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Dirección General de Investigación

CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN
COMUNIDAD DE MADRID
PROYECOS DE IN!ESIGACIÓN" IN#ORME
CIENÍ#ICO Y ECONÓMICO #INA$"
CON!OCAORIA% &SA$UD '(()*
Nº DE PROYECTO: (+"',((--,'(()
TIPO DE PROYECTO% C..rdinad. NO / SI
Subproyecto nº:
(Sólo en proyectos coordinados)
Investigador Responsable% MÓNICA SU0RE1 RODRÍGUE1 2
3erland 3ernande4 M.rales
Coordinador del Proyecto:
(Sólo en proyectos coordinados)
Ttulo del proyecto% CARACERI1ACIÓN MO$ECU$AR DE UNA NUE!A
!ÍA DE IN!ASIÓN EN $A IN#ECCIÓN DE C5$U$AS EUCARIOAS POR
!isteria "onocytogenes"
Departa"ento: S#NID#D #NI$#!
Centro: %#C&!T#D DE 'ETERIN#RI#
Organis"o: &NI'ERSID#D CO$P!&TENSE
%ec(a de co"ien)o del Proyecto: *unio +,,-
%ec(a de ter"inaci.n del Proyecto: setie"bre +,,/
#ec6a% Madrid7 die4 de setie89re de d.s 8il c:atr.

C.n;.r8e el Re<resentante El Investigad.r Res<.nsa9le
$egal del Organis8.
Fdo: CARLOS ANDRADAS HERANZ Fdo: MÓNICA SUÁREZ RODRÍGUEZ
VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN
(Debe incluirse firma original y sello de la Institución) (Firma original del Investigador)
I$MA" SRA" DIRECORA GENERA$ DE IN!ESIGACIÓN
C,Alcal= >'7 >? <lanta" '+()- MADRID
)"@ RESUMEN,AASRAC" (En castellano e inglés, máimo !" l#neas en cada idioma)$
El patógeno humano de origen alimentario Listeria monocytogenes es una bacteria
invasiva que induce su entrada en células normalmente no fagocíticas, tales como enterocitos,
hepatocitos y células endoteliales. Tras la entrada, la bacteria escapa del fagosoma, se multiplica
en el citoplasma e induce la polimerización unidireccional de actina en uno de sus polos. ct es
un factor esencial para la virulencia de Listeria y una de las proteínas mayoritarias e!puestas en
la superficie de la bacteria. En el presente proyecto hemos estudiado el papel de ct como
invasina o responsable del proceso de penetración de células adyacentes y hemos caracterizado
los dominios de la molécula implicados en la entrada. ctualmente estamos estudiando la
maduración transcripcional de ct en Listeria, en la que parece estar implicada la
metaloproteasa "pl.
The foodborne pathogen Listeria monocytogenes is an invasive bacterium that induces
its o#n phagocytosis by normally nonphagocytic cells such as enterocytes, hepatocytes and
endothelial cells. fter entry, the bacterium disrupts the phagosomal membrane and escapes to
the cytosol, #here it replicates. $ntracytoplasmic Listeria induce unidirectional actin
polymerization at one pole of the bacterial cell, resulting in rapid movement across the cytosol.
ct is an essential viruelence factor of pathogenic Listeria and is one of the ma%or surface&
e!posed proteins of these bacteria. $n this pro%ect #e characterized the role of ct as invasin
in host cell invasion and dissected the domain's( of the protein involved in host cell surface
recognition and entry. )e are also interested in the transcriptional maduration of ct in
Listeria, in #hich the metalloprotease "pl seems to be involved.
'"@ PA$AARAS C$A!E,BEY CORDS"
Listeria monocytogenes, invasión, ct, patogénesis
Listeria monocytogenes, invasion, ct, pathogenesis
>"@ MEMORIA CIENÍ#ICA"
(%esumen de los resultados del proyecto en relación con los ob&etivos propuestos$ En caso de resultados fallidos, ind#'uense
las causas$ (áimo )""" palabras)$
La listeriosis es una enfermedad bacteriana transmisible por alimentos que afecta al
hombre y a los animales '*arber y +eter,in, -..-(. En Espa/a aparece en forma de casos aislados
o brotes epidémicos y en los 0ltimos -1 a/os, se han notificado 213 casos de listeriosis al
4istema de $nformación "icrobiológica '4$"(. Estos casos han sido comunicados por 56
7ospitales de -8 9omunidades utónomas, entre las que se encuentra la 9omunidad de "adrid.
Los casos de listeriosis en dicha 9omunidad est:n aumentando considerablemente.
