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MTODOS PARA LA EVALUACIN DE CRECIMIENTO MICRIBIANO




Directos

Peso seco

Cuenta total
microscpica

Componentes de
la pared celular



Peso hmedo

Cuenta viable

Protenas

Volumen
hmedo

Medicin lineal o
radial

cidos
nucleicos



Indirectos


Determinacin
del nitrgeno
total

Numero ms
probable NPM

Produccin de
cidos orgnicos

Oxigeno

Azucares
Espectrofometria


Turbidimetria

Produccin de
alcoholes y
glcidos

CO
2

Radiacin IR

Nefelometra

Produccin de
CO
2

cidos grasos
Determinacin
de la masa
celular o
biomasa
Determinacin
del n de
microorganismos
Determinacin
de metabolitos
asociados al
crecimiento
Determinacin de
la utilizacin de
algn nutriente
Tabla # 1: La anterior tabla es una recopilacin de todos los mtodos; directos e indirectos,
existentes para la evaluacin del crecimiento microbiano en general. Todo y cada cosa que se
genere en este proceso, determinado por cuatro aspectos importantes de evaluacin. Shirley Jimnez
Hidalgo. Septiembre 01 2013.

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METODOS DIRECTOS E INDIRECTOS PARA LA EVALUACION DEL
CRECIMIENTO MICROBIANO
Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado
de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa
celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos
pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo,
mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un
aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del
genoma no se acompaa de divisin celular) el crecimiento se traduce en aumento de
tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos
puntos de vista:
Escala individual.
Escala poblacional.
Los eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y
dentro de ste podemos abordar los siguientes temas:
Inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y de plsmidos.
Segregacin de cromosoma y plsmidos a las clulas hijas.
Sntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular.
Seales que coordinan la replicacin genmica con la divisin celular.
El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos:
cintica del crecimiento
factores que afectan al tiempo de generacin (g)
factores ambientales que limitan el crecimiento.
A continuacin haremos un estudio de todos los mtodos que se emplean en el crecimiento
de poblaciones (que es el ms frecuentemente empleado al trabajar con microorganismos),
enfatizando en cada uno de ellos y presentando las ventajas y desventajas en el empleo de
cada uno de ellos.
DETERMINACION DEL PESO SECO
El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una
suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso
constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias
del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de bacterias. La
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desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el
secado y puede existir alguna degradacin.

El volumen ocupado por los huecos se determina por desplazamiento de fluidos, por lo que
estos no deben reaccionar con la pared celular para obtener un valor exacto del mismo. Se
suelen emplear el agua o el helio, siendo este naturalmente ms exacto al ser el helio
un gas inerte.
El agua, como veremos, es sorbida molecularmente por la pared celular, produciendo una
compresin de la misma que enmascara el valor obtenido, cuyo efecto estudiaremos con la
hinchazn. Con respecto al peso especfico real de la clula, o ms exactamente peso
especfico de la pared celular, despus de numerosos estudios, se ha encontrado que, con
pequeas variaciones, se puede considerar para todas las clulas prcticamente igual a 1,56.

DETERMINACION DE PESO HUMEDO
Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de
las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de
muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser
importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede
contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y
deformacin celular.
Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el
espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de
polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero
no pueden atravesar las paredes bacterianas.

CONTEO MICROSCPICO DIRECTO
Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en
un laboratorio de microbiologa, ya que consiste en contar con un microscopio la cantidad
de clulas presentes en un volumen determinado.
Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos ( cmara de Petroff
Hauser, cmara de Neubaver Fig. 5-). Una de las mayores ventajas del recuento
microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los
objetos contados. La muestra puede utilizarse tal cual, (leche, o cultivos puros en medio
lquido), o puede prepararse una dilucin.

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CONTEO DE CLULAS VIABLES
El mtodo se basa en la consideracin que el crecimiento implica el aumento de los
microorganismos capaces de formar colonias. Este mtodo puede hacerse con medios
slidos o lquidos. El mtodo ms frecuentemente empleado es el conteo en placas (medios
slidos) formando colonias. Por lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas
microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura).
Para ello se siembra una cantidad conocida de la suspensin bacteriana cuyo nmero se
desea conocer. En un medio slido cada bacteria se multiplicar formando una colonia
visible a simple vista que puede ser contada. Como las colonias pueden originarse tanto de
una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES
FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.), y esto puede constituir una desventaja ya que si
dos bacterias no se separan darn una sola colonia, subestimando de esta forma el nmero
de microorganismos en la suspensin. Adems, a los efectos de que todas las
clulas que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que
los errores del mtodo sean menores, se establece que las condiciones ptimas de conteo se
dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias. Algunas bacterias son difciles de contar en
medios slidos (Nitritadores) y se requiere de conteos en medios lquidos. Para ello se
recurre a la tcnica de determinacin del nmero ms probable (NMP) de
microorganismos. Se basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un
determinado tipo de microorganismo (en funcin de que crezcan o de que produzcan
determinada reaccin en el medio o no), en diferentes
cantidades de muestra. Para poder determinar el NMP de microorganismo se debe diluir
hasta tener una densidad que sea menor a 1 clula por cada mililitro de diluyente. La
interpretacin de los resultados, se hace en base a una distribucin estadstica, y en general
se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada
serie de tubos, teniendo en cuenta la dilucin en la se observa proliferacin de
microorganismos.
Se prefiere adems este mtodo cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o
cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.).

