You are on page 1of 42

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

MEDICINOS FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS KATEDRA







NAUJAUSI PASIEKIMAI
BALTYMŲ BIOSINTEZĖS SRITYJE

Mokslinė studija












Kaunas, 2007
TURINYS

1. PROGRAMOS APRAŠYMAS.
2. STUDIJŲ DALYKO „BALTYMŲ BIOSINTEZĖ“ PASKAITŲ KONSPEKTAI:
2. 1. Transliacijos proceso bendra charakteristika. Baltymų biosintezės stadijos.
2. 2. Ribosomos, jų sandara, funkcijos vietos.
2. 3. Transliacijos iniciacija.
2. 4. Polipeptidinių grandinių elongacija. Transliacijos terminacija.
2. 5. Baltymo biosintezės inhibitoriai. Antibiotikų poveikio baltymų sintezei mechanizmai.
3. TEORINĖ-PRAKTINĖ DALIS:
3. 1. Laboratorinių darbų aprašas:
3. 1. 1. Suminių transportinės RNR ir aminoacil-tRNR sintetazių preparatų
išskyrimas iš pelių kepenų ir jų aktyvumo nustatymas.
3. 1. 2. Transliacijos greičio ir lygio nustatymas. neląstelinėje baltymus
sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų.
3. 1. 3. Baltymų analizė gel-filtracijos, elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje
denatūruojančiomis sąlygomis ir imunoblotingo metodais.
3. 2. Studijų dalyko „Baltymų biosintezė“ seminarų temų konspektai:
3. 2. 1. Genetinio kodo bendros savybės ir iššifravimas.
3. 2. 2. Informacinės RNR (mRNR) savybės ir brendimas.
3. 2. 3. tRNR struktūra. Aminoacil-tRNR sintetazės. Aminorūgščių liekanų
akceptavimas (prijungimas) prie tRNR.
3. 2. 4. Potransliacinis baltymų paskirstymas ir modifikavimas.
4. METODINIS DALYKO PROGRAMOS APRŪPINIMAS.
4. 1. Studijoms rekomenduojama pagrindinė literatūra.
4. 2. Savarankiškam darbui rekomenduojama papildoma literatūra.





Biomedicinos mokslų srities
medicinos krypties
Baltymų biosintezės dalyko studijų programa
Medicinos fakulteto II kurso studentams

Modulis (dalykas) – MF/BCM/M-VO1 Biochemija
Studijų programa – Medicina
Dėsto padalinys – Biochemijos katedra

Studijų dalyko programos poreikis:
Aukštos kvalifikacijos medikai ir biologai turi išmanyti genų raiškos molekulinius
mechanizmus, suprasti kaip įvairūs veiksniai gali paveikti svarbiausią genetinės informacijos
realizavimo etapą ląstelėje – baltymų sintezės procesą ir kokios gali būti tų pokyčių pasekmės
organizmo funkcionavimui. Jie taip pat turi suprasti biocheminės, molekulinės biologijos,
biotechnologijos, medicininės genetikos, genų terapijos ir kitas taikomojo pobūdţio
problemas.

Studijų tikslai:
Išnagrinėti gyvybiškai svarbaus proceso – baltymų biosintezės funkcionavimo ypatumus tiek
ţmogaus ir gyvūnų, tiek ir bakterijų ląstelėse bei supaţindinti su šio proceso reguliavimo
būdais.

Studijų rezultatai:
Įgytos žinios/mokėjimai/įgūdžiai
Programos tikslas yra suteikti medicinos krypties studentams ţinias apie genų raiškos
molekulinius mechanizmus, supratimą kaip įvairūs veiksniai gali paveikti svarbiausią
genetinės informacijos realizavimo etapą ląstelėje – baltymų sintezės procesą ir kokios gali
būti tų pokyčių pasekmės organizmo funkcionavimui. Jie taip pat turi suprasti biocheminės,
molekulinės biologijos, biotechnologijos, medicininės genetikos, genų terapijos ir kitas
taikomojo pobūdţio problemas.

Įgyti gebėjimai
Studentai įsisavins molekulinės biologijos tyrimo metodus ir, panaudojant gautas teorines
ţinias, sugebės juos pritaikyti ląstelių transliacijos sistemos tyrimuose.

Studijų apimtis:

Bendras akademinių valandų ir kreditų skaičius: 80 valandų – 2 KMU kreditai

Auditorinių valandų skaičius: 40 val.

Akademinių valandų paskirstymas:

Paskaitos
10 val.
Laboratoriniai darbai
18 val.
Seminarai
12 val.
Savarankiškas darbas
40 val.
Studijų turinys:
Programoje aprašyti baltymų biosintezės aparato pagrindiniai komponentai, sudėtingo
daugiastadijinio baltymų biosintezės proceso molekulinis mechanizmas, šio proceso
specifiniai ypatumai prokariotams ir eukariotams, antibiotikų ir toksinų veikimai. Išanalizuoti
transliacijos mechanizmai ląstelėse normoje ir fagų bei virusų įtakoje. Aprašyti klasikiniai
baltymus sintezuojančios sistemos tyrimo eksperimentai.

Studijų metodai: paskaitos (10 val.), laboratoriniai darbai (18 val.), seminarai (12 val.),
studentų savarankiškas darbas (40 val.).

Paskaitos (10 val.)
Eil.
Nr.
Paskaitos pavadinimas Trukmė
1. Pagrindinė molekulinės biologijos dogma.
DNR ir jos reikšmė baltymų sintezės procesui.
Transliacijos proceso bendra charakteristika. Baltymų
biosintezės stadijos.
Baltymų biosintezės svarbiausi komponentai.
2 val.
2. Ribosomos, jų sandara, funkcijos vietos. 2 val.
3. Transliacijos iniciacija. 2 val.
4. Polipeptidinių grandinių elongacija. Transliacijos terminacija. 2 val.
5. Baltymo biosintezės inhibitoriai.
Antibiotikų poveikio baltymų sintezei mechanizmai.
2 val.

TEORINĖ-PRAKTINĖ DALIS

Laboratoriniai darbai (18 val.)

Eil.
Nr.
Laboratorinio darbo pavadinimas Trukmė
1. Suminių transportinės RNR ir aminoacil-tRNR sintetazių
preparatų išskyrimas iš pelių kepenų ir jų aktyvumo nustatymas.
6 val.
2. Transliacijos greičio ir lygio nustatymas neląstelinėje baltymus
sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų.
6 val.
3. Baltymų analizė gel-filtracijos, elektroforezės
poliakrilamidiniame gelyje denatūruojančiomis sąlygomis ir
imunoblotingo metodais.
6 val.

Seminarai (12 val.)

Eil.
Nr.
Seminaro temos pavadinimas Trukmė
1. Genetinio kodo bendros savybės ir iššifravimas. 3 val.
2. Informacinės RNR (mRNR) savybės ir brendimas. 3 val.
3. tRNR struktūra. Aminoacil-tRNR sintetazės.
Aminorūgščių liekanų akceptavimas (prijungimas) prie tRNR.
3 val.
4. Potransliacinis baltymų paskirstymas ir modifikavimas. 3 val.

SAVARANKIŠKAS DARBAS

Ruošdamiesi seminarams ir egzaminui studentai individualiai studijuoja nurodytą
literatūrą, originalius mokslinius straipsnius pagal nurodytas temas bei savarankiškai vykdo
naujos literatūros paiešką duomenų bazėse.

Studentų savarankiško darbo temos:
1. Baltymų biosintezės (transliacijos) ir ribosomų tyrimų istorija.
2. Bakterijų ir augalų toksinų poveikis baltymų biosintezei.
3. Eukariotų baltymų biosintezės potranskripcinė reguliacija.
4. Baltymai – pagrindinė organizmų struktūrinė ir funkcinė medţiaga.
5. Struktūriniai ribosomų pokyčiai.
6. Ribosomos ir augančio peptido sąveika su membrana.
7. Transliacijos tikslumas. Baltymų sintezės tikslumą apsprendţiantys faktoriai.
8. Baltymų biosintezės eukariotuose ir prokariotuose ypatybės. Baltymų degradavimas
ląstelėje. Baltymų degradavimo eukariotuose ir prokariotuose ypatybės.
9. Biologiškai neaktyvios tRNR molekulės, jų vaidmuo transliacijos reguliacijoje.
10. Eukariotų transliacijos aparato baltymų kompartmentalizacija poliribosomose.
11. Baltymų irimas ląstelėje.

Programą parengė: Dr. Ilona Sadauskienė, KMU Biochemijos katedros lektorė, darbo
telefonas: 302967, vietinis 1345, elektroninio pašto adresas: ilona_sad@med.kmu.lt

Studijų dalyko programos sandara
Studijų kursą sudaro: paskaitos (12,5 proc.), laboratoriniai darbai (22,5 proc.), seminarai (15
proc.) ir savarankiškas darbas (50 proc.).


Įvertinimas
Suminis balas. 100 proc. balo sudaro: 40 proc. auditorinio darbo + 20 proc. savarankiško
darbo + 40 proc. baigiamojo teorinio ir praktinio patikrinimo.

Studijų dalyko „Baltymų biosintezė“ paskaitų konspektai

1 paskaita
Transliacijos proceso bendra charakteristika.
Baltymų biosintezės stadijos
(2 val.)

Genų raiška, kurios dalis yra ir baltymų sintezė – tai sudėtingų biocheminių procesų
visuma. Šiuose procesuose dalyvauja apie 300 biomolekulių. Kiekvienos iš šių molekulių
aktyvumo pakitimas gali vienaip ar kitaip pakeisti genetinės informacijos, uţkoduotos ląstelės
DNR, perdavimo tikslumą ir greitį. lemia visus ląstelės funkcijų aspektus, kontroliuoja visas
ląstelę sudarančias molekules. Todėl baltymų sintezėje dalyvaujančių makromolekulių
pakitimai gali atsispindėti ir atskirų organų funkcijoje, o tuo pačiu paveikti viso organizmo
gyvybinius procesus.
Pagrindinė molekulinės biologijos dogma (1 pav.) teigia, kad aminorūgščių seką
polipeptidinėje grandinėje lemia informacinės RNR (mRNR) struktūra, o šios molekulės
struktūrą koduoja universali genetinė medţiaga. Eukariotinėse ląstelėse – tai deoksiribo-
nukleorūgštis (DNR).
Baltymų sintezė vykdoma transliacijos (angl. translation – vertimas) metu – tai procesas,
kai DNR ir atitinkamos mRNR bazių seka pervedama į aminorūgščių, sujungtų į polipeptidinę
grandinę ir sudarančių pirminę baltymo struktūrą, seką. Pirminė baltymų seka savo ruoţtu
apsprendţia antrinę, tretinę struktūras ir galiausiai – baltymų funkciją. Baltymų sintezė (kaip
DNR bei RNR) apima tris stadijas: iniciaciją, elongaciją ir terminaciją. Kiekvienai
aminorūgščiai specifinis fermentas aminoacil-tRNR sintetazė aktyvina aminorūgštį,
prijungdamas ją prie atitinkamos tRNR molekulės. Kai kuriais atvejais vieną aminorūgštį
atitinka keletas tRNR ir fermentų. Polipeptidinė grandinė ilgėja ant polisominės „surinkimo
linijos“ nuo amino link karboksilinės grupės (NH
3
+
→COO ). Baltymai, pasiţymintys
ypatingai plačiu biologinių funkcijų spektru, iš esmės sąlygoja visus ląstelės medţiagų
apykaitos ir struktūros bruoţus. Šia prasme per baltymų sintezę DNR
Skiriamos 3 baltymų biosintezės stadijos:
1. Iniciacija. Iniciacijos metu iniciacinė tRNR prisijungia prie mRNR starto signalo ir
uţima ribosomos P (angl. peptidyl) vietą.
2. Elongacija. Elongacija prasideda aminoacil-tRNR (aa-tRNR) prisijungimu prie A (angl.
aminoacyl) vietos ribosomoje. Peptidinis ryšys susidaro tarp naujos ateinančios aa-tRNR -
NH
2
grupės ir formilmetionino -COOH grupės (fmet atneša iniciacinė tRNR). Gautas
dipeptidil-tRNR pasislenka iš A į P vietą, o iniciacinė tRNR prieš palikdama ribosomą juda į
E (angl. exit) vietą. Šiems procesams energiją teikia GTP. Prie atsilaisvinusios A vietos
prisijungia nauja aa-tRNR molekulė ir vyksta sekantis elongacijos etapas.



1 pav. Pagrindinės molekulinės biologijos dogmos schema.