El género Listeria es el causante de la listeriosis y comprende bacterias ;ram positivas
de ba%o contenido en ; < 9. Listeria spp son bacilos, anaerobios facultativos, no esporulados, sin
c:psula y móviles por medio de flagelos a temperaturas de -1&2=>9. Toleran bastante bien p7s
ba%os así como son capaces de crecer en un amplio rango de temperaturas -&51>9. 4e pueden
aislar de una gran variedad de muestras ambientales, como son de suelo, agua, fangos así como de
una gran variedad de alimentos y de heces tanto humanas como animales. ?ebido a su ubicuidad,
las bacterias de este género, se incorporan f:cilmente a la cadena alimentaria mediante
alimentos contaminados. 4e piensa que el h:bitat natural de estas bacterias es la materia
vegetal en descomposición, de la que serían saprofitas. Es muy posible que los rumiantes
domésticos hayan %ugado un papel clave en el mantenimiento de este género bacteriano en el
medioambiente rural, mediante un continuo ciclo fecal&oral '@:zquez&Aoland et al., 211-(.
Los signos clínicos de la enfermedad por Listeria monocytogenes son muy similares en
todos los hospedadores susceptibles. 4e distinguen dos formas b:sicas de presentaciónB
listeriosis perinatal y listeriosis en el adulto. En ambos casos, las formas clínicas se
corresponden con infecciones diseminadas o con infecciones locales del sistema nervioso central.
La listeriosis suele ser un proceso severo, de hecho, es una de las infecciones bacterianas m:s
graves y con alta mortalidad '21&81C( aunque se instaure pronto tratamiento antibiótico
'4chuchat el al., -..-(. La fisiopatología de la infección presenta a0n enormes lagunas, gran parte
de lo que se conoce proviene del estudio de las infecciones e!perimentales realizadas en el
modelo murino.
La entrada de Listeria se realiza vía oral mediante la ingestión de alimentos
contaminados. ?esde el tracto digestivo, Listeria llega vía hematógena hasta el hígado, uno de los
órganos diana durante el proceso infeccioso. ?esde el hígado, este par:sito intracelular puede
colonizar el sistema nervioso, la placenta en caso de gestación o provocar una septicemia
generalizada, dependiendo de la respuesta del sistema inmune. Las bacterias que se encuentran
en el intestino contaminar:n las heces del hospedador, produciendo contaminación del suelo y, a
su vez, de alimentos, de modo que se cierra el ciclo oro&fecal '@:zquez&Aoland et al., 211-(.
Listeria monocytogenes es un patógeno invasivo que induce su propia entrada, tanto en
células fagocíticas como en como los macrófagos, y no fagocíticas, como células epiteliales,
hepatocitos, fibroblastos, células endoteliales e incluso neuronas '9hico&9alero et al., 2112D
;oetz et al., 211-D @:zquez&Aoland et al., 211-D 9ossart and +ortnoy, -..1(. El ciclo de
proliferación intracelular de Listeria comprende varias etapas que se encuentran reguladas por
uno o varios factores de virulencia a la vez. La forma de penetrar en las células es mediante
invasión activa y conlleva la formación de una vacuola o fagosoma. +ara poder continuar su ciclo,
Listeria debe escapar de dicho fagosoma, una vez liberada en el citoplasma, la bacteria se rodea
de de un material electrodenso formado por filamentos de actina de la célula hospedadora. Los
filamentos de actina se reorganizan en uno de los polos de la bacteria, propuls:ndola a través del
citoplasma de la célula hospedadora '4u:rez et al., 211-( . 9uando la bacteria en su propulsión,
llega a la membrana citoplasm:tica lateral de la célula que contacta con la membrana de una
célula adyacente, protruye hacia el interior de la célula vecina, quedando englobada en una
fagosoma de doble membrana. partir de aquí la bacteria inicia de nuevo el ciclo. Este comple%o
ciclo intracelular permite que Listeria evada la respuesta inmune del hospedador durante su
difusión y multiplicación en los te%idos del hospedador '@:zquez&Aoland et al., 211-(.
Las diferentes etapas del ciclo de infección intracelular est:n mediadas por factores de
virulencia específicosB
Edhesión e invasiónB mediados por $nl, $nlA, ct
EEscape del fagosomaB mediado por 7ly, +lc, +lcA y "pl
E+roliferación intracitoplasm:ticaB mediada por 7pt
E"ovimiento intra e intercelularB mediado por ct
EEscape del fagosoma de doble membranaB +lcA, 7ly
En el marco del conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la patogénesis
de la infección por L. monocytogenes y en la generación de la respuesta inmune protectora
frente a este par:sito intracelular facultativo, se ha investigado fundamentalmente el papel de
ct en la invasión y el tropismo celular de L. monocytogenes. ct es una proteína de
membrana que promueve la diseminación de Listeria spp. dentro de la célula hospedadora
'9ossart, 2111(. El gen que codifica ct, act, se localiza en el operón de la lecitinasa %unto
con otros factores de virulencia '9ossart y +ortnoy, 2111(.
