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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS


DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA
DISCIPLINA BIOQUMICA 4 BQ 004
MANUAL DE AULAS PRTICAS
Prof. L!" Do# S$%&o# G'(#
RECIFE
)00*
APRESENTAO
O objetivo deste manual tornar o aluno consciente da importncia das aulas prticas
para a sua orma!"o proissional# procurando envolv$%lo de orma mais eetiva# atravs da
aplica!"o de &uestionrios sobre cada aula prtica e'ecutada(
As ic)as de estudo tra*em inorma!+es &ue ajudam o aluno a entender a rela!"o
e'istente entre a prtica reali*ada e o tema te,rico correspondente( Alm das aulas prticas# o
manual contem um te'to sobre o tema de aula te,rica- ./nte0ra!"o e re0ula!"o do
metabolismo1( Este tema abran0ente e ser apresentado ao aluno na orma de painel
diri0ido( O manual ainda contem te'tos com e'emplos cl2nicos e temas sobre al0umas
doen!as relacionadas com o metabolismo celular# &ue ser"o apresentados pelos alunos na
orma de seminrios(
3onsiderando &ue o 3urso 4armac$utico um curso essencialmente prtico e &ue a
5io&u2mica uma disciplina bastante rida em seu conte6do# esperamos &ue os alunos
possam# com este manual# compreender mel)or os assuntos das aulas te,ricas atravs da
e'ecu!"o das prticas e da apresenta!"o dos seminrios sobre temas relacionados( /sso torna%
se imperioso# uma ve* &ue a 5io&u2mica uma disciplina undamental na orma!"o do
4armac$utico(
Nesta edi!"o estamos introdu*indo al0umas modiica!+es na metodolo0ia das prticas
e al0umas corre!+es no te'to(
Recie# 77 de maio de 899:
Pro( ;ev< dos Santos =uedes
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 8
>N?/3E
APRESENTAO (((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 8
7( 3intica de Rea!+es 3atalisadas por En*imas ((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( @
8( /nibi!"o de Rea!+es 3atalisadas por En*imas ((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( A
B( 3onsumo de =licose por 3lulas de Sacharomyces cerevisiae ((((((((((((((((((( 79
@( ?osa0em de Per,'idos de ;ip2deos ((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 7B
C( Eeito da =licose sobre a Pero'ida!"o de ;ip2deos ((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 7:
D( Eidr,lise de Prote2nas ((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 7A
:( ?osa0em de Fria no Plasma San0G2neo ((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 89
ESTF?OS ?/R/=/?OS ((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 88
PA/NE; ?/R/=/?O
7( /nte0ra!"o e Re0ula!"o Hetab,lica (((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 8@
8( Iuest+es Sobre o Tema /nte0ra!"o e Re0ula!"o Hetab,lica ((((((((((((((((((((((( BB
5/5;/O=RA4/A (((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( B@
B Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
CIN+TICA DE REA,-ES CATALISADAS POR EN.IMAS
OB/ETIVOS
A reali*a!"o desta prtica permite ao aluno-
7% Fma introdu!"o ao estudo da cintica de rea!+es catalisadas por en*imas
8% Hedir a velocidade de uma rea!"o en*imtica(
B% 3alcular a constante de Hic)aelis%Henten JK
H
L e a velocidade m'ima JM
m'
L e
destacar a importncia destes parmetros na caracteri*a!"o das en*imas(
@% 3onerir a importncia da e&ua!"o de ;ineNeaver%5urO no clculo de K
H
e M
m'
(
INTRODU,0O
3intica de rea!+es en*imticas
As en*imas desempen)am um papel de desta&ue no or0anismo vivo# uma ve* &ue
catalisam rea!+es bio&u2micas imprescind2veis ao desenvolvimento e manuten!"o das clulas(
A concentra!"o de uma en*ima em tecido ou luido biol,0ico pode ser determinada
medindo%se a velocidade da rea!"o catalisada pela en*ima( Para isso s"o utili*ados mtodos
anal2ticos &ue permitam medir a diminui!"o na concentra!"o do substrato ou o aumento na
concentra!"o do produto da rea!"o(
Huitos atores podem aetar a atividade en*imtica- concentra!"o do substrato#
temperatura# pE# concentra!"o de ativadores e inibidores# concentra!"o do produto( Todas
estas variveis podem e devem ser controladas# mas a presen!a de ativadores e inibidores em
sistemas biol,0icos nem sempre detectada e por isso n"o pode ser controlada( Por isso a
medida da atividade en*imtica n"o corresponde necessariamente P concentra!"o real da
en*ima( Para medir com precis"o a velocidade de uma rea!"o en*imtica necessrio &ue esta
velocidade se manten)a constante durante o e'perimento(
3om au'2lio da e&ua!"o de Hic)aelis%Henten poss2vel determinar o percentual da
velocidade de uma rea!"o en*imtica com uma dada concentra!"o de substrato# em rela!"o P
velocidade m'ima da rea!"o# ou seja# P velocidade obtida com uma concentra!"o de
substrato capa* de saturar toda a en*ima presente no meio da rea!"o( Assim# se em uma
rea!"o en*imtica or utili*ada uma concentra!"o de substrato correspondente a 89 ve*es o
valor do K
H
# a velocidade da rea!"o corresponder a QCR da M
m'
-
Admitindo &ue no inal da rea!"o 79R do substrato ten)a sido consumido# a
concentra!"o a0ora corresponder a 7A ve*es o valor do K
H
e a velocidade da rea!"o a Q@#:R
da M
m'
( A varia!"o da velocidade muito pe&uena e pode ser i0norada(
Na prtica esse problema torna%se mais comple'o uma ve* &ue a solubilidade do
substrato limitada e muitas ve*es as en*imas apresentam um K
H
alto( Nestes casos
aconsel)vel desenvolver a rea!"o en*imtica em um espa!o de tempo curto e repetir o
! 1 V
234
5S6 78
M
9 5S6: ! V
234
;00 1 )0 8
M
78
M
9 )0 8
M
:
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes @
e'perimento com o material &ue contem a en*ima# dilu2do# todas as ve*es em &ue mais de
79R do substrato or consumido na rea!"o(
Aplica!+es de en*imas nas anlises cl2nicas
Os con)ecimentos da en*imolo0ia v$m sendo aplicados no laborat,rio cl2nico para
medir a atividade de en*imas e a concentra!"o de substratos em tecidos ou luidos de
pacientes( En*imas como &ro2<=%$ e >?$#2=%$# associadas ao processo de coa0ula!"o
san0G2nea# bem como ?=>o>ro&@%$ ?=>$## envolvida com o processamento dos &uilom2cronsS
s"o e'emplos de en*imas espec2icas do plasma e por isso s"o encontradas em concentra!+es
mais elevadas( Nas doen!as de tecidos e ,r0"os pode )aver altera!+es na permeabilidade da
membrana# ou morte celular e com isso# en*imas dos tecidos diundem%se para o plasma(
Essas en*imas# normalmente est"o presentes em bai'as concentra!+es e n"o t$m nen)um
papel uncional no plasma(
No dia0n,stico do envolvimento de um ,r0"o espec2ico numa doen!a# seria ideal se
as en*imas particulares para cada ,r0"o pudessem ser identiicadas( /sso improvvel por&ue
os processos metab,licos de vrios ,r0"os s"o muito semel)antes( Embora e'istam poucas
en*imas espec2icas para um determinado ,r0"o ou tecido# como a 3?Aoo? (#=(roB%$# do
20ado e a fo#f$&$# 3A=($ da pr,stata# o estudo da cintica do aparecimento e
desaparecimento de en*imas particulares no plasma# permite &ue o dia0n,stico do
envolvimento de um ,r0"o espec2ico seja eito(
Estudos da cintica de libera!"o de en*imas card2acas no soro# ap,s um enarte do
miocrdio# permitem estabelecer &uando o ata&ue ocorreu e se o tratamento eetivo( A
concentra!"o plasmtica de Ar$&=%$ fo#foA=%$# J3PKL# aumenta cerca de seis ve*es# entre o
primeiro e o se0undo dia ap,s o enarteS en&uanto a ?$A&$&o (#=(roB%$# J;?EL e a
CD=(ro4=<'&@r=Ao (#=(roB%$# JE5?EL# aumentam cerca de duas ve*es# de orma mais
lenta# mas permanecem elevadas por mais tempo(
Entre as en*imas utili*adas com re&G$ncia no dia0n,stico de doen!as podemos
relacionar# alm da&uelas citadas acima# fo#f$&$# $?A$?=%$# $2=?$## ?=>$## $#>$r&$&o
$?$%=%$ $2=%o &r$%#fr$### estas duas 6ltimas# tambm con)ecidas como transaminase
0lutmico o'aloactica JT=OL e transaminase 0lutmico pir6vica JT=PL# respectivamente(
O recon)ecimento dos metab,litos &ue se acumulam em luidos biol,0icos# tem um
papel importante na identiica!"o de poss2veis deeitos na produ!"o ou na atividade de
en*imas( 3omo e'emplo temos a acid6ria or,tica )ereditria# devida P deici$ncia de duas
en*imas envolvidas com a via de bioss2ntese de pirimidinas Jorotato osoribosil transerase e
orotidinaL# 0erando um ac6mulo de cido or,tico( A )iperuricemia um outro e'emplo de
aumento de metab,lito# devido a deici$ncia na produ!"o da en*ima D=>o4$%&=%$CB'$%=%$C
fo#forr=<o#=?&r$%#fr$#(
En*imas s"o utili*adas como rea0entes &u2micos em analisadores cl2nicos portteis(
?osa0em de colesterol# triacil0licer,is# 0licose# podem ser reali*ados em poucos minutos#
usando 79; de plasma( A &u2mica cl2nica moderna tem se beneiciado da uni"o entre a
&u2mica e a imunolo0ia( Anticorpos espec2icos contra um ant20eno protico s"o acoplados a
uma en*ima indicadora# como pero'idase de rai* orte JhorseradishL# 0erando um ensaio
muito espec2ico e sens2vel( Esse ensaio con)ecido como E;/SA Jnzyme-?inked
immunoad#orbent $ssayL( Fm e'emplo de sua utili*a!"o demonstrado por um ensaio para
identiica!"o dos ant20enos proticos da capa do !@r'# ($ =2'%o(f=A=E%A=$ D'2$%$ JE/ML#
&ue 0era a #@%(ro2 ($ =2'%o(f=A=E%A=$ $(F'=r=($ JA/?SL(
A identiica!"o de isoen*imas T en*imas &ue catalisam a mesma rea!"o# mas mi0ram
dierentemente em um campo eletroortico T tambm tem sido usada para dia0n,stico
cl2nico( E'emplos de isoen*imas &ue t$m ampla aplica!"o cl2nica-
C Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
7L Cr$&=%$ fo#foA=%$# T um d2mero com dois tipos de subunidades# H JmuscularL e
5 JcerebralL( No m6sculo es&ueltico as duas subunidades s"o do tipo H( No crebro as duas
unidades s"o do tipo 5( Somente no miocrdio se encontra a isoen*ima contendo as duas
