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Juan Kruze

25/09/2009
Esterilizacin
La esterilizacin es un proceso clave en los laboratorios de microbiologa
puesto que siempre tenemos que trabaar con productos est!riles"
Este es un proceso destinado a destruir# el obetivo de la esterilizacin es
destruir a todos los m"o vivos inclu$endo a las %ormas de resistencia que como
&ds" saben se denominan endosporas# $ para lograr este obetivos 'acemos
uso de una gente %sico (la desin%eccin se di%erencia de la esterilizacin en que
mientras aqu aplicamos un agente %sico $ destruimos todos los organismos#
en la desin%eccin utilizamos un agente qumico $ nos concentramos
principalmente en organismos que producen en%ermedades# que in%ectan)"
*ara poder entender el concepto de esterilizacin# necesitamos entender
el concepto de muerte bacteriana# recuerden que cuando 'ablamos de
crecimiento# la bacteria crece aumentando su masa# pero %undamentalmente
crece aumentado el n+mero de las c!lulas la poblacin# siempre trabaamos
con poblacin# $ aqu tambi!n la muerte bacteriana de una poblacin de
c!lulas o individualmente es la p!rdida absoluta irreversible de la capacidad de
multiplicarse# de reproducirse" , como estamos 'ablando de una poblacin de
c!lulas# no tenemos que centrarnos en el individuo# sino los individuos que
constitu$en una poblacin# $ despu!s de eso conocer la cin!tica de muerte de
las c!lulas que componen esta poblacin# $ esa cin!tica de muerte de las
bacterias es e-ponencial# de la misma manera como el crecimiento de la
bacteria en condiciones optimas es e-ponencial# la muerte tambi!n es
e-ponencial# es decir decrece el n+mero de c!lulas vivas de %orma logartmica#
cuando uno aplica un agente esterilizante"
.&E/0E 1230E/4252
*6/7472 4//E8E/941LE 7E L2 32*234727 7E
/E*/:7&34/9E 7E &5 .43/::/;2549.:
2qu tenemos los conceptos<
La curva de crecimiento con sus = %ases caractersticas $ al >nal tenemos una
curva que es la %ase de declinacin o muerte donde las bacterias empiezan a
declinar# a morir" 9i nosotros aplicamos en un momento dado por eemplo aqu
un agente esterilizante# nunca mueren todas las bacterias o las c!lulas
instant?neamente# la muerte instant?nea no e-iste
Esto signi>ca que estas c!lulas van a requerir# o el m!todo que estamos
aplicando va a requerir cierto tiempo para lograr destruir a todas las bacterias #
$ se va a producir entonces una curva de muerte que es intermedia# entre la
muerte ideal de todas las c!lulas comparada con la muerte natural# por ende
una curva de muerte intermedia $ el lapso @ 'a$ entre el momento que aplico
el agente $ el momento en que se produce la muerte total# es lo @ se conoce
como el tiempo requerido para destruir a todas las c!lulas de una poblacin
dada" Este tiempo requerido de esterilizacin varia con el tipo de agente que
estemos utilizando o con el m!todo que estemos aplicando para destruir# $ eso
es sumamente importante tenerlo presente# de lo contrario nuestro proceso de
esterilizacin no va a ser e>ciente"
3u?les son los agentes %sicos que se disponen para esterilizar<
9on %undamentalmente A mas uno adicional que se los vo$ a comentar"
32L:/
B4L0/234C5
/274234:5E9
&L0/29:547:
El m?s importante de todos es el calor# 'a$ di%erentes %ormas de calor# $
vamos a ver que tenemos distintas alternativas de esterilizar por calor
9i 'a$ elementos que no podemos calentar para esterilizarlos# podemos
recurrir a la >ltracin" 9i 'a$ cosas que no podemos esterilizar ni calentar ni
poder >ltrar por eemplo una sala de clases# $o puedo recurrir a la esterilizacin
por radiacin# o por agentes qumicos"
, estas son las A %ormas b?sicas %undamentales o los A agentes" , el
complementario es la ultrasonicacin# vibraciones a altas velocidades que son
capaces de romper bacterias# matar bacterias# pero nosotros usamos el
ultrasonicadores no con >nes de esterilizacin# sino con >nes de investigacin#
para romper c!lulas# e-traer protenas" Lo te-tos inclu$en la ultrasonicacin
como m!todo de esterilizacin# pero no tiene aplicacin pr?ctica" 4gual es un
agente %sico"
MTODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
Es importante tener presente cual es la cin!tica de muerte bacteriana
por calor" E-iste una relacin inversamente proporcional entre temperatura $e l
tiempo requerido para destruir por calor# es inverso# mientras #as alta es la
temperatura menor es el tiempo requerido para esterilizar# por eemplo en este
caso# vo$ de 90D 'asta 50D # vean &ds" como se va cumpliendo el tiempo para
poder reducir el n+mero de bacterias vivas en una poblacin determinada"
Entonces la primera pregunta que me interesa es cuanto resisten las bacterias
al calor# depende de la bacteria# $ qu! cosa %undamental de una bacteria tiene
importancia para la resistencia al calor La pared igual# pero no es lo m?s
importanteE pensemos en un laboratorio# que elemento tienen las bacterias
que las 'acen ser m?s resistentes al calor# las endosporas# entonces estamos
obligados a separar los organismos en esporulados $ no esporulados cuando
'ablamos de resistencia a la temperatura" Las bacterias que no son
esporulados# los que se conocen como c!lulas vegetativas no tenemos
problema con la destruccin# una 0D promedio de F0D3 pr?cticamente mata a
la ma$ora de las esporas promedioGGG Las .$cobacterium resisten 'asta H0D3#
que tienen esporas# pero una c!lula vegetativa un polio un espeG(no se
escuc')# un est?>lo# salmonella# 55D $a los mata" :tra cosa es si la bacteria
tiene esporas# 'a$ bacterias esporuladas que son terriblemente resistentes"
2qu 'a$ una escala de temperaturas con di%erentes 'ec'os cotidianos#
0D del %reezer IJ0#I 20D# 0D del re%rigerador I=# I5D3# de a' el cuerpo 'umano
AHD3"
/ecuerden &ds" que las esporas son citoplasma que se 'a condensado#
la bacteria cuando tiene condiciones adversas nutritivas $ ambientales densa
su material citoplasm?tico $ se rodea por una carcasa por as decir una gruesa
cubierta# uan membrana# de varias capas $ puede permanecer durante 20 A0
aKos mas aKos incluso en la naturaleza resistiendo los 2 tipos de e%ecto#