En nuestro grupo de la Fniversidad 9omplutense de "adrid presentamos evidencias de
que la proteína de superficie ct, ampliamente estudiada como nucleador de actina, est:
implicada en invasión de L. monocytogenes en células epiteliales. 4in embargo, ct no
contribuye a la internalización de esta bacteria en fibroblastos 9G4&- y hepatocitos 7epa -&6,
sugiriendo una función de esta proteína en el tropismo de hospedador del proceso de invasión.
simismo, la e!presión de act en Listeria innocua fue suficiente para promover la entrada en
esta especie no invasiva de Listeria en células epiteliales, pero no en células 9G4&- y 7epa -&6,
indicando que ct dirige la ruta de internalización específica para células epiteliales '4u:rez et
al., 211- a, b(.
?entro del marco de los ob%etivos de nuestro proyecto y siguiendo con nuestro traba%o
de investigación acerca de ct, hemos usado para nuestros e!perimentos la cepa +-5 de L.
monocytogenes, un aislado clínico del serovar 5b. También usamos la cepa llamada prfE o +-5&
con un fenotipo hiperinvasivo 'Hipio et al., -..I(. En el mutante ∆act, =53 de los 615 codones
originales estaban ausentes, lo que corresponde al .1C del polipéptido ct. El mutante ∆act
fue obtenido de +-5& y tiene un fenotipo idéntico al de la cepa parental, incluyendo la
producción del halo de lecitinasa debido a la sobreproducción de la actividad de una fosfolipasa 9
codificada por plcA, confirmando que el mutante de deleción no tiene efectos polares.
9on el fin de e!cluir la posibilidad de que la pérdida de invasividad del mutante ∆act
fuera debida a otras mutaciones en un locus no conocido, se reintrodu%o act en un pl:smido
'p7act( en la cepa mutante. Fsamos )estern blot usando un anticuerpo monoclonal frente a
ct para comprobar que el producto del gen ct se e!presaba y est: relacionado con la pared
celular de la bacteria. 9omo control se uso solo el pl:smido p7+4.. Los resultados obtenidos
muestran que ct realmente estaba implicada en el fenómeno de invasión de células eucariotas
de L. monocytogenes '4u:rez et al., 211-(.
+ara estudiar si la proteina ct estaba implicada en el tropismo celular, se realizaron
e!perimentos de invasión usando fibroblastos de mono 9G4&-, células de hepatoma de ratón
7epa -,6 y línea de macrófagos murinos JII5.-. En las cuatro líneas ensayadas la invasividad de
+-5 fue muy ba%a, mientras que la de la cepa derivada de ésta prfE fue significativamente m:s
alta '-2 & 6I veces(. Ello indica que fenómenos +rf dependientes son también usados para que L.
monocytogenes penetre en fibroblastos 9G4&-, células 7epa&-,6 y macrófagos JII5.-. 4in
embargo, el efecto de la pérdida de ct, en general, mucho mas ba%o que el observado en
celulas epiteliales. En las líneas celulares aba%o mencionadas, la complementación del gen act
retauraba la invasividad a niveles similares a aquellos observados en la cepa parental prfE .
En nuestros estudios de comparación de secuencias, se muestra que la proteína ct de un
serotipo 5b difiere del serotipo -K2a en una deleción de 8= amino:cidos en la zona rica en
prolinas y en =2 residuos. 4ólo -= de estos amino:cidos corresponden con cambios conservativos,
resultando en una identidad entre las dos proteínas del I1C. Este nivel de divergencia es inusual
en los diversos factores de virulencia de diferentes serovares de Listeria spp. Las estructuras
primarias de 7ly y +rf, proteínas del mismo cluster de virulencia son pr:cticamente idénticas
en los serovares -K2a y 5b '-11 y .6C de identidad respectivamente(. El polipéptido ct es
también el m:s divergente entre las dos especies virulentas, L. monocytogenes y L. ivanovii, con
sólo un 21C de identidad versus 62 a IIC de identidad de otros factores de virulencia
codificados en este cluster.
Fna vez realizada una comparación de la estructura de esta proteína en relación con las
dem:s descritas hasta el momento en Listeria spp., realizamos an:lisis por microscopía
electrónica de barrido 'scanning electronic microscopy, 4.E.".( del proceso de internalización de
L. monocytogenes en células 9aco&2 '*ig. 2..(. Las bacterias son atrapadas por los finos
microvilli y parece que Listeria entra en la célula eucariota por retracción de éstos. Los microvilli
adherentes aparecen fusionarse y formar estructuras en la membrana seme%antes a
lamedipodios, pudiendo observarse cómo la interacción entre éstos y la bacteria es muy estrecha
hasta que Listeria es totalmente internalizada. *inalmente, usamos el microscopio electrónico de
barrido para analizar los aspectos asociados con la elevada invasividad de L.monocytogenes que
e!presa ct. 9élulas 9aco&2 subconfluentes fueron e!aminadas 81 minutos post&infección con
las cepas de L. monocytogenes con +-5, su derivada prfE, el mutante prfE ∆act y este
mutante complementado con act. 4e encontró que la cepa silvestre +-5 estaba debilmente
asociada con las células epiteliales 9aco&2, sin interaccionar pr:cticamente con los microvilli
'4u:rez et al., 211-(. La situación cambió radicalmente cuando utlizamos la cepa que e!presaba
prfE . 4e encontraron m:s bacterias interaccionando con la superficie celular de las células
9aco&2, en una asociación muy estrecha con los microvilli. La deleción de act en la cepa prfE
resultó ser muy similar a la cepa +-5, que e!presa act a niveles ba%os. 4in embargo, la
complementación del mutante prfE ∆act con ct resultó aparecer con unb modelo seme%ante
al de la cepa parental prfE '4u:rez et al., 211-(. Estos hechos muestran claramente que ct
media la internalización de bacterias en esta células, promoviendo interacciones con los
microvilli.