subunidade H e 5( Nos outros tecidos s"o encontradas &uantidades variveis de isoen*imas
HH e 55( ?e acordo com a mobilidade para o nodo# na eletroorese# essas isoen*imas s"o
denominadas 3PK
7
J55L# 3PK
8
JH5L e 3PK
B
JHHL(
8L L$A&$&o (#=(roB%$## uma en*ima tetramrica contendo apenas duas
subunidades dierentes- E# para o cora!"o e H# para o m6sculo es&ueltico( S"o identiicadas
cinco ormas dessas isoen*imas- ;?E
7
JEEEEL e ;?E
8
JEEEHL# encontradas no miocrdio
e nos eritr,citosS ;?E
B
JEEHHL# no crebro e rimS ;?E
@
JEHHHL e por im ;?E
C
JHHHHL# encontradas no 20ado e m6sculo es&ueltico(
E#&r>&oA=%$## uma mistura de en*imas obtida de um streptococcus# utili*ada para
a remo!"o de co0ulos san0G2neos# atravs da ativa!"o do plasmino0$nio# a orma inativa da
plasmina# no plasma( Fma outra aplica!"o de en*imas como a0entes terap$uticos a
utili*a!"o da $#>$r$B=%$#( Al0umas clulas leuc$micas parecem perder a capacidade de
sinteti*ar aspara0ina( ?essa orma# a aspara0inase inibe o crescimento de clulas tumorais#
redu*indo os n2veis plasmticos de aspara0ina do )ospedeiro(
Na ind6stria armac$utica# en*imas li0adas a matri*es insol6veis Jen*imas
imobili*adasL s"o utili*adas como reatores &u2micos altamente espec2icos( Por e'emplo# C
B$?$A&o#=($# utili*ada para redu*ir o conte6do de lactose no leite(
FUNDAMENTO DA PRTICA
Nesta prtica utili*aremos a en*ima urease Juria amido)idrolase# E3 B(C(7(CL( Esta
en*ima apresenta uma alta especiicidade para o substrato uria JNE
8
3O%NE
8
L#
transormando%o em amon2aco JNE
@
U
L e carbonato JE3O
B
%
L# em meio cido-
NG
)
COCNG
)
9 )G
)
O 9 G
9
111111111H )NG
4
9
9 GCO
I
C
A medida da atividade en*imtica pode ser determinada medindo%se a diminui!"o na
concentra!"o de uria ou o aumento de amon2aco ou carbonato ormado(
Neste e'perimento utili*aremos a rea!"o proposta por 5ert)elot para determinar os
n2veis de amon2aco ormado( Em meio alcalino# amon2aco transormado em amVnia JNE
B
L e
rea0e com um derivado en,lico JsalicilatoL na presen!a de )ipoclorito de s,dio produ*indo
um composto de cor a*ul# o indoenol# cuja intensidade proporcional P concentra!"o de
amVnia( Nitroprussiato de s,dio utili*ado como catalisador desta rea!"o(
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes D
UREASE
PROCESSO
/dentiicar sete tubos de ensaio- 5ranco J5L e mais seis tubos enumerados de 7 a D e
se0uir a orienta!"o abai'o-
TF5OS W=FA ?E/ON/XA?A SF5STRATO JFRY/AL
A#CDR AC#Dm0R
ENX/HA JFREASEL
J8DA FZmlL
5 9#@ m; % % 7#9 m;
7 9#B m; 9#7 m; % 7#9 m;
8 9#8 m; 9#8 m; % 7#9 m;
B % 9#@ m; % 7#9 m;
@ 9#B m; % 9#7 m; 7#9 m;
C 9#8 m; % 9#8 m; 7#9 m;
D % % 9#@ m; 7#9 m;
7% /ncubar todos os tubos em ban)o%maria J5HL a B:[3 por C minutos Jesta a rea!"o
en*imticaL(
8% Adicionar a cada tubo 7#9 m; da solu!"o o'idante J)idr,'ido de s,dio 8#A mH e
)ipoclorito de s,dio 787 mHL# misturar e levar ao 5H a B:[3 por C minutos((
B% ;er as absor!+es ,pticas em D99 nm# utili*ando o branco para ajustar o *ero do
espectrootVmetro(
CLCULO DA ATIVIDADE EN.IMTICA
3onstruir um 0rico contendo no ei'o das abcissas as concentra!+es do substrato \S]
J9#7S 9#8S 9#@S 7#9S 8#9 e @#9 mHL^ e no ei'o das ordenadas a leitura das absor!+es JvL(
3onstruir um novo 0rico contendo nos ei'o das abscissas# 7Z\S] e nas ordenadas# 7Zv(
3alcular K
H
e M
m'
(
OBSERVA,0O
A urease J8DA FZmlL est dissolvida com tamp"o osato 79 mH# pE D#QS salicilato de
s,dio B7#8 mH e nitroprussiato de s,dio 7#DA mH(
^ %3onsiderando &ue 9#7ml da solu!"o de uria# a A#CDR# contem A#CD _0 de uria(
%3onsiderando# ainda# &ue essa massa do substrato est dissolvida em um volume inal
Jvolume dos rea0entesL de 7#@ml(
%Em 7999ml da prepara!"o teremos D#77m0 de uria# cuja massa molecular D9#9D daltons(
%D#77 m0ZD9#9Dm0 por litro corresponde# apro'imadamente# a uma concentra!"o 9#7mH(
: Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
INIBI,0O DE REA,-ES CATALISADAS POR EN.IMAS
OB/ETIVOS
A reali*a!"o desta prtica permite ao aluno-
7% /dentiicar o eeito de inibidores sobre a velocidade de uma rea!"o en*imtica(
8% 3onerir a importncia do 0rico duplo rec2proco# proposto por ;ineNeaver%5urO#
na identiica!"o do tipo de inibidor de uma rea!"o en*imtica(
INTRODU,0O
Holculas dierentes do substrato podem intera0ir com a en*ima levando a uma
redu!"o de sua atividade( O estudo da inibi!"o en*imtica de interesse# por&ue revela
inorma!+es acerca do mecanismo de a!"o da en*ima( Huitas substncias t,'icas# incluindo
dro0as# e'pressam sua a!"o no or0anismo atravs da inibi!"o de en*imas(
A inibi!"o revers2vel descrita pelo e&uil2brio da intera!"o en*ima inibidor( Os
processos de inibi!"o en*imtica podem ser classiicados como Ao2>&=&=!o %Jo
Ao2>&=&=!o# dependendo da orma como o inibidor a0e sobre a en*ima( O inibidor
competitivo# 0eralmente tem uma estrutura semel)ante P do substrato e pode li0ar%se ao s2tio
ativo da en*ima# mas n"o pode ser transormado( Fm inibidor n"o competitivo n"o se li0a no
s2tio ativo da en*ima# mas li0a%se em outra re0i"o da molcula en*imtica e impede &ue a
en*ima recon)e!a o substrato(
Para distin0uir cineticamente# os dois processos de inibi!"o en*imtica# aplica%se o
0rico proposto por ;ineNeaver%5urO aos resultados obtidos e'perimentalmente( A en*ima#
numa concentra!"o constante# rea0e com concentra!+es crescentes do substrato na aus$ncia
do inibidor e em um se0undo e'perimento a en*ima rea0e com o substrato em concentra!+es
crescentes na presen!a do inibidor(
FUNDAMENTO DA PRTICA
A reali*a!"o desta prtica muito semel)ante P anterior( Ftili*aremos a en*ima urease
Juria amido)idrolase# E3 B(C(7(CL# em presen!a do substrato T uria T mas utili*aremos
cloreto de merc6rio JE03l
8
L como inibidor da en*ima(
PROCESSO
/dentiicar sete tubos de ensaio- 5ranco J5L e mais seis tubos enumerados de 7 a D e
se0uir a orienta!"o abai'o-
TF5OS W=FA
?E/ON/XA?A
/N/5/?OR
JE03l
8
9#9CRL
SF5STRATO JFRY/AL
A#CDm0R AC#Dm0R
ENX/HA
JFREASEL
J8DA FZmlL
5 9#@ m; 9#7m; % % 7#9 m;
7 9#B m; 9#7m; 9#7 m; % 7#9 m;
8 9#8 m; 9#7m; 9#8 m; % 7#9 m;
B % 9#7m; 9#@ m; % 7#9 m;
@ 9#B m; 9#7m; % 9#7 m; 7#9 m;
C 9#8 m; 9#7m; % 9#8 m; 7#9 m;
D % 9#7m; % 9#@ m; 7#9 m;
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes A
7% /ncubar todos os tubos em ban)o%maria J5HL a B:[3 por C minutos Jesta a rea!"o
en*imticaL(
8% Adicionar a cada tubo 7#9 m; da solu!"o o'idante J)idr,'ido de s,dio 8#A mH e
)ipoclorito de s,dio 787 mHL# misturar e levar ao 5H a B:[3 por C minutos((
B% ;er as absor!+es ,pticas em D99 nm# utili*ando o branco para ajustar o *ero do
espectrootVmetro(
CLCULO DA ATIVIDADE EN.IMTICA
3onstruir um 0rico contendo no ei'o das abcissas as concentra!+es do substrato \S]
J9#7S 9#8S 9#@S 7#9S 8#9 e @#9 mHL e no ei'o das ordenadas a leitura das absor!+es JvL# deste
e'perimento e dos valores da prtica anterior(
3onstruir um novo 0rico contendo nos ei'o das abcissas 7Z\S] e nas ordenadas 7Zv(
3alcular K
H
e M
m'
# com os valores obtidos nesta prtica e na prtica anterior(
3om os resultados# deinir o tipo de inibi!"o do cloreto de merc6rio sobre a urease(
Q Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
CONSUMO DE GLICOSE POR C+LULAS DE Sacharomyces cerevisiae
OB/ETIVOS
7% ?emonstrar o consumo de 0licose pelas clulas(
8% ?eterminar os n2veis de 0licose utili*ando uma tcnica espectrootomtrica(
INTRODU,0O
S. cerevisiae s"o or0anismos unicelulares# pertencentes P classe dos ascomicetes
Jasco` ,r0"o produtor de esporosL e 0$nero Sacaromicete# utili*ados em lar0a escala na
produ!"o de lcool e bebidas ermentadas e tambm na paniica!"o( Essas leveduras est"o
entre os mais importantes un0os domesticados e metaboli*am a 0licose 0erando etanol e
di,'ido de carbono( O p"o assado ad&uire uma te'tura suave# devido a orma!"o de bol)as de
di,'ido de carbono na massa(
Para este e'perimento poder2amos utili*ar as )emcias( Nos mam2eros# a )emcia
madura n"o contem n6cleo# nem mitocVndrias# nem ribossomos e por isso n"o capa* de
desempen)ar as mesmas atividades metab,licas das clulas nucleadas( No entanto# o 0an)o de
ener0ia na )emcia a*%se# undamentalmente# pela B?=AK?=#( Essa ener0ia utili*ada na
manuten!"o das condi!+es osm,ticas# da orma disc,ide e do erro no estado erroso( A
0licose desaparece rapidamente no san0ue# &uando dei'ado ora dos vasos san0G2neos e
nessas condi!+es ) um aumento nos n2veis de cido lctico(
Na prtica do laborat,rio cl2nico# o san0ue col)ido para a dosa0em de 0licose deve ter
o plasma separado imediatamente das )emcias# ou ao san0ue total acrescenta%se luoreto &ue
um inibidor da enolase# en*ima &ue catalisa a se0uinte rea!"o na via 0licol2tica-
8%oso0licerato osoenolpiruvato U E
8
O
Este e'perimento nos permite avaliar o consumo de 0licose# in vitro# medindo a
redu!"o nos n2veis de 0licose com o tempo de incuba!"o(
SUSPENS0O DE C+LULAS DE Sacharomyces cerevisiae
?issolver 7C0 de clulas em 799 m; de solu!"o isiol,0ica tamponada# pE :#@ JP5SL(
PROCESSO
Preparar tr$s tubos de ensaio# identiicados com os n6meros 9# C e 79# respectivamente e
proceder conorme es&uema-
7% Adicionar a cada tubo 9#Cm; da suspens"o de clulas U 9#8m; da solu!"o de 0licose a
79R U 7#9m; de P5S(
8% /ncubar os tubos C e 79 em ban)o%maria a B:
o
3# por C e 79 min# respectivamente(
OBS. Para utili*ar o HYTO?O ?E ?OSA=EH IF>H/3A se0uir o item B( Para dosa0em
pelo HYTO?O ?E ?OSA=EH ENX/HWT/3A se0uir a metodolo0ia# adiante(
B% Transerir al2&uotas de 9#8 m; Jem duplicataL dos tubos 9# C e 79 para tubos de centr2u0a#
previamente identiicados J9a e 9b# Ca eCb# 79a

