina de alta densidad), parte del colesterol malo.
La protena ms grande que se conoce es la Titina tiene un P.M. de prcticamente 3 millones y casi
27 mil residuos de aminocidos.
Es decir en las protenas existe una variedad enorme en cuanto a su tamao y al n de cadenas
polipeptidicas.

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Cuando las empezamos a llamar protenas y cuando son pptidos?
El lmite ms aceptado por los libros dice que de un P.M. de 10 mil hacia arriba se denominan en
general protenas, de 10 mil hacia abajo se habla de pptidos. Pero el lmite es medio difuso entre
los 5 mil y 10 mil, pero ah estamos. Por ejemplo la insulina tiene un P.M. de 5 mil y tanto y est
formado por dos cadenas polipeptidica.
La protena biolgicamente activa puede estar constituida por 1 cadena de aminocidos hasta 12
cadenas de aminocidos.
Comparacin de aminocidos en dos protenas:
Como estn hechos de aa, uno puede hacerle la
composicin de aa y eso nos da la cantidad
relativa de aa que tienen las protenas.
Recuerden que cuando vimos la tabla de todos los
aa, uno poda hacer el contenido de todas las
protenas en una base de datos y llevar la
abundancia relativa.
Pero cuando uno hace una protena en particular,
existen diferencias, ejemplo; al comparar
citocromo C y Chymotrypsinnogen del bovino hay
diferencias en el contenido de ciertos
aminocidos.
Po supuesto que hay algunos que son ms
abundantes que otros, hay hasta el doble, pero
siempre los que tienen menos son el triptfano,
serina.
Estas tablas nos permiten comparar contenido de
aminocidos y tambin propiedades de las
protenas.





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Protenas conjugadas:
Estas protenas adems de contener aminocidos, pueden tener otros grupos unidos para que la
protena sea biolgicamente activa o cumpla la funcin para la cual est diseada.
Y cuando adems de aminocidos tiene unido otro elemento que no es aa se denomina protena
conjugada, y lo que tienen unido se denomina grupo prosterico.
Las lipoprotenas tienen unidos lpidos, ya sea colesterol, triglicridos, etc. Ejemplo, la 1, la HDL.
Las glicoprotenas estn unidas a carbohidratos como la inmunoglobulina G, casi todas las
protenas que estn en las membranas plasmticas tienen unidos carbohidratos. Las
fosfoprotenas con grupos fosfatos como la casena de la leche, por eso es importante la leche,
porque para una persona que est en crecimiento es muy importante el fosfato (el fosfato se
utiliza para los fosfolpidos de membrana se utiliza en la multiplicacin celular cuando se est
creciendo).
Si la succinata deshidrogenasa no tiene unido el flavin nucletido no funciona.
Para procesar el alcohol se requiere del Zinc porque se utiliza la alcohol deshidrogenasa.
La mayora de las protenas son conjugadas, puede que tengamos una mezcla, por ejemplo la
hemoprotena como la hemoglobina tambin une fierro. Puede unir un flavin nucletido y
tambin un calcio, es decir, puede tener ms de un grupo prosttico.



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Arquitectura de las protenas
Se pueden ver distintos tipos de
arquitectura en las protenas.
Forma; pueden ser globulares o
fibrosas. Globular es con forma
de pelota y fibrosa con forma
estirada. Y vamos a ver que las
protenas que cumplen una
cierta funcin tienen forma
fibrosa y las que cumplen otro
tipo de funcin son globulares.
Y fundamentalmente las protenas globulares nosotros podemos distinguir distintos tipos niveles
de estructuras.
Estructura;
Primaria: Es la secuencia de aminocidos (que aa la componen y en que secuencia)
Secundaria: Como se ordena espacialmente esta secuencia.
Terciaria: Como la estructura secundaria se relaciona en un espacio tridimensional.
Cuaternaria: como varias cadenas polipeptidicas se relacionan entre ellas para formar una
estructura compleja.

