UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN

QUÍMICA ORGANICA

INGENIERÍA BIOMÉDICA



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TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: AISLAMIENTO DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO


Objetivos:
-Aislar el complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-proteína) a partir de timo de
ternera
-Disociar el complejo en sus dos componentes: DNA y proteínas
-Precipitar desoxirribonucleato de sodio.
-Disolver desoxirribonucleato de sodio obtenido.



Introducción


ELECCION DEL TEJIDO

Con el objeto de elegir tejido biológico adecuado para la obtención del ADN, se deben
considerar algunos requisitos, entre los que se puede mencionar los siguientes:

1) Elevada concentración de ADN.
2) Mínima relación ARN/ADN
3) Baja actividad de ADNasa.
4) Elevado contenido ADN/órgano.
5) Fácil disponibilidad.
6) Bajo costo.


1) Elevada concentración de ADN.

Casi todas las células contienen ADN; excepcionalmente, algunas de ellas carecen de
núcleo y también de ADN, como en el caso de los glóbulos rojos de los mamíferos.
En las células nucleadas, la cantidad de ADN varía notablemente en los diferentes
tejidos. Como ejemplo, consideremos el contenido de ADN de los diferentes tejidos de una
rata adulta:




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En esta tabla se observa que, en la rata adulta el órgano más rico en ADN es el timo
(concentraciones algo menores se encuentran en la médula ósea, el bazo y el intestino
delgado.).


2) Mínima relación ARN/ADN:

La presencia de elevadas concentraciones de ARN dificulta el aislamiento del ADN por
tratarse de compuestos estrechamente relacionados desde el punto de vista químico.
En general las células vivas contienen una cantidad de ARN considerablemente mayor que
la de ADN. Un caso extremo lo constituye el ovocito de los anfibios en el que la relación
ARN/ADN es 31,76; en el extremo opuesto podemos ubicar a las células espermáticas que
están casi exclusivamente constituidas por ADN. En la siguiente tabla vemos como varía
esta relación en los diferentes tejidos de la rata adulta:

TEJIDO ARN/ADN
hígado 3,68
glándula sub-maxilar 1,73
riñón 1,08
bazo 0,335
tejido linfoide 0,285
timo 0,195

Bajo este aspecto, también el timo se encuentra en las mejores condiciones.


3) Baja actividad de ADNasa

Los extractos de distintos tejidos como el hígado, bazo y timo tienen la propiedad de licuar
los geles de ADN debido a la presencia de la desoxirribonucleasa, enzima que interviene
específicamente en la degradación del ADN; la ADNasa es una fosfodiestearasa altamente
TEJIDO µg de ADN/100 mg de tejido fresco

músculo esquelético 57
cerebro 123
testículo 230
hígado 240
vesícula seminal 254
corazón 306
riñón 324
páncreas 480
pulmón 710
intestino delgado 1290
bazo 1400
médula ósea 1530
timo 2760



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específica. Para su acción esta enzima requiere la presencia de cationes bivalentes; los
activadores más específicos son los iones magnesio, manganeso, hierro y cobalto; todos
ellos son muy parecidos con respecto a la intensidad de la acción que producen.
Los inconvenientes derivados de la presencia de desoxirribonucleasa en los tejidos
puede evitarse mediante el empleo de inhibidores de esta enzima. Entre ellos se
encuentran las sustancias que extraen los cationes como los aniones citrato y fluoruro, los
agentes quelantes como el EDTA (etilen diamino tetraacetato) los iones cobre y arseniato,
fuertemente inhibidores a una concentración de 0,001 M y el borato a 0,02 M.


4) Elevado contenido en ADN/órgano.