e 79bL# contendo 7#A m; de cido
tricloroactico JT3AL# a 79R( ?ei'ar os tubos em repouso por 79 min# a0itando%os
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 79
esporadicamente e centriu0ar a B999 rpm por C minutos( Transerir# por decanta!"o# o
sobrenadante para tubos limpos# previamente identiicados J9a e 9b# etcL# &ue ser
utili*ado na dosa0em dos n2veis de 0licose# pelo mtodo de dosa0em &u2mica(
M+TODO PARA DOSAGEM DE GLICOSE
7 T Htodo de dosa0em &u2mica
F'%($2%&o % O 0rupamento amino da orto%toluidina rea0e com o 0rupamento alde2do da
0licose# em solu!"o de cido actico 0lacial a &uente e d ori0em a um composto de cor
verde# estvel( A intensidade de cor proporcional P concentra!"o de 0licose na amostra e sua
estabilidade depende do e&uil2brio entre uma 0licosilamina J%NE%3EOE%L e a base de Sc)i
J%N`3E%L correspondente(
So?'LJo >$(rJo ( B?=Ao# % 799m0 de 0licose em 799 m; de solu!"o( Para a dosa0em diluir
a solu!"o padr"o 7-79 com 0ua destilada(
Do#$B2 ( B?=Ao# % /dentiicar nove tubos J5# P7# P8# 9a# 9b# Ca# Cb# 79a

e 79bL % 5ranco#
Padr+es e Testes(
Transerir 7 m; de cada sobrenadante l2mpido para os respectivos tubos de ensaio
previamente identiicados(
Adicionar a cada tubo-
TF5O SO;FO
PA?RO ?/;F>?A
TESTES
J9a# 9b# Ca# Cb#
79a e 79bL
W=FA
?EST/;A?A
REA=ENTE ?A
ORTO%TO;F/?/NA
Padr+es 7 m; % % B#C m;
Testes % 7 m; % B#C m;
5ranco % % 7 m; B#C m;
A&uecer os tubos em ban)o%maria ervente por 79 minutos e resri%los em 0ua
corrente(
;er as densidades ,pticas J?OL da solu!"o em cada tubo# no espectrootVmetro em
DB9 nm( Ajustar o *ero do aparel)o com o 5ranco(
3alcular a concentra!"o de 0licose em cada amostra e e'pressar os valores em m0R(
3onstruir um 0rico das ?O em un!"o do tempo de incuba!"o(
3ON3;FSaES-
8% Htodo de dosa0em en*imtica
F'%($2%&o % ?uas en*imas est"o envolvidas neste processo- B?=Ao# o4=($## &ue a0e sobre
a 0licose e 0era cido lic!nico e "er#$ido de hidro%nio( E >ro4=($## &ue utili*a o
per,'ido de )idro0$nio como a0ente o'idante para transormar &-aminoanti"irina e fenol em
77 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
anti"iril'uinonimina e ua( Antipiril&uinonimina um composto colorido &ue absorve em
C9C nm( A intensidade de cor proporcional P &uantidade de per,'ido de )idro0$nio 0erado
na primeira rea!"o(
Do#$B2 ( B?=Ao# % /dentiicar nove tubos J5# P7# P8# 9a# 9b# Ca# Cb# 79a

e 79bL % 5ranco#
Padr+es e Testes(
Transerir al2&uotas de 9#9C m; para os respectivos tubos de ensaio previamente identiicados-
TF5O SO;FO
PA?RO J799m0
RL
TESTES
J9a# 9b# Ca# Cb#
79a e 79bL
W=FA
?EST/;A?A
REA=ENTE
Padr+es 9#9C m; % % 8#C m;
Testes % 9#9C m; % 8#C m;
5ranco % % 9#9C m; 8#C m;
Histurar e incubar em ban)o%maria a B:[3 durante 7C minutos(
O n2vel de 0ua do ban)o deve ser superior ao n2vel da mistura em cada tubo de
ensaio(
;er as densidades ,pticas J?OL da solu!"o em cada tubo# no espectrootVmetro em
C9C nm( Ajustar o *ero do aparel)o com o 5ranco(
3alcular a concentra!"o de 0licose em cada amostra e e'pressar os valores em m0R(
3onstruir um 0rico das concentra!+es de 0licose em un!"o do tempo de incuba!"o(
3ON3;FSaES-
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 78
DOSAGEM DE PERMIDOS DE LIPDEOS
OB/ETIVOS
A reali*a!"o desta prtica permite ao aluno determinar os n2veis de substncias &ue
rea0em com o cido tiobarbit6rico em clulas de Sacharomyces cerevisiae e avaliar o 0rau da
pero'ida!"o dos lip2deos(
INTRODU,0O
A pero'ida!"o de lip2deos um processo comple'o onde cidos 0ra'os insaturados e
outros lip2deos s"o o'idados por a!"o dos radicais livres( Para entender a reatividade destas
espcies &u2micas# devemos lembrar &ue os eltrons# nas molculas# 0eralmente se re6nem em
pares( Na molcula de 0ua# por e'emplo# o o'i0$nio se apresenta rodeado por &uatro pares
de eltronsS dois pares se li0am racamente em uni+es OE e dois pares n"o est"o li0ados-
Para descrever completamente um eltron em um tomo devemos considerar# alm dos
seus n6meros &unticos % JprincipalL# l JsecundrioL e 2
l
# um &uarto n6mero &untico 2
#
#
c)amado n6mero &untico de spinS &ue est associado com a rota!"o do eltron em torno do
seu pr,prio ei'o e

