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Anexo 3 d.

Determinación del contenido de vitamina C

Se utilizó el método espectrofotométrico reportado por Al-Ani et al. (2007) para la
determinación del contenido de vitamina C.

1. Fundamento

Este método se basa en la cuantificación espectrofotométrica del complejo
coloreado formado por la reacción entre los productos de oxidación del ácido ascórbico y el
reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNP). El método colorimétrico de 2,4-
dinitrofenilhidrazina ampliamente utilizado para la determinación del nivel de ácido
ascórbico en los fluidos biológicos se adaptó a la estimación total contenido de vitamina C
en las frutas.

El procedimiento depende del principio de la oxidación de ácido L-ascórbico en
ácido dehidroascórbico y 2,3-dicetogulónico, seguido de la reacción con 2,4-
dinitrofenilhidrazina. Después del tratamiento con ácido sulfúrico, un producto de color
rojo parduzco se forma cuya absorbancia se mide a 520 nm.La absorbancia del color
formado es proporcional a la cantidad de ácido ascórbico (más ácido dehidroascórbico)
presentes en la solución antes de la oxidación.

2. Reactivos

- Ácido metafósforico al 6%
- Ácido sulfúrico 4,5mol/L
- Ácido sulfúrico 12 mol/L
- 2,4-dinitrofenilhidrazina al 2.2%
- Tiourea al 5%
- Solución sulfato de cobre al 1%
- Ácido ascórbico



2.1. Solución de ácido metafosfórico al 6%

Se disolvió 60g de ácido metafosfórico en 400 mL de agua destilada. Se mezclo
bien y se transfirió en un fiola de 1L y se enrazó con agua destilada hasta la línea de aforo.
Se almacenó a 4°C por un tiempo no mayor a una semana.

2.2. Solución de 2,4 dinitrofenilhidrazina al 2.2%

Se disolvió 4,84g de 2,4 dinitrofenilhidrazina en 220 mL de una solución de ácido
sulfúrico 4,5 mol/L. Se mezclo bien, se friltro y se transfirió a un fraco. Se almacenó a 4°C
por un tiempo no mayor a una semana.

2.3. Solución de tiourea al 5%

Se disolvió 5g de tiourea en 20 mL de agua destilada. Se mezclo bien y se transfirió
en un fiola de 100mL y se enrazó con agua destilada hasta la línea de aforo. Se almacenó a
4°C por un tiempo no mayor a un mes.

2.4. Solución de sulfato de cobre al 1%

Se disolvió 1,56g de sulfato de cobre (CuSO
4
•5H
2
O) en 20 mL de agua destilada. Se
mezclo bien y se transfirió en un fiola de 100mL y se enrazó con agua destilada hasta la
línea de aforo. Se almacenó a 4°C por un tiempo no mayor a un mes.

2.5. Reactivo dinitrofenilhidrazina-tiourea-sulfato de cobre (DTC)

Se combinó 10 mL de solución tiourea al 5%, 10 mL de solución sulfato de cobre al
1% y 200 Ml del reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina al 2,2% Se mezcló bien y se almaceno
en una botella ambar cerrada a 4°C por un tiempo no mayor a una semana.




2.6. Soluciones de trabajo o estándares

Se empleo el ácido ascórbico como solución de trabajo, ya que es de uso común
como estándar en las curvas de determinación de vitamina C.

2.6.1. Solución madre de ácido áscorbico

Se preparó una solución madre de ácido ascórbico, para la cual se pesó 10 mg de
ácido áscorbico y se disolvió en 100 mL de ácido metafosfórico al 6% en una fiola.

2.6.2. Estándares o soluciones de trabajo de ácido ascórbico

A partir de la solución madre de ácido ascórbico de 0,1 mg/mL, se prepararon
soluciones de trabajo a distintas concentraciones. Se graficaron los valores de
concentración de ácido ascórbico y sus absorbancias, los cuales fueron analizados por
medio de una regresión lineal.


y = 3.9222x - 0.0085
R² = 0.9969
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 á
c
i
d
o

a
s
c
ó
r
b
i
c
o

(
m
g
/
1
0
0
m
l
)


Absorbancia a 520 nm
Curva Estandar de Determinación de vitamina C

Figura 22: Curva estándar de ácido ascórbico para la determinación del contenido de
vitamina C


3. Preparación de la muestra

La fruta fue lavada con agua destilada y luego se separó la pulpa de la cáscara y
semilla. Se utilizó la pulpa para la preparación de los extractos. Se peso 1 g de muestra y se
mezcló con 9 mL de solución de ácido metafosforico al 6% y se llevó a centrifugar a 6000
RPM por espacio de 10 minutos a 4ºC. Luego se procedió a filtar con paper Whatman Nº1,
seguido de otra filtración usando papel filtro 0.45 μm ambas al vacío.

4. Procedimiento

Una vez obtenida la solución de trabajo (muestra), con una micropipeta se tomó
1200 µL de la muestra (sobrenadante claro) y se diluyo con 400 µL de reactivo DTC en
un tubo de ensayo. Este procedimiento se realizó por triplicado. Al mismo tiempo se
preparó un blanco con 1200 µL de solución de ácido metafósforico al 6% en lugar de la
muestra y se procedió de igual manera que con la muestra.

Se agitó en el vortex y se llevó a incubar en baño maría a 37 ºC por un tiepo de 3
horas.

Transcurrido el tiempo se procedío a enfriar por un espacio de 10 minutos, haciendo
uso de hielo. Luego se añadió lentamente 2 mL de solución fría de ácido sulfúrico 12mol/L
a cada uno de los tubos de ensayo, y se procedió agitar la mezcla en el vortex.

Se llevó a cero el espectrofotómetro haciendo uso del blanco, para ello se transfirió
la solución a una cubeta de vidrio limpia, sacudiéndose cuidadosamente para eliminar las
burbujas que podrían estar presentes y se realizó la lectura a 520 nm.




Se elaboró una curva patrón utilizando ácido ascórbico como compuesto de
referencia. Los resultados se expresaron en mg equivalente de ácido ascórbico / 100g de
muestra.



a + bX: Proviene de la curva estándar.Donde X: Abs
520nm.
La ecuación que se obtuvo
a partir de la gráfica de la curva estándar es la siguiente:y = 3,9222x + 0,0085.

V: (Volumen de solvente en mL + Volumen de muestra en mL) / (Volumen de
muestra en mL). Se asume que la muestra tiene densidad igual a 1, es decir 1g=1mL.






mg de ácido ascórbico/100 mL muestra = (a + bX) *V