?espués de estos e!perimentos de microscopía electrónica estuvimos interesados en
analizar qué parte de la proteína ct estaba implicada en la interacción con células epiteliales.
El ensayo e!perimental para realizar este an:lisis estuvo basado en el uso de diferentes
anticuerpos monoclonales '"ab( frente a diferentes dominios de ct para bloquear la entrada
de Listeria en células 9aco&2. Los anticuerpos monoclonales usados en nuestro estudio fueron
cedidos por el +rof. JLrgen )ehland del ?epartamento de Aiología 9elular e $nmunología del
M;esellschaft fLr Aiotechnologische *orschungN ';A*(, "ascheroder )eg -, Araunsch#eig,
lemania. La localización de estos anticuerpos frente a la proteína ct se presentan en la
*igura -. α&ctB O5 ;.;-1, 8=3 9-, 85. ?5, -.= 7-, 421 IA.A-2, -.- EI, 4-- .*69-1, 4-33
Ponz, O21 ;6E-- y O3-.
Fsamos tanto ensayos de invasión como de inmunofluorescencia para estudiar el efecto
inhibitorio de los diferentes anticuerpos monoclonales en la invasión celular, con el ob%eto de
discernir qué funciones tienen las diferentes partes de la proteína ct. +reincubamos las
células y las bacterias con diferentes anticuerpos monoclonales a 1.= QgKml durante 81 minutos a
8I >9. ?espués de 81 minutos de infección, para permitir la entrada de la bacteria en la célula
eucariota, lavamos dos veces las células con +A4, y a/adimos medio fresco que contenía -11 Qg
ml
−-
de gentamicina para matar a las células e!tracelulares durante - hora. +ara los ensayos de
inmunofluorescencia, la tinción fue realizada con *$T9&faloidina, ro%o Te!as&faloidina, ?+$ o
anticuerpos secundarios cuando se necesitaron. En los ensayos de invasión celular, lavamos las
células dos veces con +A4 y se lisaron por adición de -11 µl of -C Triton R&-11 y 511 µl de +A4.
4e sembraron diluciones seriadas en placas de A7$ y las colonias se contaron después de una
incubación de una noche a 8I>9. 9ada ensayo de invasión fue realizado por duplicado en tres
e!perimentos independientes.
9omo se muestra en la *igura 8.., L. monocytogenes +-5 apareció ser significativamente
m:s invasiva que +-5&. Este resultado obtenido por inmunoflorescencia confirma nuestros
estudios preliminares en los que las colonias fueron contadas después de los ensayos de invasión
en células epiteliales '4u:rez et al., 211- b(. En las mismas condiciones de tiempo de infección y
"G$ 'multiplicity of infection(, la cepa prfE +-5& es apro!imadamente entre 61 y I1 veces
m:s invasiva que la cepa silvestre +-5.
En los e!perimentos realizados con anticuerpos monoclonales que se presentan en la
*igura 8.A., las células infectadas 9aco&2 fueron te/idas con ro%o Te!as&faloidina y ?+$ . 4e
observa que bacterias no tratadas entran y pueden moverse dentro de las células eucariotas,
mientras que las bacterias tratadas con el anticuerpo monoclonal, en este caso, α&ct
'O21;6E--( agregan o no entran dentro de la célula '*ig. 8.A.(. Hesultados similares fueron
obtenidos con el monoclonal 4-33Ponz. 4e pueden observar en la *ig. -.A. las células eucariotas y
las colas de actina de Listeria te/idas con verde&faloidina. Las bacterias en este caso se ti/eron
de ro%o y puede observarse como se acumulan en una región de la célula 9aco&2.
4eme%antes resultados fueron obtenidos mediante ensayos de invasión en los que se
plaquearon y contaron las colonias internalizadas '*ig. 5(. 9omo control negativo usamos bacterias
sin tratar con un monoclonal específico frente a succina, el -65 ?5. El resto de los anticuerpos
monoclonales empleados fueron frente a diferentes partes de ct '*ig. -(. Los monoclonales
4--. *69-1, 4-33Ponz, O21 ;6E-- y -.- EI muestran el m:!imo efecto de inhibición de la
invasión, similar a los niveles obtenidos con el mutante ∆act '*ig. 5(. Los siguientes anticuerpos
monoclonales analizados fueron frente a la región de nucleación y frente a una parte de región
rica en prolinaB
• S119F6C10B 868&86I
• S188KonzB-28&-23
• N20G6E11B -I3&-31
• 191 E7B 3=&.-
Fna vez realizada una comparación de la estructura de esta proteína en relación con las
dem:s descritas hasta el momento en Listeria spp., realizamos an:lisis por microscopía
electrónica de barrido 'scanning electronic microscopy, 4.E.".( del proceso de internalización de
L. monocytogenes en células 9aco&2. Las bacterias son atrapadas por los finos microvilli y parece
que Listeria entra en la célula eucariota por retracción de éstos. Los microvilli adherentes
aparecen fusionarse y formar estructuras en la membrana seme%antes a lamedipodios, pudiendo
observarse cómo la interacción entre éstos y la bacteria es muy estrecha hasta que Listeria es
totalmente internalizada.