3. Terminacija. Terminacija vyksta pasiekus ant mRNR esantį terminacijos signalą, kurį
atpaţįsta atpalaidavimo (angl. release) faktoriai, atpalaiduojantys polipeptidą.
Baltymų biosintezės svarbiausi komponentai.
Ribosomos. Tai makromolekuliniai kompleksai, koordinuojantys tRNR, mRNR ir baltymų
tarpusavio sąveiką bei katalizuojantys nuo mRNR priklausomą peptidinių ryšių susidarymą.
Ribosomos sudarytos iš maţojo ir didţiojo subvienetų. Vadinamos ribosomomis, nes apie 2/3
jų masės sudaro rRNR – molekulės, vaidinančios labai svarbų vaidmenį transliacijos procese.
Bakterijų ląstelėse yra apie 20 000 ribosomų, sudarančių apie 20 proc. sausos ląstelės masės,
o rRNR ir jų baltymus koduoja apie 5 proc. E. coli genomo.
Ribosoma disocijuoja į didįjį (50S) ir maţąjį (30S) subvienetus. Visos rRNR įgauna
būdingą struktūrą, kurią suformuoja trumpos susiporavusios sritys. Įrodyta, kad baltymų
sintezėje svarbiausią vaidmenį atlieka rRNR.
Ribosomų struktūros palaikymui labai svarbūs Mg
2+
– maţinant jo koncentraciją iš
pradţių vienas po kito atsiskiria abu subvienetai, o paskui pradeda disocijuoti ir patys
subvienetai.
tRNR. Dar Francis Crick numatė, kad turi būti adaptorinės molekulės, kurios būtų lyg tiltas
tarp mRNR, kuriose yra informacija apie būsimo baltymo struktūrą, ir aminorūgščių. Ta
adaptorinė molekulė pasirodė besanti tRNR, atpaţįstanti: a) fermentą, prijungiantį teisingą
aminorūgštį ir b) mRNR antikodoną.
Visos šiuo metu ţinomos tRNR yra sudarytos iš vienos 73-95 nukleotidų ilgio
grandinės, jos turi daug neįprastų, daugiausiai metilintų bazių. Subrendusios tRNR 3' galo
nukleotidų seka yra CCA, prie kurios jungiasi aktyvinta aminorūgštis (prie galinio adenino
3'-OH). Be to, apie pusė tRNR nukleotidų susiporuoja ir sudaro dvigubas spirales.
Aminoacil tRNR sintetazės – ARSazės. Peptidinio ryšio susidarymas tarp vienos
aminorūgšties NH
2
galo ir kitos aminorūgšties COOH galo yra termodinamiškai nepalankus.
Šis barjeras įveikiamas aktyvinant aminorūgšties COOH grupę. Baltymų biosintezės aktyvinti
tarpininkai yra aminorūgščių esteriai, kuriuose aminorūgščių karboksi grupė sujungta su
tRNR 3' galu. Toks tRNR aminorūgšties esteris vadinamas aminoaci-tRNR (aa-tRNR),
kartais – pakrauta tRNR. Pačios aminorūgštys negali atpaţinti mRNR kodonų, todėl būtinos
tRNR, atpaţįstančios mRNR kodonus ir nešančios į ribosomą reikalingą aminorūgštį –
adaptorinė tRNR funkcija.
Aminorūgštis aktyvina ir prie tRNR prijungia fermentai – ARS-azės:
Aminorūgštys + ATP + tRNR +H
2
O ↔ aminoacil-tRNR + AMP + 2P
n
Kiekvienai aminorūgščiai egzistuoja maţiausiai viena ARS-azė ir viena tRNR.
ARSazės yra labai specifiški fermentai ir labai tikslūs atpaţindami tiek aminorūgštis,
tiek tRNR. Šie fermentai pasiţymi savęs pasitikrinimo (angl. proofreading) savybe.
„Svyravimo“ hipotezė.
„Svyravimo“ hipotezė (nevienareikšmio atitikimo, angl. wobble) paaiškina, pirmiausia,
kodėl viena tRNR gali atpaţinti keletą kodonų ir, antra, kadėl dauguma kodonų gali būti
atpaţinti keletu tRNR molekulių rūšių. Tačiau reikia paţymėti, kad kiekviena tRNR gali nešti
tik vienos rūšies aminorūgštį. Tai įmanoma tik todėl, kad ribojimai, kurie yra dėl bazių
poravimo pagal Kriko-Votsono taisyklę nesiderina su 3 (skaičiuojant 5
/
3
/
kryptimi) kodono
bazės mRNR ir 1 (5
/
3
/
kryptimi) bazės tRNR antikodono poravimuisi. Tai priverčia
nukleotidus tiesiog suptis, keičia sąveikos kodonas-antikodonas geometriją ir leidţia
susidaryti G-U poroms. Kai kurių rūšių tRNR esantys modifikuoti nukleotidai pirmoje
antikodono padėtyje ar netoli jos taip pat gali sukelti svyravimą ir dėlto sumaţinti apribojimus
poruojantis kodonui su antikodonu. Svarbus modifikuotas nukleotidas pagal
„svyravimo“ hipotezę yra inozino rūgštis, kuri gali sudaryti poras su A, C ir U, kurie yra 3
mRNR kodono padėtyje. Ribojimų sumaţinimas porų susidarymui svyravimo procese
teoriškai reiškia, kad daugybė skirtingų kodonų gali būti atpaţinti santykinai nedideliu kiekiu
tRNR antikodonų. Tačiau gamtoje ši galimybė praktiškai neišnaudojama ir dauguma ląstelių
turi maţdaug tiek tRNR rūšių, kiek egzistuoja aminorūgščių.

2 paskaita
Ribosomos, jų sandara, funkcijos vietos
(2 val.)

Baltymų sintezė vyksta ribonukleoproteininėse dalelėse – ribosomose. Ribosoma – tai
kompleksas, sudarytas iš dviejų tarpusavyje surištų pagrindinių subvienetų. Šis kompleksas
koordinuoja baltymų surinkimą.
Ribosoma
Bakterijų ribosomos. Gerai ištirtos bakterijų (pvz. E. coli) ribosomos yra netaisyklingos
formos nukleoproteininės dalelės, kurių sedimentacijos konstanta yra 70S, diametras apie 20
nm ir molekulinė masė apie 2700 kDa.
Eksperimentinėmis sąlygomis ribosomą galima padalinti į didesnį 50S subvienetą ir
maţesnį 30S subvienetą, o toliau kiekvieną jų – į juos sudarančius baltymus ir rRNR (2 pav.).
Ribosomos struktūra ir funkcijos priklauso nuo susisukimo ir sąveikos su baltymais ją
sudarančių rRNR molekulių. Kiekviena bakterijų ląstelė turi maţdaug 20000 ribosomų, kurios
sudaro apie 25 proc. ląstelės masės. Elektroninė mikroskopija leidţia pamatyti laisvas
ribosomas citoplazmoje
Eukariotų ribosomos. Nors ribosomų struktūra bei funkcijos ţinduolių ir E. coli ląstelėse
panašios, egzistuoja atitinkami skirtumai jų sudaryme. Ţinduolių ribosomos sedimentacijos
konstanta 80S, molekulinė masė 4200 kDa ir jos disocijuoja į du subvienetus – 60S bei 40S.
40S subvienetas turi 18S rRNR ir apie 30 su ja surištų baltymų. 60S subvienetas sudarytas iš
5S, 5,8S ir 28S rRNR ir apie 45 su juo susijusių baltymų. Elektroninis mikroskopas leidţia
pamatyti tiek laisvas ribosomas, tiek su endoplazminiu tinklu tvirtai surištas ribosomas.
Paprastai laisvos ribosomos sintezuoja baltymus, kurie skirti naudojimui citoplazmoje, o su
endoplazminio tinklo membrana surištos ribosomos sintezuoja baltymus, kurie eksportuojami
iš ląstelės arba įeina į membranos sudėtį.



2 pav. Prokatiotų ir eukariotų ribosomų erdvinė struktūra

Transliacija
Baltymų sintezės procese prie mRNR molekulės vienu metu gali prisijungti keletas
ribosomų, kurios sudaro poliribosomą arba kitaip vadinamą polisomą (3 pav.).


3 pav. Bendra transliacijos proceso schema

Blogiausiu atveju viena ribosoma tenka kiekvieniems 8 mRNR molekulės nukleotidams.
Atskiros ribosomos, įeinančios į polisomos sudėtį, funkcionuoja nepriklausomai viena nuo
kitos, kiekviena jų formuodama pilną polipeptidinę grandinę. Polipeptidinė grandinė
Prokariotų 70S ribosoma
Eukariotų 80S ribosoma
23S ir 5S rRNR
16S rRNR
28S, 5,8S ir 5S rRNR
Iniciacija Elongacija Terminacija
Ribosomos judėjimo kryptys
18S rRNR

sintezuojama NH
3
→COOH kryptimi, o mRNR nuskaitoma nuo 5
/
į 3
/
galą. Eukariotų
baltymų sintezė vyksta citoplazmoje, kur ir pernešama mRNR iš branduolio. Prokariotų (pvz.,
E. coli) mRNR molekulės transliacija gali prasidėti anksčiau, nei pilnai pasibaigs transkripcija.

Lentelė. Prokariotų ir eukariotų baltymų sintezė (reziume)

Savybė Prokariotai Eukariotai
Didysis ribosomos subvienetas 50S 60S
Maţasis ribosomos subvienetas 30S 40S
Ribosoma 70S 80S
Didţiojo subvieneto rRNR 5S, 23S 5S, 5,8S, 28S
Maţojo subvieneto rRNR 16S 18S
Baltymų skaičius didţiajame subvienete 34 50
Baltymų skaičius maţajame subvienete 21 34
Iniciacijos faktoriai IF1, IF2, IF3 eIF2, eIF3, eIF4a,
eIF4b, eIF4c, eIF5, eIF6,
„cap“ surišantis baltymas
Iniciacinė aminoacil-tRNR fMet-tRNR Met-tRNR
Turtinga purinai priešstartinė seka Šaino-Delgarno seka Nėra
Elongacijos faktoriai EF-G (translokazė) EF1, EF2 (translokazė)
Atpalaidavimo faktoriai RF1, RF2, RF3 RF

3 paskaita
Transliacijos iniciacija
(2 val.)

Transliacijos iniciacija prokariotuose.
Prokariotinėje ląstelėje baltymų sintezė prasideda citozolyje nuo iniciacinės tRNR
molekulės, nešančios metionino (Met) aminorūgštį, prisijungimo prie maţojo ribosomos
subvieneto (4 pav.). Iniciacinė tRNR suriša Met reakcijoje, kurią katalizuoja atitinkama
aminoacil-tRNR sintetazė, o su tRNR surištas Met yra formilinamas transformilazės (formilas
– skruzdţių rūgšties liekana, HCOOH). Iniciacinė tRNR ţymima kaip tRNR
f
.
Su tRNR surištas Met paprastai netampa polipeptidinės grandinės dalimi – baltymų
sintezės pabaigoje jis yra pašalinamas. Su iniciacine tRNR surištas Met paprastai
formilinamas. Tačiau Met, surištas su ta tRNR rūšimi, kuri neša Met, skirtą įjungti į baltymo
molekulę, nėra formilinamas. Šiuo atveju atitinkamą tRNR ţymime kaip tRNR
Met
arba tRNR
m
.
Laisvas maţasis 30S subvienetas suriša 3 iniciacijos faktorius (IF): IF1, IF2 ir IF3. IF2
suriša GTP, o taip pat paţįsta kompleksą Met-tRNR
f
. Be to, reakcija tarp IF2 ir GTP leidţia


4 pav. Transliacijos iniciacijos schema

mRNR molekulei prisijungti prie 30S subvieneto. Kai tik susiformuoja kompleksas 30S-met-
tRNR
f
, IF3 išlaisvinamas. Prie komplekso prisijungus didţiajam 50S subvienetui, vyksta GTP
hidrolizė, po to atpalaiduojami IF1 ir IF2. Tuo metu formuojasi du surišimo centrai: P-centras
(peptidinis, angl. peptidyl) ir A-centras (aminoacilinis, angl. aminoacyl). Baltymų sintezės
eleongacijos stadijos pradţioje Met-tRNR
f
molekulė yra ribosomos P-centre, o A-centras
laisvas. Susidaręs 70S kompleksas vadinamas iniciacijos kompleksu.
Šaino-Dalgarno seka.
Met tRNR
f
molekulės antikodonas – UAC, sugebantis nekovalentiškai sąveikauti su
iniciacijos kodonu AUG ant mRNR molekulės. AUG koduoja Met. E.coli iniciacijos sritis
išsidėsčiusi virš start-kodono AUG purininėmis bazėmis turtingoje srityje. Šią sritį vadina
Šaino-Dalgarno seka (pvz., E. coli lacl ši seka susideda iš 5
/
-AGGAGG-3
/
). Ši seka poruojasi
su komplementaria sritimi, išsidėsčiusia 30S subvieneto 16S rRNR 3
/
gale.
Taigi, baltymo sintezė prasideda ten, kur antikodonas tRNR
f
susiriša su iniciacijos
kodonu AUG, o mRNR susiporuoja su komplementaria seka ant 16S rRNR molekulės 3
/
galo.
Transliacijos iniciacija eukariotuose.
Transliacijos iniciacijos mechanizmas eukariotų ląstelėse yra toks pat kaip ir prokariotų,
tačiau turi ir skirtumų:
1. Iniciacijos tRNR neša Met, o ne formilmetioniną (fMet). Ji ţymima kaip tRNR
i
.
2. Egzistuoja ţymiai daugiau iniciacijos faktorių – IF (šiandien jų ţinoma 9 ir, be abejo, bus
nustatyta daugiau):
a) eIF2 suriša GTP ir dalyvauja surišant tRNR su 40S kompleksu;
Prokariotų mRNR
16S RNR
Eukariotų mRNR
40S subvienetas
Šaino-Dalgarno seka
Ribosomų skenavimas
b) „cap“-surišantys baltymai sąveikauja su 5
/
-kepurėle mRNR, o eIF3 susiriša su
arčiausiai prie „cap“ esančiu start-kodonu AUG dėka ATP energijos, aprūpinamos
eIF4;
c) Met-tRNR
i
susiriša su start-kodonu AUG, o eIF5 verčia eIF hidrolizuoti GTP, o tai
atpalaiduoja eIF2 ir eIF3 iš iniciacijos komplekso;
d) vyksta 60S subvieneto prijungimas bei pilno iniciacijos komplekso formavimasis.
Eukariotai turi tik vieną start-kodoną – AUG ir neturi purinais turtingos Šaino-Dalgarno
sekos. 40S kompleksas susiriša su 5
/
mRNR galu ir, panaudodamas ATP energiją, juda 3
/
galo
kryptimi iki start-signalo AUG.

4 paskaita
Polipeptidinių grandinių elongacija.
Transliacijos terminacija
(2 val.)