Es muy importante que la concentración del ADN en el tejido sea elevada; pero desde el
punto de vista práctico, el material biológico será más ventajoso si la cantidad total del ADN
en el órgano es también alta. Daremos un ejemplo:
Por lo que se ha visto hasta ahora, el timo es el órgano de la rata que reúne las mejores
condiciones para la obtención de ADN; pero éste es un órgano pequeño: pesa
aproximadamente 33 mg, por lo tanto se obtiene menos de 1 mg de ADN. En el timo de
ternera la concentración del ADN es aproximadamente la misma (2250 µg ADN/100 mg de
tejido), pero tiene un tamaño mucho mayor: pesa aproximadamente 500 g y se pueden
obtener de él más de 100 mg de ADN, cantidad para la cual se deberían sacrificar unas 100
ratas adultas.


5) Fácil disponibilidad:

No basta con que el material biológico reúna todas las características que vimos
anteriormente; es necesario también que sea fácil de obtener en el momento que se
necesite. Por ejemplo, el esperma de salmón tiene casi exclusivamente ADN y constituye
una excelente materia prima, pero no es fácil de conseguir. A su vez, el timo de ternera se
consigue con mucha facilidad en nuestro país que es típicamente ganadero, pero en EEUU
no ocurre lo mismo y resulta más sencillo de conseguir el bazo de cerdo. Es decir, que la
elección del tejido depende del lugar donde se trabaja por las posibilidades que se ofrecen
de conseguirlo con mayor facilidad.

6) Bajo costo:

En nuestro país el timo de ternero puede conseguirse gratuitamente en los mataderos,
porque constituye un material de desecho.


CONCLUSION: para obtener ADN en nuestro laboratorio elegimos el timo de ternera
vulgarmente llamado molleja de cuello porque reúne todos los requisitos enumerados.






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AISLAMIENTO DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO DEL TIMO DE TERNERA

El método consta de los siguientes pasos:

1) Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-proteína).
2) Disociación del complejo en sus dos componentes: DNA y proteínas.
3) Eliminación de las proteínas.
4) Precipitación del desoxirribonucleato de sodio.
5) Disolución del desoxirribonucleato de sodio obtenido.


FUNDAMENTO.

1) Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-proteína).

El propósito de esta primera etapa es aislar, en fracciones diferentes, los complejos
nucleoprotéicos que se encuentran presentes en el timo de la ternera: la ribonucleoproteína
(RNP) y la desoxirribonucleoproteína (dRNP).
Esta separación se consigue homogeneizándo el tejido en una solución salina de baja
fuerza iónica (NaCl: 0,05 a 0,25 moles/litro), que favorece la estabilidad de ambos
complejos y disuelve a la mayor parte de las moléculas que se encuentran presentes en el
timo (incluso la RNP) pero no disuelve a las dRNP. En el método elegido se utiliza una
solución isotónica (NaCl 0,15 M = 0,9 %).
Los métodos de baja fuerza iónica son adecuados para el aislamiento de las dRNP; sin
embargo presentan una gran desventaja: favorecen la liberación de las nucleasas; estas
enzimas producen la degradación enzimática parcial de los ácidos nucleicos y requieren,
para su actividad la presencia de ciertos cationes bivalentes (Mg
++
, Mn
++
, Fe
++
y Co
++
). Para
evitar este inconveniente, la homogeneización se realiza en presencia de agentes quelantes
como el EDTA, o de ciertos aniones como el fluoruro o el citrato, que extraen del medio los
cationes bivalentes que son necesarios para la actividad de estas enzimas. En el método
que elegimos se utiliza el citrato para complejar los cationes (citrato de sodio 0,015 M).
Si se quiere mantener la integridad de la molécula de ADN es necesario verificar que las
soluciones que se emplean en su aislamiento se encuentren a pH 7. Es también sabido que
los ácidos, a pH inferior a 2 producen la ruptura del enlace N-glucosídico de las purinas
dando orígen al ácido apurínico. A pH alcalino se produce la desnaturalización del ADN o
sea la ruptura de los puentes hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas
polinucleotídicas.
También se recomienda agregar algunas gotas de alcohol octílico normal, porque evita
la formación de espuma y produce hemólisis con lo cual se facilita la eliminación de la
hemoglobina del tejido.
Otro factor muy importante es la temperatura; a bajas temperaturas (0 a 5°C) se inhibe la
ADNasa y otras enzimas que se producen en el metabolismo de la glándula y que actúan
sobre el DNA produciendo la degradación de su molécula. Por ese motivo en esta primera
etapa todos los pasos deben realizarse en frío (0 a 5°C), aunque se trabaje en presencia de
inhibidores.
Los dos tipos de nucleoproteínas (RNP y dRNP) que se encuentran presentes en el
homogenato, diferenciables por su distinta solubilidad, pueden separarse por centrifugación
en frío; se obtiene un precipitado formado por el material insoluble en la solución salina
(dRNP) y un sobrenadante que contiene el material soluble en esa solución (RNP).