pode ter um dos dois valores poss2veis- U b ou % b # dependendo da dire!"o
da rota!"o do eltron( ?ois eltrons em um mesmo orbital com valores de 2
#
U b ou % b s"o
ditos emparelhados( U2 >$r ?&rN%=Ao O 2$=# #&3!? (o F' o# ?O&ro%# =#o?$(o#P '2$
!Q F'P $>$r%&2%&P (o=# ?O&ro%# Ao2 #>=%# o>o#&o# &E2 #'# A$2>o# 2$B%O&=Ao#
rA@>roAo# $%'?$(o#.
Radicais livres podem ser deinidos como tomos# molculas ou ra0mento molecular
com# pelo menos# um eltron desemparel)ado( A presen!a do eltron desemparel)ado# em
0eral# conere ao radical livre alta reatividade &u2mica e# ainda# certas propriedades como
caracter2sticas parama0nticas( Para restaurar sua estabilidade estas espcies &u2micas tendem
a retirar um eltron de outra substncia ou doar o seu eltron desemparel)ado( 3om isso
podem 0erar novos radicais livres# numa rea!"o em cadeia(
No or0anismo vivo a produ!"o de radicais livres permanente# mas esta produ!"o est
associada ao metabolismo celular do o'i0$nio e Ps rea!+es de ,'ido%redu!"o( Entre as ontes
0eradoras de radicais livres destacam%se-
A A$(=$ r#>=r$&Kr=$ 2=&oAo%(r=$? % A mitocVndria considerada a .casa de or!a1 da
clula# a2 se encontra um comple'o sistema de transer$ncia de eltrons# con)ecido como
3adeia Transportadora de Eltrons J3TEL( A un!"o deste sistema redu*ir o o'i0$nio ao
mesmo tempo em &ue 0era ener0ia# &ue arma*enada sob a orma de ATP( Embora os
eltrons sejam transeridos aos pares# os citocromos inte0rantes da 3TE s, transerem um
eltron de cada ve*( Iuando uma molcula de o'i0$nio recebe um eltron transormada no
nion super,'ido JO
8
%.
L % um radical livre( 3erca de CR do nion super,'ido# 0erado no
processo de redu!"o do o'i0$nio# pode ser liberado da 3TE e# por dismuta!"o# 0era per,'ido
de )idro0$nio JE
8
O
8
L(
Os radicais livres derivados da redu!"o do o'i0$nio s"o os produtos isiol,0icos
potencialmente mais peri0osos# 0erados a partir da respira!"o celular(
7B Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
A f$BoA=&o# % Em estado de repouso os neutr,ilos consomem pouco o'i0$nio( Em
contato com part2culas a serem a0ocitadas# eles produ*em uma inva0ina!"o de sua
membrana# encerrando assim o material a destruir Ja0ossomaL# isolando%o do citoplasma(
Essa estimula!"o dos neutr,ilos acompan)ada de uma acelera!"o no consumo de o'i0$nio
J.c)o&ue respirat,rio1L# com ativa!"o de uma en*ima de membrana % a NA?PE%o'idase % &ue
catalisa a redu!"o do o'i0$nio# 0erando o nion super,'ido# &ue por dismuta!"o 0era
per,'ido de )idro0$nio(
Estes dois a0entes o'idantes JO
8
%.
e E
8
O
8
L participam da produ!"o de espcies
&u2micas ativas# como o radical )idro'il JOE
.
L e na libera!"o de )ipoclorito e de cloraminas#
sob a inlu$ncia de uma en*ima leucocitria# a mielopero'idase( Este conjunto de rea0entes
a0ressivos Jnion super,'ido# per,'ido de )idro0$nio# )ipoclorito e cloraminasL liberados nos
a0ossomas s"o responsveis pela destrui!"o do material a0ocitado( Na aus$ncia de NA?PE%
o'idase# a atividade a0ocitria torna%se diminu2da ou mesmo abolida(
A# r$LR# ( (#=%&o4=A$LJo % Os pero'issomos s"o or0anelas celulares &ue
desempen)am um papel importante na desinto'ica!"o de numerosas molculas( Fma
variedade de substncias t,'icas s"o absorvidas com re&G$ncia atravs do trato
0astrointestinal# ou s"o produ*idas a partir do metabolismo celular( Estas substncias podem
sorer modiica!+es em sua estrutura &u2mica Jo processo de desinto'ica!"oL e em se0uida
devem ser e'cretadas# sobre tudo# pela urina(
Os mecanismos de desinto'ica!"o utili*ados no 20ado s"o diversiicados# envolvendo
o'ida!"o# redu!"o# )idr,lise# conju0a!"o# ou uma combina!"o destes mecanismos( Em 0eral#
a o'ida!"o o primeiro dos mecanismos utili*ados# se0uido Ps ve*es de rea!"o de
conju0a!"o(
A desinto'ica!"o por o'ida!"o# implica na )idro'ila!"o# &ue catalisada por um
sistema .o'idase de un!"o mista1 presente nos pero'issomos( Este sistema constitu2do de
uma )idro'ilase# citocromos P
@C9
# NA?PE# erredo'ina e 4A?( Neste sistema o citocromo P
@C9
transere um eltron# de cada ve*# para o o'i0$nio molecular# o &ue avorece a produ!"o de
nions super,'ido e per,'ido de )idro0$nio( Este 6ltimo desdobrado a 0ua e o'i0$nio pela
catalase# presente nessas or0anelas(
A #@%&# ( >ro#&$B?$%(=%$# % As prosta0landinas# como a prostaciclina e o trombo'ano
A
8
# t$m sua ori0em no cido ara&GidVnico# liberado dos osolip2deos inte0rantes de
membrana# por a!"o da osolipase A
8
(
Os radicais )idro'il s"o 0erados no processo de s2ntese das prosta0landinas# na ase de
transorma!"o do cido ara&GidVnico a endoper,'idos# por a!"o da cicloo'i0enase(
Estes radicais livres interv$m secundariamente sobre a cascata do cido ara&GidVnico#
inibindo a cicloo'i0enase e promovendo a via metab,lica pr,%a0re0ante do trombo'ano A
8
sobre a via anti%a0re0ante e vasodilatadora da prostaciclina(
A# r$(=$LR# % Raios 0ama e raios%c s"o e'emplos de radia!+es ioni*antes( Iuando uma
molcula colide com essas radia!+es absorve ener0ia e pode emitir eltrons com alto n2vel
ener0tico(
O material celular est undamentalmente distribu2do em uma ase a&uosa( A
transer$ncia da ener0ia para a molcula de 0ua e'cita os eltrons constituintes e 0era uma
molcula de 0ua e'citada Jcom um e'cedente de ener0ia# comparada com sua ener0ia
normalL( A conse&G$ncia mais provvel deste evento uma ioni*a!"o# como se0ue-
J7L H
2
O H
2
O
+
+ e
-
J8L H
2
O
+
+ H
2
O H
2
O
+
+ OH
.
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 7@
ambas as espcies JE
8
O
U
e OE
.
L t$m um eltron desemparel)ado# s"o radicais livres e por isso
s"o espcies e'tremamente reativas( Outras espcies reativas podem ser 0eradas(
O eltron da rea!"o J7L % eltron )idratado % pode rea0ir com o'i0$nio presente na
clula e 0erar nion super,'ido( Admite%se &ue cerca de 79
%C
se0undo o tempo decorrido
entre a a!"o inicial dos radicais sobre os constituintes em uma solu!"o e a orma!"o de
produtos( Male ressaltar# no entanto# &ue essas espcies reativas t$m um tempo de a!"o muito
curto( Eltrons produ*idos na rea!"o J7L perdem sua ener0ia para as espcies &u2micas do
meio# em uma escala de tempo da ordem de 79
%7B
a 79
%77
se0undo(
Iuando uma molcula absorve um ,ton de lu* ultravioleta# cuja ener0ia inerior P
sua ener0ia de ioni*a!"o# ela dever se e'citar( Se a ener0ia arma*enada or suiciente# pode
)aver ruptura de li0a!+es e produ!"o de radicais livres por diversos mecanismos(
Os tecidos mais suscet2veis ao eeito dessas radia!+es s"o a pele e sobretudo os ol)os#
devido P sua e'posi!"o direta e P intensidade de seu metabolismo( ?e orma 0eral# os radicais
livres e'ercem vrios eeitos citot,'icos# envolvendo# virtualmente todos os componentes
celulares( S"o capa*es de promover eventual destrui!"o de estruturas e tecidos# causando
doen!as 0enticas# 0entico ambientais e ambientais# a e'emplo da arteriosclerose#
)ipertens"o# cncer# osteoartrite# entre outras# alm da libera!"o de uma variedade de produtos
de de0rada!"o como cetonas# lcoois# alde2dos e steres# propa0ando%se pela circula!"o( As
membranas biol,0icas de um modo 0eral# oerecem um rico meio para o ata&ue pero'idativo
&ue interere na inte0ridade das clulas(
Halondialde2do JH?AL# ormado a partir da &uebra de cidos 0ra'os poliinsaturados#
identiicado como o principal produto da pero'ida!"o de lip2deos e serve como 2ndice
determinante da e'tens"o da rea!"o pero'idativa( O H?A rea0e com o cido tiobarbit6rico
JT5AL produ*indo um pi0mento de cor avermel)ada &ue absorve em comprimento de onda de
CBC nm( O pi0mento ormado resultado da condensa!"o de 8 moles de T5A com 7 mol de
H?A( Esta rea!"o n"o espec2ica para &uantiicar H?A# uma ve* &ue e'istem outras
substncias &ue rea0em com o T5A JT5ARSL# mas vem sendo amplamente utili*ada para
avaliar o 0rau de pero'ida!"o de lip2deos(
DOSAGEM DE TBARS
Htodo de 5ue0e dA e Aust S? JMethods in (nzymoloy C8-B98%B79# 7Q:AL
REA=ENTE- Solu!"o de T5A 9#B:CR em cido tricloroactico JT3AL a 7CR
PRO3ESSO-
/dentiicar &uatro tubos de ensaio- 9# C# 79 e 89(
A cada tubo adicionar 7#9 m; de suspens"o de clulas de S( cerevisiae(
/ncubar os tubos respectivos por C# 79 e 89 minutos a B:
o
3 e em se0uida transerir o
conte6do de cada tubo para tubo de centr2u0a contendo 7#9 m; de T3A a B9R(
A suspens"o do tubo 9 n"o ser incubada a B:f 3# mas deve ser transerida para tubo de
centr2u0a contendo 7#9 m; de T3A a B9R(
?epois de transerir as amostras para tubos de centr2u0a contendo T3A a B9R ?ei'a%las em
repouso por um tempo m2nimo de79 min# misturando esporadicamente(
3entriu0ar todos os tubos a B999 rpm por C min e transerir o sobrenadante l2mpido para
tubos previamente identiicados- 9# C# 79 e 89(
Preparar mais dois tubos J5ranco e Padr"oL( Ao 5ranco adicionar 7#9 m; de 0ua destilada e
ao Padr"o# 9#7 m; da solu!"o padr"o de H?A JB8#78nmolZm;L U 9#Q de 0ua destilada(
7C Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
Adicionar a todos os tubos 8#9 m; da solu!"o rea0ente# a0itar e levar ao ban)o ervente por
7C min(
Esriar os tubos em 0ua corrente e a*er a leitura da absor!"o ,ptica em CBCnm(
3alcular a concentra!"o J_HL de T5ARS em cada e'perimento# considerando &ue-
Hassa do padr"o JB#878nmolL ?Opadr"o
Hassa da amostra J ' nmol L ?Oamostra
9#Q ml de suspens"o de S. cereviseae ' nmol de T5ARS
;an!ar os resultados em um 0rico Jconcentra!"o vs tempoL e comparar com os resultados
obtidos no pr,'imo e'perimento(
O5S(- ?O T ?ensidade ,ptica
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 7D
EFEITO DA GLICOSE SOBRE A PEROMIDA,0O DE LIPDEOS
OB/ETIVOS
7% Recon)ecer o malondialde2do como produto da pero'ida!"o dos lip2deos(
8% /dentiicar o eeito da 0licose sobre a pero'ida!"o dos lip2deos(
INTRODU,0O
Halondialde2do JH?AL um produto da pero'ida!"o dos lip2deos nos diversos
tecidos e est presente no plasma san0G2neo( Pes&uisas t$m mostrado &ue os n2veis de H?A
plasmtico aumentam com a idade( Esse composto muito reativo e tem 0rande ainidade por
0rupamentos amino# o &ue pode avorecer sua li0a!"o com as prote2nas da membrana das
clulas# comprometendo sua pereita un!"o( Na prtica anterior pudemos acompan)ar a
produ!"o de per,'idos de lip2deos medindo os n2veis de T5ARS em clulas de S. cerevisiae
submetidas ao estresse o'idativo( Nesta prtica vamos avaliar os n2veis de T5ARS em clulas
de S. cerevisiae com suprimento de 0licose# como onte de ener0ia(
PROCESSO
/dentiicar &uatro tubos de ensaio- 9# C# 79 e 89(
A cada tubo adicionar 9#Q m; de suspens"o de clulas de S( cerevisiae U 9#7 m; da solu!"o de
0licose a 79R(
/ncubar os tubos respectivos por C# 79 e 89 minutos a B:
o
3 e em se0uida transerir o
conte6do de cada tubo para tubo de centr2u0a contendo 7#9 m; de T3A a B9R(
A suspens"o do tubo 9 n"o ser incubada a B:f 3# mas deve ser transerida para tubo de
centr2u0a contendo 7#9 m; de T3A a 79R(
?epois de transerir as amostras para tubos de centr2u0a contendo T3A a 79R ?ei'a%las em
repouso por um tempo m2nimo de79 min# misturando esporadicamente(