Po baltymų sintezės iniciacijos vyksta eleongacijos procesas, o po to, kai pasiekiamas
atitinkamas kodonas – terminacija. Peptidas palieka ribosomą ir gali būti keičiamas dėl
potransliacinėss modifikacijos. Baltymo modifikacijos pobūdis priklauso nuo to, ar jis skirtas
kitoms ląstelės organelėms (mitochondrijoms, branduoliui ar lizosomoms), ar struktūriniams
vienetams (ląstelės membranos). Modifikuojami gali būti ir baltymai, eksportuojami iš
ląstelės. Potransliacinių modifikacijų klaidos kartais sukelia įvairius susirgimus.
Elongacija.
Po pirmo metionino sekanti aminorūgštis (komplekse su tRNR) prisijungia prie
ribosomos A centro dėka elongacijos faktoriaus. Labai svarbu, kad į A centrą patektų
„teisinga“ aminoacil-tRNR, todėl kad ląstelė negali nustatyti „neteisingos“ aminorūgšties po
jos įsijungimo į grandinę. Prokariotuose patikrinimą atlieka elongacijos faktorius EF-TU. EF-
TU suriša GTP, po to jis geba susirišti su aminoacil-tRNR ir uţtikrina sąveiką su A centru.
Aminorūgštis negali būti įjungta į augančią grandinę anksčiau, nei EF-TU paliks kompleksą,
o pastarasis negali atsilaisvinti, kol neįvyks GTP hidrolizė iki GDP. Taigi,
„neteisinga“ aminoacil-tRNR turi laiko išeiti iš komplekso kol vyksta GTP hidrolizė ir EF-TU
atsiskyrimas. Eukariotuose elongaciją tikrinančiu faktoriumi yra EF1, kurio EF1 subdalelė
sudaro kompleksą su aminoacil-tRNR.
Elongacijos procesą (5 pav.) sudaro dvi pagrindinės stadijos: peptidinės jungties
susidarymas ir translokacija. Peptidinės jungties susidarymo reakciją katalizuoja
peptidiltransferazė. Ji prijungia aminoacil-tRNR, esančios P centre, karbonilinį atomą prie
aminoacil-tRNR, esančios A centre, -aminogrupės. Po to A centras turi būti išlaisvintas
sekančiai aminoacil-tRNR, todėl nuskaitymo rėmelis pasislenka išilgai mRNR per 3 bazes ir
A centre atsiranda sekantis kodonas. Pasislinkimą uţtikrina kitas elongacijos faktorius –
translokazė, energijos šaltiniu naudojanti GTP hidrolizę. Prokariotams šis faktorius EF-G,
eukariotams – EF2. Šio proceso metu aminorūgštį praradusi tRNR-OH pastumiama į taip
vadinamą ribosomos išėjimo sritį, iš kur ji išlaisvinama atgal į citoplazmą. Eukariotuose buvo
nustatyta eilė kitų elongacijos faktorių, bet tikslus jų vaidmuo neaiškus.

5 pav. Transliacijos elongacijos schema

Terminacija.
Kai tik pasiekiamas terminacijos kodonas arba „stop“ kodonas, A centras daugiau
nesuriša aminoacil-tRNR (6 pav.). Vietoje jo prie kodono prijungiamas išlaisvinimo
faktoriaus ir GTP kompleksas (RF-GTP). Tada peptidiltransferazė atlieka hidrolazės vaidmenį
ir prijungia vandens molekulę prie peptidinės grandinės karbonilinio galo. RF hidrolizuoja
GTP iki GDP ir pakeičia konformaciją. Šie pokyčiai aprūpina energija elongacijos komplekso
disociaciją į mRNR, polipeptidinę grandinę ir ribosomų subvienetus. Prokariotams aprašyti 3
išlaisvinimo faktoriai: RF1, RF2 ir RF3. Du pirmieji atpaţįsta skirtingus stop-kodonus, o RF3
potencijuoja RF1 ir RF2 veikimą.


6 pav. Transliacijos terminacijos schema

5 paskaita
Baltymų biosintezės inhibitoriai.
Antibiotikų poveikio baltymų sintezei mechanizmai
(2 val.)

Baltymų biosintezės inhibitoriai.
Baltymų biosintezę inhibuoja antibiotikai ir tam tikri toksinai. Antibiotikai – tai medţiagos,
neleidţiančios mikroorganizmams augti arba daugintis. Todėl jie vartojami uţkrečiamosioms
ligoms gydyti. Antibiotikus gamina mikroorganizmai, pelėsiai arba grybai. Tačiau antibiotikai
veikia pagrindinius, gyvybiškai svarbius molekulinius ląstelės mechanizmus, svarbius ne tik
mikrobo, bet kartais ir ligonio gyvybinėms funkcijoms. Daugeliui antibiotikų būdingos
antikancerogeninės savybės, nes jie ypač veiksmingai veikia greitai besidalijančias ląsteles –
bakterijas, vėţines ląsteles, ląsteles – kraujo kūnelių pirmtakus (tuo aiškinamas tam tikrų
antibiotikų poveikis kraujo gamybai). Antibiotikai daţnai sėkmingai vartojami tiriant
biocheminius procesus, nes jie inhibuoja tik tam tikrus molekulinius mechanizmus.
Puromicinas. Tai vienas iš geriausiai ištirtų antibiotikų – bakterijų baltymų biosintezės
inhibitorių. Jį išskiria Streptomyces alboniger. Puromicinas yra panašus į aminoacil-tRNR
akceptorinio stiebo 3' galą. Todėl jis gali prisijungti ribosomos A centre (50S didţiajame
subvienete) ir sudaryti peptidinį ryšį – peptidil-puromiciną. Tačiau puromicinas neturi aminoacilo
grupės (karboksigrupės), todėl augančią polipeptidinę grandinę pernešus ant šio antibiotiko,
tolesnis polipeptidinės grandinės ilgėjimas tampa neįmanomas. Kai turėtų įvykti peptido
translokacija į P centrą, peptidil-puromicinas disocijuoja iš ribosomos, ir įvyksta priešlaikinė
polipeptidinės grandinės terminacįja. Taip inhibuojama bakterijų baltymo biosintezė.
Tetraciklinas slopina baltymų biosintezę bakterijose, prisijungdamas ribosomos 30S
subvieneto A centre. Jis inhibuoja aminoacil-tRNR prisijungimą prie ribosomos 30S subvieneto.
Yra plataus spektro antibiotikas.
Chloramfenikolis (levomicetinas) jungiasi prie ribosomos 50S subvieneto; slopina
baltymo biosintezę bakterijose, mitochondrijose ir chloroplastuose, inhibuodamas
peptidiltransferazę, t.y. peptidilo pernašą ir peptidinio ryšio susidarymą (eukariotų baltymų
sintezės neveikia). Atvirkščiai, cikloheksimidas slopina eukariotų 80S ribosomos
peptidiltransferazę ir, susijungdamas su ribosomos didţiuoju subvienetu, inhibuoja translokaciją.
Tačiau jis neveikia bakterijų, mitochondrijų bei chloroplastų 70S ribosomos. Panašiai veikia ir
linkomicinas, sparsomicinas bei eritromicinas. Eritromicinas, prisijungdamas prie 50S
subvieneto, inhibuoja ribosomos translokaciją. Veikia gramneigiamąsias ir gramteigiamąsias
bakterijas.
Streptomicinas ir gentamicinas (aminoglikozidai) sutrikdo normalų genetinio kodo
nuskaitymą sukeldami daug translokacijos klaidų. Pavyzdţiui, poli(U) normaliai koduoja
fenilalanino įsijungimą. Esant streptomicinui, polinukleotidas (mRNR) ant ribosomos gali
koduoti ne tik fenilalanil-tRNR, bet ir leucil-tRNR (leucil-tRNR koduoja CUU, UUG) bei
izoleucil-tRNR. Esant šiems antibiotikams, maţėja mRNR tripletų specifiškumas, ir jie gali
sąveikauti su antikodonais, turinčiais tik dvi komplementarias bazes. Antibiotikai inhibuoja
baltymo sintezės iniciaciją ir geriausiai veikia gramneigiamąsias bakterijas. Panašus veikimas
būdingas ir neomicinui, ir kanamicinui.
Veikiant bakterijų populiaciją, pvz., E. coli, buvo gauti mutantai, atsparūs streptomicinui,
nors jų atsiradimo daţnis yra labai maţas – 10
-12
. Iš atsparių streptomicinui bakterijų galima
atrinkti mutantų, kurie negali augti ir daugintis, jei terpėje nėra streptomicino. Atsiradusi nauja
savybė priklauso nuo vienintelės taškinės mutacijos, pakeičiančios tik vieną aminorūgštį
bakterijos ribosomos baltyme.
Penicilinas inhibuoja bakterijų sienelių susidarymą. Veikia gramteigiamąsias bakterijas.
Cefalosporinas taip pat veikia bakterijų sienelę. Inhibuoja gramteigiamųjų ir
gramneigiamųjų bakterijų biosintezę.
Antibiotikai neveikia virusų, nes virusai neturi nei transkripcijos, nei baltymus
sintetinančios sistemos. Savo replikacijai, transkripcijai ir transliacijai jie naudoja šeimininko
ląstelės aparatą. Patekus virusui į ląstelę, išjungiama šeimininko RNR, o kartu ir baltymų
biosintezė. Visas baltymus sintetinantis aparatas perjungiamas į viruso nukleorūgščių ir
baltymų sintezę. Būtent šie procesai vyksta uţsikrėtus raupų, poliomielito, gripo ir kt. virusais.
Labai stiprus ţmogaus ir kitų ţinduolių baltymo biosintezės inhibitorius yra difterijos
toksinas. Jis inhibuoja baltymo biosintezės elongacijos faktoriaus eEF2 prisijungimą prie
ribosomos. Difterijos bacila dauginasi ant gerklų gleivinės paviršiaus ir išskiria baltyminės
kilmės toksiną, sudarytą iš vienos polipeptidinės grandinės (molekulinė masė 60 kDa).
Veikiant šeimininko proteazėms, difterijos toksinas suskyla į du fragmentus – A ir B.
Fragmentas A yra fermentas ADP-riboziltransferazė, pernešanti ADP-ribozilinę liekaną nuo
NAD'o ant eukariotų elongacijos faktoriaus 2 (eEF2):
NAD+eEF2→ADP-ribozil-EF2 + nikotinamidas + H
+

Taip modifikuotas eEF2 praranda savo galimybę dalyvauti ribosomos translokacijoje.
Transliacija nutrūksta. Tuo ir paaiškinamas toksinis baltymo veikimas.

Inhibitorius Veikimo vieta Inhibuojamas procesas
Chloramfenikolas Prokariotų 50S subvienetas Peptidiltransferazė
Cikloheksimidas Eukariotų 80S ribosoma Elongacija
Eritromicinas Prokariotų 50S subvienetas Translokacija
Fuzido rūgštis Prokariotų EF-G veikimas Translokacija
Neomicinai Prokariotai, daug taikinių Transliacija
Puromicinas Eukariotų ir prokariotų ribosoma Peptido pernešimas
Ricinas Eukariotai Eilė procesų
Streptomicinas Prokariotų 30S subvienetas Iniciacija
Elongacija
Tetraciklinai Prokariotų 30S subvienetas Aminoacil-tRNR surišimas
Laboratorinių darbų aprašas

1 laboratorinis darbas
Suminių transportinės RNR ir aminoacil-tRNR sintetazių
preparatų išskyrimas iš pelių kepenų ir jų aktyvumo nustatymas
(6 val.)

