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I.

OBJETIVOS:
Conocer el funcionamiento de un Espectrofotmetro.
Calcular la concentracin de una solucin problema.
Determinar la curva de calibracin del Bicromato de Potasio.
Hallar el factor de calibracin de la solucin de Bicromato de Potasio.
Determinar las Absorbancias de la solucin problema.
II. MARCO TEORICO:
Entre los mtodos pticos ms usados en el anlisis bioqumico se encuentra
la otometra !Colorimetra " Espectrofotometra#.
$a otometra permite medir la concentracin% establecer la estructura e
identificar ciertas sustancias% aprovec&ando su capacidad de absorber o emitir
ener'a. Este mtodo se utili(a para se'uir las reacciones catali(adas por
en(imas mediante la medicin espectrofotomtrica de la aparicin del producto
o la desaparicin del sustrato.
$os otocolormetros son aparatos que emplean ciertas lon'itudes de onda.
$os espectrofotmetros emplean todas las lon'itudes de onda !ultravioleta "
visible#. Ellos permiten medir la trasmisin " la densidad ptica.
Ley de Beer-Lambert (o ley de Beer-Lambert -Bouguer)
$a absorbancia de un &a( de radiacin monocromtica colimado en un medio
isotrpico &omo'neo es proporcional al camino de la absorcin% l% " a la
concentracin% c% o )en fase 'aseosa) a la presin de las especies que
absorben. Esta le" se aplica solo ba*o las limitaciones de la ley de Lambert "
para las especies que absorben sin formar a're'ados dependientes de la
concentracin o de la presin. $a le" puede e+presarse como,
A - lo' !P
0
. P # - cl P - P
0
/0 1 cl
Donde la constante de proporcionalidad% e% se denomina coeficiente de
absorcin molar !decimal#. 2i l se e+presa en cm " c en mol dm13 o 4% e
resultar en dm3 mol1/ cm1/% o 4
1/
cm
1/
que son las unidades utili(adas
com5nmente. En el 26 las unidades de e son m7 mol1/. 8tese que se debe
usar la potencia radiante espectral porque la le" de Beer1$ambert se aplica solo
si la anc&ura de banda espectral de la lu( es estrec&a comparada con la
anc&ura de las lneas del espectro.
III. DESARROLLO EXPERIMENTAL:
/. Enumerar los tubos de ensa"o.
7. Preparar la si'uiente batera de tubos,
9ubo 6 9ubo 66 9ubo 666 9ubo 666
Bicromato de
potasio
/ml 7ml 3ml :ml
A'ua Destilada ;ml <ml =ml >ml
2olucin 2toc?, Bicromato de Potasio :0m'@
3. Calcular la concentracin en m'@ de Bicromato de Potasio en cada uno de
los tubos,
9ubo 6 9ubo 66 9ubo 666 9ubo 666
Bicromato de
potasio
/ml 7ml 3ml :ml
A'ua Destilada ;ml <ml =ml >ml
Dilucin /./0 7./0 3./0 :./0
Concentracin !m'
@#
:m'@ <m'@ /7m'@ />m'@
Procedimiento para &allar la concentracin !m'@#,
9ubo 6, 9ubo 66,
/ + :0 - :m'@ 7 + :0 - <m'@
/0 /0
9ubo 66, 9ubo 6A,
3 + :0 - /7m'@ : + :0 - />m'@
/0 /0
:. $eer las Absorbancias de los cuatro tubos a B30nm de lon'itud de onda ! #
utili(ando el espectrofotmetro.
B. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la 'rfica de
absorbancia vs Concentracin de Bicromato de Potasio.
>. Cna ve( obtenida la curva de calibracin% medir la absorbancia de la muestra
problema.
=. Dbtener el factor de calibracin !c# promedio con las soluciones 2tandard
utili(adas para construir las curvas de calibracin a*ustadas.