desin%ectantes# radiaciones# calor" *ero cuando las condiciones son %avorables
nutritivas $ ambientales# las bacterias eliminan est? cubierta# $ la misma
espora se trans%orma una vez m?s en la bacteria que la %ormo" :o que una
bacteria produce una espora# $ una espora cuando germina produce una
bacteria# no 'a$ multiplicacin"
, vean &ds" que $a empezamos a tener una temperatura donde la
bacteria ""(tos"") aborigenG 2 AAD vamos a tener las bacterias mes>las
aquellas que tienen su ptima en A5 AF AH D" 2 los FAD las bacterias patgenas
$a pueden ser destruas en A0 min# so$ destruidas tambi!n por la
pasteurizacin#
9i $o subo un poco la 0 $o reduzco estos A0 min a J5 seg" para destruir $
esa es la 0 por eemplo de de la pasteurizacin de la lec'e# HJ#5DE si $o subo un
poco m?s la 0 a L2D3 $a las bacterias patgenas son destruidas en solo A seg#
o sea mientras m?s $o subo la 0 m?s corto es el tiempo que requiero para
matarla# 'asta aqu estamos 'ablando de bacterias que no tienen esporas#
estas son bacterias vegetativas"
7i%erente es la cosa cuando tengo bacterias esporuladas# esa 0 ninguna
de estas me destru$e una esporulada" 2 J00D las esporas $o las puedo destruir
con agua 'irviendo en 2 'rs# eso es muc'o" Entonces generalmente lo que $o
'ago es aumentar la 0 $ usas m!todos especiales en un autoclave# $o puedo
destruir en 20 min m?s o menos las esporas a J20D" 2'ora si $o aumento m?s
la t JF0D $o la puedo destruir en 2 'rs pero en este caso con aire caliente# el
aire caliente es muc'o menos e%ectivo que el autoclave# por eso el m!todo @
da con>anza no es el aire caliente sino que el autoclave# el vapor de agua no
%unciona" Entonces est? claro# di%erente es una c!lula vegetativa respecto de
una c!lula esporulada"
&no puede pensar que calor es uno solo# pero 'a$ %ormas de calor
B&E;: 74/E30:
32L:/ MN.E7:
32L:/ 9E3: (24/E 32L4E50E)
3alor directo que es el %uego# es la llama# algunos lo 'ablan que es calor
seco# pero $o lo separo"
0enemos un calor '+medo# que es cuando se asocia con el agua caliente
o el vapor de agua# $ el calor seco que es aire caliente"
2'ora vamos a ver para qu! sirve cada uno de estos tipos de calor
B&E;: 74/E30:
0enemos 2 alternativas< o incineramos algo con la desventaa de que el
material se pierde porque se quema (Mabla del tratamiento de residuos
peligrosos $ que la & tiene un pro$ecto de luo")" *ero eso no nos interesa a
nosotros como un m!todo de esterilizacin en el laboratorio"
El m!todo de esterilizacin que usamos en el laboratorio es el mec'ero# sin
mec'ero no se puede trabaar" El uso es b?sicamente para esterilizar las asas
de cultivo con las cuales &ds" 'acen sus siembras# para esterilizar las bocas de
los tubos cuando 'acen un traspaso o para las puntas de las pipetas cuando
'acen tambi!n alguna manipulacin" El mec'ero no se usa para esterilizar
tubos $ pipetas enteras"
Ma$ varios modelos# algunas tienen piloto# otras no# lo importante es que
produce una llama de 2 colores# una llama color azul o otra roo intenso en el
medio# la zona de mas calora es la zona que est? en el interior de esta llama#
es a' donde &ds" deben colocar el asa o micrn
Boto< mal procedimiento de esterilizacin del asa" El asa nunca debe ir de
arriba para abao" Ma$ un riesgo# de que r?pidamente el mango del asa se les
va a calentar" Ma$ unas asas que no son de mu$ buena calidad# 'a$ unas de
pl?stico $ se derrite" Lo m?s peligroso es que se van a quemar la mano" La
manera correcta de colocar esto es de abao 'acia arriba"
La esterilizacin de la boca de los tubos# cada vez que &ds" abren el tubo
de ensa$o# el tubo de ensa$o queda e-puesto a la contaminacin de las
bacterias del aire# de modo que cada vez que trabaen &ds" con un medio de
cultivo liquido en un tubo siempre tienen que trabaar con la boca del tubo lo
m?s pr-imo al mec'ero" ('abla de que 'a$ alumnos que trabaan a J5 cm del
mec'ero# est? malO)"El mec'ero tiene que crear un arco de %uego# un arco de
esterilizacin en la zona donde debe estar manipulando las bacterias# sino de
qu! sirve el mec'ero prendido" Entonces# si &ds" tienen el mec'ero prendido#
esta llama les 'ace un arco de esterilidad# $ todas las bacterias que puedan
estar en el ?rea $ que est!n ca$endo se destru$en# incluso a veces#
particularmente cuando trabaamos con bacterias patgenas usamos 2
mec'eros# uno al lado del otro# entonces el arco de %uego es muc'o m?s
grande# el ?rea que $o tengo de trabao# de seguridad# es como una mini
c?mara de bioseguridad# entonces es +til"
La otra precaucin que tienen que tener con el tubo# es que no pueden
dear el tubo en %orma est?tica sobre el mec'ero porque se les va a quebrar el
vidrio# el mec'ero lo tiene que ir rotando# cosa que la llama esterilice toda la
boca"
, la otra alternativa que tengo es para esterilizar la punta de la pipeta
(%oto est? correcta)# en este caso una pipeta *asteur# en otros casos puede ser
una pipeta volum!trica# pero cada vez que &ds" usen una pipeta la punta se
tiene que esterilizar porque basta que la saquen de su condicin de esterilidad#
generalmente la pipeta est!ril se guardan envueltas en papel# o se guarda en
un caKn de acero ino-idable# donde se esterilizan J0IJ5I20 pipetas untas#
pero el 'ec'o de sacarlas $ pasar por el aire 'asta que la usen# se va a
contaminarE tengan presente que las bacterias est?n en el aire# en todos lados#
entonces 'a$ que esterilizar la punta# que es lo que $o vo$ a introducir dentro
del tubo cuando vo$ a sacar mi muestra"
La otra %orma de calor es el calor '+medo"
32L:/ M&.E7:
E1&LL434C5
82*:/ 7E 2;&2 (82*:/4P27:/)
82*:/ 7E 2;&2 2 */E94C5
*290E&/4P234C5
04572L4P234C5
Ma$ muc'as %ormas de calor '+medo# el m?s simple $ antiguo de todos
es producido por la ebullicin# agua 'irviendo# pero tambi!n puedo usar el
vapor de agua$ adem?s puedo usar el vapor de agua sometido a presin sobre
la presin atmos%!rica" Esas son las A %ormas b?sicas de calor" , dentro de este
captulo de calor '+medo tambi!n se usa o se describe la pasteurizacin $ la
tindalizacin# $ $a vamos a ver que di>eren un poquito de los otros en su uso"
E1&LL434C5
Es un proceso que cada vez est?