Universalus genetinis kodas yra realizuojamas vienos iš pagrindinių biocheminių
reakcijų metu. Ši reakcija – tai tRNR molekulės aminoacilinimas, kurią katalizuoja specifiniai
fermentai – aminoacil-tRNR sintetazės (ARSazės). Kiekvienai aminorūgščiai egzistuoja viena
ARSazė ir viena tRNR. tRNR aminoacilinimo reakcijoje dalyvauja viena iš 20-ies ARSazių,
kurių kiekviena yra specifinė tik vienai aminorūgščiai.
1. Suminių tRNR preparatų išskyrimas.
Transliacijos metu mRNR molekulėje esanti kodonų seka, patekusi į ribosomą, nurodo
aminorūgščių seką polipeptidinėje grandinėje. Tačiau mRNR kodonas tiesiogiai neatpaţįsta
aminorūgšties. Ir aminorūgštį, ir tris ją atitinkančio kodono nukleotidus specifiškai atpaţįsta
RNR molekulė, vadinama transportine RNR (tRNR). tRNR yra pakankamai maţa molekulė,
kurios grandinę sudaro 73-95 nukleotidai, jos molekulinė masė yra apie 25 kDa,
sedimentacijos koeficientas 4S. Eukariotų ląstelių citoplazmoje yra daugiau kaip 100 įvairių
tRNR. Kiekviena aminorūgštis turi jai specifiškas kelias tRNR, vadinamas izoakceptinėmis.
Darbo eiga:
1. Pelių kepenys pasveriamos ir 3 min. homogenizuojamos 1,5 tūrio (lyginant su kepenų
svoriu) buferio (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 1,0 M natrio chloridas; 0,005 M
etilendiamintetraacetatas).
2. Į homogenatą įpilama 1,5 tūrio (lyginant su kepenų svoriu) 80 proc. fenolio tirpalo ir
purtoma purtyklėje 5 min.
3. Gautas mišinys centrifuguojamas 15000xg pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga.
4. Po centrifugavimo nusiurbiamas vandeninis sluoksnis, į kurį pridedama lygus tūris 80 proc.
fenolio, purtoma purtyklėje 5 min. ir dar kartą centrifuguojama (15000xg pagreičiu 15 min.
K-24 centrifuga).
5. Po centrifugavimo nusiurbiamas vandeninis sluoksnis, pridedamas trigubas tūris šalto 96
proc. etanolio ir laikoma -20
0
C temperatūroje 3 val.
6. Nuosėdos surenkamos centrifuguojant 8000xg pagreičiu 5 min. K-24 centrifuga ir
tirpinamos tokiame 0,3 M natrio acetato ml kiekyje, kiek gramų buvo kepenų.
7. Į gautą tirpalą lėtai maišant po truputį pilama iki 0,54 tūrio (lyginant su nuosėdų tirpalo
natrio acetate tūriu) izopropanolio.
8. Po to centrifuguojama 8000xg pagreičiu 5 min. ir nuo nuosėdų nupilamas supernatantas.
9. Į supernatantą po truputį pilama iki 0,44 tūrio izopropanolio (galutinis izopropanolio tūris
turi būti 0,98 lyginant su nuosėdų tirpalo natrio acetate tūriu) ir paliekama nakčiai -20
0
C
temperatūroje.
10. Iškritusios nuosėdos surenkamos centrifuguojant 8000xg pagreičiu 5 min., ištirpinamos
bidistiliuotame vandenyje ir gaunamas suminis tRNR preparatas.
11. tRNR koncentracija gautame tirpale nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį ties
260 ir 280 banga.
2. Aminoacil-tRNR sintetazių preparatų išskyrimas.
ARSazės – tai 20-ties fermentų šeima, atliekanti panašias funkcijas, tačiau pasiţyminti
skirtingu specifiškumu substratui. Viena ypatingų šių fermentų savybių yra ta, kad juos
sudaro skirtingas skaičius įvairaus dydţio subvienetų. ARSazės gali būti ir monomerai, ir
dimerai, ir tetramerai, o jų subdalelių molekulinė masė skiriasi nuo 37 kDa iki 108 kDa.
Darbo eiga:
1. Bemitochondrinio supernatanto išskyrimui pelių kepenys pasveriamos ir
homogenizuojamos trijuose buferio (100 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl
2
; 10 mM KCl;
250 mM sacharozė; 1 mM ditiotreitolas) tūriuose.
2. Fermentai ekstrahuojami audinių homogenatą 15 min. maišant stikline lazdele ledo vonioje.
3. Ląstelių, branduolių ir mitochondrijų nuolauţos pašalinamos homogenatą centrifuguojant
15000 g pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga.
4. Supernatantas filtruojamas per keturgubą sterilios marlės sluoksnį ir gaunamas aminoaci-
tRNR-sintetazių preparatas.
5. Baltymų koncentracija gautame tirpale nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį
ties 260 ir 280 banga, preparatą praskiedus 100 kartų homogenizacijos buferiu.
3. tRNR
Leu
aktyvumo nustatymas.
Darbo eiga:
1. Aminoacilinimo reakcijos mišinys (100 l), kurį sudaro: 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10
mM MgCl
2
, 10 mM KCl, 4 mM ATP, 0,2 mM [
14
C]-leucino, 250 g aminoacil-tRNR-
sintetazių preparato ir 50 g tRNR preparato, inkubuojamas 37
o
C temperatūroje 20 min.

2. Aminoacilinimo reakcija sustabdoma pridedant 0,2 ml 10 proc. trichloracto rūgšties.
3. Mėginiai laikomi ledo vonioje 20 min., kad susiformuotų nuosėdos.
4. Nuosėdos surenkamos ant nitroceliuliozės filtrų ir praplaunamos 25–30 ml. 5 proc.
trichloracto rūgšties tirpalu.
5. Filtrai išdţiovinami (apie 30 min. po staline lempa).
6. Reakcijos produktų radioaktyvumas kiekybiškai įvertinamas matuojant skysčio
scintiliaciniu skaitikliu ,,Delta 300“ (skaičiavimo efektyvumas – 60 proc.). Pagal [
14
C]
leucino prisijungimą prie tRNR
Leu
galima spręsti apie tRNR
Leu
akceptinį aktyvumą pelių
kepenyse.
4. Leucil-tRNR sintetazės aktyvumo nustatymas.
Darbo eiga:
1. Leucil-tRNR-sintetazės aktyvumo nustatymui mišinys (100 l), kurį sudaro: 100 mM Tris-
HCl, 10 mM MgCl
2
, 10 mM KCl, 4 mM ATP, 0,2 mM [
14
C]-leucino, 250 g aminoacil-
tRNR-sintetazių preparato, 150 g tRNR preparato, inkubuojamas 3 min. 37
o
C temperatūroje.
2. Po to reakcija sustabdoma, pridėjus dvigubą tūrį 10 proc. trichloracto rūgšties.
3. Mėginiai laikomi ledo vonioje dar 20 min. nuosėdų susiformavimui.
4. Nuosėdos surenkamos ant nitroceliuliozės filtrų „Synpor Nr. 3“ ir praplaunamos 25-30 ml
5 proc. trichloracto rūgšties tirpalu.
6. Filtrai išdţiovinami (apie 30 min. po staline lempa).
7. Reakcijos produktų radioaktyvumas kiekybiškai įvertinamas matuojant skysčio
scintiliaciniu skaitikliu ,,Delta 300“ (skaičiavimo efektyvumas – 60 proc.).

2 laboratorinis darbas
Transliacijos greičio ir lygio nustatymas
neląstelinėje baltymus sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų
(6 val.)

Transliacijos greičio ir lygio nustatymui yra naudojama neląstelinė sistema, turinti
bemitochondrinį supernatantą. Šios sistemos privalumas yra tas, kad joje baltymų biosintezė
vyksta panašiai kaip intaktinėse ląstelėse. Lyginant su sistema, turinčia ribosomas ir
mikrosomas, sistemoje su bemitochodriniu supernatantu baltymų biosintezė vyksta 25-50
proc. efektyviau.
Darbo eiga:
1. Bemitochondrinio supernatanto išskyrimui pelių kepenys pasveriamos ir
homogenizuojamos trijuose buferio (100 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl
2
; 10 mM KCl;
250 mM sacharozė; 1 mM ditiotreitolas) tūriuose.
2. Fermentai ekstrahuojami audinių homogenatą 15 min. maišant stikline lazdele ledo vonioje.
3. Ląstelių, branduolių ir mitochondrijų nuolauţos pašalinamos homogenatą centrifuguojant
15000 g pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga.
4. Supernatantas filtruojamas per keturgubą sterilios marlės sluoksnį.
5. Nufiltruotas supernatantas centrifuguojamas 30000xg pagreičiu 20 min. MSE centrifuga
(rotorius 10x10 ml): gaunama S-30 frakcija.
6. Baltymų koncentracija gautame tirpale nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį
ties 260 ir 280 banga, preparatą praskiedus 100 kartų homogenizacijos buferiu.
7. 0,1 ml inkubacinio neląstelinės baltymus sintezuojančios sistemos mišinio, kurį sudaro 30
mM HEPES buferis (pH 7,5), 5 mM magnio acetatas, 100 mM kalio chloridas, 2 mM
adenozintrifosfatas, 0,4 mM guanozintrifosfatas, 20 mM fosfokreatinas, 2 g
fosfokreatinkinazės, 100 M aminorūgščių mišinio, 5 l [
14
C]-chlorelos baltymų hidrolizato ir
0,5 optiniai vienetai [A
260
-A
320
] S-30 frakcijos, inkubuojama 37
0
C temperatūroje 5, 10, 20 ir
30 min.
8. Reakcija stabdoma, pridėjus 0,5 ml 10 proc. trichloracto rūgšties.
9. Po to mėginiai inkubuojami 10 min. 90
0
C temperatūroje aminoacil-tRNR hidrolizei.
10. Atšaldţius mėginius 20 min ledo vonioje, nuosėdos rinktos ant nitroceliuliozinių filtrų
“Synpor Nr. 3” (Čekija) ir praplautos 25-30 ml šaltos 5 proc. trichloracto rūgšties.
11. Filtrai išdţiovinami (30 min. po staline lempa).
12. Radioaktyvumas matuotas scintiliaciniu skaitikliu “Delta-300” (Olandija), kurio
efektyvumas 60 proc.

3 laboratorinis darbas
Baltymų analizė gel-filtracijos, elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje
denatūruojančiomis sąlygomis ir imunoblotingo metodais
(6 val.)

Individualių baltymų išskyrimo metodai pagrįsti skirtingomis fizikinėmis ir
cheminėmis savybėmis. Baltymus galima išskirti tik esant ţemai temperatūrai. Tinkamiausia
temperatūra yra artima tirpalo uţšalimo temperatūrai. Esant ţemai temperatūrai, susilpnėja
mikroorganizmų dauginimasis, nuslopinamas proteazių poveikis.
Tiriant maţai ţinomus baltymus, reikia vengti rūgščių ir šarmų, nes daugelis baltymų
nekinta, kai pH artimas 7, nors esama ir išimčių, pvz.: tripsinas, chimotripsinas, pepsinas ir
histonai yra patvaresni rūgščioje terpėje. Organiniai tirpikliai (etanolis, acetonas) tinka
baltymams išskirti tik esant ţemai temperatūrai (apie -10°C).
Pagrindiniai baltymų išskyrimo etapai:
1. Baltymų ekstrahavimas iš ląstelių ir audinių.
2. Nebaltyminių medţiagų pašalinimas.
3. Baltymų mišinio frakcionavimas.
4. Druskų pašalinimas iš baltymų.
Druskoms ir kitoms maţos molekulinės masės priemaišoms pašalinti iš baltymų
naudojamas dializės metodas, gel-filtracija. Šių metodų pagrindą sudaro tai, kad baltymų
molekulės, turėdamos didelę molekulinę masę, negali prasiskverbti pro membranų poras arba
įsiskverbti į gelio granules.
Baltymams išskirti plačiai taikomas elektroforezės metodas, kuris pagrįstas tuo, kad
skirtingi baltymai nevienodai jonizuojami, įgyja skirtingą krūvį ir todėl nevienodu greičiu juda
elektros lauke.
1. Fermentų molekulinės masės nustatymas chromatografijos gelyje metodu.
Gel-filtracijai naudojami vadinamieji molekuliniai tinkleliai – inertinės hidratuotos
medţiagos: polisacharidai kaip poringos granulės. Jos gaunamos iš bakterijų polisacharidų
(sefadeksai), agaro arba polimerizuotų akrilamido gelių (akrileksas). Nedidelės molekulės
prasiskverbia į granules per poras, todėl pro geliu pripildytą kolonėlę juda lėčiau negu didelės
molekulės, negalinčios patekti į granulių vidų.
Molekulinės masės nustatymas chromatografijos gelyje metodu pagrįstas skirtingu
įvairaus dydţio molekulių sugebėjimu praeiti per sefarozės kolonėlę. Priklausomybė tarp
biologinių molekulių eliucijos greičio ir jų molekulinės masės logaritmo yra tiesinė.
Laisvas sefarozės 6B kolonėlės tūris nustatomas pagal mėlynojo dekstrano 2000
eliucijos tūrį. Kalibravimo kreivė nustatoma pagal ţinomos molekulinės masės baltymų-
ţymių eliucijos tūrius. Skaičiuojamas kiekvieno baltymo-ţymės pasiskirstymo koeficientas
(K
av
) ir sudaromas K
av
priklausomybės nuo molekulinės masės logaritmo (lg M) grafikas. K
av
apskaičiuojamas pagal formulę: K
av
=V
e
-V
o
/V
t
-V
o
, kur V
e
– baltymo-ţymės eliucijos tūris, V
o

– laisvas kolonėlės tūris, V
t
- bendras kolonėlės tūris.
Naudojami ţinomos molekulinės masės baltymai-ţymės: JSA (67 kDa), aldolazė (158
kDa), katalazė (232 kDa), feritinas (440 kDa), tyroglobulinas (669 kDa). Eliucija vykdoma 12
ml/val. greičiu. Aprašytu metodu apskaičiuojama K
av
reikšmė tiriamam baltymui ir pagal
kalibravimo kreivę nustatoma jo molekulinė masė.
Darbo eiga:
1. Kolonėlė pripildoma išbrinkinta izotoniniame (0,9 proc.) NaCl tirpale sefaroze 6B.
2. Paruošiamas mišinys frakcionuoti iš dviejų komponentų: sočiojo mėlynojo dekstrano
tirpalo, kurio molekulinė masė yra 10
7
Da, ir sočiojo K
2
Cr
2
0
7
tirpalo, kurio molekulinė masė
yra 294 Da, santykiu 1:1.
3. Ant gelio paviršiaus uţlašinami 2-3 lašai frakcionuoto mišinio ir palaukiama, kol gelis
sugers tirpalą.
4. Atsargiai per stiklinę lazdelę, priglaustą prie sienelės, į kolonėlę įpilama apie 2 ml 0,9 proc.
NaCl tirpalo ir prijungiamas lašintuvas su izotoniniu NaCl tirpalu. Šio tirpalo reikia
išskiriamų medţiagų eliucijai (išplovimui).
5. Perėjęs per kolonėlę mišinys pasiskirsto skirtingų spalvų frakcijomis. Kiekviena frakcija
surenkama į skirtingus mėgintuvėlius.
2. Molekulinės masės nustatymas elektroforezės poliakrilamido gelyje,
denatūruojant fermento molekules, metodu.
Baltymų molekulės elektrinio krūvio dydis ir ţenklas priklauso nuo bazinių ir rūgštinių
jonizuotų grupių santykio molekulėje. Elektriniam laukui susidarius baltymų molekulės
tirpale juda priešingai įkrauto poliaus link.
Baltymų elektroforezė gali vykti natyvinėmis ir denatūravimo sąlygomis. Vykstant
elektroforezei natyvinėmis sąlygomis, baltymų molekulių judėjimo greitis priklauso nuo jų
krūvio, molekulinės masės, hidratacijos laipsnio, molekulių dydţio ir formos. Vykstant
elektroforezei denatūravimo sąlygomis, pridedama natrio dodecilsulfato, todėl baltymo
molekulės tarsi išsitiesia ir jų judėjimas elektriniame lauke priklauso tik nuo jų molekulinės
masės.
Elektroforezė natyvinėmis sąlygomis atliekama, kai norima išvalyti ir išgryninti baltymą,
o denatūravimo sąlygomis – kai norima nustatyti baltymo molekulinę masę.
Elektroforezė vyksta specialiose plokštelėse ar nedideliuose vamzdeliuose, pripildytuose
poliakrilamido gelio. Poliakrilamido gelis yra akrilo rūgšties amido (akrilamido ir ir
bisakrilamido) polimeras.
Darbo eiga: Elektroforezė 15 proc. PAAG, denatūruojant fermento molekules (su 0,2
proc. NDS), atliekama Lemlio metodu.
1. Elektroforezės plokštelės sandariai pritvirtinamos stove guminėmis tarpinėmis ir gnybtais.
2. Paruošiamas mišinys geliui gauti iš akrilamido (akrilo rūgšties amido), bisakrilamido
(N,N'-metilenbisakrilamido), amonio persulfato (NH
4
)
2
S
2
O
3
ir TEMED (N
>
N,N
I
,N
I