dem:s, hemos centrado nuestro estudio en relacionar las proteínas "pl y ct. "pl es
una metaloproteasa neutra de 2=P?a que contiene un motivo de unión al zinc. Esta proteasa
convierte +lcA, secretada en forma de pro&proteína, en proteína madura. +lcA constituye el
principal factor responsable de la lisis de la doble membrana del fagosoma durante el ciclo
intracelular de Listeria. La fosfolipasa A '+lcA( también se denomina lecitinasa, ya que hidroliza
la fosfocolina o lecitina, es la responsable de la formación del halo opaco alrededor de las
colonias de Listeria monocytogenes en placas con agar&yema de huevo '@:zquez&Aoland et al.,
211-(.
La proteína "pl est: codificada por el gen mpl, primer gen del operón lecitinasa. 4e
encuentra entre el gen hly y el gen act. El gen mpl de Listeria monocytogenes tiene una
longitud de -=88pb y se compone de =-1 amino:cidos. d%unto el esquema siguiente 'Listeria
)eb 4erve httpBKKgenolist.pasteur.frKListiListKinde!.htmlr( de los genes de la zona del genoma
bacteriano en la que se encuentra el gen mpl.
En la región intergénica de la secuencia del gen se encuentra una ca%a +rf. El codón T;
de mpl se encuentra a unas -.1pb de la ca%a +rf. +ara la construcción de nuestro mutante,
partimos de una cepa hiperinvasiva como es la cepa de Listeria monocytogenes +-5&, ya que ésta
posee un +rf alterado por una mutación puntual en un amino&:cido, que se traduce en una sobre&
e!presión de todos los factores de virulencia. ?ebemos comprobar que los resultados que se
obtengan con nuestro mutante de deleción se deben e!clusivamente a la pérdida del gen mpl.
+ara ello debemos comprobar que no hay alteración o inactivación del gen prf, estudiando la
actividad hemolítica. Gbservamos que nuestro mutante sigue siendo muy hemolítico pero pierde
la actividad lecitinasa de la cepa silvestre, ya que no tiene el gen que codifica para la proteína
"pl responsable de la maduración de la lecitinasa.
Conclusiones. Los mecanismos moleculares implicados en la penetración de células
normalmente no fagocíticas por L. monocytogenes est: siendo ob%eto de investigación
actualmente '9ossart y +ortnoy, 2111D 9ossart y Aierne, 211-(. 4e han descrito dos proteínas de
la familia de las internalinas, $nl 'internalina sensu stricto( e $nlA, codificadas por el operón
inlA, ambas implicadas en la entrada de L. monocytogenes en células eucariotas. En nuestro
grupo de la Fniversidad 9omplutense de "adrid presentamos evidencias recientemente de que la
proteína de superficie ct, ampliamente estudiada como nucleador de actina, est: implicada en
invasión de L. monocytogenes en células epiteliales. 4in embargo, ct no contribuye a la
internalización de esta bacteria en fibroblastos 9G4&- y hepatocitos 7epa -&6, sugiriendo una
función de esta proteína en el tropismo de hospedador del proceso de invasión. simismo, la
e!presión de act en Listeria innocua fue suficiente para promover la entrada en esta especie no
invasiva de Listeria en células epiteliales, pero no en células 9G4&- y 7epa -&6, indicando que
ct dirige la ruta de internalización específica para células epiteliales '4u:rez et al., 211- a,
b(. +or lo tanto, de los resultados obtenidos en nuestro traba%o podemos concluir que ct
aparece como un factor de virulencia multifunctional implicado en dos aspectos importantes de la
patogénesis de ListeriaB invasión celular y movilidad basada en actina.
9on la elucidación de los mecanismos de invasión de Listeria monocytogenes en células
eucariotas mediante el estudio de la proteína ct contribuímos a desentra/ar los comple%os
mecanismos moleculares y celulares de la interacción bacteria&hospedador, y así con ello,
aportamos nuevos conocimientos al desarrollo de nuevas estrategias diagnósticas, terape0ticas y
vacunales con las que hacer frente a la listeriosis de origen alimentario.