m?s en desuso# porque 'a sido
superado por equipos m?s
so>sticados# pero en el pasado
%ue un elemento bastante
popular# los esterilizadores# as
se llama# un equipo de
sobremesa" Que ponen &ds" un
recipiente de acero ino-idable
que tiene una bandeita adentro
$ ac? van a ver que tiene 2
perillitas# como estas %reidoras
el!ctricas que uno sube o baa
el canastillo del %reidor# es
e-actamente igual# $o agarro
estas 2 perillas# en esta posicin la perilla est? arriba entonces $o puedo llegar
$ sacar las cosas# $ si no# las bao $ esta reilla llega 'asta el %ondo $ se
sumerge en el agua que &ds" tienen adentro" Entonces $o subo $ bao esta
reilla a ver si me soporta los materiales que quiero esterilizar" RQu! aplicacin
tiene este equipoG Boto en el edi>cio *ugin# tenamos una pieza de toma de
muestra# pequeKas biopsias de animales# entonces tenan este equipo de
emergencia# para esterilizar los cuc'illos# los bistur# las pinzas"
5o es un m!todo J00S a%able con>ableGG *alpableG# por qu!# el gran
inconveniente del m!todo es que no destru$e la esporas bacterianas# $a
veamos que las esporas soportan J00D3" 9 sirve para esterilizar estas cosas#
como m!todo de emergencia# cuando $o tengo que usar un bistur varias veces
$o tengo que esterilizar# a veces no tengo material est!ril disponible $ usar un
autoclave signi>ca esperar un da este ciclo de esterilizacin# $ esto es r?pido
(ebullicin)
0iempo $ temperatura< la 0D son J00D3 $ el tiempo mnimo requerido
para esterilizar por ebullicin son mnimo J0 minutos contados desde el minuto
en que el agua empieza a 'ervir# no desde el momento en que $o pongo las
cosas adentro $ enc'u%o el esterilizadorE J0 minutos $ listo"
Llegamos a la %orma m?s importante de calor que es vapor de agua#
vapor de agua que puede ser natural o Tu$ente" 3uando uso un vapor Tu$ente
los aparatos que se usan para ello se denominan vaporizadores obviamente# o
per%ectamente $o puedo usar un autoclave a llave abierta" 5o es un m!todo
mu$ e%ectivo# la verdad es que nosotros no lo usamos como m!todo de
esterilizacin# s usamos los vaporizadores para a$udar a disolver algunos
ingredientes que llevan los medios de cultivo que tienen baa solubilidad#
cuando uno agita algo# un ingrediente poco soluble# una manera de %avorecer o
%acilitar la disolucin es calentarlo# entonces uno puede tener una olla# tambi!n
con una especie de canastillo una reilla# &ds" colocan los materiales $ el agua
'ierve# 'ierve $ 'ierve $ uno somete a vapor $ puede 'acer esto# pero no es un
m!todo recomendado para esterilizar"
9 el m!todo cambia radicalmente si este vapor de agua $o lo someto a
presin por sobre la presin atmos%!rica"
8eamos aqu la relacin que 'a$ entre la presin $ la temperatura<
9i $o tengo a presin a
nivel del mar# presin
atmos%!rica a nivel del
mar# el agua 'ierve a
J00D3" 9i &d" sube a una
montaKa# el agua 'ierve a
menor 0D# 'ierve antes de
J00D3" 2'ora si $o
aumento por sobre la
presin atmos%!rica 5 Lb
de presin sobre el agua
agregadaGG# la 0D es de
J0LD3# si $o sigo
aumentando la presin a
J0 Lb la 0D alcanza JJ5D3# si aumento a J5 Lb de presin# la 0D llega a J2JD3"
5osotros aprovec'amos entonces esta relacin 0D v/s presin para utilizar un
m!todo de esterilizacin# $o dira con baa 0D pero mu$ e>ciente"
9e marc con verde los 2 ciclos de esterilizacin que se utilizan en un
laboratorio de microbiologa" , le vamos a llamar convencional al segundo ciclo
que consiste en obtener una presin de J5 Lb con lo cual se logra J2J#FD3 de
0D $ se esteriliza durante 20 minutos" Este m!todo se llama convencional
porque es el que debi!ramos usar siempre# es el que me asegura la
destruccin total de las bacterias# todas las %ormas de resistencia# es el m!todo
que $o ocupo para esterilizar todos los materiales que llegan contaminados#
in%ectados del laboratorio# todo lo que se ocupa en la zona de practico# todo lo
que se recoge de los laboratorios de investigacin de los pro%esores# todo va a
una pieza una sala de esterilizacin# donde 'a$ un gran autoclave# que
%unciona >o con este ciclo# J2JD3# J5 Lb# 20 minutos# incluso a veces A0
minutos"
9in embargo# cuando $o preparo medios de cultivo# es otro uso que le
damos al autoclave# el autoclave tiene 2 grandes usos< para esterilizar el
material contaminado o para esterilizar medios de cultivo que est?n limpios#
pero no est?n est!riles" 3uando $o vo$ a preparar medios de cultivo# la
ma$ora de los cultivos soportan un ciclo convencional" &n agar peptona no
tiene ning+n problema con resistir los J2JD3# pero si $o preparo un material de
cultivo que tiene materiales org?nicos como 'idratos de carbono# estos son
bastante menos resistentes a la 0D# se pueden caramelizar# la lactosa# la
glucosa se caramelizan con muc'a 0D en muc'o tiempo" Entonces e-iste este
ciclo alternativo en que $o reduzco la presin a J0 Lb# reduzco la 0D de J2JD3
a JJ5D3 $ reduzco el tiempo de 20 minutos a no m?s de J0 minutos es el
tiempo de esterilizacin# para no destruir la naturaleza qumica de los
compuestos que son esterilizados# $ as $ todo 'a$ compuestos que no
soportan la 0D# no soportan ni los JJ0D3# entonces no me sirve# $ tendr! que
buscar otro m!todo como por eemplo la >ltracin (cmo suero sanguneo)"
*regunta< Rpor qu! no se puede esterilizar suero >siolgico en un 'orno
*asteurG 9uero >siolgico no tiene protenas# no con%undir con suero
sanguneo" 5o se puede esterilizar por calor# porque se deshidrata" &n 'orno