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En conclusión:



(SSC-1X)
Timo ______________Homogenato ____________________ Centrifugado





(RNP y dRNP) RNP (sol.) dRNP (insol.)




susp. y homogenización



SSC-1X = (Solución de ClNa 0,15 M- Citrato de Na 0,015 M a pH 7).

2) Disociación del complejo en sus dos componentes : DNA y proteínas.

La homogenización del tejido con solución SSC-1X y la centrifugación posterior
posterior, realizadas en la primera etapa, han permitido aislar el DNA del timo de ternera
combinado por proteínas en forma de un complejo: Desoxirribonucleoproteínas (dRNP).
El propósito de esta segunda etapa es disociar el complejo aislado, liberando el DNA
(como desoxirribonucleato de sodio) de las proteínas que lo acompañan.
Esta disociación se consigue mediante el empleo de SDS (Lauril sulfato de sodio o
dodecil sulfato de sodio) reactivo que en presencia de clorurode sodio, disocia el complejo
desoxirribonucleoprotéico y precipita las proteínas liberadas sin producir la depolimerización
del nucleato.

3) Eliminación de las proteínas.

Las proteínas que quedan en el sobrenadante luego del tratamiento con SDS se
eliminan con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24:1), que las desnaturaliza y
coagula.
La preparación cruda de ADN se agita vigorosamente con cloroformo-alcohol isoamílico.
La emulsión resultante se centrifuga en frío para acelerar la separación de las fases. Se
separan dos faces bien definidas separadas por una interfase sólida; ellas son:

1-Fase Orgánica: (Cloroformo - alcohol isoamílico) se separan en el fondo del tubo
y contiene los compuestos lipídicos.
2-Fase acuosa: sobrenada en la parte superior del tubo y contiene la sal de sodio
del ADN y nucleoproteína.
Precip (dRNP)
Sobrenad (RNP)
Resuspender y trabajar
a volumen total



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3-Interfase sólida: es de color blanco y se interpone entre las dos anteriores; está
constituída por el gel que se forma entre el clorhidrato de proteína y la mezcla de
cloroformo - alcohol isoamílico.

4) Precipitación del desoxirribonucleato de sodio.

El etanol al 95 % precipita al ADN bajo la forma de un material fibroso que puede
ovillarse alrededor de una varilla de vidrio. Esta propiedad permite separar el ADN de otras
macromoléculas que coagulan de una manera no fibrosa, como por ejemplo el RNA y las
proteínas.

5) Disolución del desoxirribonucleato de sodio obtenido.

La sal de sodio del ADN es fácilmente soluble en agua destilada y en soluciones de baja
fuerza iónica.


ACIDOS NUCLEICOS II: ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN)

OBJETIVOS:

1) Separar el ácido desoxirribonucleico del ácido ribonucleico a partir de un tejido animal, a
través de sus propiedades diferenciales de solubilidad.

2) Obtener el ADN puro por precipitación.