tetrametiletilendiamino).
3. Paruoštas pagrindinio gelio tirpalas (0,75 M Tris-HCl buferio (pH 8,8), 15 proc. PAA
(bisakrilamido/akrilamido santykis 1:37) ir 0,2 proc. NDS) supilamas į ertmę tarp
elektroforezės plokštelių taip, kad viršutinis gelio paviršius būtų 1,5 cm ţemiau uţ viršutinį jų
kraštą. Atsargiai ir lėtai pilant sienele, uţpilamas kelių milimetrų storio distiliuoto vandens
sluoksnis. Turi būti riba, skirianti vandenį ir gelį. Vanduo apsaugo gelį nuo oro deguonies,
kuris yra polimerizacijos inhibitorius, be to, sudaro sąlygas gauti lygų, plokščią paviršių. Gelis
stingsta apie 20 min.
4. Pagrindiniam geliui sustingus, vandens sluoksnis pašalinamas siaura filtrinio popieriaus
juostele.
5. Į ertmę tarp plokštelių uţpilamas koncentruojantis gelis, kuris ruošiamas iš 0,25 M Tris-HCl
buferio (pH 6,8), 3,5 proc. PAA (bisakrilamido/akrilamido santykis 1:37), 20 proc. sacharozės
ir 0,2 proc. NDS. Po to į ertmę tarp plokštelių įstatomos „šukutės“. Gelis stingsta apie 15 min.
6. Sustingus koncentruojančiam geliui, „šukutės“ atsargiai ištraukiamos, gelyje susidarę šulinėliai
praplaunami vandeniu, o po to elektrodiniu buferiu.
7. Baltymų pavyzdţiai elektroforezei ruošti, inkubuojant juos 3 min. 90
o
C temperatūroje 0,01
M Tris-HCl (pH 8,2), kurio sudėtyje yra 20 proc. glicerolio, 0,01 M MgCl
2
, 2 proc. NDS ir 5
proc. -merkaptoetanolio. Į PAAG plokštelės griovelius įnešama po 5-20 g baltymo. Į
tiriamą baltymų tirpalą pridedama mėlyno daţo – brom-fenolio mėlynojo, kad galima būtų
stebėti elektroforezės eigą ir matyti jos pabaigą.
8. Apatinė elektrodinė kamera pripildoma elektrodinio buferinio tirpalo ir sujungiama su
viršutine elektrodine kamera. Viršutinė elektrodinė kamera pripildoma elektrodinio buferio ir
uţdengiama dangteliu.
9. Elektroforezė atliekama 0,05 M Tris-HCl buferyje (pH 8,3), kurio sudėtyje yra 0,38 M
glicino ir 0,2 proc. NDS. Elektroforezė vyksta, tekant pastoviai 40 mA/plokštelei srovei.
10. Elektroforezė baigiama, kai mėlyna juosta pasiekia plokštelių apatinį galą. Ji trunka apie
1 val. Pasibaigus elektroforezei, išjungiamas srovės šaltinis, viršutinė kamera atskiriama nuo
apatinės, išpilamas buferinis tirpalas, išimamos plokštelės su geliu.
11. Geliai iš plokštelių atsargiai išimami ir patalpinami į nerūdijančio plieno indą, kur daţomi
specialiais mėlynais daţais (coomasi blue) 60 min.
12. Daţų perteklius nuplaunamas 7 proc. acto rūgšties tirpalu, periodiškai keičiant tirpalą, kol
gelio sritys, kur nėra baltymo, tampa visiškai skaidrios.
13. Gelį nudaţius ir atplovus daţo perteklių, matuojami baltymų-ţymių ir tiriamojo baltymo
pagrindiniame gelyje nueiti atstumai (R). Nustatoma lg10R priklausomybė nuo baltymų-
ţymių molekulinės masės logaritmo. Pagal gautą kalibravimo kreivę nustatoma tiriamų
baltymų molekulinę masę. Naudojami baltymai-ţymės: mioglobinas (17,8 kDa),
chimotripsinogenas (25 kDa), JSA (68 kDa), fosforilazė B (91,5 kDa).
3. Kaspazės 3 aktyvaus subvieneto nustatymas imunoblotingo metodu.
Imunoblotingas (dar vadinamas Western blotingu) yra vienas iš imunocheminės
analizės metodų. Naudojant specifinius antikūnus, šiuo metodu galima identifikuoti tiriamąjį
baltymą kitų baltymų mišinyje, pavyzdţiui, ląstelių lizate, kraujo serume ir pan. Todėl
imunoblotingas plačiai taikomas medicinoje, biotechnologijoje ir moksliniuose tyrimuose.
Pavyzdţiui, šiuo metodu galima nustatyti virusų, tokių kaip ŢIV, tymų, hepatito B, C ir kt.,
baltymus ţmogaus kraujo serume ir patvirtinti diagnozę. Be to, šiuo metodu galima tirti
įvairių baltymų, net ir netirpių, ekspresiją ląstelėse – pavyzdţiui, membranoje esančių
receptorių ir pan. Biotechnologijoje šis metodas gali būti taikomas rekombinantinių baltymų
ekspresijai tirti.
Baltymai poliakrilamidiniame gelyje atskiriami elektroforezės būdu ir pernešami ant
specialios membranos. Po to membrana inkubuojama su specifiniais antikūnais prieš tiriamąjį
baltymą. Prisijungę antikūnai išryškinami, inkubuojant su antriniais antikūnais.
Darbo eiga:
1. Atliekama tiriamų audinių poribosominio supernatanto elektroforezė, kaip aprašyta 3
laboratorinio darbo 2 dalyje 1-10 punktuose.
2. Gelis iš plokštelių atsargiai išimamas, patalpinamas į lėkštelę su pernešimo buferiu (25 mM
Tris, 192 mM glicinas, 20 proc. metanolio) ir plaunamas 15 min.
3. Blotingo membrana 1 min. plaunama metanolyje, po to 1 min. distiliuotame vandenyje ir
perkeliama į lėkštelę su pernešimo buferiu.
4. Iš filtrinio Vatmano popieriaus iškerpami gelio dydţio lapeliai ir pamerkiami į lėkštutę su
pernešimo buferiu.
5. Iš poliakrilamidinio gelio baltymai pernešami ant membranos, naudojant blotingo aparatą,
sudedant tokia tvarka: filtrinis popierius, membrana, gelis, filtrinis popierius. Pernešimas
trunka 1 valandą, esant pastovios srovės stiprumui (40 mA).
6. Toliau atliekamas membranos blokavimas. Tam membrana 5 min. plaunama 50 ml TTBS
buferio, kurio sudėtyje yra 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,05 proc. tvino, pH 7,5 ir
inkubuojama 1 val. blokavimo buferyje (TTBS+5 proc. pieno miltelių) kambario
temperatūroje.
7. Membrana 5 min. plaunama 50 ml TTBS buferio.
8. Membrana, patalpinta į plastikinį maišelį su pirminiais antikūnais prieš kaspazę 3
(praskiedimas 1:500 su TTBS+3 proc. pieno miltelių), inkubuojama per naktį 4
0
C
temperatūroje.
9. Kitą dieną membrana išimama iš maišelio ir 2 kartus po 5 min. plaunama TTBS buferiu.
10. Inkubacija su antriniais antikūnais. Paruošiama 8,3 µl antrinių antikūnų tirpalo 25 ml
TTBS+3 proc. pieno miltelių. Membrana inkubuojama šiame tirpale 1 val. kambario
temperatūroje.
11. Membrana du kartus po 5 min. plaunama TTBS buferyje.
12 Po to membrana 5 min. plaunama TBS (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5) buferiu.
13. Fermentinės reakcijos išryškinimas. Membrana inkubuojama daţymo buferyje (paruoštas
pagal aprašymą iš imunoblotingo rinkinio), kol išryškėja specifiškai nusidaţiusios juostelės
(apie 30 min.). Daţymas baigiamas membraną pernešus į lėkštelę su dejonizuotu vandeniu
(10 min.). Po to ji dar keletą kartų plaunama dejonizuotu vandeniu, išdţiovinama ir
fotografuojama.
14. Rezultatų įvertinimas. Imunoblotingo rezultatai įvertinami kokybiškai: nustatoma,
kuriame iš tiriamųjų pavyzdţių yra aktyvus kaspazės 3 subvienetas (apie 20kDa).

Laboratorinių darbų rezultatai pateikiami pagal Biochemijos laboratorinių darbų aprašą
(ţiūr. ţemiau).
Biochemijos laboratorinių darbų aprašas

1. Data

2. Darbo pavadinimas

3. Darbo tikslas

4. Darbo principas

5. Tyrimo objektas, reagentai, pagrindinės darbo priemonės

6. Darbo rezultatai ir skaičiavimai

7. Išvados

Studijų dalyko „Baltymų biosintezė“ seminarų temų konspektai

1 seminaras
Genetinio kodo bendros savybės ir iššifravimas
(3 val.)

Baltymus sudaro maţiausiai 20 skirtingų aminorūgščių, tuo tarpu DNR ar RNR sudėtyje
yra tik 4 bazės. Buvo nustatyta, kad informaciją apie kiekvieną aminorūgštį neša 3 bazių seka,
vadinama kodonu. Galimų tripletinių kodonų, sudarytų iš 4 bazių, skaičius lygus 4
3
64.
Eksperimentai parodė, kad iš šių teoriškai galimų variantų 61 tikrai koduoja aminorūgštis.
Jeigu vienoms aminorūgštims (pvz., triptofanui) atitinka tik vienas kodonas, tai kitoms (pvz.,
serinui) – iki 6 kodonų. Nepaisant to, genetinis kodas yra specifinis ir vienareikšmis, vienas
kodonas koduoja tik vieną aminorūgštį.

5' kodono
galas
Vidurinė kodono bazė 3' kodono
galas
U C A G
U Phe Ser Tyr Cys U
U Phe Ser Tyr Cys C
U Leu Ser Stop Stop A
U Leu Ser Stop Trp G
C Leu Pro His Arg U
C Leu Pro His Arg C
C Leu Pro Gln Arg A
C Leu Pro Gln Arg G
A Ile Thr Asn Ser U
A Ile Thr Asn Ser C
A Ile Thr Lys Arg A
A Met
(starto kodonas)
Thr Lys Arg G
G Val Ala Asp Gly U
G Val Ala Asp Gly A
G Val Ala Glu Gly C
G Val Ala Glu Gly G

Kodą vadina išsigimusiu, kadangi vieną aminorūgštį paprastai atitinka keletas kodonų.
Be to, kodas yra universalus – praktiškai vienodas kodas buvo nustatytas visiems gyviems
organizmams.
Mitochondrijos yra vienintelė ţinoma išimtis iš universalumo principo – kai kurie
kodonai jose turi neįprastą reikšmę.
Eukariotų baltymų biosintezės starto signalu yra metionino kodonas AUG. Todėl
metioninas yra pirma aminorūgštis peptidinėje grandinėje. Stop signalai UGA, UAA ir UAG
nekoduoja jokios aminorūgšties ir kartais yra vadinami beprasmiais (angl. nonsens)
kodonais.

Kodonas Mitochondrijose Įprasta reikšmė
CUA Thr Leu
AUA Met Ile
UGA Trp Stop

Genetinio kodo savybės:
1. Genetinis kodas yra trinukleotidinis (tripletas). Iš 4 nukleotidų gali susidaryti 64
kodonai (4
3
= 64). Terminas kodonas reiškia trijų nukleotidų seką mRNR molekulėje, kuris
nurodo specifinės aminorūgšties įjungimą į baltymą. Iš 64 kodonų 61 koduoja
aminorūgštis, o 3 yra nekoduojantys – jie vadinami beprasmiais (angl. nonsens) arba
"stop" kodonais. Tai baltymų biosintezės pabaigos signalai.
2. Genetinis kodas yra išsigimęs (degeneruotas), t.y. tą pačią aminorūgštį gali koduoti
daugiau nei vienas kodonas (taigi ta pati aminorūgštis gali jungtis prie kelių tRNR, turinčių
skirtingus antikodonus). Daugelis aminorūgščių turi po kelis kodonus, tik Met ir Trp – po
vieną.
3. Genetinis kodas labai specifinis, paprastai vienas kodonas koduoja vieną aminorūgštį.
Išimtis iniciacijos kodonai AUG (Met), GUG (Val), UUG (Leu) ir AUU (Ile), tačiau kai jie
lokalizuoti mRNR pradţioje, prie jų jungiasi tRNR, prisijungusi formilmet. Ši aminorūgštis
būna prokariotų baltymų N gale, kol vyksta sintezė. Po to atskeliama arba formilo grupė
(CHO-), arba visas formilmet. Genetinio kodo specifiškumą nulemia pirmi 2 kodono
nukleotidai, o 3-ias galinis nukleotidas ne toks specifinis. Ši savybė ţinoma kaip trečios
bazės išsigimimas. Tas pačias arba panašias aminorūgštis koduojančių kodonų seka yra
panaši.
4. Genetinis kodas yra universalus. Visuose organizmuose tie patys tripletai koduoja
tas pačias aminorūgštis. Išimtis – kai kurie mitochondrijų kodonai, pvz., AUA koduoja ne
Ile, bet Met; UGA čia ne terminacijos kodonas, bet koduoja Trp. Taip pat ţinomos išimtys
kai kuriuose prokariotuose ir ţemesniuosiuose eukariotuose.
5. Genetinis kodas nepersidengiantis (kai kurie kodonai persidengia – mitochondrijų
ir chloroplastų). Prasidėjus baltymo biosintezei, nukleotidiniai tripletai skaitomi vienas po
kito, kol pasiekia terminacijos kodoną.
6. Genetinis kodas yra nesanklotinis, t.y. tarp kodonų nėra jokių skiriamųjų ţenklų,
po vieno tripleto tuoj pat eina kitas.