*asteur %unciona a JH0D3 por una 'ora $ mediaE un tubo con 5 mL de suero
>siolgico a JH0D3 por 'ora $ media le queda el tubo seco"
Entonces tenemos 2 ciclos de esterilizacin# uno que es el convencional el
%uerte el tradicional# $ otro que es
e-cepcional para medios de cultivo"
Boto< 2 secciones del laboratorio de
microbiologa"
2 la derec'a< 9ala donde %uncionaba la
esterilizacin con 2 autoclave
pr?cticamente gigantes" En los pases
desarrollados los laboratorios de
investigacin est?n en el primer piso" Era
J00S automatizado" 0ena una puerta en
%orma de gillotina# 'abia un carrito donde
se cargaba el material $ venia el carrito $
se acoplaba a la puerta"
0enamos 2 salas donde 'a$ autoclave# una donde %unciona la esterilizacin de
material contaminado# donde se requiere aparatos de alto volumen# de alta
capacidad" 7espu!s tenemos otra pieza en un laboratorio de microbiologa
donde %unciona la preparacin de los medios de cultivo que uno va a usar" Esto
es lo que se llama la cocina# donde se preparan los medios de cultivo" Entonces
la >nalidad de estos aparatos# el uso es di%erente# aqu destru$o todo lo que
est? contaminado# tengo que tener la certeza de que esta 0D destru$a todo lo
que est? contaminado# entonces en esta pieza utiliz?bamos el m!todo
convencional# incluso le d?bamos A0 minutos en vez de 20" En cambio en esta
(preparacin medios de cultivo us?bamos los 2 ciclos# convencional pero
muc'as veces tenamos que usar el setting de las J0 Lb a JJ0D3 por J0
minutos" 2 la
izquierda< eran
absolutamente
manuales#
comprados en
J95H"
3omo %unciona
un autoclave<
Boto< este es un
esquema# uno de
los autoclaves de
la sala de esterilizacin# lleva una cubierta de acero ino-idable# si le sacan la
cubierta aparece el cuerpo# el corazn del aparato que es as" A o = cosas
importantes del uso del autoclave< el JD el sistema de puertas# independiente
de cu?l sea el autoclave# vertical u 'orizontal como son estos# siempre el
autoclave tiene que tener una puerta que se pueda cerrar 'erm!ticamente $ la
manera de cerrar 'erm!ticamente la puerta adem?s de tener una
empaquetadura# que era el gran problema que esta empaquetadura se quema#
es la puerta# el timn# %ense que las manillas del aparato tienen una %orma de
tri?ngulo como timn de barco para que pueda girar $ cerrar 'erm!ticamente
(los antiguos tambi!n)" 2D despu!s tienen un manmetro que les mide como
indica la presin para que $o pueda controlar J0 o J5 Lb de presin" AD tiene
obviamente termmetro en la puerta# un barmetro incorporado en este que es
autom?tico" =D $ lo m?s importante es esta v?lvula# el e-'aust del vapor (tubo
de escape)"
3uando uno carga el autoclave con el material que tiene que esterilizar#
representado aqu por un matraz# pongo los materiales# cierro la puerta# lo
conecto a la electricidad# $ el agua que tiene el autoclave# obviamente J/A se
llena con agua# debe tener una entrada de agua# generalmente estos vienen
conectados al agua potable" Entonces cuando se empieza a calentar# el agua
empieza a 'ervir obviamente genera vapor# pero dentro del autoclave 'a$ aire#
$o tengo que sacar el aire para poder esterilizar# si $o no saco el aire# no sube
la 0D# entonces cuando empieza a generarse vapor# como el aire es m?s liviano
que el vapor# el vapor empua al aire# lo e-pulsa $ va saliendo por este
e-'austE el aire $o no lo veo# pero cuando empieza a salir vapor $o digo se
acab el aire# en ese momento entonces $o cierro esta v?lvula $ no deo salir el
vapor# entonces sigue calentando como una olla a presin# $ a' empieza a
subir la agua en el vapor" 3omo estos aparatos vienen preIsetiados o $o los
puedo presetiar# $o digo crtese cuando la presin llega a J0IJ5 Lb# $ en ese
momento $o empiezo a contar el tiempo de esterilizacin# cuando la 0D llega a
J2JD3 $ la agua del manmetro llega a J5 Lb de presin# $o empiezo a contra
los 20 min o 20 min de esterilizacin"
3uando 'ablamos de vaporizadores# $o die se usan los autoclaves de
llave abierta# si $o cuando empiezo a calentar# $ est? saliendo aire $ est?
saliendo vapor# si $o no cierro esta llave# vo$ a generar un vapor Tu$ente#
entonces puedo usarlo de 2 maneras"
RQu! cosas esterilizo en un autoclaveG La respuesta es mu$ general"
3asi todos los medios de cultivos pasan por autoclave# tambi!n puedo
esterilizar agua# ropa# tierra# cualquier cosa que resista la 0D del autoclave#
pero el obetivo es en
nuestro laboratorio .E74:9
7E 3&L048:"
3iclos del autoclave< no es
instant?neo# se alcanzan los
J20D3 en 2 minutos# serie de
cosas t!cnicasU (sin
importancia)"
Ma$ 2 %actores que son importantes que pueden a%ectar la e>ciencia de un ciclo
de esterilizacin" El primero $a lo comentamos< es el e%ecto del aire" 2'ora
datos de cmo el aire a%ecta negativamente un ciclo de esterilizacin" 3olumna
J< presiones con las cual puedo trabaar# al lado 0D que logro a esa presin sin
aire (saturacin total de vapor) $ las columnas aberrantes o errneas# lo que no
debe ocurrir# que pasa si cierro la v?lvula antes d eliminar todo el aire# $
elimino solo 2/A# no se alcanza la 0D# $ con J/A es menor la 0D"
El otro %actor importante que muc'as veces no se cumple por %alta de
e-periencia# se debe tener licencia otorgada por departamento de prevencin
de riesgo para uso de autoclave# pro'ibido para estudiantes" Es gente
entrenada# capacitada" 2 veces este error se comete por ignorancia# de qu!
