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PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE MUESTRAS

LISTA DE MATERIAL NECESARIO:

Frascos estériles o bolsas desechables estériles NASCO


Cucharas o espatulas estériles.
Mechero
Desinfectantes (alcohol 70%, etc..)
**Todo este material debe estar envuelto en forma individual previamente esterilizado e
identificado.

Además el muestreador deberá de utilizar cubrebocas y bata.

La toma de muestra con fines de análisis microbiológicos se realiza en condiciones


asépticas evitando así, que se produzca contaminación durante la obtención.

A)TOMA DE MUESTRA:

• Alimentos líquidos: se deberán agitar o mezclar, hasta conseguir homogenizar y


después hacer la toma de muestra asepticamente.
• Alimentos sólidos: pueden muestrearse con ayuda de tubos estériles utilizados como
sacabocados o bien usar, cucharas, tenedores y cuchillos todo previamente
estérilizado.
• Alimentos envasados: es preciso abrirlos y extraer la muestra en condiciones
asépticas para evitar contaminación.
• Alimentos a granel: En productos a granel, tomar la muestra a partir de varios puntos
del contenedor para obtener una muestra representativa.

La cantidad de producto muestreado varia, así que enseguida se mencionan algunos y su


cantidad a muestrear:

Producto Cantidad a muestrear


Carnes crudas 250 g
Ensaladas de frutas 200 g
Ensaladas rusas o mixtas 200 g
Salsas crudas 100 g
Salsas cocidas 100 g
Quesos frescos 250 g
Cremas 200 g
Alimentos cocinados 250 g
Salsas a base de leche 100 g
Bocadillos 100 g
Agua 100 ml
Hielo potable 500 g
Nieve 250 ml

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B) IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA:

1.-La información que deberá identificar a la muestra es fecha, lugar de muestreo,


descripción de la muestra, iniciales de la persona que muestreo.

C) PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LA MUESTRA:

Los alimentos lìquidos poco espesos y poco contaminados se pueden trabajar


directamente sin dilución ya que método Simplate se obtendrá un rango de conteo de <2
a >738 UFC/ml.
En el caso que su muestra tuviera un conteo mas elelvado a 738 UFC/ml se
tendrá que hacer diluciones para aumentar el rango de conteo.

*Los alimento sólidos se tendran que preparar en la dilución 1:10.

Dilución 1:10.
Tomar 10 ml de muestra con una pipeta serologica estéril de 10 ml. (Muestras líquidas)
o en muestras sólidas pesar asépticamente 10 g de muestra.
Homogenizar en 90 ml de Buffer de Fosfatos estéril.

Con el método Simplate se podrá tener un rango de conteo con dilución 1:10 de <20
UFC/ml hasta 7380 UFC/ml.

Dilución 1:100
Tomar 1 ml de la dilución 1:10
Homogenizar en un tubo de ensayo con 9 ml de buffer de fosfatos estéril.

Con el método Simplate se podrá tener un rango de conteo con dilución 1:100 de <200
UFC/ml hasta 73800 UFC/ml.

Y así sucesivamente usted podrá aumentar 10 veces el rango de conteo en cada dilución
pasando solamente 1 ml de la dilución anterior a 9 ml de buffer de fosfatos estéril.

*Estas diluciones aplican a las 3 determinaciones de Simplate, solamente variará el


grado de dilución de la muestra para el tipo de determinación microbiologica
(generalmente la dilución que se maneja mas alta es para cuenta total ya que esta abarca
todos los microorganismos que pueden crecer a 35ºC). Pero todo dependerá de la
contaminación del producto y de los límites que se manejen para el tipo de alimento.

PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO RÁPIDO SIMPLATE

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CUENTA TOTAL Color Indicator o Fluorescente

FUNDAMENTO:

Este método esta basado en tecnología de enzimas múltiples en donde un buffet de sustratos
que es proporcionado por el reactivo hacen un enlace enzima-sustrato con las enzimas que contienen la
bacteria mesófilica. Produciendo así después de 24 horas de incubación una flourescencia debido a la
reacción enzima-sustrato de la cual el sustrato desprende una molécula de color la cual es la 4-metil
umbeliferona (MUG).

