TRABAJO PRÁCTICO N° 2

ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA α-AMILASA (PARTE I)
OBJETIVO: Investigar y analizar el comportamiento de la α-amilasa frente a diferentes
temperaturas y pH
1. INTRODUCCIÓN
La actividad de una enzima puede evidenciarse ya sea registrando la aparición de un
producto o bien la desaparición de un sustrato. Para esto pueden usarse tests colorimétricos en
donde la actividad enzimática puede detectarse a través de cambios en la coloración en el producto
final de la reacción.
Investigar la actividad de una enzima implica determinar cuáles son las condiciones óptimas
para su actividad: pH temperatura concentración de sustrato y concentración de producto.
La α-amilasa es una enzima !ue degrada el almidón principal polisacárido de reserva de las
plantas. "l almidón está compuesto por monómero de glucosa.
La α-amilasa rompe uniones entre los carbonos de dos glucosas. Por lo tanto usando
almidón como sustrato libera como productos polisacáridos compuestos por unas pocas unidades
de glucosa en general disacáridos como la maltosa
"n este #P para analizar la actividad de la α-amilasa vamos a usar un test colorimétrico !ue
permite revelar la presencia de almidón en una solución de Iodo $lugol%. "s decir !ue se verificará la
reacción de la enzima cuantificando la cantidad de almidón !ue se &alla coloreado esto implica !ue
se cuantifica el sustrato !ue !ueda remanente después de e'poner la enzima ya !ue el producto de la
reacción!ue es la maltosa no se ti(e.

La reacción estudiada es:
")*I+,
-.-#/,#0-------------------------P/01.2#0
,+IL,-,
,L+I13)--------------------------+,L#0-,

"l almidón en presencia del lugol presenta una coloración azulada debido a la interacción
f4sica entre el iodo y las moléculas de almidón. 2uando la α-amilasa degrada el almidón elimina
esa propiedad de interactuar con el iodo y por lo tanto de presentar coloración azulada.
-e trata de determinar cual es la temperatura y pH óptimos de esta enzima. Para esto se
realizaran diferentes pruebas en las !ue se cambiaran estas variables de manera independiente.
• Formule la pregunta de investigación, la hipótesis correspondiente y sus predicciones. $"l
docente a cargo formulará una pregunta de investigación como e5emplo y el alumno otra%
1e acuerdo con lo e'plicado una forma de medir la actividad enzimática es a través de los
cambios en la coloración. "sto se puede medir utilizando un color4metro.
67ué es un color4metro8
"s un e!uipo de medición !ue 9mide: o cuantifica la densidad o coloración de una muestra
obviamente coloreada. "sta medición se realiza &aciendo pasar un &az de luz con determinada
longitud de onda sobre la muestra. La idea final es !ue si la muestra es muy coloreada $muy densa%
pasara poca luz y por el contrario si es poco coloreada pasara muc&a.
"l color4metro !ue se utilizara es de marca ;ernier. La densidad óptica se mide a través de la
,bsorbancia !ue tiene la muestra. La absorbancia es una medida adimensional $sin unidades% cuyo
valor indica la cantidad de luz !ue absorve la muestra.
-i se e'pone una determinada concentración de enzima $!ue se mantiene constante% a una
determinada concentración de almidón $!ue se mantiene constante% pero a diferentes temperaturas
y observo la absorbancia puedo determinar la temperatura óptima de la enzima.
Por el docente
• Pregunta de investigación:
• Hipótesis:
• Predicciones:
Por el alumno
• ;ariable indepenpendiente
• ;ariable dependiente
• Listar todas las variables de control $se mencionan dos en el te'o y faltan otras dos%
• Indicar +<#010 !ue utilizará para controlar las variables de control.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
M!"#$%"&
--olución de ,lmidón =g>L $pH ? @ABACA y =D%
--olución de ,lmidón =g>L $ #E2? @F BG GD y HG%

-Lugol $stocI%
-Pipeta graduada de = y G ml
-;aso de precipitados
-HJD 1estilada
-;ernier Lab7uest y color4metro
-Piseta
-+ec&ero
-#r4pode
-#ela metálica
-+atraz GD y =Dml
-Preparado enzimático =Bg>=Dml
-2ronómetro
2. 1 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
M'!()(&
C*+"! C*%!$,( E-.$/0!$1( B%-1(
Lugol $K D.D= ml% D.DG D.DG
HJ0 destilada $KD.=ml% D J.C
,lmidónL $KD.DGml% J.C D
Preparado "nzimático $K D.D=ml% D.@ D.@
Tabla 1: Protocolo para la cuantificación de la enzima amilasa.*: Utilizar almidón de un pH adecuado.
-2olocar inmediatamente el color4metro y medir la absorbancia a H@G nm a tiempo cero y registrar
el valor en una tabla disparar un cronómetro y colocar la enzima en ba(o térmico $a la temperatura
adecuada%.
-, los H minutos del ba(o térmico secar la cubeta y medir absorbancia y registrar el valor en una
tabla.
-/ealizar G réplicas.
2.2 Efecto del pH sobre la actividad enzimática
-i se e'pone una determinada concentración de enzima $!ue se mantiene constante% a una
determinada concentración de almidón $!ue se mantiene constante% pero a diferentes pH y observo
la absorbancia puedo determinar el pH óptimo de la enzima.
, partir de lo e'plicado anteriormente I)1I2,/:

;ariable indepenpendiente
;ariable dependiente
Listar todas las variables de control $se mencionan dos en el te'o y faltan otras dos%
Indicar +<#010 !ue utilizará para controlar las variables de control.
M'!()(&
Para esta parte realizar el mismo procedimiento !ue en el punto anterior pero utilizando las
soluciones de almidón a distinto pH sin utilizar el ba(o simplemente de5ándolo reposar a
temperatura ambiente.
"n #010- los casos $ya sea !ue se traba5e sobre variaciones del pH o variaciones de la
temperatura% se colocarán en la cubeta los siguientes reactivos en el orden indicado y luego el
tapón.
-N( 2#"2# "% 3#"3#)( "-.$/0!$1( (4%!$/( 3&() &$- 1(-&*%!# 3#",$/"-!" % )(1"-!" ( %
5*)-!".
R"&*%!)(&

-/ealizar un gráfico de actividad de la enzima en función de la temperatura y en función del pH
--e considera pH ?C y temperatura ? GDE2 como condiciones estándar si se traba5a analizando la
variación en el pH se fi5a la temperatura e GDE2 $se coloca la cubeta en ba(o térmico a GDE2% y si se
traba5a analizando la variación en la temperatura se fi5a el pH en C $se utiliza solución de almidón a
pH ? C%