I- AISLAMIENTO DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO

Pesar 15 gr. de timo en una cápsula de Petri y cortar con un cuchillo o navaja en láminas
delgadas; colocar el tejido desmenuzado en un vaso homogeneizador de 100 ml de
capacidad y se le agregar 45 c.c. de citrato de sodio 0,015 M y 45 c.c. de cloruro de sodio
0,15 M. Tomar el pH y elevar a pH 7 con Tris. Enroscar el vaso en la tapa que lleva la
cuchilla (ver figura) haciéndola girar en sentido contrario a las agujas del reloj. Todo el
equipo se hace descender (aflojando el tornillo 2) hasta que el vaso queda bien sumergido
en hielo picado.
Mover el control de velocidad (tornillo 1) lentamente hasta llegar a 5.000 r.p.m. y en ese
punto dejar durante 3 minutos. Una vez cumplido el tiempo, llevar el control a cero, elevar
todo el equipo, hasta que el vaso queda fuera del hielo y desenroscar el vaso. Se obtiene
una suspensión de color rosado con resto de tejido de aspecto fibroso.


Centrifugación:

Verter el homogeneizado en tubos de centrífuga y centrifugar en frío (5ºC) durante 5
minutos a 5.000 r.p.m.. Se obtiene un precipitado adherente blanquecino (dRNP) y un
sobrenadante de color rosado (RNP). Desechar el sobrenadante y trabajar con el
precipitado.




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II-DISOCIACION DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO:

Colocar en un Erlenmeyer de 200 ml el precipitado obtenido y agregar 30,75 ml de
Citrato de Sodio 0,015 M y dispersar con varilla de vidrio a temperatura ambiente. Agregar
0,77 ml. de solución de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 5% en etanol al 45%.
Sucesivamente agregar siguiendo el orden que se indica y mezclar bien después de cada
adición, 9,72 ml de SDS al 45% en etanol al 45%, 52,50 ml. de ClNa 2 M y 3,78 ml de
Citrato de Sodio 0,015 M (para completar 105 ml.)


III-ELIMINACION DE LAS PROTEINAS:

En una ampolla de decantación colocar la suspensión obtenida y agregar el mismo
volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), agitar vigorosamente durante 30
segundos. Distribuir la emulsión resultante en tubos de centrífuga y se centrifuga en frío
(5ºC) durante 10 minutos a 5000 r.p.m.. Retirar los tubos suavemente de la centrífuga para
mantener la separación de las fases. Con una pipeta
capilar retirar la capa acuosa superior que contiene la sal de sodio del DNA tratando de no
perturbar la fase proteica.

IV-PRECIPITACION DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO:

En un recipiente de telgopor colocar hielo picado y sobre el mismo, un vaso de
precipitación que contiene la capa acuosa desproteinizada. Medir dos volúmenes de etanol
al 95% frío y vertir lentamente sobre las paredes del vaso tratando de formar una capa
alcohólica sobre la fase acuosa viscosa. Con una varilla de vidrio gruesa agitar la solución
de ADN con un movimiento de rotación suave y contínuo hasta que las dos fases se
mezclen y todas las fibras del material gelatinoso rico en ADN se hallan enroscado sobre la
varilla.
Cuando el etanol se vuelve límpido, signo de que ya se ha enroscado todo el ADN,
retirar la varilla del líquido y presionar las fibras de ADN sobre las paredes del vaso de
precipitación para exprimir el exceso de solvente.
Eliminar el líquido residual apoyando la varilla sobre un papel de filtro. Lavar el
precipitado introduciendo la varilla que contiene el ADN en un tubo que contenga etanol al
95% y luego en otro que contenga éter etílico. Retirar el ADN de la varilla y colocar en un
vidrio de reloj dejar secar 10 minutos para eliminar por completo el solvente.
BIBLIOGRAFIA
QUIMICA ORGANICA DE FINAR, VOL II.
BIOQUIMICA DE LEHNINGER.
BIOQUIMICA DE STRYER, VOL I.
BIOQUIMICA DE NIEMEYER, VOL I.-