manera el volumen que esto$ usando me puede a%ectar negativamente el ciclo
de esterilizacinE pensemos que la esterilizacin por vapor signi>ca que el
vapor tiene que penetrar lo que esto$ esterilizando# a'ora es mu$ %?cil que el
calor llegue r?pidamente a la parte e-terna de un matraz# pero requiere m?s
tiempo# si el matraz es mu$ grande# para que el vapor llegue al centro de este#
un punto de J5 o 20 L# con 20 min en el autoclave# no se va esterilizar
completamente" Entonces# la m?-ima es que# mientras menor es el volumen
de lquido que $o esterilice# menor es el tiempo requerido para esterilizar"
0abla< compara matraces de
di%erentes vol+menes#
cuantos matraces de medio
litro puedo $o colocar que me
reemplacen a un matraz de 5
L# si uso matraces pequeKos#
que es lo que nosotros
recomendamos# que es de J L
m?-imo" 2 pesar que $o
necesite 5 L de cultivo# a
veces preparamos J0 L de
medio de cultivo# coloco J0
matraces de litro# no coloco J
matraz de J0 L" 9i &ds" usan
matraces de V litro# J litro#
requieren A0 min# 20 min#
aqu pusieron == de tiempo
total del ciclo# cuando 'ablo del tiempo total 'ablo del tiempo de
calentamiento del autoclave# pero el tiempo requerido para esterilizar son 20
minutos" 9i &ds" usan un matraz de 5IF L se triplica el tiempo requerido# J
'ora# 'ora $ V# no tiene sentido# $ adem?s as $ todo no asegura que el vapor
penetre con absoluta seguridad al centro de ese matraz"
*290E&/4P234C5
9M:3K 06/.43: *2/2 7E90/&4/ ./:
EL4.452 W95 7E L:9 ./: (5: E90E/4L4P2)
*/:L:5;2 L2 8472 N04L 7EL 2L4.E50:
M23E 45:3&: 2L 2L4.E50: *2/2 L2 92L&7
5o es un proceso de esterilizacin# sin embargo en todos los te-tos se
inclu$e dentro de este captulo"
Que es# es un m!todo que aplico por JX vez *asteur# por eso queda su
nombre# no %ue el que le puso ese nombre" En el norte de Brancia# un grupo de
viKeteros tena problemas con la acidi>cacin de los vinos# recurren a *asteur
por su %ama de microbilogo# del tratamiento de los microorganismos# del
concepto de la %ermentacin# etc" $ *asteur resuelve el problema# toma un par
de muestras del los moscos que estaban agridos $ los otros que estaban sanos#
los mira en un microscopio rudimentario que tenia# $ se da cuenta que los
moscos que estaban agridos tenan algo que los moscos sanos no tenan $ el
dio bueno ve?moslo calentando !l saba $a la destruccin de microorganismos
por calor# la teora de generacin espontanea# estaba calentito el e-perimento
de 0indall cuando incuba las esporas# en >n# entonces calienta estos moscos $
destru$e las levaduras" 7espu!s cuando aparece la tuberculosis# que 'a
matado a m?s personas que la guerra# $ una de las maneras de contagiarse
con el .$cobacterium de la tuberculosis es con lec'e contaminada# de vacas
que tienen tuberculosisE no s! si &ds" saben que la tuberculosis es un problema
de salud p+blica mundial# J/A de la poblacin del mundo tiene tuberculosis# la
actual" &na de las recomendaciones que 'izo la :5& para reducir la
en%ermedad de tuberculosis# la lec'e era la principal %uente de contaminacin
con tuberculosis en 'umanos# porque la tuberculosis bovina tambi!n es un
problema de salud p+blica persistente" , la :5& dice que una manera de
proteger a la poblacin es 'aciendo algo con la lec'e que destru$a al agente
de la tuberculosis# $ a' es donde dice bueno# 'agamos lo que 'izo *asteur#
calentemos la lec'e# $ de a' surge el nombre de pasteurizacin# que
originalmente %ue pensada en destruir a los agentes zoonticos (zoonosis<
en%ermedades que se transmiten de los animales a los 'umanos o viceversa)"
Maban A grandes zoonosis a comienzos del siglo Y4Y# que eran la tuberculosis#
la brucelosis $ la >ebre""(no entend)# entonces una manera de cortar la
transmisin de para estas zoonosis era pasteurizando la lec'e# entonces se
busco la 0D que %uera capaz de destruir a estas bacterias patgenas# pero que
no alterara las propiedades de la lec'e" , as# entonces nace la pasteurizacin
de los alimentos# 'o$ da se pasteuriza el vino# se pasteuriza la cerveza# los
ugos# por nombrar entre los m?s conocidos" Entonces en qu! consiste la
pasteurizacin# la pasteurizacin es un s'oc@ t!rmico con la >nalidad de
destruir algunos m"o# por eso no es un proceso de esterilizacin# no dea un
producto est!ril" Elimina apro-imadamente el 9HI9LS de las bacterias
presentes en la lec'e# pero no la esteriliza" En el supermercado se compra la
lec'e pasteurizada convencional# pero s e-iste 'o$ da lec'e pasteurizada que
es est!ril" La lec'e pasteurizada convencional es aquella que se vende en
bolsitas de pl?stico $ que est? generalmente en anaqueles re%rigerados# porque
se tiene que mantener re%rigerado" 3u?l es la >nalidad de la pasteurizacin
entonces si no esteriliza# son 2 obetivos<
I Hacer inocuo el aliento para el consuo !uano# es decir#
asegurarme que esa lec'e que viene de un animal# no est! contaminada con
tuberculosis# brucelosis o de otra en%ermedad bacteriana# la pasteurizacin
destru$e esa bacteria"
I 2l destruir las bacterias patgenas tambi!n destru$e otras bacterias# que no
son problemas para la salud# pero si son problema para el producto# entonces
aparte de 'acer inocuo para el consumo 'umano# auenta la vi"a #til "el
pro"ucto" &na lec'e bien pasteurizada debiera durar F semanas# sin
problemas"
Ma$ varios tipos de pasteurizacin<
*290E&/4P234C5 12J2 (L0L0 Z F0Dc - A0 m)
*290E&/4P234C5 2L02 (M090 Z HJ"5D3 - J5 s)