*Los que tienen una sola cadena polipeptidica tienen solo hasta la estructura terciaria.
Determinacin de estructura;
Como determinamos la estructura primaria de la protena y porque es tan importante?
Toda la informacin de cmo se estructura una protena en el fondo radica en su estructura
primaria, en su secuencia de aminocidos.
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Hay distintas estrategias para llegar a conocer la estructura primaria de la protena.
1.- Purificarla; si nosotros molemos una clula
tenemos miles de protenas distintas de las
cuales nos interesa solo una. En el dibujo est
representado por bolitas de colores las distintas
protenas que tiene una clula y a nosotros nos
interesan las bolitas rojas, por lo tanto, hay que
ir eliminando todas las otras bolitas para quedar
solo con las rojitas.
Esta no es una estrategia muy fcil, pero se
puede hace con distintas tcnicas, entre ellos, y que se usa muchsimo es cromatografa.
Por ejemplo aqu se muestra como se purifica una enzima hipottica.
Comienzo con 1400 mL de extracto celular (volumen bastante grande) que contiene gran cantidad
de protenas. La actividad de la enzima se mide como actividad especfica y su unidad es units/mg
8actividad/cantidad de protena). *Si yo voy enriqueciendo esta la protena a travs de distintas
etapas de purificacin, esta actividad especfica va a ir aumentando, porque va disminuyendo la
cantidad de protenas del color que no me interesan, de acuerdo al plasma y voy enriquecindome
de las rojas.
Luego se hace una precipitacin con sulfato de amonio, un intercambio inico, exclusin molecular
y afinidad en cromatografa.
Y as, al final nos quedamos con un volumen pequeo de 6 mL que tiene 3 mg protenas y su
actividad especfica a aumentado a 15.000.




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Como saber que la protena que obtuvimos es una
protena pura?; Para eso existe una tcnica que se denomina
electroforesis en condiciones biolgicas.
Electroforesis: Esta tcnica nos permite separar protenas en un
campo elctrico conteniendo la muestra un detergente.
La electroforesis usa un gel de poliacrilamida (es como una
gelatina que forma poros, y el tamao del poro yo lo puedo
controlar. Entonces la protena, adems de ser sometida a un
campo elctrico va a avanzar, le voy a agregar un tampn de tal
manera que todas las protenas queden con carga negativa y van
a avanzar hacia el polo positivo que est abajo.
A las protenas ms grandes les cuesta mucho pasar por el poro y se van retrasando, cuando las
ms chiquititas avanzan ms rpido, y por tanto las puedo ir separando por tamao y P.M.
El detergente que se utiliza es el sodio docecil sulfato SDS
(agente surfactante, se encuentra en los shampoo).
Luego de correr la electroforesis y separar las protenas,
estas se pueden teir con un colorante (azul de t).

Lo que finalmente se obtiene es algo
como la imagen de la derecha.
Aqu tenemos un marcador de P.M. que
son protenas a las cuales se le conocen
su P.M., por tanto, yo puedo hacer ac
una escala patrn.
En esta imagen estn todas las etapas
comparadas; la clula no inducida,
inducida, extracto, ppdo, intercambio
anionico, cationico y finalmente la
protena pura. Se debera llegar a una
banda de protena.
De esta manera de una mezcla de protenas llegamos a tener una sola con el mtodo de
purificacin. Y ahora hay que hacer otras tcnicas para poderla analizar.

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Estos geles adems permite calcular el P.M., como tienen marcadores de P.M., la gracia es que el
grafico de Log(P.M.) Vs migracin relativa (cm que avanzo la protena) es una lnea recta. A donde
migra la protena es conocida, la interpolan y ustedes pueden conocer el P.M.
Punto isoelctrico:
Otro parmetro fisicoqumico que se puede
usar para identificar la protena es el punto
isoelctrico, y al igual que en los aa,
corresponde al pH al cual la carga neta es
igual a cero, solo que como son muchos aa
es ms difcil, pero igual se puede.
Aqu hay una tabla de protenas con sus
puntos isoelctricos. Por supuesto las que
tienen el punto isoelctrico ms bajo
predominan los aminocidos cidos, y las
protenas que tiene pI muy alto predominan
los aa bsicos.