Procedimiento:

A-1)Reactivo Cuenta Total prueba múltiple (para 10 muestras):

Este reactivo se disuelve en 100 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 12 hrs en
refrigeración.

A-2) Reactivo Cuenta Total prueba sencilla ( para una muestra):

Este reactivo se disuelve en 9 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 12 hrs en
refrigeración.

B) Preparación e inoculación de la muestra:

1) Se coloca 1 ml de muestra en el centro de la placa SIMPLATE.

2) Posteriormente se le agregan 9 ml del reactivo Cuenta Total.

3) Se homogeniza con movimientos circulares de la placa y golpeando un poco para eliminar las
burbujas que se pudieron haber formado.

4) Se retira el exceso de la placa y se invierte, incubando posteriormente a 35ºC por 24 hrs.

C) Lectura:
1) Después de 24 hrs de incubación se incide la luz UV en cada una de las placas contando los pocillos
fluorescentes refiriendo este número a una tabla de NMP proporcionada por su distribuidor
multiplicando este número por la dilución que se halla hecho.
Por ejemplo: si en mi placa 1:10 cuento 1 pocillo fluorescente el NMP correspondiente es de 2
multiplicando por la dilución x 10= 20 UFC/g.

COLIFORMES Y E. COLI

FUNDAMENTO:

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Este método esta basado en tecnología de sustrato definido, el cual tiene la ventaja de poder contar
coliformes totales y E. Coli con cuentas separadas.
En Coliformes totales ocurre la reacción de B-d-glucuronidasa (enzima proveniente de los coliformes totales) y el
sustrato (aportado por el reactivo) es B-d-glucuronido-rojo de cloro fenilo; de tal manera que al ocurrir la
reacción enzima-sustrato se desprendera la molécula de color la cual es el rojo de cloro fenilo (RCPG ) (puede
tener totalidades desde un rosa tenue hasta un rojo carmin).
En E. Coli ocurre la reacción de B-d-glucuronidasa (enzima proveniente de E. Coli ) y el sustrato (aportado por
el reactivo) el cual es B-d-glucuronido-4-metil umbeliferona; de tal manera que al ocurrir la reacción enzima-
sustrato se desprendera la molécula de color la cual es 4-metil umbeliferona (MUG)la cual con la insidencia de la
luz UV da flourescencia (puede ser variable desde un azul fuerte hasta un azul tenue .

Procedimiento:

A-1)Reactivo Coliformes y E. Coli prueba múltiple (para 10 muestras):


Este reactivo se disuelve en 100 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 12 hrs en
refrigeración.

A-2) Reactivo Cuenta Total prueba sencilla ( para una muestra):

Este reactivo se disuelve en 9 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 12 hrs en
refrigeración.

C) Preparación e inoculación de la muestra:

1)Se coloca 1 ml de muestra en el centro de la placa SIMPLATE.

2)Posteriormente se le agregan 9 ml del reactivo de Coliformes y E. Coli.

3)Se homogeniza con movimientos circulares de la placa y golpeando un poco para eliminar las
burbujas que se pudieron haber formado.

4)Se retira el exceso de la placa y se invierte, incubando posteriormente a 35ºC por 24 hrs.

C)Lectura:
Después de 24 hrs de incubación podremos ver a simple vista ya que los pocillos positivos dan un tono
de rosa a rojo (esos corresponden a Coliformes totales) y este número de refiere a una tabla de NMP
reportando como Coliformes UFC/g o ml y posteriormente se incide la luz UV en cada una de las
placas contando los pocillos fluorescentes (estos corresponderán a E. Coli) refiriendo este número a una
tabla de NMP proporcionada por su distribuidor multiplicando este número por la dilución que se halla
hecho, reportando el nùmero de E. Coli UFC/g o ml de muestra. .Por ejemplo: si en mi placa 1:10
cuento 1 pocillo positivo el NMP correspondiente es de 2 multiplicando por la dilución x 10=Reportare
20 UFC/g

HONGOS Y LEVADURAS Fluorescente ó Color Indicator

FUNDAMENTO:
Este método esta basado en tecnología de enzimas múltiples en donde un buffet de
sustratos que es proporcionado por el reactivo hacen un enlace enzima-sustrato con las enzimas
que contienen la bacteria mesófilica. Produciendo así después de 48 horas de incubación (30 ºc)
una flourescencia debido a la reacción enzima-sustrato de la cual el sustrato desprende una

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molécula de color la cual es la 4-metil umbeliferona (MUG ) ó la reducción respectiva de la
resarzurina en colores de tonalidades melón, rojizo, café, rosa y blanco.