2 seminaras
Informacinės RNR (mRNR) savybės ir brendimas
(3 val.)

Labai svarbią vietą transliacijos procese uţima mRNR. Transkripcijos metu susintetinta
mRNR molekulė yra vadinama pirminiu mRNR transkriptu. Šis transkriptas toliau
modifikuojamas ir brandinamas, vyksta splaisingas, kurį vykdo splaiseosomos – tai
kompleksas, sudarytas iš kelių rūšių ribonukleoproteidų. Splaisingo metu yra iškerpamos
nekoduojančios intronų sekos bei nuosekliai sujungiamos koduojančios egzonų sekos (7 pav.).
Subrendusi mRNR palieka branduolį.


7 pav. DNR transkripcija ir RNR splaisingas

Nustatyta, kad ląstelės branduolyje prie tam tikrų mRNR vietų prisijungia baltymai,
suformuodami informasomas. Branduolio baltymai labai svarbūs mRNR pernešimui.
Priklausomai nuo koduojamo polipeptido dydţio, mRNR molekulės gali būti įvairaus
ilgio. mRNR molekulės yra maţiausiai stabilios iš visų RNR rūšių, todėl nereikalingų
baltymų sintezė ląstelėje gali būti greitai nutraukta. Tačiau ši savybė labai apsunkina mRNR
struktūros tyrimus, todėl iki šiol mRNR antrinė ir tretinė struktūros nėra iki galo aiškios.
mRNR struktūroje yra įvairių reguliacinių sričių, kurios nekoduoja baltymų. Eukariotų mRNR
molekulės 5′ gale yra netransliuojama seka, vadinama “kepure” (angl. “cap”), kurioje yra
modifikuotas guanino nukleotidas, nurodantis, kur turi prisijungti ribosoma, prasidedant
transliacijai. Transliuojama seka prasideda iniciacijos kodonu AUG ir baigiasi vienu iš šių 3
terminacijos kodonu UAA, UAG, UGA. Po transliuojamos sekos mRNR molekulės 3′ gale
yra dar viena nekoduojanti seka, kuri vadinama poli-A uodega. Ji susideda iš 150-200 adenino
(A) nukleotidų grandinės, jos funkcijos nėra pilnai ištirtos. Manoma, kad greičiausiai uodega
palengvina mRNR pernašą iš branduolio ir reguliuoja transliaciją. Taip pat nustatyta, kad
kepurėlė ir poli-A apsaugo mRNR nuo egzonukleazių veikimo ir suteikia šiai molekulei
didesnį stabilumą.

RNR tipas Sintezės vieta, S Funkcija
Informacinė RNR
(mRNR)
Nukleoplazma Baltymų sintezės matrica
Transportinė RNR
(tRNR)
Nukleoplazma, 4S Perneša aminorūgštis prie
mRNR
Maţos branduolio RNR
(snRNR)
Nukleoplazma Reguliacinė chromatinui ir
struktūrinė RNR
Heterogeninė branduolio
RNR (hnRNR)
Nukleoplazma, 30-
100S
Kitų RNR pirmtakai
Ribosominė RNR (rRNR) Nukleoplazma, 5S
Branduolėlis, 5,9-18S
Mitochondrijos, 12-16S
Ribosomos struktūros dalis
Mitochondrijų mRNR (mt
mRNR)
Mitochondrijos, 9-40S Baltymų sintezės matrica
Mitochondrijų tRNR (mt
tRNR)
Mitochondrijos, 3,2-4S Perneša aminorūgštis prie
mRNR
Maţos citoplazmos RNR
(scRNR)
Šiurkštusis
endoplazminis tinklas ir
citozolis, 7S
Atrenka eksportuojamus
baltymus

3 seminaras
tRNR struktūra. Aminoacil-tRNR sintetazės.
Aminorūgščių liekanų akceptavimas (prijungimas) prie tRNR
(3 val.)

Transportinė RNR.
Transliacijos metu mRNR molekulėje esanti kodonų seka, patekusi į ribosomą, nurodo
aminorūgščių seką polipeptidinėje grandinėje. Tačiau mRNR kodonas tiesiogiai neatpaţįsta
aminorūgšties. Ir aminorūgštį, ir tris ją atitinkančio kodono nukleotidus specifiškai atpaţįsta
RNR molekulė, vadinama transportine RNR (tRNR). tRNR yra pakankamai maţa molekulė,
kurios grandinę sudaro 73-95 nukleotidai, jos molekulinė masė yra apie 25 kDa,
sedimentacijos koeficientas 4S. tRNR molekulėje susidaro vandeniliniai ryšiai tarp nukleotidų
komplementarių bazių porų toje pačioje grandinėje.
Eukariotų ląstelių citoplazmoje yra daugiau kaip 100 įvairių tRNR. Kiekviena
aminorūgštis turi jai specifiškas kelias tRNR, vadinamas izoakceptinėmis. Kai kuriais atvejais
viena tRNR atpaţįsta tik vieną mRNR kodoną, o kai kada gali atpaţinti iki keturių kodonų.
tRNR molekulėje gali būti 4 spiraliniai fragmentai. Dėl to tRNR įgyja specifinę erdvinę
struktūrą, dvimatėje erdvėje atrodančią kaip “dobilo lapas” (8 pav.). Šiai antrinei struktūrai
yra būdingi 5 regionai: akceptinis stiebas, D domenas, antikodoninis domenas, variabili kilpa
ir T domenas.


8 pav. Schematinis “dobilo lapo” vaizdas

tRNR funkcijai ypač svarbios dvi nesuporuotų nukleotidų vietos: vienoje iš jų yra
nukleotidų tripletas, vadinamas antikodonu, o kitoje – CCA seka. tRNR molekulės akceptinis
stiebas yra sudarytas apytikriai iš septynių bazių porų ir aminorūgščių prisirišimo vietos,
esančios 3 akceptinio stiebo gale – tai CCA seka. Atitinkama aminorūgštis rišasi
kovalentiškai prie tRNR galinio adenozino 3 - arba 2 - OH- galo.
Antikodoninis domenas susideda iš antikodoninio stiebo (5 bazių poros) ir kilpos.
Antikodone esančios bazės yra komplementarios kodono bazėms mRNR molekulėje.
T domenas susideda iš T stiebo (5 bazių poros) ir T C kilpos. T C kilpa yra vadinama
taip dėl joje esančio timino nukleotido, kuris yra randamas DNR ir tRNR molekulėse, bet jo
nėra kitose RNR rūšyse. T C kilpoje visada būna minorinis nukleotidas pseudouridinas.
Manoma, kad ši kilpa svarbi sąveikai su ribosoma.
D domenas yra sudarytas iš D stiebo (4 bazių poros) ir D kilpos. D kilpa yra labai svarbi
fermentų, kurie prisijungia prie aminorūgščių, (aminoacil-tRNR sintetazė, transferazė)
atpaţinimo vieta. D kilpoje yra dihidrouridinas.
Maţoji kilpa vadinama variabilia, nes jos ilgis įvairiose tRNR molekulėse nevienodas.
Variabili kilpa išsikiša apie 45 laipsnių kampu į tRNR L formos plokštumą.
Tarp antrinės struktūros kilpų susidaro vandeniliniai ryšiai, dėl kurių tRNR įgauna dar
kompaktiškesnę tretinę L-formos konformaciją (9 pav.). Antrinės struktūros kilpos D ir T C
svarbios universalios tRNR tretinės struktūros susidarymui. tRNR biologinę funkciją ir lemia
ši tretinė struktūra. Joje aktyviai veikia dvi nesuporuotos nukleotidų vietos, t. y. antikodonas
ir 3 gale esanti CCA seka.


9 pav. tRNR tretinė struktūra.

Aminoacil-tRNR-sintetazės
Universalus genetinis kodas yra realizuojamas vienos pagrindinės biocheminės
reakcijos metu. Ši reakcija – tai tRNR molekulės aminoacilinimas, kurią katalizuoja
specifiniai fermentai – aminoacil-tRNR-sintetazės (ARSazės). Kiekvienai aminorūgščiai
egzistuoja viena ARSazė ir viena tRNR. tRNR aminoacilinimo reakcijoje dalyvauja viena iš
20-ies ARSazių, kurių kiekviena yra specifinė tik vienai aminorūgščiai. Tačiau yra ir išimčių.
ARSazės – tai 20-ties fermentų šeima, atliekanti panašias funkcijas, tačiau pasiţyminti
skirtingu specifiškumu substratui. Viena ypatingų šių fermentų savybių yra ta, kad juos
sudaro skirtingas skaičius įvairaus dydţio subvienetų. ARSazės gali būti ir monomerai, ir
dimerai, ir tetramerai, o jų subdalelių molekulinė masė skiriasi nuo 37 kDa iki 108 kDa. Pagal
aminorūgšties prijungimo vietą ARSazės skirstomos į dvi klases.
Pirmajai klasei priklauso fermentai, kurie katalizuoja specifinės aminorūgšties
prijungimą prie 2 -OH adenozino, esančio 76-oje padėtyje tRNR molekulės 3 -gale.
Daţniausiai šios ARSazės yra monomeriniai baltymai.
Antrosios klasės fermentai jungia aminorūgštį prie atitinkamos tRNR 3 -OH, išskyrus
fenilalanil-tRNR sintetazę, kuri jungia aminorūgštį prie 2 -OH. Šios klasės ARSazės visada
yra oligomeriniai baltymai.
Aminoacilinimo reakcija yra dvipakopė:
ARSazė + aminorūgštis + ATP <-----> ARSazė-(aminorūgštis-AMP) + PP
n

ARSazė-(aminorūgštis-AMP) + tRNR <-----> aminorūgštis-tRNR+ ARSazė + AMP
___________________________________________________________________________
Aminorūgštis + ATP + tRNA <---------> aminorūgštis-tRNR + AMP + PP
n