3entriu0ar todos os tubos a B999 rpm por C min e transerir o sobrenadante l2mpido para
tubos previamente identiicados- 9# C# 79 e 89(
Preparar mais dois tubos J5ranco e Padr"oL( Ao 5ranco adicionar 7#9 m; de 0ua destilada e
ao Padr"o# 9#7 m; da solu!"o padr"o de H?A U 9#Q de 0ua destilada(
Adicionar a todos os tubos 8#9 m; da solu!"o rea0ente# a0itar e levar ao ban)o ervente por
7C min(
Esriar os tubos em 0ua corrente e a*er a leitura da absor!"o ,ptica em CBCnm(
3alcular a concentra!"o J_HL de T5ARS em cada e'perimento# considerando &ue-
Hassa do padr"o JB#878nmolL ?Opadr"o
Hassa da amostra J ' nmol L ?Oamostra
9#Q ml de suspens"o de S. cereviseae ' nmol de T5ARS
;an!ar os resultados em um 0rico Jconcentra!"o vs tempoL e comparar com os resultados
obtidos no e'perimento anterior(
3ON3;FSaES-
7: Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
GIDRLISE DE PROTENAS
OB/ETIVOS
7% /dentiicar os aminocidos como unidade undamental das prote2nas
8% Acompan)ar a )idr,lise de prote2nas por a&uecimento em meio cido(
INTRODU,0O
Todas as prote2nas na nature*a t$m como unidade undamental vinte %aminocidos e
s"o constru2das atravs de li0a!+es amida entre estes aminocidos( Iuando isolados das
prote2nas os aminocidos apresentam caracter2sticas estruturais comuns# &ual seja um 0rupo
carbo'ila e um 0rupo amino li0ados ao carbono ( O &ue distin0ue estes compostos &uanto Ps
suas caracter2sticas 2sicas# &u2micas e biol,0icas o 0rupo R# lateral# &ue 6nico para cada
aminocido( Y undamental &ue se estabele!a mtodos prticos usados na separa!"o e
identiica!"o destes compostos# uma ve* &ue a estrutura e un!+es biol,0icas de uma prote2na
depende do seu conte6do em aminocidos(
Iuando prote2nas s"o a&uecidas em um meio a&uoso# cido ou bsico# as li0a!+es
amida sorem )idr,lise liberando os aminocidos constituintes# cuja identiica!"o implica no
con)ecimento de suas propriedades 2sico%&u2micas( Y importante relembrar &ue estas
substncias s"o anotricas# ou seja# podem a0ir como cido de 5rgnsted Jdoadoras de
pr,tonsL ou como base de 5rgnsted Jaceptoras de pr,tonsL % rea!+es 7 e 8(
G
I
N
9
CG7R:COOG S111H G
I
N
9
CG7R:COO
C
JRea!"o 7L
/ //
G
I
N
9
CG7R:COO
C
S111H G
)
NCG7R:COO
C
JRea!"o 8L
// ///
A orma *NiteriVnica J//L produ*ida pela dissocia!"o do pr,ton em / JRea!"o 7L e essa
orma pode tambm sorer dissocia!"o de um pr,ton e 0erar o nion ///(
3ada rea!"o iVnica deinida por uma constante de ioni*a!"o# Ka e um pKa J%lo0 KaL(
Todos os 0rupos %carbo'2licos dos 89 aminocidos t$m valores de pKa pr,'imos# mas
dierentes JpKa 8 a BL# o mesmo se observa para os 0rupos %amino JpKa Q a 79L( O valor
do pKa de um aminocido representa o pE no &ual as duas ormas iVnicas est"o presentes em
concentra!+es i0uais( Al0uns aminocidos apresentam 0rupos ioni*veis na cadeia R lateral(
Os 0rupos cidos ou bsicos e'tras# l,0ico# aumentam a comple'idade das rea!+es cido%
base dos aminocidos# o &ue 0arante maior resolu!"o na anlise destes compostos em uma
mistura(
O primeiro passo na caracteri*a!"o de uma prote2na isolada e puriicada a
determina!"o da composi!"o de seus aminocidos( Ela )idrolisada e a mistura de
aminocidos livres submetida P anlise &ualitativa e &uantitativa( A )idr,lise de uma
prote2na em meio cido ou bsico n"o leva a resultados ideais# uma ve* &ue ambos os
mtodos tendem a destruir al0uns aminocidos( A )idr,lise cida destr,i triptoano# causa
al0uma perda de serina e treonina e converte aspara0ina e 0lutamina em cido asprtico e
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 7A
0lutmico# respectivamente( A )idr,lise em meio bsico leva P destrui!"o de serina# treonina e
racemi*a!"o de aminocidos livres( A )idr,lise cida mais utili*ada# por ser um mtodo &ue
apresenta menor 2ndice de destrui!"o(
O processo de )idr,lise consiste em dissolver a amostra de prote2na em uma solu!"o
a&uosa cida Jnormalmente E3l DNL e a&uecer a solu!"o a 779[3 por 78 a 7C )# ou mant$%la P
temperatura ambiente por uma semana( O intervalo de tempo necessrio para a )idr,lise
depende da nature*a dos res2duos de aminocidos( Para separa!"o e identiica!"o dos
aminocidos# as tcnicas mais versteis# econVmicas e convenientes s"o baseadas em mtodos
cromato0ricos( A anlise &ualitativa dos aminocidos pode ser eita por cromato0raia em
papel# em camada ina de s2lica 0el ou celulose# no entanto muitas tcnicas mais sens2veis s"o
utili*adas atualmente( Os aminocidos livres s"o detectados na placa ou papel# em &ue oi
desenvolvido o cromato0rama# atravs da rea!"o com nin)idrina( O aminocido prolina
desenvolve uma cor amarela# en&uanto os demais aminocidos desenvolvem uma cor violeta(
FUNDAMENTO DA PRTICA
Em nosso e'perimento iremos acompan)ar o processo de )idr,lise protica# medindo
os n2veis de aminocidos liberados atravs da rea!"o com )idr,'ido de s,dio( As prote2nas
ser"o precipitadas com cido tricloroactico JT3AL en&uanto os aminocidos livres# no
sobrenadante# rea0em com NaOE# ormando um composto de colora!"o castan)a# &ue
absorve em @@9 nm J;ei0ton et al( dournal Holecular 5iolo0<# :D-79B%788# 7Q:BL(
PRO3ESSO
A% Prepara!"o da solu!"o de ovoalbumina Jsolu!"o AL-
?issolver B ml de clara de ovo com 7: ml de 0ua destilada# em um Erlenme<er e
adicionar C#9 ml de E3l concentrado( Histurar(
5% Eidr,lise cida com a&uecimento-
7% Transerir al2&uotas de B ml da solu!"o de ovoalbumina para cinco tubos de
ensaio( ;evar os tubos ao ban)o%maria ervente e ap,s 89# B9# @9 e C9 min# transerir o
conte6do dos tubos de ensaio Jum a cada per2odo de tempoL para tubos de centr2u0a#
previamente identiicados J89# B9# @9 e C9L# contendo 9#C ml de T3A a B9R( A0itar e dei'ar
em repouso por um m2nimo de79 minutos(
8% 3entriu0ar o conte6do de cada tubo# transerir 7#C ml do sobrenadante para tubos
de ensaio# previamente identiicados# e ao tubo branco adicionar 7#C ml de 0ua destilada(
B% No inal adicionar ao conte6do de cada tubo de ensaio# B ml da solu!"o de
)idr,'ido de s,dio 7 H(
@% ;er a densidade ,ptica J?OL em @@9 nm# nos diversos tubos( Ajustando o *ero do
espectrootVmetro com o branco(
C% 3onstruir um 0rico da ?O em un!"o do tempo(
7Q Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
DOSAGEM DE UR+IA
OB/ETIVOS
7% /dentiicar a uria como o principal produto de e'cre!"o de amVnia(
8% Recon)ecer a en*ima urease como um rea0ente para anlises bio&u2micas(
B% ?escrever os mtodos mais comumente utili*ados para a determina!"o de uria(
@% ?escrever o undamento do mtodo utili*ado neste e'perimento(
C% ?eterminar os n2veis de uria no soro san0G2neo(
D% /dentiicar as causas &ue 0eram o aumento nos n2veis plasmticos de uria(
INTRODU,0O
A uria ormada no 20ado a partir de amVnia produ*ida em todos os tecidos# como
produto inal do catabolismo protico( A uria representa a maior ra!"o de substncias
or0nicas presentes na urina e cerca de A9R do nitro0$nio n"o protico e'cretado na urina#
em condi!+es normais(
E'istem vrios mtodos utili*ados na determina!"o de uria( Entre eles destacamos-
aL A utili*a!"o de 'antidrol em mtodos 0ravimtricos# colorimtricos# o'idimtricos(
bL A determina!"o de nitro0$nio pelo mtodo de Kjelda)l(
cL ?etermina!"o colorimtrica utili*ando rea0entes como diacetil%mono'ima# dimetil%
0lio'ima ou p%dimetil%amino%ben*alde2do(
dL ?etermina!"o en*imtica utili*ando urease Juria amido)idrolase# E3 B(C(7(CL( A
)idr,lise en*imtica da uria 0era amVnia JNE
B
L e bi,'ido de carbono J3O
8
L( Este pode ser
dosado por 0asometria# en&uanto a amVnia pode ser &uantiicada- iL por titulometria# com o
rea0ente de NesslerS iiL en*imaticamente# com 0lutamato desidro0enaseS iiiL atravs da rea!"o
de 5ert)elot(
FUNDAMENTO DA PRTICA
Ftili*aremos a rea!"o de 5ert)elot para &uantiicar a amVnia ormada por a!"o da
urease sobre a uria# presente no soro san0G2neo( 3ada molcula de amVnia rea0e com duas
molculas do derivado en,lico JsalicilatoL na presen!a de )ipoclorito de s,dio# em meio
alcalino# para ormar indoenol# composto de cor a*ul( A intensidade de cor da rea!"o
proporcional P concentra!"o de amVnia(
PROCESSO
Em um tubo de ensaio diluir 9#7 m; de soro com 9#Q m; de solu!"o salina(
Harcar cinco tubos de ensaio- 5ranco# Padr"oJ8L e TesteJ8L e adicionar a cada um-
TF5OS FRY/A J:9m0RL SORO ENX/HA JFREASEL
J8DA FZmlL
5ranco % % 7#9 m;
Padr"o J8L 9#9C m; % 7#9 m;
Teste J8L % 9#9C m; 7#9 m;
7% /ncubar todos os tubos em ban)o%maria J5HL a B:[3 por C minutos Jesta a rea!"o
en*imticaL(
8% Adicionar a cada tubo 7#9 m; da solu!"o o'idante J)idr,'ido de s,dio 8#A mH e
)ipoclorito de s,dio 787 mHL# misturar e levar ao 5H a B:[3 por C minutos((
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 89
B% ;er as absor!+es ,pticas em D99 nm# utili*ando o branco para ajustar o *ero do
espectrootVmetro(
CLCULO
Podemos calcular a concentra!"o de uria no soro % e'pressa em m0R % atravs da
,rmula-
3oncentra!"o de uria Jm0RL ` ;
T
Z ;
P
' :9
;
T
% ;eitura do Teste
;
P
% ;eitura do Padr"o
CONSIDERA,-ES SOBRE O M+TODO
7% O mtodo en*imtico para dosa0em de uria apresenta um alto 2ndice de conian!a#
uma ve* &ue a urease rea0e especiicamente com a uria(
8% A rea!"o de 5ert)elot um mtodo de dosa0em de amVnia sens2vel e acurado(
B% A amostra de soro ou plasma deve ser utili*ada t"o lo0o ten)a sido coletada( Para
obten!"o do plasma n"o devem ser utili*ados anticoa0ulantes contendo sais de amVnia# por
motivos ,bvios e luoretos# por&ue inibem a urease(
IMPORTTNCIA CLNICA
Os n2veis plasmticos de uria s"o utili*ados em conjunto com os n2veis de creatinina
como au'iliar no dia0n,stico dierencial de )iperuremia pr%renal e p,s%renal(
Entre as causas pr%renais responsveis pelo aumento de uria no plasma est"o a
descompensa!"o card2aca# desidrata!"o# aumento no catabolismo de prote2nas( Entre as causas
renais destacam%se nerite crVnica# necrose tubular# 0lomerulonerite a0uda ou crVnica( As
causas p,s%renais s"o &ual&uer tipo de obstru!"o do trato urinrio Jclculos# dilata!"o da
0lndula prosttica# tumoresL(
Os n2veis de uria se encontram redu*idos na insuici$ncia )eptica a0uda# com les+es
muito e'tensas( No 6ltimo trimestre da 0ravide* tambm se observa uma diminui!"o nos
n2veis de uria(
V$?or# %or2$=#- 79 a C9 m0 de uria por 799 m; de plasma(
87 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
ESTUDOS DIRIGIDOS
C=%O&=A$ ( R$LR# C$&$?=#$($# >or E%Q=2$#
97% Iual a importncia das en*imas nos or0anismos vivosh
98% 3omo poss2vel avaliar a concentra!"o de uma en*ima em tecido ou luido biol,0icoh
9B% E'pli&ue por&ue a medida da atividade en*imtica n"o corresponde necessariamente P
concentra!"o real da en*ima(
9@% Iual a importncia dos parmetros M
m'
e K
H
# na caracteri*a!"o de uma en*imah
9C% ?$ e'emplos da aplica!"o cl2nica das en*imas(
9D% E'pli&ue como oi poss2vel acompan)ar a velocidade da rea!"o en*imtica# na prtica(
9:% 3om os dados obtidos na prtica sobre en*imas# demonstre como cresce a velocidade de
uma rea!"o en*imtica com o aumento da concentra!"o do substrato e calcule K
H
e M
m'
da en*ima(