2e obtuvo lo si'uiente,
9ubo 6 9ubo 66 9ubo 666 9ubo 666
Concentracin m'@ : < /7 />
Absorbancia 0.00> 0.00: 0.0B3 0.0B/
actor de calibracin >>>.= 7000 77>.: 3/3.=
Procedimiento para &allar el factor de calibracin,
9ubo 6, 9ubo 66,
: - >>>.= < - 7000
0.00> 0.00:
9ubo 666, 9ubo 6A,
/7 - 77>.: /> - 3/3.=
0.0B3 0.0B/
<. $ue'o% calcular el factor de calibracin promedio !c+#,
c+ - f/ E f7 E f3 E f:
:
c+ - >>>.=E77>.:E7000E3/3.= - 370>.< - <0/.=
: :
;. Calcular la concentracin de la muestra problema% por los si'uientes
mtodos,
F Grficamente e+trapolando su absorbancia en la curva de calibracin.
!Aer en papel milimetrado#.
F Analticamente% multiplicando su absorbancia por el factor de calibracin del
2tandard.
Dbtenindose lo si'uiente,
9CBD 6 , 9CBD 666 ,
<0/.= + 0.00> - :.</07 m' !@# <0/.= + 0.0B3 - :7.:;0/ m' !@#
9CBD 66 , 9CBD 6A ,
<0/.= + 0.00:- 3.70>< m' !@# <0/.= + 0.0B/ - :0.<<>= m' !@#
IV. DISCUSIN DE LOS RESULTADOS:
- Al pipetear la solucin de bicromato de potasio " de a'ua destilada al parecer
no se reali( de la manera adecuada% "a que al finali(ar se diferenci que los
cuatro tubos de ensa"o no quedaban al mismo nivel siendo el mismo volumen
final !/0ml# en cada tubo.
1 Cuando se llevan las muestras de los : tubos al espectrofotmetro para su
lectura de la absorbancia% se tiene que tener cuidado con la manipulacin de la
cubeta "a que deben mane*arse con cuidado para evitar ralla(os sobre la
superficie por donde pasa la lu(. 2i es que la cubeta estuviera rallada% los ra"os
de lu( que incidan en la (ona se difractan " no pasan por la muestra% por lo
que puede dar lecturas de absorbancia errneas.
V. CONCLUSIONES:
1 A ma"or concentracin en las soluciones% ma"or ser la cantidad de soluto
adsorbida cuando se mantiene la cantidad de adsorbente constante.
1 $a absorbancia es directamente proporcional a la concentracin " la
transmitancia es inversamente proporcional a esta.
1 El Espectrofotmetro tiene la capacidad de pro"ectar un &a( de lu(
monocromtica !de un lar'o de onda particular# a travs de una muestra "
medir la cantidad de lu( que es absorbida por dic&a muestra.
1 $as cubetas son unos viales de plstico transparente o cuar(o que de*an
pasar la lu(% siendo las me*ores las de cuar(o porque su interferencia al paso
de la lu( es mnimo.
1 9odas las molculas presentan absorbancia porque todas interfieren con el
paso de la lu(. 2lo que la absorbancia ser ptima a un lar'o de onda de lu(
especfico para cada tipo de sustancia.
1 2e comprob que la intensidad de los colores en este caso intensidad del
color amarillo tienen diferente absorbancia.
VI. RECOMENDACIONES:
- Antes de tomar una lectura en el espectrofotmetro se debe observar que la
cubeta no ten'a ralla(os ni est sucia% sino tendra que limpiarse con papel
tis5. 8o se debe usar nin'5n otro tipo de papel para limpiar las cubetas% puesto
que pueden soltar fibras que pudieran caer en la muestra o rallar la superficie.
Adems% si la cubeta se manipula muc&o% debe de ser sostenerla usando
papel tis5 para evitar pe'arle los aceites que normalmente tenemos en las
manos.
VI. CUESTIONARIO
. E!"#$%&e e# me'a($)m* de +&('$*(am$e(t* de &( e)"e'tr*+*t,metr*.
$os mtodos espectroscopios de anlisis se basan en la medida de la radiacin
electroma'ntica emitida o absorbida por la materia.
$os mtodos espectroscpicos se clasifican se'5n la re'in del espectro
electroma'ntico que est implicadaH siendo las ms importantes las re'iones
de ra"os I% ultravioleta% visible% infrarro*a% microondas " radiofrecuencia.
Cn espectrofotmetro est equipado con un monocromador de prisma o red%
que permite la seleccin de cualquier lon'itud de onda dentro de la capacidad
del instrumento. $os espectrofotmetros son adecuados para reali(ar medidas
en las re'iones ultravioleta% visibles e infrarro*a.