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Para determinar el pI se prepara un gel de
poliacrilamida, pero a este gel se le
incorpora una sustancia que se denomina
anfolito. La gracia de los anfolitos es que
son una familia de compuestos que
cuando uno los somete a un campo
elctrico estos se ordenan produciendo un
gradiente de pH en el gel.
Entonces cuando le agregamos la muestra
y le aplicamos corriente, la muestra migra
hasta que llega a su pI, y como en su pI la
carga neta es cero la protena ya no se
mueve.
Es una electroforesis en equilibrio, demora mucho ms que la
otra, pero las protenas se ubican de acuerdo a su pI y como yo
puedo cortar el gel, puedo medir el pH en cada uno, hay unos
electrodos de superficie que me permiten conocer el pH, y as
conocer el pI.
La gracia de hacer esto, que uno puede hacer lo siguiente,
separa los pI, toma el gel y lo pone acostadito en el gel para
separar por peso molecular, y lo que yo obtengo ahora es un
mapa de separacin de protenas de acuerdo a su pI y P.M. y
se denomina separacin por electroforesis bidimensional.
Con esta tcnica utilizo dos parmetros fisicoqumicos para
separar mis protenas el pI y el P.M.


Si yo hago esto con una clula (E. coli) observen el
mapa de protenas que se obtiene, es como un
fingerspring, una huella digital de todas las protenas
que tiene la clula en un determinado momento.
Esta es una herramienta extraordinariamente
poderosa, no es fcil de estandarizar. Pero aqu se
comienza a hablar del proteoma de la clula.
El proteoma de una clula, son las distintas protenas que tiene una clula. El de la imagen debe
tener como 3 mil marcar, mil se pueden reconocer fcil, las otras son chiquititas.
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Esta tcnica es ms poderosa aun porque tambin puedo estudiar clulas en estado basal,
estimulan la clula ahora, vuelven a hacer lo mismo y ven si aumentan o disminuyen determinadas
protenas o aparecen nuevas protenas, se modifica el proteoma.
Esta es una tcnica que permite simplificar la purificacin de protenas. Cuando ya saben lo que
andan buscando, si es la protena que aumenta, disminuye o, si es la que aparece o desaparece
con una enfermedad, esa protena es interesante, es la que quiero conocer, entonces que
estructura primaria tiene. Para ello tomo la banda correspondiente a esa protena y la
secuenciamos para obtener su estructura primaria.
Determinacin de la Estructura Primaria

Determinar la estructura primaria es como esto, yo quiero
conocer donde empieza mi protena, con que aa y conocer
cada uno de los siguientes aa para determinar su relacin
espacial.


Por ejemplo la insulina presenta puentes
disulfuro, tiene dos cadenas y saber dnde (por
medio de otras tcnicas que no vamos a ver) se
producen estos enlaces covalentes que
mantienen unidas las dos cadenas.









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Todas las protenas tienen como una polaridad, se sintetizan del amino al carboxilo terminal.
Hay una tcnica para saber cul es el primer aa porque reacciona con el amino terminal y HCl.
Y para hacer la secuencia total se utiliza un reactivo que se llama fenillisodio cianato, reacciona
con el primer aa, bajo ciertas condiciones qumicas se produce este aducto, se sale del aa, y aqu
yo tengo el pptido con un aa menos, este compuesto que es coloreado (fluorescente) se hace la
reaccin de nuevo y as sucesivamente para saber la secuencia de la protena.
El secuenciador lo hace automtica y eficientemente pero
hasta 50 o 60 residuos, si la cadena es ms larga tenemos
un problema, lo que uno hace es tratarla con enzimas que
corten la protena, para eso los pptidos se separan por cromatografa en fase reversa utilizando
HPLC y luego se secuencian los pptidos.