Reakciją į produkto pusę perstumia makroerginio neorganinio pirofosfato (PP
n
) hidrolizė.
Pirmosios pakopos metu aminorūgštis suţadinama (aktyvinama) dalyvaujant ATP
molekulei – susidaro tarpinis junginys – aminoaciladenilatas (aminoacil-AMP) ir pirofosfatas.
Antrosios pakopos metu prie 3 -tRNR galo prijungiama aminorūgštis ir susidaro aminoacil-
tRNR bei AMP. Aminoacil-tRNR (aa-tRNR) – tai aminorūgšties esteris, kuriame
aminorūgšties karboksigrupė sujungta su tRNR 3 galo 2 - ar 3 - OH grupe. Taigi aminoacil-
tRNR susidarymui sunaudojami 2 makroerginiai fosfatiniai ryšiai. Abi pakopas katalizuoja ta
pati ARSazė: aa-AMP tarpininkas nedisocijuoja nuo ARSazės; nekovalentiniais ryšiais jis
stipriai susijęs su fermento aktyviuoju centru.
Daţniausiai tRNR aminoacilinimo reakcijoje dalyvauja viena iš 20-ties ARSazių,
kiekviena iš kurių specifinė tik vienai aminorūgščiai. Tačiau yra išimčių. Buvo išskirtos ir
aprašytos visos 20 ARSazių iš E. coli ir didelė dalis ţemesniųjų bei aukštesniųjų eukariotų
ARSazių. Genų klonavimo ir sekvenavimo metodais buvo nustatyta prokariotinių ARSazių
pirminė seka. Visas jas koduoja skirtingi ir unikalūs genai, išskyrus lizil-tRNR sintetazę, kurią
koduoja du genai – ekspresuojamas genas – lysS ir šilumos indukuojamas genas lysU.
Buvo klonuota ir sekvenuota 20 ţemesniųjų eukariotų genų, koduojančių citoplazmos
ir/arba mitochondrijų ARSazes. Visas mitochondrijų ARSazes koduoja branduolio DNR.
Ţemesniųjų eukariotų ARSazių genai neturi intronų, išskyrus tris genus, sekvenuotus iš
Neurospora crassa. Ţinduolių ARSazių tyrimų progresas vyko lėčiau, tačiau buvo aptikta
visa eilė struktūrinių ir funkcinių ARSazių ypatybių, kurių nėra bakterijų ir mielių
fermentuose. Dalis ţinduolių ARSazių buvo klonuota ir sekvenuota, nustatyta, kad jų genai
yra sudaryti iš kelių egzonų, atskirtų dideliais intronais. Atlikti šių fermentų aktyvumo
reguliacijos tyrimai.
ARSazėms būdingi keturi ketvirtinės struktūros tipai. Jų molekulės gali būti sudarytos iš
vieno subvieneto ( tipo struktūra), dviejų identiškų subvienetų (
2
tipo struktūra), keturių
identiškų subvienetų (
4
tipo struktūra), dviejų skirtingų porinių subvienetų (
2 2
tipo
struktūra).
Evoliucijos eigoje homologinių fermentų subvienetų struktūra praktiškai nekito nuo
prokariotų iki ţemesniųjų eukariotų. Eukariotų ARSazių molekulės polipeptidinė grandinė
vidutiniškai ilgesnė nei jų analogų prokariotų ar ţemesniųjų eukariotų ląstelėse. ARSazės
tarpusavyje arba su kitais baltymus sintezuojančios sistemos komponentais ar ląstelės
struktūromis jungiasi į didelės molekulinės masės kompleksus, todėl kompleksų molekulinė
masė labai didelė. Remdamasis eukariotinių ARSazių hidrofobinėmis savybėmis bei jų
sąveikos ypatybėmis, Deučeris pasiūlė šių fermentų kompleksų organizacijos bendrą modelį.
Pagal šį modelį ARSazių susijungimas į kompleksą vyksta dėl jų hidrofobinių domenų
sąveikos. Šie domenai sudaro komplekso branduolį. Tuo tarpu fermentų aktyvūs centrai
išsidėsto komplekso išorėje. Komplekso branduolyje greičiausiai yra lipidai ar kiti
hidrofobiniai komponentai, stabilizuojantys jo struktūrą. Pagal atliktus tyrimus nustatyta, kad
viena iš komplekso funkcijų yra ARSazių aktyvumo stabilizacija. Dabartiniu metu ARSazių
makromolekuliniai kompleksai išskirti beveik iš visų aukštesniųjų eukariotų organizmų.
ARSazių kompleksų dydis ir sudėtis įvairiose rūšyse skiriasi, be to, priklauso ir nuo
fiziologinės būklės bei nuo amţiaus.
ARSazių kompleksai gali būti asocijuoti su ląstelės membrana ir gali surišti
aminorūgštis iš tarpląstelinės terpės, tuo tarpu laisvi fermentai suriša ląstelės citoplazmoje
esančias aminorūgštis.
ARSazės yra labai specifiški fermentai ir tikslūs atpaţindami tiek aminorūgštis, tiek
tRNR. Šie fermentai pasiţymi savęs pasitikrinimo savybe. Hidrolitinis patikrinimas
ARSazėms yra pagrindinis, tačiau egzistuoja ir kiti savęs pasitikrinimo keliai, pvz., tirozino
ARSazė 10
4
karto stipriau prijungia minėtą aminorūgštį (dėl turimos OH-grupės) nei
fenilalaniną.
Specifinės ARSazės atlieka daugybę naujų, neįprastų funkcijų, tokių, kaip dalyvavimas
aminorūgščių sintezėje, ląstelės ciklo kontrolėje, RNR splaisinge, tRNR transporte iš
branduolio į citoplazmą eukariotinėse ląstelėse ir DNR replikacijoje. Stebinanti funkcijų
įvairovė parodo šio fermento plastiškumą ir sugebėjimą prisitaikyti baltymų sintezės procese.



4 seminaras
Potransliacinis baltymų paskirstymas ir modifikavimas
(3 val.)

Paskutiniojo baltymų biosintezės etapo metu naujai susintetinta polipeptido grandinė
įgauna atitinkamą erdvinę struktūrą ir biologiškai aktyvią formą. Natyvinė baltymo konformacija
susidaro veikiant vandeniliniams ir van der Valso (angl. Waals) ryšiams, joninėms ir
hidrofobinėms sąveikoms. Tačiau dauguma naujai susintetintų baltymų dar nėra biologiškai
aktyvūs – jie daugiau ar maţiau modifikuojami. Tokios modifikacijos vadinamos
posttransliacinėmis modifikacijomis.
Polipeptido N ir C galų modifikacijos. Polipeptido pradţioje yra iniciacijos aminorūgštis
– N-formil-metioninas (bakterijų) arba metioninas (eukariotų). Formilo grupė ar metioninas
(daugiausia ir C galo aminorūgštis) yra pašalinami fermentiniu būdu. Daugiau kaip 50 proc.
eukariotų baltymų N-galinės aminorūgšties aminogrupė po transliacijos yra N-acetilinama. C
galo aminorūgštys kartais taip pat yra modifikuojamos.
Signalinių sekų pašalinimas. Tam tikrų baltymų seka iš 15-30 aminorūgščių, esančių
polipeptido N gale, nukreipia baltymą į jo paskirties vietą ląstelėje. Tokias signalines sekas
brendimo metu galutinai pašalina specifinės peptidazės.
Individualiųjų aminorūgščių modifikacijos. Tam tikrų baltymų aminorūgščių – Ser, Thr
ir Tyr – hidroksigrupės, dalyvaujant ATP, fermentiniu būdu yra fosforilinamos. Fosfatinės
grupės polipeptidui suteikia neigiamąjį krūvį. Funkcinė šios modifikacijos reikšmė įvairiems
baltymams yra įvairi. Pavyzdţiui, pieno baltymas kazeinas turi daug fosfoserino grupių,
sujungiančių Ca
2+
. Fosforilinimo-defosforilinimo ciklas valdo daugelio fermentų ir
reguliavimo baltymų aktyvumą.
Prie kai kurių baltymų tam tikrų aminorūgščių, pvz., Glu, prijungiama papildoma
karboksigrupė. Pavyzdţiui, kraujo krešėjimo baltymas protrombinas turi kelis γ-
karboksiglutamatus N-galiniame regione. Karboksigrupių prijungimą katalizuoja fermentas,
kurio aktyvumui būtinas vitaminas K. Šios karboksigrupės sujungia Ca
2+
jonus, būtinus kraujo
krešėjimo iniciacijai.
Monometil- ir dimetillizino turi raumenų baltymai ir citochromas c. Daugumos
organizmų Ca
2+
sujungiantis baltymas kalmodulinas specifinėje savo struktūros vietoje turi vieną
trimetilliziną. Kitų baltymų metilinant Glu karboksigrupę, pašalinamas neigiamasis molekulės
krūvis.
Sacharidų prijungimas. Po polipeptido biosintezės kovalentiškai prijungiami sacharidai.
Daugumos glikoproteinų sacharidas fermentiniu būdu yra prijungiamas daţniausiai prie Asn
(N-ryšiu prijungtas oligosacharidas) arba prie Ser ar Thr (O-ryšiu prijungtas oligosacharidas).
Dauguma neląstelinių baltymų, pvz., proteoglikanų, turi oligosacharidines grandines.
Izoprenilo grupių prijungimas. Keletas eukariotų baltymų yra modifikuojami prijungiant
prie jų izoprenilo grupes. Tioesterinis ryšys susidaro tarp izoprenilo grupės ir baltymo
aminorūgšties cisteino – Cys. Izoprenilo grupė yra kilusi iš cholesterolio biosintezės
fosforilintų tarpinių produktų, tokių kaip farnezildifosfatas. Vykstant šiai modifikacijai
dalyvauja specialus baltymas Ras (jis yra ras onkogeno ir protoonkogeno produktas), G
baltymas ir baltymai laminai, esantys branduolio matrikse. Tam tikrais atvejais izopreno
grupės padeda baltymui prisitvirtinti membranoje. Transformuotas onkogeno Ras aktyvumas
prarandamas, kai Ras baltymo izoprenilinimas yra blokuojamas šios posttransliacinės
modifikacijos inhibitoriais, vartojamais vėţio chemoterapijai.
Prostetinių grupių prijungimas. Daugumos prokariotų ir eukariotų baltymų aktyvumui
būtinos kovalentiniu ryšiu prijungtos prostetinės grupės. Pavyzdţiui, biotino molekulės
prijungimas prie fermento acetil-CoA karboksilazės ir hemo – prie citochromo c.
Proteolizinis brendimas. Dauguma baltymų sintetinami didelių molekulių baltymų
pirmtakių pavidalu, ir aktyvios jų formos susidaro tik tuomet, kai sumaţėja molekulė. Pavyzdţiui,
insulinas, tam tikri virusų baltymai ir proteazės (tripsinas ir chimotripsinas).
Disulfidinių ryšių susidarymas. Susidarius tretinei struktūrai ir baltymo molekulei
įgavus natyvinę konformaciją, kai kuriuose baltymuose tarp polipeptidinių grandinių susidaro
disulfidiniai ryšiai (tarp Cys liekanų). Jie daţniausiai susidaro baltymuose, kurie eksportuojami
iš eukariotinės ląstelės. Disulfidiniai ryšiai palaiko baltymo molekulės natyvinę konformaciją.
Eukariotų baltymų nukreipimas į jų paskirties vietą
Kad ląstelės normaliai funkcionuotų ir galėtų sudaryti savo struktūras bei organeles,
būtinas tam tikras baltymų ir fermentų rinkinys. Beveik visi baltymai sintetinami ant citozolio
ribosomų ir po transliacijos nukreipiami į jų paskirties vietą. Vieni sekretuojami iš ląstelės, kiti
integruojami į plazminę membraną, tam tikri patenka į lizosomas, mitochondrijas ar branduolius
arba pasilieka citozolyje. Jei naujai susintetinti baltymai skirti mitochondrijoms, chloroplastams
(augalų) ar branduoliams, tai jie iš pradţių yra atitinkamai modifikuojami. Modifikacijos
prasideda endoplazminiame tinkle (ET). Jos yra susijusios su trumpa aminorūgščių seka –
signaline seka. Nustatyta šimtai tokių sekų. Jų struktūrą, savybes ir funkcijas 1970 m. nustatė D.
Sabatinis ir G. Blobelis. Signalinė seka nukreipia baltymą į jo paskirties vietą. Ji yra
polipeptido N gale. Šią seką daţniausiai turi lizosominiai, membraniniai ir sekreciniai baltymai.
Signalinę seką pašalina signalinė peptidazė, nutraukdama peptidinį ryšį sekos C gale (iš
karboksi-grupės pusės) po to, kai baltymas jau patenka į ET. Signalinė seka sudaryta iš 13-36
aminorūgščių. Jai būdingos tam tikros bendros savybės: 1) signalinė seka turi apie 10-15
hidrofobinių aminorūgščių; 2) N gale prieš hidrofobinę seką yra viena ar daugiau aminorūgščių,
turinčių teigiamąjį krūvį; 3) prie C galo (netoli kirpimo vietos) yra trumpa polinė seka, turinti
trumposios grandinės aminorūgščių (pvz., Ala). Baltymai, turintys signalines sekas, sintetinami ant
ribosomų, prisitvirtinusių prie ET. Tokių baltymų N galo signalinė seka nurodo, kad sintetinamas
polipeptidas, atsiskyręs nuo ribosomos, pateks į ET spindį. Polipeptidinė grandinė aktyviai
pertempiama pro endoplazminio tinklo membraną. Naujai sintetinamo polipeptido kelias nuo
ribosomos į ET jau prasideda baltymo biosintezės iniciacijos ant laisvųjų ribosomų metu.
Signalinė seka sintetinama pirmiausia, nes ji turi N galą. Kai tik signalinė seka pasirodo iš
ribosomos, ji tuoj pat sujungiama su didele signalinę seką atpažįstančia dalele – SRP (angl.
signal recognition particle). SRP yra lazdelės formos kompleksas. Jį sudaro 300 nukleotidų
ilgio RNR (7SL-RNR) ir šeši skirtingi baltymai (bendra molekulinė masė 325 kDa). Vienas
SRP subvienetas tiesiogiai jungiasi prie signalinės sekos ir, blokuodamas aminoacil-tRNR
įsijungimą, inhibuoja elongaciją ir peptidiltransferazę. Kiti baltyminiai SRP subvienetai (α- ir
β-) jungiasi su GTP ir ją hidrolizuoja. SRP receptorius yra heterodimeras: jį sudaro α- (mol.
masė 69 kDa) ir β-subvienetai (mol. masė 30 kDa).
Paskui SRP jungiasi su GTP. Polipeptido elongacija sustabdoma, kai jo ilgis pasiekia apie
70 aminorūgščių, o signalinė seka yra nutolusi nuo ribosomos. GTP ir SRP nukreipia ribosomą
(vis dar susijungusią su mRNR) ir neuţbaigtą sintetinti polipeptidą SRP receptoriaus link,
esančio ET citozolinėje pusėje. Naujai susintetintą polipeptidą jau ET spindyje atskiria
peptidtranslokacijos kompleksas, kuris tiesiogiai sąveikauja su ribosoma. SRP disocijuoja
nuo ribosomos; disociacijos metu įvyksta GTP hidrolizė.
Signalinę seką ET viduje pašalina signalinė peptidazė, esanti ET spindyje. Ribosomos
disocijuoja ir ciklas prasideda iš naujo.
ET spindyje vyksta naujai susintetinto baltymo modifikacijos. Pašalinus signalinę seką,
susiformuoja atitinkama erdvinė polipeptido struktūra, susidaro disulfidiniai ryšiai, ir daugelis
baltymų yra glikozilinami. Beveik prie visų baltymų, susintetintų ant susijusių su membranomis
polisomų, kovalentiškai prisijungia viena ar keletas sacharidinių grupių. Per Asn N-ryšiu
daţniausiai prijungiami įvairūs oligosacharidai (N-acetilgliukozaminas, manozė, gliukozė).
Baltymams būdingas vienas bendras poţymis – visi jie jungiasi prie bendros oligosacharidinės
šerdies, savo ruoţtu prisijungusios prie dolicholio fosfato.
Baltymo glikozilinimą katalizuoja fermentas transferazė, esanti ET spindţio paviršiuje.
Ją slopina kai kurie antibiotikai, pvz., tunikamicinas. Iš ET pernašos pūslelės susidariusius
glikoproteinus perneša į Goldţio kompleksą, kur oligosacharidinės liekanos trumpinamos ir
galutinai glikozilinamos. Goldţio komplekse glikoproteinai rūšiuojami, paruošiami sekrecijai pro
plazminę ląstelės membraną ir siunčiami pagal paskirtį arba patenka į lizosomas (pvz., baltymų,
patenkančių į lizosomas, signalas N-ryšiu prijungtuose oligosachariduose yra viena ar daugiau
manozės-6-fosfato liekanų).
Baltymų pernaša į branduolį.
Baltymai, nešami iš citozolio į branduolį, taip pat turi nukreipiančias signalines sekas.
Pavyzdţiui, ribosominiai baltymai yra sintetinami laisvose citozolinėse ribosomose ir
pernešami į branduolį. Čia, susijungę su rRNR, sudaro didįjį (60S) ir maţąjį (40S)
ribosomos subvienetus. Ribosomų subvienetai iš branduolio grąţinami atgal į citozolį. Įvairūs
branduolio baltymai (RNR ir DNR polimerazės, histonai, topoizomerazės, genų ekspresiją
valdantys baltymai ir kt.) sintetinami citozolyje ir tik paskui siunčiami į branduolį. Pernašą
atlieka sistema, kurią sudaro atitinkami molekuliniai signalai ir pernašos baltymai.
Branduolio apvalkalas ląstelės dalijimosi metu suskyla (būdinga daugumai daugialąsčių
eukariotų). Po ląstelės dalijimosi jis vėl atsinaujina, o išsibarstę branduolio baltymai vėl
reimportuojami atgal į branduolį. Branduolio baltymai turi specialią signalinę seką (NLS;
angl. nuclear localization sequence), kuri tam tikrą baltymą nukreipia į branduolį. Skirtingai
nuo sekų, kurios baltymą nukreipia į ET, sekos, nukreipiančios baltymą į branduolį,
neatskeliamos ir nepašalinamos.
Vykstant baltymo pernašai į branduolį dalyvauja baltymas importinas (sudarytas iš a-
ir β-subvienetų) ir maţa GTPazė, vadinama Ran. Tarp citozolio ir branduolio vyksta ciklinis
baltymų pernašos procesas. Heterodimerinis importinas atlieka baltymų, nešamų į branduolį,
receptoriaus funkciją. Jo a- subvienetas citozolyje jungiasi su nešamo baltymo NLS seka.
Prisijungus β-subvienetui, susidaro kompleksas – NLS-nešamas baltymas-importinas ir,
dalyvaujant Ran (GTPazei; pernašos mechanizmas priklauso nuo energijos), įvyksta šio viso
komplekso translokacija pro branduolio poras (jas sudaro specialūs baltymai) į branduolio
vidų. Translokacijos metu iš komplekso disocijuoja importino subvienetai, ir baltymas,
turintis signalinę seką, patenka į nukleoplazmą. a- ir β-importino subvienetai pro branduolio
poras vėl išeina atgal į citozolį, ir ciklas kartojasi iš naujo.
Baltymų pernaša į ląstelę receptorinės endocitozės būdu.
Tam tikri baltymai, pvz., maţo tankio lipoproteinai (MTL), geleţį pernešantis baltymas
feritinas, peptidiniai hormonai, baltymai, skirti suardyti ląstelės viduje ir kt. – iš ląstelę supančios
aplinkos patenka į jos vidų. Nešamas baltymas jungiasi prie plazminės membranos receptorių
(receptorinių baltymų), kuriems, koncentruojantis plazminės membranos paviršiaus vienoje
vietoje, susidaro dangalinė įduba, kurią citoplazmos pusėje dengia uţdarosios struktūros
poliedrinio baltymo klatrino sluoksnis. Klatrinas padengia nuo Goldţio aparato atsiskiriančias
pūsleles. Receptorinės endocitozės būdu citoplazmoje atsidūrusios pūslelės yra nepatvarios ir per
kelias sekundes suyra, atskirdamos klatrino apvalkalą ir plazmine membrana apgaubtą vidinį turinį.
Klatrinas vėl įsiterpia į plazminę membraną, o vidinis turinys susilieja su endosomomis. Klatrinas
yra būtinas atrankiajai stambiamolekulinių junginių pernašai, vykstančiai tarpininkaujant
receptoriams. Pūslelės ir jos turinio naudojimas priklauso nuo to, kuris ligandas (makromolekulė,
prisijungianti prie receptoriaus) yra jos viduje. Jei į ląstelę patenka hormonas, kurio funkcija
ląstelėje yra reguliacinė, jis suvirškinamas kartu su visu receptoriumi, vos tik pūslelė susilieja su
endosoma. Jei į ląstelę patenka cholesterolis (MTL sudėtinė dalis), pūslelės membrana, o kartu su
ja ir receptoriai, grąţinami į plazminę membraną arba pūslelė gali keliauti prie kitų membraninių
darinių. Receptorinės endocitozės būdu į ląstelę patenka toksinai ir virusai. Pavyzdţiui, šiuo būdu
patenka difterijos toksinas, choleros toksinas, gripo virusas.
Baltymų pernaša į mitochondrijas.
Beveik visus mitochondrijų baltymus koduoja branduolio DNR. Po transliacijos
citoplazmoje jie pernešami į mitochondrijas. Baltymų pirmtakai, skirti mitochondrijoms, N gale
turi seką, prie kurios jungiasi citozoliniai baltymai šaperonai.
Mitochondrijų baltymų signalinę seką sudaro apie 20-35 aminorūgščių seka, kurioje yra
daug Ser, Thr ir bazinių aminorūgščių. Mitochondrinių baltymų pirmtakai prijungiami prie
Hsp 70 baltymo (šiluminio šoko baltymo 70) arba prie specifinio mitochondrijų baltymo MSF
(patekimą į mitochondrijas skatinantis faktorius). Šie abu baltymai priklauso šaperonų klasei.
Jie stabilizuoja nesulankstytą baltymų pirmtakų konformaciją. MSF baltymai yra specifiniai
mitochondrijoms; Hsp 70 priklauso bendrai šaperonų baltymų klasei; jų turi bakterijos ir
eukariotų ląstelės.
Susijungę su šaperonais, mitochondrijų baltymų pirmtakai pernešami ant baltymų
komplekso, vadinamo Tom – mitochondrinis receptorius (pernašai pro išorinę membraną).
Tom kompleksas sukuria kanalą pro išorinę membraną. Antrasis baltyminis kompleksas,
ţinomas kaip Tim (skirtas pernašai pro vidinę membraną), perkelia baltyminį pirmtaką į
mitochondrijų matriksą. Translokacijai būtina energija, kuri išsiskiria sąveikaujant
mitochondriniam Hsp 70 baltymui (mHsp 70) su ATP arba GTP; kartais translokaciją lengvina
transmembraninis elektrocheminis potencialas. Mitochondrijų viduje baltymai įgauna tam tikrą
erdvinę struktūrą su tam tikrų šaperonų (tarp jų ir mHSP 70) pagalba, o signalinę seką pašalina
specifinė brendimo proteazė, esanti matrikse.
Mitochondrinio signalo sekos turi „stop“ pernašos signalų. Kai šis signalas, pernešant
mitochondrinį baltymą pirmtaką pro membranos kanalą atpaţįstamas ir kai hidrofobinė
aminorūgščių dalis atsiranda tarp išorinės ir vidinės membranų, translokaciją trumpam
sustabdoma. Tuomet baltymas atsiskiria ir integruojasi į membraninius baltymus. Kitais
atvejais sekos, atsiradusios vidinėje membranoje, yra skaidomos ir sudaro tarpmembraninio
tarpo tirpius baltymus.
Metodinis dalyko programos aprūpinimas