I%=<=LJo ( R$LR# C$&$?=#$($# >or E%Q=2$#


7% Iual a importncia de analisarmos o eeito de inibidores sobre rea!+es en*imticash
8% O &ue distin0ue o eeito de um inibidor competitivo da&uele n"o competitivoh
B% 3omo poss2vel distin0uir# e'perimentalmente# um inibidor competitivo de um n"o
competitivoh
@% 3om os dados obtidos na prtica# demonstre o tipo de inibi!"o em &ue se en&uadra o
cloreto de merc6rio# em rela!"o P urease(

Co%#'2o D G?=Ao# >or AO?'?$# ( Sacharomyces cerevisiae


C% E'pli&ue por&ue a via 0licol2tica importante para as )emcias(
98% Por&ue importante separar o plasma dos elementos i0urados do san0ue# o mais rpido
poss2vel# &uando se pretende dosar os n2veis plasmticos de 0licoseh
9B% Iual a op!"o# &uando n"o ) condi!+es de separar o plasma dos elementos i0urados de
imediatoh
D% E'pli&ue como oi poss2vel acompan)ar o consumo de 0licose pelas clulas de
Sacharomyces cerevisiae(
:% 3om os resultados obtidos na prtica calcule a concentra!"o de 0licose# em m0R#
construa um 0rico das concentra!+es em un!"o do tempo de incuba!"o e e'pli&ue
por&ue os resultados oram dierentes(

Do#$B2 ( PrK4=(o# ( L=>@(o#


97% O &ue s"o radicais livres e &ual a a!"o dessas espcies &u2micas no or0anismo vivoh
98% 4ale sobre tr$s ontes 0eradoras de radicais livres no or0anismo vivo(
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 88
9B% 3omo e'plicar a a!"o danosa da lu* ultravioleta sobre a peleh
9@% E'pli&ue como oi poss2vel determinar os n2veis de per,'idos de lip2deos no plasma(
9C% 3om os resultados obtidos na prtica calcule a concentra!"o de per,'idos de lip2deos
plasmticos# reeridos como n2veis de T5ARS em H e construa um 0rico da
concentra!"o em un!"o do tempo de incuba!"o das clulas de S. cerevisiae(

Ef=&o ($ G?=Ao# So<r $ Pro4=($LJo ( L=>@(o#


7% 3omo 0erado# no or0anismo vivo# o malondialde2do JH?ALh
8% Por &ue um aumento de H?A no plasma pode comprometer a atividade biol,0ica das
prote2nash
B% Iual o eeito prtico na determina!"o do eeito da 0licose sobre a pero'ida!"o de
lip2deosh
@% 3om os resultados obtidos nesta prtica e a&ueles obtidos na prtica anterior demonstre#
0raicamente# o eeito da 0licose sobre os n2veis de T5ARS medidos nas clulas(