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Otra manera de hacerlo es
por espectrofotometra de
masas. Es la tcnica que
permite obtener la masa ms
exacta de una molcula o
polmero, en caso de una
protena. Hay distintos tipos.
En general se volatiliza la
molcula, se ioniza la muestra
y esta vuela por un sistema de
vacio al detector y se conoce como
MALDI/TOF.
La gracia del MS es que muchos usan lo
que se llama una celda de colisin,
entonces, se selecciona una masa de la
mezcla de protenas y este lo rompe en
fragmentos y de ese determina la masa.
Entonces si nosotros tenemos una cadena
polipeptidica y la rompen al azar en
distintos tamaos, cada mezcla de pptidos tiene una masa distinta (hasta con decimales),
entonces cualquier combinacin de aa que tengamos (alanina/metionina o valina/valina) ser una
masa bien determinada, ustedes pueden identificar esos pequeos pptidos y por un mecanismo
computacional se pueden secuenciar.
Lo nico malo es que se tiene que tener una base de
datos ms o menos importante para poder establecer
correctamente las masas.
No vamos a profundizar ms, pero lo importante es
que yo puedo establecer de forma exacta la secuencia
de una protena a partir de sus pptidos.

Esta es la parte destructiva cuando se corto la
protena con y se obtuvieron dos pptidos.
Cuando se hace la secuenciacin normal de esta,
utilizando las enzimas, lo que hay que hacer es
ver cmo se sobreponen las distintas secuencias
de aa.
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Reconstruyendo la Secuencia:
La secuencia y composicin de aa reflejan la
funcin de la protena, entonces conociendo la
secuencia podemos reconocer la funcin, las
protenas de membrana tienen residuos mas
hidrofbicos y las protenas mas fibrosas tienen
secuencias mas atpicas (menso comunes).
Las protenas homologas en diferentes
organismos tienen secuencias homologas, por
ejemplo el citocromo C es altamente
conservado.





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Aqu se compara la alicoproteina?? humana con la de la carpa. Y podemos observar que hay 75
aa iguales y 31 aa semiconservativos.
Semiconservativo significa que cambiamos el aa por uno parecido, por ejemplo Valina y leucina
son apolares, glutamico por aspartico los dos son aa cidos, son de la misma familia, del mismo
grupo de aa.
Esta es la secuencia aminoacidica del citocromo C, aqu hay distintas especies alejadas
evolutivamente, y se aprecia en celeste los que son semiconsevativos.
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Se puede concluir que las zonas amarillas son los aa claves para la funcin de la protena y por eso
se conserva intacta entre las distintas especies. El citocromo C tiene que ver con la regeneracin
celular, con la cadena replicatoria. Si cambian uno de los aa conservativos va a funcionar mal, y si
funciona desperfectamente es una desventaja evolutiva y por tanto la especie desaparece.
Aqu hay un cuadro
comparativo en trminos
gruesos de cuantos aa de
diferencia hay en el
citocromo entre las
distintas especies.











- El numero de aa diferentes entre dos secuencias de citocromos c es proporcional a la
diferencia filogentica entre las especies de las cuales derivan.
- Estas observaciones pueden ser usadas para construir arboles filogenticos.
- Estas son las bases para los estudios de la evolucin molecular.
Es decir no solo nos permite hacer la estructura primaria de la protena, identificar cuales zonas
son importantes, sino que tambin nos permite hacer relaciones entre las especies, como han
evolucionado que parentesco tienen.



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Aqu hay un rbol filogentico segn la evolucin del citocromo C.


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De esta manera se pueden hacer rboles ms complejos.
Es decir, hay evidencia solida, molecular, no de observacin o de creencias de la evolucin en la
tierra.

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Aqu tenemos la lactoalbumina (albumina de la leche humana) y la lisozima del huevo de gallina. Y
Vemos como de la estructura primaria se puede llegar a establecer la estructura terciaria de las
protenas por modelamiento y as observar la extraordinaria semejanza entre dos protenas de dos
especies distintas con funciones distintas.
Entonces, hay ciertas formas de estructuras que son posibles porque estn relacionadas a ciertas
funciones, pero tambin existen estas coincidencias.



En la actualidad hay mucha informacin con muchos programas, que permiten estudiar la
estructura primaria de las protenas y relacionarlas con la funcin, y sus caractersticas
fisicoqumicas, simplemente conociendo la estructura primaria.
Y esto se puede hacer todo solamente en computador.