*290E&/4P234C5 &M0 (J=0D3 - A s) (E906/4L)
L0L0 (Lo[ temperature \ long time)
2l correr de los aKos se demostr que calendar la lec'e por A0 minutos a F0D3
produca un %uerte deterioro de la condicin organol!ptica de la lec'e# pero
como $a sabemos a menor tiempo ma$or 0D"
90M0 (Mig' temperature# s'ort time)
7e a' surge la actual# que est? vigente en la ma$ora de los pases del mundo
M090# $ esa 0D al menos en 3'ile es de HJ#5D3" La norma 3'ilena del ministerio
de economa dice que la 0D o>cial es de HJ#5D3 por J5 a 20 segundos"
&M0 (&ltra Mig' 0emperature)
La revolucin de la *asteurizacin &M0# que a di%erencia de los 2 anteriores s
es un proceso est!ril# este me elimina todas las bacterias" *ero vean que un
golpe t!rmico soportanG J2 volt# JA volt JA0D3# tambi!n la 0D $ el tiempo
depende de la industria# de la %?brica# en los tetrapac@ por le$ debe decir a que
0D se esteriliza" Esta lec'e dura F meses" (La que debiera durar F semanas es
la M090 re%rigerada# si la abren $ no se re%rigera se corta# a'ora est? durando A
meses")
&na lec'e optima no debiera tener m?s de J000 &B3/mL"
2 la izq" *asteurizador
de placas tradicional
sistema M090" *or un
lado se calienta el
agua" *or contacto se
calienta la lec'e por J5
segundos" 9i por
alguna razn %racasa el
proceso eso es
detectado por un
proceso enzim?tico#
una enzima que
cambia de color# llega
a cierta 0D $ si ese
cambio no se produce al t!rmino e-iste aqu un b$pass $ la lec'e vuelve a
pasar $ se vuelve a pasteurizar"
2 la derec'a un pasteurizador &M0 (*armalat# 1rasil)"
04572L4P234C5
E%ecto 0indall< cuando uno dea pasar un ra$o de luz en una pieza oscura
$ se ven millones de partculas suspendidas en el aire" Le sirvi a 0indall para
descubrir este proceso de esterilizacin"
0indall un da se encuentra con la sorpresa que pro m?s que calentaba
un caldo de cultivo contaminado con bacterias# las bacterias no moran" , para
eso us su e%ecto# en una caa oscura 'izo pasar un ra$o coloca los tubos aqu
en medio de cultivos est!riles# dea tubos abiertos para demostrar que las
partculas que estaban aqu en el aire era donde estaban las bacterias
presentes $ que de esta manera uno poda ver que 'aba algo suspendido en el
aire que era lo que caa dentro de los tubos# $ por eso se produca la
]generacin espontanea^# pero no era eso# sino que el medio estaba
contaminado con bacterias" 3omo el calor no le %unciono# pens que era por las
esporas" Entonces !l propone calentar estos medios de cultivos por A das
consecutivos# por A0 minutos a J00D3# esto se de>ne como la pasteurizacin
%raccionada# cu$o obetivo es eliminar las esporas# 5: matarlas# este m!todo
no mata las esporas# eliina esporas$ 2 los J00D3 el primer da $o mato
todas las c!lulas vegetativas# con ellas no 'a$ problema se mueren con F0D3
sin ning+n problema# pero van a resistir las esporas# $ como las esporas son
resistentes a condiciones adversas# entre un da $ otro# vo$ a incubar# para
darle la 0D# las condiciones optimas# $ esa espora va a germinar# $ al da
siguiente van a ser bacterias vegetativas# entonces vuelvo a calentar al 2do da
por A0 minutos# a F0# a J00D3 $ vo$ a matar todas las c!lulas vegetativas# $ si
alguna espora me quedara sin germinar le do$ un Aer da" : sea# al Aer da# $o
no me matado ninguna espora# 'e matado las c!lulas vegetativas pero no 'a$
ninguna espora"
24/E 32L4E50E
El aire caliente tiene la desventaa que es menos caliente que el aire '+medo#
por lo tanto# necesitamos muc'o mas 0D $ muc'o m?s tiempo" 8ean &ds" la
relacin que 'a$ entre tiempo de esterilizacin $ la 0D del aire caliente< a
medida que $o subo la 0D $o puedo reducir# pero aun as 'ablamos de JH0D3
comparado con J20D3 del autoclave# o sea# es casi el doble del tiempo $ la 0D
que necesito $o# con aire caliente" El aparato para utilizar# comercialmente se
conoce como Morno *asteur# JH0D3 durante 90 minutos (en su laboratorio)"
Es un 'orno# una caa# el
equivalente a un 'orno# una cocina
el!ctrica o a gas" Es una caa met?lica
o de madera que tiene una doble pared
aislante para mantener la 0D# tiene un
termostato""(ruido)"
El 'orno *asteur con aire caliente se
utiliza para esterilizar material limpio#
pero no est!ril" 0odo el material que
&ds" ven a'# placas# matraces#
pipetas# todo lo que sale de la sala de
esterilizacin# pasa a una seccin de
lavado# $ volver a esterilizarlo para ser reutilizado# en ese momento se utiliza el
'orno# para esterilizar le material limpio pero no est!ril# las pipetas# las placas#
eringas" Estos deben estar tambi!n protegidos de contaminacin# guardados"
Las placas *etri en paquetes de papel (con no m?s de AI=)# deben ser paquetes
c'icos porque si son mu$ grandes el aire puede no va a penetrar al corazn del
paquete" Entonces oala 'acer paquetes pequeKos $ dear espacios vacos para
que circule el aire" .atraces o vasos de precipitado est?n cubiertos por papel $
tienen una pita que sueta el papel# los tubos tambi!n# todo est? protegido de
la contaminacin ambiental# $ esos protectores se sacan cuando se va a utilizar
el material# no antes" .edios de cultivo por JH0D3 J V 'ora se evaporara
(medios de cultivo entonces en el autoclave)"
B4L0/234C5
0enemos medios de cultivo que no se pueden esterilizar en autoclave porque
no soportan la 0D# como el suero sanguneo# algunos antibiticos# algunas
soluciones M" de 3"