MEDICIN DE LA DENSIDAD BACTERIANA
Es una tcnica en la que se mide la masa de microorganismos en una suspensin. Para ello
se utiliza un espectrofotmetro y se mide la cantidad de luz que atraviesa en una suspensin
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de microorganismos, en comparacin con un blanco que es el medio esterilizado y sin
sembrar. Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto menor es el porcentaje
de luz que atraviesa el medio. Para relacionar la transmitancia con la densidad bacteriana se
requiere de hacer curvas patrn de densidades conocidas.

DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO POR CUANTIFICACIN DE CIDOS
NUCLEICOS
Extraccin del ADN en cada tiempo de muestreo.
Determinacin de la pureza del ADN por el clculo de la relacin de absorbancia a
260 nm y 280nm (A260/ A280).
Valores obtenidos entre 1.8 y 2.0, indican que las muestras no contienen residuos
proteicos ni fenol.
La concentracin del ADN extrado se determina por medio de la siguiente
frmula:
D.O.260 = 1 contiene 50
g de ADN de doble cadena por mililitro.

DETERMINACIN DE UN COMPONENTE CARACTERSTICO
peptidoglucano, ADN, ARN, protenas, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos, etc.
Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros mtodos ms fciles dan errores
debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en
determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.
MEDIDA DE CONSUMO DE NUTRIENTES O DE PRODUCCIN DE ALGN
METABOLITO POR UNIDAD DE TIEMPO Ejemplos: consumo de oxgeno (QO
2
) y
consumo de carbnico (QCO
2
), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin
de cidos.
MTODOS TURBIDIMTRICOS (PTICOS).
Son muy usados en la prctica cotidiana del laboratorio. La base comn de estos mtodos
consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo
bacteriano.
Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier
partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin de la luz es, dentro de
ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.
a) Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de
Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia (una
medida de la luz transmitida a travs de la suspensin).
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Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de A con la
masa bacteriana en una muestra problema.
Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamao de
la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica aumenta pues a
longitudes de onda (l) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida
para >10
7
cls/ml.
b) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en
ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz
dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el
espectrofotmetro.
Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una
graduacin en superficie y unas medidas muy concretas:
excavacin con 0.02 mm de profundidad
rea de 1 mm
2
, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes
cada cuadrado grande esta subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeos
o sea la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdilla (cuadrados pequeos).
La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma
del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de clulas en varias celdillas
(normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el nmero n de
clulas observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentracin celular es fcil de
establecer:
n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml.
Ventajas: es un mtodo muy rpido.
Inconvenientes: slo sirve para suspensiones relativamente concentradas
(>10x10
6
cls./ml). Por debajo de este valor el nmero de clulas vistas en el campo del
microscopio es muy pequeo y poco significativo estadsticamente. En bacterias mviles,
hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.
Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensin
microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que
por un orificio (30 mm dimetro) pasa una partcula (p. ej., bacteria) se interrumpe la
corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el
nmero y el tamao de las partculas que van pasando. (El tamao detectado es funcin de
la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partcula).
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Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partculas extraas (las
pequeas seran contabilizadas errneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar
el orificio del aparato).
Recuento de viables en placa: Los mtodos de recuento de nmero de clulas que hemos
visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre clulas vivas y muertas. En muchos
casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el
recuento de viables. (Una clula se define como viable cuando, colocada en un medio
adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es
sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de
Petri con medio slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible
despus del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles, teniendo en
cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil deducir el
nmero de clulas viables en la suspensin original.
Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un
gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles
(con un dimetro de poro que retiene las bacterias pero permite el trnsito de sustancias).
Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las
colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se
cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de
suspensin que se hizo pasar por el filtro.













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BIBLIOGRAFA

Brock, T. & M. Madigan. 1993. MICROBIOLOGA. 6ta Edicin. Prentice Hall
Hispanoamrica S. A. Mxico. Ranea, F. 2002.
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Magali Pedrique de Aulacio
Norma De Castro. Ctedra de Microbiologa - Facultad de Farmacia UCV
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Noviembre 2001, Revisin 2008.









CONCLUSIONES

Finalmente se logro concluir la variada existencia de mtodos para la evaluacin de
crecimiento de los microorganismos, cada uno con su incidencia directa o indirecta, al
igual que sus finalidades, sus ventajas y desventajas y la pertinencia a la hora de evaluar
uno o varios parmetros dentro del enorme campo del crecimiento microbiano. Es de
relevancia destacar que el trabajo investigativo nos llevo al conocimiento y a la
interiorizacin de cada uno de estos mtodos a fondo lo que nos enriquece como
profesionales y fortalece nuestras bases para el adecuado y excelente desarrollo de la
materia en cuestin. Agradecemos por esto la oportunidad de llevar a cabo este trabajo
puesto por el docente.







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