Los resultados obtenidos mediante este proyecto ser:n publicados en revistas
internacionales incluidas dentro del 49$. Los datos est:n siendo y ser:n enviados tanto a
congresos nacionales como internacionales. 7asta el momento, se han publicado tres artículos de
investigación y hay datos para realizar otros tres que se encuentran en preparación. 4e han
enviado siete comunicaciones a congresos, tanto nacionales como internacionales.
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FIGARAS
FIG. 1. 4ecuencia de amino:cidos de ct y localización de diferentes anticuerpos
monoclonales.

FIG. 2.
'( "icrografías de microscopía electrónica de barrido de la interacción de L. monocytogenes
+-5& prfE con la superficie de células 9aco&2 a los 81 minutos de infección.
'A( Ensayo de inmunofluorescencia usando *$T9&faloidina para te/ir colas de actina y
citoesqueleto, y rodamina para te/ir Listeria +-5& tratada con el anticuerpo monoclonal
4-33Ponz.
FIG. 5.
'( $nvasión de Listeria monocytogenes +-5 y +-5& en células 9aco&2.
'A( Ensayo de inmunofluorescencia usando ?+$ y ro%o Te!as&faloidina para analizar la invasion
de L. monocytogenes +-5& con y sin incubación con anticuerpos monoclonales.
FIG. B. Entrada de L. monocytogenes tratada con diferentes anticuerpos monoclonales frente
a ct en células 9aco&2.
FIG. 9.
'( +reparaciónd e proteínas de sobrenadante de Listeria monocytogenes +-5& y el mutante
∆mpl.
'A( )estern&Alot del gel anterior realizado utilizando el monoclonal frente a ct.
-"@ RESU$ADOS M0S SIGNI#ICAI!OS A$CAN1ADOS EN
E$ PROYECO"
-")"@ Res:ltad.s CientD;ic.s% ((áimo !" l#neas)
Ouestros datos ponen de manifiesto que la invasividad de L. monocytogenes es un proceso
multi&factorial. dem:s de las proteínas ampliamente estudiadas, $nl and $nlA, un importante
papel en la interacción con la superficie cellular est: ahora siendo demostrada para otras
proteínas como la identificada recientemente adhesina mi '"ilhoanic et al., 211-( y ct
'4u:rez et al., 211- b(. El an:lisis sistem:tico de diferentes mutantes de los factores implicados
en la internalización de Listeria, correspondiendo con las complementaciones adecuadas en varios
bac,grounds reguladores, líneas celulares y estudios in vivo, nos ayudar: a determinar las
funciones individuales y la contribución relativa al proceso de internalización como importante
etapa en la patogénesis de la infección producida por L. monocytogenes. Estos avances
científicos contribuir:n de manera signiticativa al desarrollo de nuevos agentes terape0ticos.
-"'"@ Res:ltad.s ecn.lógic.s% ((áimo !" l#neas)
-">"@ Car=cter de l.s res:ltad.s .9tenid.s%
9 eóric.s 9 eóric. @Pr=ctic.s
9 Pr=ctic.s 9 De a<licación in8ediata
-"-"@ Res:ltad.s del <r.2ect.%
-"-")"@ N? de esis D.ct.rales """""""""""""""""""""""""""""""""""""" E ' F
(Documentar con* +#tulo, ,ombre del doctorando, -niversidad, Facultad o Escuela, fec.a de lectura, calificación,
y director).
;<)uloC n:lisis estructura&función de +rf, el regulador central de la virulencia de
Listeria.
7oc)o$#n0oC ?S Tolanda @ega Hocha, Fniversidad 9omplutense de "adrid
Lu*#$ 6 @ec!#C *acultad de @eterinaria, 23 de %unio de 2112
C#li@ic#ciDnB 4obresaliente Mcum laudeN
7i$ec)o$B José ntonio @:zquez&Aoland, ;u)o$# 6 2onen)eB "ónica 4u:rez Hodríguez
;<)uloC 7pt, un transportador de he!osas fosfato implicado en la proliferación
intracelular de Listeria monocytogenes.
7oc)o$#n0oC ?S $sabel 9hico 9alero, Fniversidad 9omplutense de "adrid
Lu*#$ 6 @ec!#C *acultad de @eterinaria, entregada en la secretaría del ?epartamento de
4anidad nimal.
C#li@ic#ciDnB
7i$ec)o$B José ntonio @:zquez&Aoland y "ónica 4u:rez Hodríguez
;<)uloC +apel de la proteína ct en la invasión celular de Listeria spp.
7oc)o$#n0oC ?S Tania ;aitero 9orcelle, Fniversidad 9omplutense de "adrid
Lu*#$ 6 @ec!#C *acultad de @eterinaria, en fase de realización.
C#li@ic#ciDnB
7i$ec)o$B "ónica 4u:rez Hodríguez
-"-"'"@ N? de ArtDc:l.s cientD;ic.s en revistas """"""""""""" E F Nac" E > F Internac"
(Documentar indicando autor(es), t#tulo, referencia de la publicación, ad&untando separatas)
AR;CALOS 4ABLICA7OS
SAERE(% '., ;GOUVLEU&UGHO, A., @E;, T, OG@ELL, 4., 97$9G&9LEHG, $.,
T$EHHEU, ., @VUWFEU&AGLO?, J..