E9 EL *29: 7E 9&90253429 L_Q&4729 2 0/28E9 7E .20E/42LE9 *:/:9:9 (membranas porosas)"
Es importante que conozcan el tamaKo de las bacterias con respecto a
otros organismos in%eriores# bacterias promedio J micra# virus m?s pequeKos#
protozoos m?s grandes"
5uestro problema est? aqu en esta banda amarilla< rango de resolucin
del microscopio ptico que &ds" usan en pr?ctico# su poder de resolucin es la
dimensin m?s pequeKa que el organismo puede resolver $ eso est? alrededor
de 0#J `# por debao de eso necesitamos microscopio electrnico"
Entonces# si 'ablamos de >ltro tenemos que pensar en >ltros que sea
capaz de retener estos organismos o los virus" Entonces# en esta curva de
;auss vamos a ver que la ma$ora de las bacterias tienen alrededor de 0#5 `#
algunas pueden medir de H# J0# J5 `# $ de las bacterias m?s pequeKas son
m?s pequeKas que los virus m?s grandes# el virus m?s grande que se conoce
es el virus *:Y# el virus de la viruela que mide 0#5 `"
Eso signi>ca que vo$ a tener di%erentes tipos de >ltros# vo$ a tener un
pre >ltro# que puede ser a lo meor un papel >ltro# que me separe las partculas
mas groseras $ no me sature los otros >ltros que a m me interesan que son los
bacteriolgicos" /uido""virus"
Mistoria
Maban muc'os >ltros 'ec'o a base de asbesto# porcelana# o de vidrio
%ricado# o de tierra porosa# en >n" 9eg+n el material se llamaban buas# los de
tierra porosa# que uno 'ace pasar un lquido pro estas cosas" 7ependiendo de
los materiales tenan distintos nombres# 3'amberland# 1er@er>eld" Eso es
'istoria# $a no se usan# eran complicados de limpiar# se saturaba con %acilidad#
no permitan >ltrar pequeKas cantidades# etc"
7e repente a alguien se le ocurri 'acer estos &L0/2 Biltros# que son
membranas de esteres de celulosa# son sumamente delicados# mu$ %r?giles#
pero la ventaa es que son desec'ables $ baratos# $ vienen en tubitos de J00
unidades# o de J0# 'a$ de todas las capacidades# 'a$ pre >ltros#
bacteriolgicos# virolgicos# de todos los taKamos# el m?s c'ico tiene el tamaKo
de una moneda de 50 pesos# $ el m?s grande puede medir A0I=0 cm si $o
quiero >ltrar grandes vol+menes de liquido" 9e usan $ se botan" 9on %r?giles
porque son tan delgaditos como una tela de cebolla" Estos se colocan en un
soporte cosa que al pasar el liquido la presin del lquido no me rompa el >ltro#
entonces el >ltro queda apo$ado sobre un soporte# $ 'a$ un sistema de acople
(ensamble) donde uno coloca el >ltro# despu!s se coloca o a un tubo de ensa$o
o a un matraz# $ recoo# no se pierde nada" La precaucin es cambiar el >ltro
cada cierto tiempo# no se puede usar in>nitamente# uno tiene m?s o menos
calculado cuanto puedo pasar a trav!s de una eringa# lo otro# no 'acer muc'a
presin porque puede romper el >ltro# dear caer por gravedad"
Ma$ algunas eringas que vienen con el >ltro adentro# pero es m?s barato
comprar una caa $ montar esto" &samos una eringa# colocamos el lquido#
abao el tubo de ensa$o $ recogemos"
E90E/4L4P234C5 *:/ /274234:5E9
3uando 'a$ cosas que no podemos calentar o >ltrar# es la alternativa que
queda"
7i%erentes tipos de radiaciones electromagn!ticas que e-isten<
/274234:5E9 &8
/2,:9 45B/2/:J:9
/2,:9 Y
/2,:9 ;2..2
ELE30/:5E9
7erec'a< onda larga
4zquierda< onda corta
.ientras m?s corta la longitud de onda mas germicida es esta radiacin" 7e
aqu entonces que los ra$os Y# a# inicos# son terriblemente perudiciales $
peligrosos# no se pueden utilizar como agentes esterilizantes" 5osotros usamos
generalmente las ondas &8# son bastante germicidas# no son tan peligrosas"
Est?n en una longitud de onda de J00 a 200 nm# los colores aqu son las
radiaciones luminosas que nosotros somos capaces de ver# los colores del
arcoris# $ el e-tremo derec'o las radiaciones in%rarroas (aparatos< microondas)
Las radiaciones &8 son las m?s usadas con >nes de esterilizacin# $ tambi!n se
est? masi>cando el microondas# ra$os Y $ gamma no se utilizan por ser mu$
peligrosos"
/274234:5E9 &8
8ienen de los ra$os solares# sin bastante germicidas $ mas all? de eso
tienen u poder mutag!nico# es un agente mutag!nico utilizado en esterilizacin
para mutar genes de bacterias" *ero otra caracterstica es que son
cancergenos" &na e-posicin prolongada la piel de este agente produce una
mutacin $ puede producir c?ncer"
&so pr?ctico de las radiaciones desde el punto de vista de la esterilizacin
Boto< sala de ra$os &8 que se utilizaba cuando uno tena que trabaar
con bacterias peligrosas o 'acer traspasos de cultivo# uan sala mu$ pequeKa
de 2 metros cuadrados# provista de un tubo de ra$os &8 arriba# $ la manera de
usarlo era dearlo prendido toda la noc'e $ cuando uno llegaba en la maKana la
sala esta est!ril" La otra alternativa son estos gabinetes o c?maras de
bioseguridad# con la misma >nalidad# pero $a para trabaar dentro de un
ambiente# $ no necesita m?s espacio# simplemente est? provista de un ra$o &8
en el interior# tiene una abertura ac? abao# con en las incubadoras del
'ospital# esta es una aleta de goma mvil# puedo pasar las 2 manos $ trabaar
sin estar e-puesto directamente a los ra$os &8" *ero lo que es m?s so>sticado
que usamos 'o$ son las c?maras de Tuo laminar# es una c?mara de Tuo
laminar# este es un gabinete de bioseguridad# cu$o otro nombre es c?mara de
Tuo laminar# porque tiene un doble sistema de seguridad# un sistema de Tuo
laminar de aire %orzado# que entra aire $ abao tienen unos >ltros donde el aire