Studijoms rekomenduojama pagrindinė literatūra:

Eil.
Nr.
Leidinio
pavadinimas
Leidinio autorius
Leidimo metai ir
leidykla
1. Biochemija Praškevičius A., Ivanovienė L.,
Stasiūnienė N. ir kt.
2003, KMU Spaustuvė
2. Biochemija Praškevičius A., Ivanovienė L.,
Stasiūnienė N. ir kt.
2006, Vitae Litera
3. Textbook of
biochemistry with
clinical correlations
Devlin T. 1997, Wiley and sons
4. Principles of
biochemistry with a
human focus
Garrett R., Grisham C. 1997, Thomson
learning
5. Biochemistry Stryer L. 1998, Freeman and Co
6. Fundamental of
biochemistry
Voet D., Voet J., Pratt C. 1999, John Wiley and
sons
7. Molecular biology
techniques
Ream W., Field K. 1999, Academic press
8. Molecular biology of
the cell
Alberts B., Johnson A., Lewis J.,
Raff M., Roberts K., Walter P.
2002, Garland science
9. Biochemistry Berg J., Tymoczko J., Stryer l. 2002, Freeman and Co

Savarankiškam darbui rekomenduojama papildoma literatūra:

Eil.
Nr.
Leidinio pavadinimas Leidinio autorius Leidimo metai ir
leidykla
1. Protein synthesis and
ribosome structure.
Nierhaus K.H., Wilson D.N. 2004, Wiley-VCH
Verlag GmbH&Co.
KGaA
2. The structure and
function of initiation
factors in eukaryotic
protein synthesis.
Pestova T. V., Hellen C. U. T. Cellular and Molecular
Life Sciences. 2000. Vol.
57. P. 651-674.
3. The new aspects of
aminoacyl-tRNA
synthetases.
Szymanski M., Deniziak M.,
Barciszewski J.
Acta Biochim. Polon.
2000. Vol. 47. P. 821-
834.
4. Protein synthesis:
twenty three amino
acids and counting.
Ibba M., Stathopoulos C., Soll
D.
Current Biology. 2001.
Vol. 11. P. R563-R565.
5. Molecular mechanisms
of translation initiation
in eukaryotes.
Pestova T. V., Kolupaeva V.
G., Lomakin I. B., Pilipenko E.
V., Shatsky I. N., Agol V. I.,
Hellen C. U. T.
Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2001. Vol. 98. P.
7029-7036.
6. The ribosome in focus. Maguire B. A., Zimmermann
R. A.
Cell. 2001. Vol. 104. P.
813-816.
7. Aminoacyl-tRNA
synthetases and
aminoacylation of
tRNA in the nucleus.
Mucha P. Acta Biochim. Polon.
2002. Vol. 49. P. 1-10.
8. Regulation of
mammalian translation
factors by nutrients.
Proud C. G. Eur.J. Biochem. 2002.
V. 269. P. 5338-5349.
9. After the ribosome
structure: how are the
subunits assembled?
Williamson J. R. RNA. 2003. Vol. 9. P.
165-167.
10. After the ribosome
structure: how does
translocation work?
Moore P.B., Steitz T.A. RNA. 2003. Vol. 9. P.
155-159.
11. After the ribosome
structure: how does
translocation work?
Joseph S. RNA. 2003. Vol. 9. P.
160-164.
12. Aminoacyl-tRNA
synthetase complexes:
beyond translation.
Lee S.W., Cho B.H., Park
S.G., Kim S.
J. Cell Sci. 2004. Vol.
117. P. 3725-3734.
13. tRNA maturation:
RNA polymerization
without a nucleic acid
template.
Weiner A.M. Current Biology. 2004.
Vol. 14. P. R883-R885.
14. Ribozymes:
applications to
functional analysis and
gene discovery
Shiota M., Sano M.,
Miyagishi M., Taira K.
J. Biochem. 2004. Vol.
136. P. 133-147.
15. Mechanisms of
elongation on the
ribosome: dynamics of
a macromolecular
machine.
Wintermeyer W., Peske F.,
Beringer M., Gromadski K.B.,
Savelsbergh A., Rodnina M.V.
Biochemistry Society
Transactions. 2004. Vol.
32 (part 5). P.733-737.
16. Mammalian target of
rapamycin inhibition
Dutcher J. P. Clinical Cancer
Research. 2004. Vol. 10.
P. 6382s-6387s.
17. Recent progress of
structural biology of
tRNA processing and
modification.
Nakanishi K., Nureki O. Mol. Cells. 2005. Vol.
19. P. 157-166.
18. Occurrence of the
aminoacyl-tRNA
synthetases in high-
molecular weight
complexes correlates
with the size of
substrate amino acids.
Wolfson A., Knight R. FEBS Lett. 2005. Vol.
579. P. 3467-3472.
19. Aminoacyl-tRNA
synthesis.
Cochella L., Green R. Curr. Biol. 2005. Vol.
15. P. R536-R540.
20. Prospects for
aminoacyl-tRNA
synthetase inhibitors as
new antimicrobial
agents.
Hurdle J.G., O'Neill A.J.,
Chopra I.
Antimicrob. Agents
Chemother. 2005. Vol.
49. P. 4821-4833.
21. Antibiotics and the
ribosome.
Tenson T., Mankin A. Molecular Microbiology.
2006. Vol. 59. P. 1664-
1667.
25. Mitochondrial DNA
medicine.
Dimauro S. Biosci. Rep. 2007. Vol.
27: 5-9.
26. Aminoacyl-tRNA
synthetases: essential
and still promising
targets for new anti-
infective agents.
Ochsner U.A., Sun X., Jarvis
T., Critchley I., Janjic N.
Expert. Opin. Investig.
Drugs. 2007. Vol. 16:
573-593.
27. Ribozyme catalysis of
metabolism in the RNA
world.
Chen X, Li N, Ellington AD. Chem. Biodivers. 2007.
Vol. 4: 633-655.
28. http://www.accessexce
llence.org/RC/VL/GG/
protein_synthesis.html

29. http://www.emc.maric
opa.edu/faculty/farabee
/biobk/BioBookPROTS
Yn.html

30. http://web.indstate.edu
/thcme/mwking/protein
-synthesis.html

31. http://users.rcn.com/jki
mball.ma.ultranet/Biolo
gyPages/T/Translation.
html#polysomes