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PRACTICA N°1: FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE, COLORACION GRAM Y

LA GALERIA BIOQUIMICA OxNiGLUMoCISKAD
I. INTRODUCCIÓN.
Existen un conjunto de microorganismos que integran la flora microbiana del
intestino del hombre y de los animales representados por bacilos Gram negativo
no esporulado que se encuentran también en excretas, aguas, pastos, suelos,
alimentos y vegetales al estado y en descomposición.
Nos estamos refiriendo a los integrantes de la Familia Enterobacteriaceae, cuyo
conocimiento racional y orgánico permite establecer el diagnóstico inmediato de
las enfermedades entéricas, dictar las medidas de orden epidemiológico y
establecer las causales de una serie de enfermedades intestinales, que forman un
extenso capítulo de la patogenia infecciosa del país.
El conocimiento de estos seres vivos, es obligatoria en los estudios
microbiológicos, no sólo porque algunos géneros y especies ocupan destacada
posición en la patogenia entérica de origen humano animal, sino porque también
es una base fundamental en la sanidad pública y en el diagnóstico bacteriológico
en general. Existe un conjunto de microorganismos que integran la flora
microbiana del intestino del que se encuentran también en la excretas, aguas,
pastos, suelos, -alimentos y vegetales al estado.
Características de las Enterobacteriaceae
En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos,
adicional a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir a ciertos
géneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman parte
de esta familia:
 Son bacterias Gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos
y otros pleomórficos.
 No son exigentes, son de fácil cultivo.
 Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa
positivo), es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa.
 Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
 Son anaeróbicos facultativos.
 Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con
o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa),
y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones
aeróbicas.

II. REVISION BIBLIOGRAFICA
A las enterobacterias, se les describe como microorganismos Gram negativo
esporulados, móviles o inmóviles, provistos de flagelos en perítrico, que
adoptan la forma de bacilos y cocobacilos; viven normal y patológicamente
como huéspedes en el intestino del hombre y de los animales, se les halla en
los alimentos en descomposición, excretas de origen humano y animal, en las
aguas del albañal y emuntorios en general viven saprofíticamente en las
materias orgánicas en descomposición. Gran número de especies que integran
esta familia son patógenas pura el hombre y los animales; produciendo
infecciones graves en forma individual, endémica y epidémica (Guia de
microbiología agroindustrial).
CLASIFICACION DE LA ENTEROBACTERIAS
 Escherichia coli es un habitante intestinal. No es con mucho el más
abundante numéricamente, sino que está por detrás de Bacteroides y
Bifidobacteriurn. No obstante, E. coli se mantiene viable un cierto tiempo
fuera del intestino y es fácilmente demostrable. Por ello es apropiado
utilizarla como demostración de contaminación fecal en las aguas de
bebida.
 Proteus vulgaris pertenece también a la flora intestinal normal pero
asimismo está ampliamente distribuido en el suelo y en las aguas. Esta
bacteria es conocida debido a su tendencia a la modificación de forma
(nombre), su intensa actividad y la tendencia a diseminarse sobre las
superficies de agar y cubrir toda la superficie.
 Enterobacter aerogenes es en cierto modo el hermano gemelo de E. coli;
ambos se designan como "Coliformes". Es muy abundante en los suelos.
Tal como indica su nombre, esta bacteria forma mucho gas. Se diferencia
de E. coli tan s610 par unas pocas características bioquímicas.
 Serratia marcescens (anteriormente Bacterium prodigiosum u "hongo de
las hostias") puede ser considerada como una variante pigmentada de
 Enterobacter. Al género Erwinia pertenecen algunas especies pat6genas
de vegetales, que afectan a los vástagos, las hojas y las raíces y que
desencadenan enfermedades debido a la excreci6n de pectinasas.
 Klebsiella pneumoniae se diferencia de Enterobacter exclusivamente para
la formaci6n de una capsula gruesa y por su falta de motilidad. Se presenta
en algunas formas muy peligrosas de inflamaci6n de los pulmones.
 Salmonella typhimurium es la bacteria más extendida de entre aqueas
que provocan una gastroenteritis, la Hamada "intoxicación por productos
alimentarios". Esta intoxicaci6n se debe a la liberaci6n de lipopolisacaridos
que desencadena una irritaci6n de las mucosas; no se da ninguna invasi6n
del sistema sanguíneo. S. typhi es el causante del tifus epidémico.