circula por conveccin en este sentido $ no me dea entra partculas desde la
sala 'acia el interior ni viceversa# tiene doble mecanismo de proteccin#
protege al operador# medio ambiente $ a lo que esto$ trabaando# por eemplo
trabao con virus $ bacterias" Es imprescindible para investigacin bacteriana"
Lo otro que tiene atr?s es una l?mpara de ra$os &8# cosa que si alguna
cosa pudiera entrar# estos ra$os &8 irradian inmediatamente"
3omo mata la luz &8# por qu! es germicida" /a$o &8 va dirigido
directamente sobre el 752 de las bacterias# espec>camente act+a sobre las
timinas# cuando en una secuencia de polinucletidos de 752# e-isten 2
timinas# una al lado de la otra# los ra$os &8 act+an sobre esas timinas $
producen $ un dmero de timinas# que se conoce como dimerizacin e las
timinas# esto signi>ca que estas 2 bases nitrogenadas se untan# por lo tanto#
se acorta la distancia natural entre ellas 2 $ se %orma un enlace# $ como esta
mol!cula de 752 se replica# se pierde la secuencia $ la r!plica no es id!ntica a
la secuencia original# mutacin (cambio en el 752) que puede ser viable o letal
dependiendo de cuanto sea el daKo producido" En consecuencia# la luz &8 la
puedo utilizar como agente esterilizante# dependiendo del tiempo de accin# de
la distancia que 'a$ entre 2 tubosGG# o como agente mutag!nico" *or eemplo
si $o lo usara como agente mutag!nico# $o irradio el cultivo por J0 segundos# si
lo ocupo como agente esterilizante lo puedo usar por V 'ora# entonces
depende de cu?nto tiempo va a actuar# depende del e%ecto letal o viable"
B230:/E9 4.*:/0250E9
2lgunos %actores que tiene que tener en cuenta cuando uno esteriliza con &8<
b Longitud de onda (c longitud de onda W poder o e%ecto germicida)
b 0ipo de germen (esporulados $ Tuorescentes m?s resistentes)
b .edio ambiente (medio opaco o turbio no dea pasar ra$os &8E materia
org?nica protege a las bacteriasE vidrio $ pl?stico no dea pasar ra$os &8
b 0iempo de e-posicin
2'ora dentro de la radiacin &8 tambi!n 'a$ radiaciones de onda corta $
de onda larga" 9e 'a visto el uso de una l?mpara de luz &8 en los 'ospitales
(quir%ano)# en la carnicera# en los bancos# para ver si los billetes son %alsos"
En esa l?mpara# la que nosotros usamos en nuestro laboratorio para
diagnostico# se usan onda s larga# porque el obetivo no es matar bacterias# se
usa para ver si un billete es %also o no"
En el caso de las rotiseras# carniceras# se usan de onda corta# porque su
obetivo es destruir g!rmenes"
7ependiendo del uso 'a$ l?mparas que tienen un s[itc'# $ dicen onda
corta $ onda larga# entonces uno escoge"
El tipo de germen es otro %actor importante a considerar# que los
g!rmenes varan en su resistencia a la accin de los ra$os &8" Ma$ ciertas
estructuras celulares# por eemplo la produccin de pigmentos 'ace que las
bacterias sean m?s resistentes a la radiacinE la presencia de esporas o de
c?psulas 'ace que la bacteria sea m?s resistente"
El medio ambiente< es sumamente importante en qu! condiciones uno
irradia en el laboratorio" En el medio ambiente natural por eemplo toda la
materia org?nica# la grasa# todos los bitritusG *rotegen a las bacterias sobre los
ra$os &8# a pesar de las %uertes radiaciones solares que tenemos por el ozono"
En el laboratorio tenemos que tener cuidado con los medios de cultivo"
Los ra$os &8 no traspasan el vidrio# no traspasan el pl?stico"
Entre m?s turbio# m?s denso sea el cultivo bacteriano# ma$or es la
absorbancia de los ra$os &8 $ menor el e%ecto sobre las bacterias que est?
adentro# por lo tanto# si $o quiero irradiar por eemplo# a una bacteria para
producir una mutacin# tenemos que tener la precaucin de irradiar
directamente sobre la suspensin bacteriana $ no a trav!s de la tapa placa
*etri o a trav!s de un tubo de vidrio# porque no va a pasar"
El tiempo de e-posicin< dependiendo del tiempo de e-posicin es el
e%ecto viable o letal que $o puedo tener# mientras m?s tiempo# m?s letal"
/2,:9 45B/2//:J:
Los microondas
5o est? diseKado para esterilizar# no es su obetivo# es descongelamiento o
calentamiento de alimentos# pero se uso por razones econmicas" 2 di%erencia
de los ra$os &8 (penetran)# los ra$os 4/ no penetran# por eso tiene que estar en
permanente rotacin la sustancia que esto$ irradiando para tener e%ecto" Es
e%ectivo para material de pl?stico que no se puede esterilizar de otra manera#
siempre que se respeten algunas condiciones" .?-imo de L tubos por J0
minutos $ colocando un vaso de pp con agua adentro# porque los ra$os 4/
%uncionan con la 'umedad" *roduce calor# $ lo que esteriliza es el calor# con la
ventaa que no derrite como el autoclave"
&L0/29:54B43234C5
El ultrasonido no es un m!todo de esterilizacin# aunque produce esterilizacin
de c!lulas# se usa con otros >nes# para e-traer bacterias# para e-traer
productos de bacterias" , la razn por la cual no sirve para esterilizar es porque
para que la sonicacin sea %actible# tienen que estar las bacterias en una
suspensin en medio liquido# en consecuencia no puedo esterilizar una pared#
un piso# algo que sea met?lico# porque le mecanismo de accin es esta alta
%recuencia sonora# se 'ace con un v?stago un sonicador $ vibra# $ si lo
podemos sentir" *uede ser peligroso# produce burbuas $ estas burbuas
producen un s'oc@ violentsimo para las bacterias $ estas bacterias >nalmente
se rompen por este s'oc@ de las ondas sonoras"
5atalia &ribe 1"
Qumica $ Barmacia