Procedimiento:

A-1)Reactivo Hongos y Levaduras prueba múltiple (para 10 muestras):


Este reactivo se disuelve en 100 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 1 semana en
refrigeración.

A-2) Reactivo Hongos y Levaduras prueba sencilla ( para una muestra):

Este reactivo se disuelve en 9 ml de agua destilada estéril, tiene una vida útil de 1 semana en
refrigeración.

C) Preparación e inoculación de la muestra:

1)Se coloca 1 ml de muestra en el centro de la placa SIMPLATE.

2)Posteriormente se le agregan 9 ml del reactivo de Hongos y Levaduras

3)Se homogeniza con movimientos circulares de la placa y golpeando un poco para eliminar las
burbujas que se pudieron haber formado.

4)Se retira el exceso de la placa y no se invierte, incubando posteriormente a 30ºC por 48 hrs o a 25 ºC
por 72 hrs.

C)Lectura:
1) Después de 48 o 72 hrs de incubación se incide la luz UV en cada una de las placas contando los
pocillos fluorescentes refiriendo este número a una tabla de NMP proporcionada por su distribuidor
multiplicando este número por la dilución que se halla hecho.
2) En el formato color indicator, todas los pocillos que cambien a un color diferente en tonalidad al
púrpura-violeta de inicio, son tomados como positivos (tonalidades comunes: blanco, melón, café,
rojizo)
Por ejemplo: si en mi placa 1:10 cuento 1 pocillo fluorescente el NMP correspondiente es de 2
multiplicando por la dilución x 10= 20 UFC

PROCEDIMIENTOS
PRODUCTOS IDEXX

COLILERT (Presencia/Ausencia)

USO.-
se utiliza para detección simultanea, identificación y confirmación de resultados para coliformes totales
y E. Coli en agua.

PRINCIPIO.-

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Utiliza la tecnologia de sustrato definido (DST). El sistema es una formulación diseñada
especificamente que optimiza el pH y el ambiente químico de crecimiento, esto permite favorecer el
crecimiento de los microorganismos mas rápidamente posible para lo cual fue diseñado.
PERMITIENDO suprimir los microorganismos QUE NO CONTIENEN ESTA ENZIMA necesaria y no
LOGRAN DIGERIR el nutriente indicador y por lo tanto no pueden tener crecimiento.

La formulación de colilert es especifica para optimizar el crecimiento de coliformes totales y


E. Coli en agua.

El nutriente indicador que contiene, correspondiente al microorganismo que se desea analizar.

Los microorganismos objetivos tienen afinidad por el nutriente indicador que corresponde con
su metabolismo y que puede usar como una fuente importante de carbono. Los nutrientes indicadores
específicos de colilert, el orto-nitrofenil-b-d-galactopiranoside (ONPG) y el 4 metil-umbeliferil-b-d-
glucuronido (MUG) corresponden a las enzimas constitutivas que siempre están presentes en las
bacterias y que solo existen en las coliformes y E. Coli las bacterias coliformes tienen la enzima B-
galactosidasa y si existe una bacteria coliformes tienen la enzima B-galactosidasa y si existe una
bacteria coliforme en la muestra metabolizada el ONPG dará una coloración amarilla. E.Coli contiene
la enzima B-Glucuronidasa y si esta se encuentra en la muestra metabolizada el MUG producirá
fluorescencia.

PROCEDIMIENTO.-

1.- Agregue el reactivo a 100 ml de agua (muestra).

2.- Incube a 35º C +/- 0.5º C por 24 hrs.

3.- Leer resultados

INTERPRETACIÓN:

INCOLORO.- Negativo a coliformes y E. Coli

AMARILLO SIN FLUORESCENCIA (a la incidencia de Luz UV 365 nm).-positivo a Coliformes


totales y negativo a E. Coli

AMARILLO CON FLUORESCENCIA (a la incidencia de Luz UV 365).-positivo a Coliformes totales


y positivo a E. coli.

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