G=(rK?=# ( Pro&@%$#
97% Por&ue importante con)ecermos a se&G$ncia dos aminocidos constituintes de uma
prote2nah
98% O &ue acontece com as prote2nas &uando s"o a&uecidas em um meio a&uoso# cido ou
bsicoh
9B% 3onceitue pKa e ale sobre a importncia desta constante na anlise dos aminocidos em
uma mistura(
9@% E'pli&ue como oi poss2vel acompan)ar o processo de )idr,lise protica(
9C% 3om os resultados obtidos na prtica demonstre# atravs de um 0rico# o aumento na
concentra!"o dos aminocidos livres com o tempo(

Do#$B2 ( UrO=$ %o Soro S$%BU@%o


97% 4ale sobre a ori0em da uria no or0anismo e sobre sua importncia(
98% Relacione tr$s mtodos utili*ados na dosa0em de uria# destacando o mais preciso entre
eles(
9B% Iual o undamento da rea!"o de 5ert)elot e &ual a sua aplica!"oh
9@% 3om os dados obtidos na prtica calcule a concentra!"o de uria e comente o resultado(
8B Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
9C% 4ale sobre a importncia cl2nica da dosa0em plasmtica de uria(
PAINEL DIRIGIDO
INTEGRA,0O E REGULA,0O METABLICA
Hetabolismo o conjunto total das transorma!+es das molculas dos nutrientes
or0nicos nas clulas vivas( Atravs dessas transorma!+es# catalisadas por en*imas#
e'tra2da a ener0ia &u2mica das molculas dos nutrientes# &ue utili*ada na reali*a!"o do
trabal)o celular(
Os or0anismos vivos podem ser divididos em dois 0randes 0rupos- Os seres
autotr,icos J&ue se alimentam por si mesmosL podem utili*ar o di,'ido de carbono da
atmosera como 6nica onte de carbono e produ*ir todas as biomolculas essenciais P vida( Os
seres )eter,troos J&ue se alimentam Ps custas de outrosL necessitam obter os tomos de
carbono do meio ambiente na orma de molculas or0nicas relativamente comple'as(
Alm das ontes de carbono# o'i0$nio e ener0ia# todos os or0anismos vivos necessitam
de uma onte de nitro0$nio# necessrio para a s2ntese dos compostos nitro0enados# como os
aminocidos# as bases p6ricas e pirim2dicas# etc(
O metabolismo pode ser entendido# ainda# como o conjunto das diversas vias
metab,licas# resultado da a!"o de se&G$ncias multien*imticas &ue# individualmente#
catalisam os passos sucessivos dessas vias( As se&G$ncias espec2icas de intermedirios
envolvidos nas vias do metabolismo celular desi0nado re&Gentemente como metabolismo
intermedirio( A transorma!"o dos nutrientes# como carboidratos# prote2nas e lip2deosS em
estruturas mais simples# como 3O
8
e E
8
O c)amada de catabolismo( Este um processo de
de0rada!"o dos nutrientes# acompan)ado pela libera!"o da ener0ia livre inerente P estrutura
comple'a das molculas or0nicas( As vias catab,licas 0eram ener0ia e conver0em para
poucos produtos inais(
O processo de s2ntese de macromolculas# como prote2nas e cidos nucleicos# a partir
de pe&uenas molculas precursoras Jas unidades undamentaisL con)ecido como
anabolismo ou bioss2ntese( As vias anab,licas envolvem consumo de ener0ia e diver0em para
a orma!"o de muitos produtos dierentes(
F=B'r$ ; Pro('LJo ( %rB=$ %o A$&$<o?=#2o #'$
'&=?=Q$LJo %o $%$<o?=#2o A?'?$r
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 8@
A 4i0ura 7 mostra &ue )# na clula# um ciclo ener0tico em &ue o ATP serve como elo
de transporte de ener0ia &u2mica# avorecendo uma uni"o entre o catabolismo e o anabolismo(
Fm outro elo importante entre estes dois processos metab,licos o NA?PE# &ue transporta
ener0ia na orma de or!a redutora( 3om isso poss2vel entender &ue a estrat0ia do
metabolismo ormar ATP# poder redutor e unidades undamentais para os processos de
bioss2ntese(
No metabolismo celular e'iste um intrincado sistema de re0ula!"o# de tal orma &ue a
libera!"o de ener0ia nos processos catab,licos controlada pelas necessidades celulares de
ener0ia na orma de ATP e de NA?PE# e n"o pela simples disponibilidade dos nutrientes(
A re0ula!"o do metabolismo ocorre de vrias ormas-
7 T )om"artimenta*+o T A clula est dividida em compartimentos# separados uns dos
outros por membranas( Al0uns processos metab,licos como a 0lic,lise# a via pentose osato#
a s2ntese dos cidos 0ra'os ocorrem no citossol( Outros processos ocorrem na mitocVndria#
como acontece com o'ida!"o dos cidos 0ra'os# as rea!+es do ciclo do cido c2trico e a
osorila!"o o'idativa( E'istem ainda a&ueles processos &ue dependem da intera!"o de
rea!+es &ue ocorrem em ambos os compartimentos# como a 0liconeo0$nese# a s2ntese de
uria( 3om isso a utili*a!"o de um determinado nutriente pela clula vai depender do
compartimento em &ue essa molcula se encontra( A separa!"o entre as vias de s2ntese e as
vias de de0rada!"o de undamental importncia para a re0ula!"o do metabolismo(
8 T ,is"onibilidade de substrato T 3om re&G$ncia# a concentra!"o do substrato
comanda direta ou indiretamente a velocidade de determinados processos( Embora muitas
ve*es seja i0norada a importncia do suprimento de substrato como um ator de re0ula!"o do
metabolismo# a concentra!"o de cidos 0ra'os do san0ue &ue entra no 20ado um ator
determinante da velocidade da ceto0$nese( =ordura sinteti*ada em e'cesso &uando ocorre o
consumo e'cessivo de substratos &ue contribuem para a lipo0$nese( Por outro lado# a in0est"o
deiciente de substratos 0lico0$nicos Jprincipalmente alaninaL podem 0erar )ipo0licemia na
0ravide* ou no jejum prolon0ado(
B T (fetores alost-ricos T A primeira rea!"o essencialmente irrevers2vel em uma via
metab,lica &uase sempre ortemente re0ulada( As en*imas &ue catalisam estas rea!+es s"o
re0uladas alostericamente( A &uantidade e a atividade dessas en*imas v"o determinar o lu'o
de molculas na maioria das vias metab,licas( Na via 0licol2tica# rutose 8#D%bisostato
estimula a osorutocinase e inibe a rutose 7#D%bisosatase# dessa orma estimula a 0lic,lise
ao mesmo tempo em &ue inibe a 0liconeo0$nese( N2veis elevados de A?P estimulam a
atividade da isocitrato desidro0enase# no ciclo do cido c2trico( O citrato ativa a acetil 3oA
carbo'ilase# estimulando a s2ntese de malonil 3oA# na via de s2ntese de cidos 0ra'os( O
aumento nos n2veis de malonil 3oA inibe a carnitina aciltranserase /# interrompendo a
o'ida!"o de cidos 0ra'os(
@ T Modifica*+o covalente T Al0umas en*imas &uando s"o osoriladas mudam sua
conorma!"o e sua atividade( A 0lico0$nio osorilase# por e'emplo# &uando osorilada tem a
sua atividade catal2tica aumentada# en&uanto a 0lico0$nio sintase osorilada tem a sua
atividade diminu2da( Essas modiica!+es covalentes s"o catalisadas por en*imas espec2icas(
Entre as en*imas &ue sorem re0ula!"o pela osorila!"o revers2vel# podemos citar ainda-
piruvato cinase# lipase sens2vel a )ormVnio# enilalanina )idro'ilase# rutose 8#D%bisosatase(
C T ./veis de enzimas T A mudan!a nos n2veis en*imticos um mecanismo de
re0ula!"o &ue envolve mudan!as da velocidade de s2ntese ou de de0rada!"o de en*imas
c)aves( Entre essas en*imas est a 0licocinase# osrutocinase# piruvato cinase# 0licose D%
osatase# rutose 7#D%bisosatase(
8C Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
D T (s"ecializa*+o metab#lica dos #r+os T A e'ist$ncia de ,r0"os com dierentes
caracter2sticas# aeta consideravelmente a re0ula!"o do metabolismo( Nem todas as principais
vias metab,licas operam em todos os tecidos em um determinado momento(
Estas ormas de re0ula!"o do metabolismo evidenciam o papel preponderante das
en*imas( Has vale ressaltar a relevncia dos )ormVnios# como moduladores da velocidade de
uma 0rande variedade de rea!+es bio&u2micas e vias metab,licas(
A 4i0ura 8 apresenta um es&uema relacionando Ps principais vias metab,licas e o local
onde elas ocorrem na clula( Os atores &ue diri0em o lu'o das molculas no metabolismo
podem ser mel)or compreendidos pelo e'ame de tr$s importantes jun!+es metab,licas-
0licose%D%osato# piruvato e acetil 3oA( 3ada uma dessas molculas t$m diversos destinos
mas est"o interrelacionadas-
A Glicose-0-fosfato pode ser arma*enada como 0lico0$nio# de0radada a
piruvato# 0erando ATP# ou transormada em ribose C%osato# para s2ntese de nucleot2deos#
com a produ!"o concomitante de NA?PE( Por outro lado# 0licose D%osato pode ser ormada
pela mobili*a!"o do 0lico0$nio ou pode ser sinteti*ada a partir de piruvato e aminocidos
0lico0$nicos pela via da 0liconeo0$nese(
O Piruvato primariamente derivado da 0licose D%osato# alanina e lactato( A
cil redu!"o do piruvato# catalisada pela lactato desidro0enase# serve para re0enerar NA?
U
#
permitindo &ue a 0lic,lise prossi0a temporariamente em condi!+es anaer,bicas( O lactato
acumulado nos m6sculos transerido para o 20ado e sore o'ida!"o( Fma outra rea!"o
revers2vel no citossol a rea!"o de transamina!"o do piruvato 0erando alanina# o &ue 0arante
um elo de li0a!"o entre o metabolismo de aminocidos e de carboidratos( Alm da alanina#
outros aminocidos podem ser convertidos em piruvato( O'aloacetato# produto da
carbo'ila!"o do piruvato# pode ser transormado em osoenolpiruvato e# por isso# permite &ue
a 0licose seja sinteti*ada a partir de piruvato(
Acetil )oA produ*ido em maior &uantidade pela descarbo'ila!"o o'idativa do
piruvato e pela %o'ida!"o dos cidos 0ra'os( Esse composto pode ser totalmente o'idado a
3O
8
e E
8
O# atravs das rea!+es do ciclo do cido c2trico e cadeia transportadora de eltrons#
F=B'r$ ) U2$ !=#Jo #F'23&=A$ ($ Ao2>$r&=2%&$LJo ($#
>r=%A=>$=# !=$# 2&$<K?=A$#
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 8D
ou pode 0erar B%)idro'i%B%metil 0lutaril 3oA# precursor para a via de s2ntese do colesterol
como tambm dos corpos cetVnicos( Fm outro destino do acetil 3oA a sua utili*a!"o para a
s2ntese de cidos 0ra'os( O acetil 3oA serve como elo de inte0ra!"o entre o metabolismo dos
carboidratos# dos lip2deos e das prote2nas e a inte0ra!"o destas vias metab,licas com o ciclo
do cido c2trico(
I%&Br$LJo M&$<K?=A$ %&r o# D=!r#o# TA=(o#
A inte0ra!"o das diversas un!+es dos ,r0"os um processo muito comple'o# uma ve*
&ue os padr+es metab,licos de crebro# m6sculo# tecido adiposo# trato di0estivo e 20ado s"o
muito dierentes( Para um pereito entendimento destas inter%rela!+es ) necessidade# alm da
aborda0em bio&u2mica# de uma aborda0em isiol,0ica( Neste te'to abordaremos somente
al0uns aspectos bio&u2micos si0niicativos(
T$<?$ ; R#r!$ %rBO&=A$ 2 '2 Do22 $('?&o 7V*0WB:
E%rB=$ (=#>o%@!? 7WA$?:
RG0O G?=AoBE%=o
o' B?=Ao#
Tr=$A=?B?=ArK=# Pro&@%$#
Mo<=?=Q3!=#X
San0ue D9 @C 9
420ado @99 @C9 @99
3rebro A 9 9
H6sculo 7(899 @C9 8@(999
Tecido adiposo A9 7BC(999 @9
^Embora prote2na n"o constitua material de reserva# na inani!"o podem ser consumidos C9R
do seu total(
A distribui!"o das reservas ener0ticas nos diversos tecidos JTabela 7L mostra como
esses tecidos dierem no uso dos alimentos para satisa*er as suas necessidades ener0ticas-
)-rebro T N"o tem reservas ener0ticas e# por isso# necessita de um suprimento
cont2nuo de 0licose( Ele consome cerca de 789 0 diariamente# o &ue representa cerca de D9R
do consumo de 0licose pelo or0anismo inteiro em repouso( ?urante a inani!"o# o crebro
utili*a os corpos cetVnicos Jacetoacetato e %)idro'ibutiratoL# 0erados pelo 20ado# como onte
de ener0ia# substituindo parcialmente a 0licose( Essa mudan!a no uso de combust2vel de
0licose para corpos cetVnicos tem por objetivo minimi*ar a de0rada!"o de prote2nas durante a
inani!"o( Os cidos 0ra'os n"o servem como alimento para o crebro# por n"o atravessarem a
barreira )ematoencelica# mas os corpos cetVnicos# derivados dos cidos 0ra'os# podem ser
utili*ados como onte de ener0ia pelo crebro(
M1sculo T ?iere do crebro por ter 0rande reserva de 0lico0$nio e alm de
0licose utili*a cidos 0ra'os e corpos cetVnicos como ontes de ener0ia( O m6sculo# como o
crebro# n"o tem a en*ima 0licose%D%osatase# por isso n"o pode e'portar 0licose# &ue seu
alimento preerido para surtos de atividade( A velocidade da 0lic,lise no m6sculo es&ueltico
em contra!"o ativa# e'cede a&uela do ciclo do cido c2trico( Huito do piruvato ormado nesse
processo redu*ido a lactato# &ue lui para o 20ado onde transormado em 0licose( A
alanina# como o lactato# podem ser transormada em 0licose pelo 20ado( No m6sculo em
repouso os cidos 0ra'os s"o a principal onte de ener0ia# en&uanto os corpos cetVnicos
podem tambm servir de alimento para o m6sculo card2aco(
2ecido adi"oso T Tem como un!"o arma*enar triacil0licer,is T produto da
esteriica!"o dos cido 0ra'os# sinteti*ados no 20ado# com 0licerol( O 0licerol B%osato#
intermedirio nessa rea!"o de esteriica!"o# um produto da de0rada!"o da 0licose na via
0licol2tica( 3omo os adip,citos n"o podem osorilar o 0licerol# necessitam de 0licose para a
8: Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
s2ntese de triacil0licer,is( As lipases do tecido adiposo s"o en*imas envolvidas com a
libera!"o da maior parte de ener0ia arma*enada( A lipase &ue remove o primeiro cido 0ra'o
de um triacil0licerol sens2vel a vrios )ormVnios circulantes J4i0ura BL( O controle da
)idr,lise de triacil0licer,is deve ser balanceado com o processo de s2ntese destes compostos#
para asse0urar um arma*enamento de ener0ia ade&uado e evitar a obesidade( Os n2veis de
0licerol B%ostato# produ*idos a partir de 0licose# nos adip,citos desempen)am um papel
importante sobre destino dos cido 0ra'os( N2veis elevados de 0licerol B%ostato estimulam a
esteriica!"o# en&uanto bai'os n2veis deste composto nos adip,citos avorecem a libera!"o
dos cidos 0ra'os para a corrente san0G2nea(
3/ado % Suas atividades metab,licas s"o essenciais para o provimento de
material ener0tico para o crebro# m6sculo e outros ,r0"os periricos( A maioria dos
compostos absorvidos pelos intestinos passa atravs do 20ado# o &ue permite &ue ele re0ule o
n2vel de muitos destes compostos no san0ue( O 20ado pode captar 0randes &uantidades de
0licose e convert$%las em 0lico0$nio# como pode liberar 0licose para o san0ue a partir das
reservas de 0lico0$nio ou atravs da 0liconeo0$nese( ;actato e alanina# a partir dos m6sculos
e 0licerol# do tecido adiposo# bem como os aminocidos 0lico0$nicos# s"o os principais
precursores de 0licose na 0liconeo0$nese( Assim como o 20ado re0ula o metabolismo dos
carboidratos# tambm desempen)a papel central na re0ula!"o do metabolismo dos lip2deos(
As lipoprote2nas de muito bai'a densidade JM;?;L s"o sinteti*adas no 20ado e transportam
os cidos 0ra'os para o tecido adiposo para a s2ntese de triacil0licer,is( E o 20ado &ue# no
jejum# transorma os cidos 0ra'os em corpos cetVnicos( Halonil%3oA# precursor para a
s2ntese de cidos 0ra'os# inibe a en*ima carnitina aciltranserase /# envolvida com o transporte
de cidos 0ra'os para a mitocVndria( ?essa orma# &uando os n2veis de malonil 3oA est"o