+rf&dependent invasiveness and role of ct as invasin in Listeria monocytogenes.
Eur. J. Aiochem. '211-( 268, suppl. -B 213. '49$B 8.I(
SAERE(% '., ;GOUVLEU&UGHO, A., @E;, T, 97$9G&9LEHG, $., @VUWFEU&
AGLO?, J..
role for ct in epithelial cell invasion by Listeria monocytogenes.
9ell. "icrobiol. '211-( 5B 3=8&365. '49$B 5.==(
97$9G, $., SAERE(% '., ;GOUVLEU&UGHO, A., 49GHTT$, "., 4L;7F$4, J., T7E
Listeria ;EOG"E 9GO4GHT$F",., ;GEAEL )., @VUWFEU&AGLO?, J..
7pt, a bacterial homolog of the microsomal glucose&6&phosphate translocase mediates
rapid intracellular proliferation in Listeria.
+roc. Oatl. cad. 4ci. F4 '2112( 99B 58-&586. '49$B -1.2I(
AR;CALOS EN 4RE4ARACIFN
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?istribution of act in Listeria spp. Journal of "olecular Evolution 'en preparación(.
SAERE(% '., ;$TEHG, T., @VUWFEU&AGLO?, J.., )E7LO?, J. The O&terminal
part of ct is involved in the entry of L. monocytogenes into epithelial cells. $nfection
$mmunity 'en preparación(.
;$TEHG, T., 97$9G, $., SAERE(% '. Hole of the metalloprotease "pl in the
maduration of ct from L. monocytogenes. *E"4 "icrobiology Letters 'en
preparación(.
CONGRESOS
SAERE(% '., ;GOUVLEU&UGHO, A., @E;, T, 97$9G&9LEHG, $., 49GHTT$, ".,
4VO97EU, "., ;F$HHE, E., @VUWFEU&AGLO?, J..
$nternalization of Listeria monocytogenes in epithelial cellsB +rf&dependance and role
of ct.
-12nd 4" ;eneral "eeting.
4alt La,e 9ity, Ftah, F4. -.&28 de mayo, 2112.
97$9G, $., SAERE(% '., ;GOUVLEU&UGHO, A., 4L;7F$4, J., ;GEAEL, ).,
49GHTT$, "., 4VO97EU, "., @VUWFEU&AGLO?, J..
Ftilization of sugar phosphates from the host cell cytosol, a ,ey mechanism of Listeria
intracellular parasitism.
-12nd 4" ;eneral "eeting.
4alt La,e 9ity, Ftah, F4. -.&28 de mayo, 2112.
SAERE(% '., @VUWFEU&AGLO?, J..
?ifferential sequence divergence of the virulence factor ct of Listeria
monocytogenesBevolutionary implications.
R $nternational "eeting of the 4ociety for "olecular Aiology and Evolution.
4orrento, $taly. -8&-6 de %unio, 2112.
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+apel de la proteína ct en la invasión celular de Listeria spp.
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"adrid, mayo 2118.
97$9G, $., ;$TEHG, T., SAERE(% '. *unción del transportador de he!osas fosfato
7pt en la patogénesis de Listeria monocytogenes.
$$ 9ongreso en 9iencias @eterinarias.
"adrid, mayo 2118.
;$TEHG, T., 97$9G, $., @VUWFEU&AGLO?, J.., SAERE(% '.
9aracterización de ct como invasina en Listeria spp. RR@$ 9ongreso de la 4ociedad de
Aioquímica y Aiología "olecular.
La 9oru/a, setiembre 2118.
97$9G, $., ;$TEHG, T., SAERE(% '. @VUWFEU&AGLO?, J..
El papel de 7pt, un transportador de he!osas fosfato, en la fase de replicación
intracelular de Listeria monocytogenes.
RR@$ 9ongreso de la 4ociedad de Aioquímica y Aiología "olecular.
La 9oru/a, setiembre 2118.
-"-">"@ N? de ArtDc:l.s de div:lgación . revisión """"""" E F Nac" E F Internac"
(Documentar indicando autor(es), t#tulo, referencia de la publicación, ad&untando separatas)
-"-"-"@ $i9r.s7 ca<Dt:l.s de li9r.s 2 8.n.gra;Das """""" E ) F Nac" E F Internac"
(Documentar)
4FVHEU, ;., SAERE(% '.
"icrobiología. Evolución histórica. El mundo microbiano. Estado actual y perspectivas
futuras. En M"anual de "icrobiología @eterinariaN '2112(, capítulo -. Ed. "ac ;ra# 7ill.
-"-"G"@ Patentes 2 .tr.s tDt:l.s de Pr.<iedad Ind:strial E F Registrad.s"
(Documentar) E F En eH<l.tación"
E F Es<aIa"
E F EHtranJer."
G"@ GASOS DE$ PROYECO.