Esto le permite reali(ar dos funciones,
/. Da informacin sobre la naturale(a de la sustancia en la muestra. Esto se
lo'ra midiendo la absorbancia !Abs# a distintos lar'os de onda !# " 'raficar
estos valores en funcin del lar'o de onda% formando un espectro'rama. Como
cada sustancia tiene unas propiedades espectrales 5nicas% distintas sustancias
producen distintos espectro'ramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene
un arre'lo de tomos tridimensional particular que &ace que cada sustancia
ten'a caractersticas 5nicas. Al ser e+puestos a la lu( del espectrofotmetro%
al'unos electrones de los tomos que forman las molculas absorben ener'a
entrando a un estado alterado. Al recuperar su estado ori'inal% la ener'a
absorbida es emitida en forma de fotones. Esa emisin de fotones es distinta
para cada sustancia% 'enerando un patrn particular% que vara con el lar'o de
onda usado. Dependiendo del lar'o de onda% ser la cantidad de ener'a
absorbida por una sustancia% lo que lo'ra 'enerar un espectro particular al
'raficar Abs vs
7. 4uestra la cantidad que est presente de la sustancia que nos interesa.
$a concentracin es proporcional a la absorbancia% se'5n la $e" Beer1$ambert,
a ma"or cantidad de molculas presentes en la muestra% ma"or ser la
cantidad de ener'a absorbida por sus electrones.
Abs - J C $ Abs, absorbancia
J, coeficiente de e+tincin molar
C, concentracin
$, distancia que via*a la lu( a travs de
la muestra. !normalmente es de / cm#
$a cubeta promedio% que 'uarda la muestra% tiene dimensiones internas de un
centmetro !$#. $a ecuacin describe una lnea recta% donde el ori'en es cero.
2i $ es constante !/.0 cm# " se conoce el valor de J% podemos calcular C en
base a Abs,
Abs . J $ - C
El espectrofotmetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de
lu( ultravioleta " visible !700 a <B0 nm#. El lar'o de onda es determinado por un
prisma que descompone el ra"o de lu( de acuerdo al lar'o de onda esco'ido.
$ue'o la lu( pasa por una &endidura que determina la intensidad del &a(. Este
&a( atraviesa la muestra " lle'a a un tubo foto'rfico% donde es medido. $a
cantidad de lu( que atraviesa la muestra es el porcenta*e !@# de tramitancia.
Podemos usar esta unidad o cambiarla a absorbancia usando la si'uiente
ecuacin.
@9 - - $o' Abs.
El espectrofotmetro nos puede dar ambos valores a la misma ve(% a&orrando
la necesidad de &acer los clculos. !9ramitancia- cantidad de lu( que atravie(a
la me(cla#.
Cna caracterstica del instrumento es la necesidad de KblanquearL el aparato
antes de cada lectura. Esto se &ace colocando una cubeta con una solucin
control que ten'a todos los componentes de la reaccin menos la sustancia
que va a ser medida en el instrumento " a*ustando la lectura a cero
absorbancia. El propsito de esto es eliminar el re'istro de absorbancia
!bac?'round# que puedan presentar los dems componentes de la reaccin a
ese lar'o de onda particular.

-. ./&0 d$+ere('$a) e!$)te( e(tre &( +*t*'*#*r1metr* y &(
e)"e'tr*+*t,metr*2
Estos son equipos utili(ados en el $aboratorio clnico para el anlisis de
muestras fisiol'icas% basndose en el principio que cada compuesto qumico
absorbe o emite ener'a lumnica de diferente lon'itud de onda. Esta lon'itud
puede estar en el espectro de lu( visible% o en otra parte del espectro
electroma'ntico.
$a diferencia fundamental entre un espectrofotmetro " un fotmetro o
fotocolormetro% consiste en que el fotocolormetro traba*a 5nicamente en el
espectro de lu( visible " selecciona una lon'itud de onda determinada
mediante filtros fi*os
El otocolormetro " sus partes
/. 6nterruptor de encendido
7. Portafiltros
3. Portamuestras
:. Control de compensacin
B. A*uste de cero mecnico
>. Cartula del 'alvanmetro
=. Escala lo'artmica
En cambio% un Espectrofotmetro es capa( de traba*ar% no solo con la lu(
visible sino que en otras re'iones del espectro electroma'ntico !ultravioleta e
infrarro*a#. Adems posee un monocromador para seleccionar la lon'itud de
onda deseada.