altos a s2ntese de cidos 0ra'os avorecida e a %o'ida!"o# inibida( Iuando os alimentos s"o
escassos# os n2veis de malonil 3oA bai'am e os cidos 0ra'os liberados do tecido adiposo s"o
transormados em corpos cetVnicos(
F=B'r$ I Mo<=?=Q$LJo ( 3A=(o# Br$4o# (o# $(=>KA=&o# =%('Q=($
>or Dor2N%=o. P8A Pro&@%$ A=%$#P MAGP
DAGP TAG Mo%oP (= &r=$A=?B?=Aro?
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 8A
Entre os )ormVnios envolvidos com a inte0ra!"o metab,lica# insulina# 0luca0on
epinerina e norepinerina s"o de particular importncia no arma*enamento e na mobili*a!"o
de alimentos-
4nsulina T Y secretada pelas clulas do pncreas estimulada pela presen!a de
0licose e pelo sistema nervoso parassimptico( Esse )ormVnio atua nas cascatas de prote2nas
cinase( Estimula a s2ntese de 0lico0$nio no m6sculo e no 20ado( Estimula a 0lic,lise )eptica#
avorecendo a s2ntese de cidos 0ra'os( 3omo j oi discutido# o aumento de cidos 0ra'os e
0licose no tecido adiposo estimula a s2ntese e arma*enamento de triacil0licerol( A insulina
tambm promove a capta!"o de aminocidos ramiicados Jvalina# leucina e isoleucinaL pelo
m6sculo e apresenta um eeito estimulador 0eral sobre a s2ntese proteica e inibe a de0rada!"o
intracelular de prote2nas(
Glucaon T Y secretado pelas clulas do pncreas em resposta aos bai'os
n2veis de 0licose no san0ue( O 0luca0on inibe a s2ntese de 0lico0$nio e estimula a
0lico0en,lise# por&ue dispara a cascata de cAHP( Alm disso estimula a 0liconeo0$nese e
inibe a 0lic,lise por redu*ir os n2veis de rutose 8#D%bisosato( O aumento de cAHP nos
adip,citos ativa a lipase &ue mobili*a os triacil0licer,is(
("inefrina e nore"inefrina T S"o secretadas pela medula adrenal e termina!+es
nervosas simpticas em resposta ao bai'o n2vel de 0licose circulante( T$m eeito semel)ante
P&uele do 0luca0on por disparar a cascata de cAHP( Esses )ormVnios dierem do 0luca0on
F=B'r$ 4 I%&Br$LJo (o 2&$<o?=#2o %&r o# >r=%A=>$=# &A=(o# %o
#&$(o <2 $?=2%&$(o
8Q Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
por&ue seu eeito 0lico0enol2tico mais acentuado no m6sculo do &ue no 20ado( Na presen!a
desses )ormVnios a capta!"o de 0licose pelos m6sculos inibida e os cidos 0ra'os# liberados
do tecido adiposo# s"o utili*ados como onte de ener0ia( A epinerina tambm estimula a
secre!"o de 0luca0on e inibe a secre!"o de insulina( Assim# as catecolaminas aumentam a
libera!"o de 0licose )eptica no san0ue e diminuem a utili*a!"o de 0licose pelo m6sculo(
A 4i0ura @ mostra um panorama da inte0ra!"o metab,lica entre diversos tecidos( O
transporte dos diversos compostos entre os ,r0"os 0eralmente assumida pelo san0ue( Os
lip2deos# a princ2pio constituintes dos &uilom2crons# s"o removidos do intestino pelo sistema
lintico# en&uanto 0licose passa das clulas epteliais intestinais para o 20ado atravs da veia
porta( Ainda no intestino ocorre o metabolismo parcial dos aminocidos# antes de serem
liberados no sistema porta(
A($>&$LR# M&$<K?=A$# %o /Y'2 Pro?o%B$(o
A ener0ia necessria para um per2odo de 8@ )oras varia de apro'imadamente 7(D99
Ocal no estado basal a D(999 Ocal# dependendo do 0rau de atividade( 3onsiderando os dados
da Tabela 7# as reservas ener0ticas em um indiv2duo com peso em torno de :9 O0 s"o
suicientes para satisa*er as necessidades cal,ricas na inani!"o por cerca de tr$s meses( Has
as reservas de 0licose se es0otam em apenas um dia( Hesmo assim# o n2vel de 0licose
circulante mantido acima de @9 m0Zdl( O crebro n"o suporta n2veis mais bai'os# mesmo por
per2odos curtos( Alm disso e'istem tecidos &ue s, utili*am 0licose como onte de ener0ia
JTabela 8L( No entanto# os precursores de 0licose n"o se encontram em 0rande &uantidade( A
maior parte da ener0ia est arma*enada nos cidos 0ra'os dos triacil0licer,is# mas esses
compostos n"o podem ser convertidos em 0licose# por&ue o acetil 3oA n"o pode ser
convertido em piruvato( O 0licerol# &ue pode ser utili*ado como precursor da 0licose#
liberado em pe&uenas &uantidades dos triacil0licer,is( Resta uma 6nica onte de precursores
da 0licose# os aminocidos derivados da de0rada!"o proteica( Has como o m6sculo a maior
onte de prote2nas e tem papel undamental na estrutura do or0anismo# precisa ser
preservado( 3omo preciso prover os n2veis de 0licose acima de @9 m0Zdl e preservar as
prote2nas do m6sculo# os cido 0ra'os e corpos cetVnicos passam a serem utili*ados como
combust2vel(
T$<?$ ) Co2<'#&@!=# U#$(o# >?o# D=!r#o# TA=(o#
TECIDOS GLICOSE A. GRAMOS C. CETZNICOS
Eritr,citos U % %
;euc,citos U % %
Hedula renal U % %
3,rte' renal U U U
3rebro U % U
H6sculo es&ueltico UJe'erc2cio intensoL UJrepousoL U
H6sculo card2aco U U U
Retina U % %
420ado U U %
Hucosa intestinal U % %
As altera!+es metab,licas durante o primeiro dia de jejum s"o como a&uelas ap,s o
jejum de uma noite( 3om a redu!"o nos n2veis de carboidratos# aumenta a secre!"o de
0luca0on# estimulando a mobili*a!"o de triacil0licer,is do tecido adiposo e a 0liconeo0$nese
pelo 20ado( A capta!"o de 0licose pelo m6sculo redu*ida com os bai'os n2veis de insulina
circulante# en&uanto os cidos 0ra'os entram livremente e a %o'ida!"o destes compostos no
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m6sculo 0eram aumento na concentra!"o de acetil 3oA e de citrato# inibindo a via 0licol2tica
e impedindo a convers"o de piruvato em acetil 3oA(( Ap,s vrias semanas de inani!"o# os
corpos cetVnicos tornam%se o principal combust2vel para o crebro# redu*indo a utili*a!"o de
0licose e 0arantindo a preserva!"o das prote2nas do m6sculo JTabela BL(
T$<?$ I RB'?$LJo (o M&$<o?=#2o %o /Y'2 Pro?o%B$(o
FONTES DE ENERGIA
QUANTIDADE GERADA OU CONSUMIDA EM )4
GORAS 7GRAMAS:
I
o
DIA 40
o
DIA
Co%#'2o >?o AOr<ro
=licose 799 @9
3orpos cetVnicos C9 799
Ftili*a!"o de 0licose por
outros tecidos
C9 @9
L=<r$LJo >?o f@B$(o
=licose 7C9 A9
3orpos cetVnicos 7C9 7C9
;ip,lise no tecido adiposo 7A9 7A9
?e0rada!"o da prote2na
muscular
:C 89
A($>&$LR# M&$<K?=A$# %o E4rA@A=o
A convers"o da ener0ia &u2mica em trabal)o mecnico pelo m6sculo implica na
necessidade instantnea do consumo de 0licose( No e'erc2cio anaer,bico Jcomo corrida de
velocidade ou levantamento de pesoL o m6sculo depende de suas reservas de 0lico0$nio e
creatina osato# para a produ!"o de ATP( A creatina osato serve como onte de osato de
alta ener0ia para s2ntese de ATP# at &ue a 0lico0en,lise e a 0lic,lise sejam estimuladas( A via
0licol2tica torna%se a onte primria de ATP para o m6sculo# devido a alta de o'i0$nio(
?urante uma corrida de velocidade J799 m em i79 sL o n2vel de ATP do m6sculo cai de C#8
mH para B#: mH# en&uanto o n2vel de creatina osato cai de Q#7 mH para 8#D mH( 3om a
0lic,lise anaer,bica aumenta o n2vel san0G2neo de lactato de 7#D mH para A#B mH#
avorecendo o abai'amento do pE san0G2neo de :#@8 para :#8@( Por isso essa marc)a n"o
pode ser mantida em uma corrida de 7999 m em i7B8 s# por&ue as reservas de creatina osato
seriam consumidas em poucos se0undos e a 0lic,lise seria interrompida por alta de NA?
U
S
sem alar na &uantidade de cido ormado( Parte do ATP consumido ser 0erado pela
osorila!"o o'idativa(
A corrida de uma maratona J@8(899 m em i8 )L implica na utili*a!"o de cidos 0ra'os
para a produ!"o de ATP# uma ve* &ue os dep,sitos de 0lico0$nio s"o insuicientes para prover
os 7C9 mol de ATP necessrios para essa competi!"o( No entanto# se a o'ida!"o dos cidos
0ra'os ossem a 6nica onte de ATP a maratona deveria durar D )# uma ve* &ue essa via
metab,lica muito mais lenta do &ue a o'ida!"o do 0lico0$nio( Os mel)ores corredores
consomem &uantidades apro'imadamente i0uais de 0lico0$nio e cidos 0ra'os# de tal orma
&ue a 0licose seja poupada para o inal da maratona(
A ta'a de o'ida!"o dos cidos 0ra'os de cadeia lon0a aumenta de cinco a oito ve*es#
&uando )umanos s"o submetidos a um esor!o 2sico &ue e'i0e menos de ACR do consumo de
o'i0$nio( ?ois atores determinam a utili*a!"o de cidos 0ra'os- A dura!"o e a intensidade do
e'erc2cio( ?essa orma# e'erc2cio intenso por C a 79 min# implica na utili*a!"o de ATP 0erado
a partir da o'ida!"o de carboidratos( Em um esor!o com menor intensidade por um per2odo
de B9 min ou mais# 0era um aumento na ta'a de o'ida!"o de cidos 0ra'os( Essa ta'a
B7 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
m'ima# &uando o esor!o 2sico re&uer cerca de D9R do consumo m'imo de o'i0$nio(
/ndiv2duos bem treinados utili*am um percentual maior de cidos 0ra'os como onte de
ener0ia# do &ue indiv2duos sedentrios# n"o treinados(
Tr$%#&or%o# (o M&$<o?=#2o %o D=$<&#
No diabetes mellitus ) uma superprodu!"o de 0licose pelo 20ado &ue subutili*ada
pelos outros ,r0"os( Em um indiv2duo n"o tratado# o n2vel san0G2neo de insulina muito
bai'o e o de 0luca0on muito alto em rela!"o Ps necessidades do paciente( A alta rela!"o
0luca0onZinsulina no diabetes estimula a 0lico0en,lise e 0liconeo0$nese e inibe a 0lic,lise#
contribuindo para o aumento dos n2veis de 0licose circulante( A 0licose e'cretada na urina
junto com a 0ua# o &ue leva o diabtico na ase a0uda da doen!a sentir ome e sede(
A utili*a!"o redu*ida de carboidratos no diabtico leva a um est2mulo na &uebra de
lip2deos e prote2nas( A o'ida!"o de cidos 0ra'os promove a s2ntese de 0licose atravs do
aumento da concentra!"o de Acetil%3oA# um eetor alostrico positivo da >=r'!$&o
A$r<o4=?$#( O aumento nos n2veis de Acetil%3oA estimula a produ!"o de corpos cetVnicos#
&ue podem suplantar a capacidade dos rins de manter o e&uil2brio cido%base e levar o
diabtico n"o tratado a entrar em coma# por causa do abai'amento do pE san0G2neo e da
desidrata!"o(
S"o con)ecidas duas ormas do diabetes mellitus- O tipo /# ou insulino%dependente#
&ue em 0eral come!a antes dos 89 anos de idade( ?evido P produ!"o deeituosa de insulina
pelas clulas do pncreas# os n2veis san0G2neos de insulina n"o aumentam em resposta aos
n2veis elevados de 0licose no san0ue( No tipo //# ou n"o insulino%dependente# a insulina n"o
est ausente( N2veis elevados de insulina podem ser observados nesse tipo de diabetes# mas )
resist$ncia dos tecidos P a!"o do )ormVnio( O pncreas do paciente diabtico n"o insulino%
dependente n"o produ* insulina suiciente para superar a resist$ncia P insulina# indu*ida por
sua obesidade( Embora n"o esteja bem entendido o enVmeno da resist$ncia P insulina# a
maioria dos indiv2duos com diabetes do tipo // s"o obesos(
M&$<o?=#2o (o E&$%o? $ R?$LJo NAD
9
[NADG
Etanol uma substncia )idrossol6vel e de bai'o peso molecular( Por isso
rapidamente absorvido# especialmente &uando o estVma0o se encontra va*io( A concentra!"o
alco,lica no san0ue pode atin0ir# em mdia# cerca de 9#7R uma )ora ap,s a in0est"o de um
copo de lcool a C9R# &uatro copos de vin)o# ou &uatro 0arraas de cerveja( O etanol c)e0a
ao 20ado e transormado em acetato# evolvendo duas etapas-
CG
I
CG
)
OG 9 NAD
9
CG
I
CGO 9 NADG 9 G9 J7L
Etanol Acetalde2do
CG
I
CGO 9 NAD9 CG
I
COOC 9 NADG 9 G9 J8L
Acetalde2do Acetato
A etapa J7L T etapa lenta T catalisada pela en*ima 3?Aoo? (#=(roB%$## no citossol
en&uanto a etapa J8L ocorre na matri* mitocondrial e catalisada pela en*ima $?(@(o
(#=(roB%$#( Em ambas as etapas ocorre a produ!"o de NA?E( Por esta ra*"o# as vias
metab,licas da 0liconeo0$nese e da %o'ida!"o dos cidos 0ra'os# &ue t$m en*imas cuja
atividade sens2vel P presen!a de NA?E# sorem inibi!"o durante o metabolismo do etanol(
No jejum# esta situa!"o avorece P )ipo0licemia e ao ac6mulo de triacil0licer,is no 20ado
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes B8
J20ado 0ordoL( Pode# tambm# )aver um ac6mulo de cido lctico# 0erando acidose
metab,lica(
O consumo de lcool por uma pessoa subnutrida ou ap,s e'erc2cio e'tenuante pode
causar )ipo0licemia( Os e&uivalentes de NA?E em e'cesso blo&ueiam a convers"o de lactato
em 0licose e promovem a convers"o de alanina em lactato# &ue acumula na corrente
san0G2nea( 3om a redu!"o da 0licemia ocorre &ueda no desempen)o motor e intelectual( Altas
doses de etanol apresenta um eeito depressor# &ue pode levar a estupor e anestesia(
O etanol apresenta um alto conte6do ener0tico# produ*indo cerca de :#7 OcalZ0#
&uando o'idado( O acetato derivado do metabolismo do etanol pode ser transormado em
acetil%3oA# &ue o'idado a 3O
8
e E
8
O# atravs das rea!+es do ciclo do cido c2trico e da
cadeia transportadora de eltrons( No 20ado as mitocVndrias t$m uma capacidade limitada
para o'idar o acetato# por&ue a ativa!"o do acetato a acetil%3oA re&uer =TP( 3om o aumento
nos n2veis de NA?E# as rea!+es do ciclo sorem inibi!"o( /sto leva a uma redu!"o nos n2veis
de =TP# 0erado na transorma!"o de sucnil%3oA a succinato# e o'ida!"o do acetil%3oA
tambm ica comprometida( =rande parte do acetato e'portado do 20ado para o san0ue e
pode ser o'idado# na orma de acetil%3oA# em outros tecidos(
3omo acetato# acetalde2do pode ser e'portado do 20ado para a circula!"o san0G2nea(
Este 6ltimo composto rea0e# rapidamente# com 0rupos uncionais importantes# como as
prote2nas das clulas san0G2neas e dos demais tecidos# comprometendo a sua atividade
biol,0ica(
Q'#&R# So<r o T2$ I%&Br$LJo RB'?$LJo M&$<K?=A$
7% 3onceitue metabolismo# e e'pli&ue o &ue s"o seres autotr,icos e seres )eter,troos e
como esses seres sobrevivem(
8% 4ale sobre a importncia das en*imas no metabolismo e conceitue anabolismo e
catabolismo(
B% Iual a importncia do ATP e NA?PE na re0ula!"o do metabolismo celularh
@% Relacione as ormas pelas &uais ocorre a re0ula!"o do metabolismo e e'pli&ue como elas
uncionam(
C% Relacione as principais vias metab,licas e ale sobre a importncia das jun!+es
metab,licas- 0licose%D%osato# piruvato e acetil 3oA(
D% 3omo poss2vel e'plicar a inte0ra!"o entre os diversos ,r0"os# &uando e'iste dierentes
padr+es metab,licos entre crebro# m6sculo# tecido adiposo# trato di0estivo e 20adoh 4ale
sobre essas dieren!as
:% 4ale sobre os )ormVnios envolvidos com a re0ula!"o do arma*enamento e da mobili*a!"o
dos alimento e sobre seu papel na inte0ra!"o do metabolismo(
A% E'pli&ue como o or0anismo vivo se adapta a uma situa!"o de jejum prolon0ado(
Q% As ontes de ener0ia s"o as mesmas em &ual&uer atividade muscularh E'pli&ue(
79% Iuais os transtornos do metabolismo causados pelo diabetes mellitus e o &ue entende por
diabticos insulino%dependentes e n"o insulino%dependentesh
77% /ndependente dos eeitos prejudiciais# sociais e econVmicos do alcoolismo# e'pli&ue
por&ue o etanol n"o deve ser consumido como onte de ener0ia# apesar do seu alto teor
cal,rico(
BB Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes
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