0Obligatoria"ente se ad*untar1 al In2or"e Cient2ico y Econ."ico un Certi2icado de 3asto e"itido por el servicio
econ."ico ad"inistrativo del organis"o4 as co"o listado de los *usti2icantes de gastos correspondientes al perodo de
5ue se trate4 aco"pa6ado de copias de los "is"os7
G")"@ Res:8en de Gast.s del Pr.2ect.%
(Indi'ue, en Euros y /esetas, el gasto global reali0ado por conceptos)
APROAADO EJECUADO
)? AKO '? AKO OA$ )? AKO '? AKO OA$
Pers.nal
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Material
Inventaria9le
3.000,00 0,00 3.000,00 3,000,00 0,00 3.000,000
Material
#:ngi9le
12.000,00 10.000,00 22.000,00 .3!!,"! 1".0#1,33 23.!3$,1%
!iaJes 2 Dietas
1.200,00 1.200,00 2.!00,00 1%2," $#3,%3 "$$,"
Gast.s
Generales
0,00 0,00 0,00 0,00 100,00 100
C.stes
Indirect.s
2.!30,00 1.$"0,00 !.110,00 2.!30,00 1.$"0,00 !.110,00
OA$
1".$30,00 12.""0,00 31.10,00 ".1%,$#
R&'()&)*&:
%.$"2,31
1"."",0$ 31.10,00
G"'@ J:sti;icación 2 d.c:8entación de &desviaci.nes* <r.d:cidas en el
Pres:<:est.%
(Descripción de los cambios presupuestarios .abidos, ad&untando copia de las solicitudes y aprobaciones de los mismos+
G">"@ Gast.s de Pers.nal """""""""""""""""""""""""""LLL""""""""""""""""""" E:r.s Pesetas
(Indicar datos personales y función desempe1ada)
OA$ """"""""""""""""
MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM
G"-"@ Material Inventaria9le """"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" E:r.s Pesetas
(Describir brevemente, incluyendo material bibliográfico)
MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM
G"G"@ Material #:ngi9le """""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" E:r.s Pesetas
(Describir brevemente)
E, '(*&-.(, /0)1.2,& 0*.,.3(do 4(-( -&(,.3(- &, 4-o5&6*o /0&-o) /0)d('&)*(,'&)*& -&(6*.7o8 d&
9.o,o1:( Mo,&60,(- 5 6&,0,(-. H&'o8 d&8*.)(do &, -&'()&)*& d& ,( 4-.'&-( ()0(,.d(d 4-.)6.4(,'&)*&
( &8*& /.).
OA$ """""""""""""" 1".0#1,33 EUR
G"N"@ !iaJes 2 Dietas """""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""LL"""""" E:r.s Pesetas
(Describir brevemente)
S& ;( (8.*.do ( do8 6o)1-&8o8 4(-( ('4,.(6.<) d& 6o)o6.'.&)*o8 =*.,&8 4(-( &,
d&8(--o,,o d&, 4-o5&6*o 4o- 4(-*& d& ,(8 2&6(-.(8 I8(2&, C;.6o C(,&-o 5 T().( G(.*&-o
Co-6&,,&.
• >>VI Co)1-&8o d& 9.o?0:'.6( 5 9.o,o1:( Mo,&60,(-. L( Co-0@(, 8&*.&'2-& 2003.
I)86-.46.<), 7.(A& 5 &8*()6.( &) &, ;o*&,.
• > Co)1-&8o A)0(, &) C.&)6.( 5 T&6)o,o1:( d& ,o8 A,.'&)*o8. M(d-.d, '(-3o
d& 200!. I)86-.46.<).
OA$ """""""""""""""" $#3,%3 EUR
MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM
G"O"@ Gast.s Generales """"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" E:r.s Pesetas
(Describir brevemente)
S& ;( .)6,0.do ,(8 *(8(8 d& 0) 60-8o -&(,.3(do 4o- ,( .)7&8*.1(do-( 4-.)6.4(, 5 o*-o
&) ,( F(60,*(d d& V&*&-.)(-.( d& ,( 2&6(-.( T().( G(.*&-o Co-6&,,&.
• II Bo-)(d( N(6.o)(, d& ,( R&d E84(@o,( d& MC*odo8 A,*&-)(*.7o8 D2enómica, proteómica y citómica*
,uevas .erramientas en el desarrollo de medicamentosE. C&)*-o d& C.&)6.(8 M&d.o('2.&)*(,&8 d&,
CSIC. M(d-.d, 1 d& '(-3o d& 200!.
OA$ """""""""""""""" 100 EUR
MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM
G"+"@ C.stes Indirect.s """""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" E:r.s Pesetas
((áimo !34)
OA$ """""""""""""""""
MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM
G"P"@ Re8anente """"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" E:r.s Pesetas
(5antidades entregadas y no e&ecutadas)
MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM
G")("F C.8<le8ent. reci9id. del <res:<:est. del Organis8. %
(%efle&o de su importe$ Sólo en caso de eistir)