Espectrofotmetro " sus partes
/. C&asis
7. Portacubeta
3. 2elector de filtro
:. 2elector de modo
B. A*uste 'rueso
>. 2elector de lon'itud de onda
=. 6ndicador de lon'itud de onda
<. Pantalla !displa"#
3. 4ra+$%&e e# e)"e'tr* de #&56 ta(t* e( e# ra(7* 8$)$b#e '*m* (* 8$)$b#e
'*( )&) re)"e't$8a) #*(7$t&de) de *(da).
1Espectro de la lu( en ran'o visible " no visible
1Espectro de lu( en ran'o solamente visible
9. ./&0 re#a'$,( matem:t$'a e!$)te e(tre Ab)*rba('$a y Tram$ta('$a2
En disolucin% la absorbancia es el lo'aritmo decimal del cociente entre la
potencia radiante espectral de la lu( transmitida a travs de la referencia " la de
la lu( transmitida a travs de la muestra% ambas observadas en cubetas
idnticas. 9 es la transmitancia !interna#.
Esta definicin supone que toda la lu( incidente es transmitida o absorbida%
siendo despreciables la refle*ada " la difundida.
4ientras que% la transmitancia es el Cociente entre la potencia radiante
espectral (P ) transmitida " la que incide sobre la muestra (P
0
):
T - P .P
0
$a transmitancia interna se refiere a la prdida de ener'a por absorcin%
mientras que la transmitancia total tiene en cuenta la absorcin% la refle+in% la
dispersin% etc.
$os espectrofotmetros miden en @ de transmitancia !9# " absorbancia !A#. El
porciento de transmitancia se refiere a la cantidad de radiacin que pasa a
travs de la muestra " alcan(a el detector. $as unidades de absorbancia van de
0 a 7. $a absorbancia se relaciona con la transmitancia como A -1 lo' /.9%
!lo'aritmo decimal#.
$a Absorbancia se define matemticamente como,

=
0
log
I
I
A

$a trasmitancia se define matemticamente,
0
I
I
T =
Entonces la 9rasmitancia se relaciona con la Absorbancia como,

= =
0
log log
I
I
T A
Por lo tanto% la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin "
la transmitancia es inversamente proporcional a esta.
;. C*()tr&ya &(a '&r8a de 'a#$bra'$,( '*( #*) )$7&$e(te) 8a#*re),
2tandard / 2tandard 7 2tandard 3 2tandard
:
2tandard B
Concentracin Bm'.dl /0m'.dl 70m'.dl 30m'.dl :0m'.dl
Absorbancia 0.07B 0.0B0 0./00 0./B0 0.700
Con la curva obtenida &allar la concentracin de las si'uientes muestras%
sabiendo que sus absorbancias fueron,
4uestra AMMMM0.0/B
4uestra BMMMM0./7B
4uestra CMMMM0.3B0
2olucin,
Dbtenindose,
4uestra A - 0.0/B A - !B F 0.0/B#.0.07B 3 m'.dl
4uestra B - 0./7B B - !B F 0./7B#.0.07B 7B m'.dl
4uestra C - 0.3B0 C - !B F 0.3B0#.0.07B =0 m'.dl
VII. BIBLIO4RA<=A:
BroNn1$e4a"1Bursten. /;;3. Oumica. Prentice1Hall Hispanoamericana
2.A. 4+ico. 4+ico.
alen Bo''ie% P. /;;7. 4anual de prctica de Bioqumica. $ima. Per5.
Qamos% 2H Pa*ares% E. /;;/. Oumica General. 4anual de $aboratorio.
Editorial 2E4 $tda.. $ima .Per5.
6nformacin obtenida de los sitios Neb,
NNN.fotoquimica.or'.
NNN.frlp.utn.edu.ar.'rupos.aepeq.lab.&tml
NNN.efn.uncor.edu.intrbiol.espectro
NNN.efn.uncor.edu
&ttp,..edison.upc.edu.curs.llum.lu(Rvision.lu(.&tml