 Shigella dysenteriae y cepas relacionadas son los causantes de la
disentería y las diarreas.
 Vibrio cholerae es el causante del colera, una enfermedad epidémica. Este
agente causal no pertenece al grupo de las Enterobacteriaceae, pero desde
el punto de vista metabolico y fisiol6gico es muy pr6ximo. V. cholerae se
reproduce en el intestino. Se fija sobre el epitelio intestinal, pero no penetra
en las células. La enterotoxina del co1era es una proteína, que se fija a las
células del epitelio intestinal (unos receptores específicos) y que determina
la salida de iones sodio, bicarbonato y cloruro, as! como de agua a la luz
intestinal.
 Yersinia pestis es el causante de la peste. Yersinia no pertenece al grupo
taxonómico de las Enterobacteriaceae, pero es muy pr6ximo desde el punto
de vista de su modo de vida facultativamente anaer6bico y de su tipo de
fermentaci6n. EI reservorio natural del causante de la peste son los
roedores salvajes, sobre todo ratas. Las bacterias son transmitidas par
pulgas infectadas 0 por otros ectoparásitos hasta el hombre y conducen a la
peste bub6nica o a la peste pulmonar. Mediante una multiplicaci6n rápida y
la producci6n de una fuerte toxina conducen rápidamente a la muerte.
(Microbiología General Hans. Scheler nueva edición).

III. OBJETIVO
-Hacer que el alumno recuerde las técnicas y procedimientos básicos de
microbiología general, para poderlos aplicar posteriormente en el control
microbiológico de los alimentos.
IV. MATERIALES Y METODOS
A) Coloración Gram a partir de una cepa marcada
- Desengrasar un porta-objeto con alcohol-acetona y algodón.
- Descolgar una gota de agua estéril, suspender en ella una pequeña cantidad de
cepa problema y homogenizar.
- Dejar secar y flamear suavemente la extensión para fijarla.
- Cubrir con una solución del colorante primario. Cristal violeta u otro similar y
dejar en contacto por espacio de 2 minutos. Lavar con agua de caño.
- Cubrir con el mordiente o fijador y dejar en contacto por un minuto. Lavar.
- Decolorar con la solución de Alcohol-Acetona (1:1). Lavar.
- Cubrir con solución de contraste, safranina u otro similar y dejar en contacto por
30 segundos. Lavar.
- Secar suavemente, agregar una gota de aceite de inmersión y observar al
microscopio. Anotar los resultados.
B) Galería Bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD para Enterobacteriaceaes
A partir de una cepa marcada, efectuar las siguientes pruebas bioquímicas:
- Reacción de la Oxidasa (Ox)
- Reducción de los Nitratos (Ni)
- Fermentación de la Glucosa (G)
- Fermentación de la Lactosa (L)
- Hidrólisis de la Urea (U)
- Ensayo de Movilidad por cultivo (Mo)
- Asimilación del Citrato (C)
- Formación del Indol (I)
- Formación del Ácido Sulfhídrico (S)
- Prueba de la Tolerancia al Cianuro de Potasio CNK (K)
- Transformación de la Fenilalanina en Acido Phenil Pirúvico APP (A).
C) Fundamento v procedimiento de las pruebas bioquímicas
para la familia Enterobacteriaceae
Constituida por gérmenes de bastón Gram negativo móviles (flagelos en
peritrico) e inmóviles, Oxidasa negativos. Nitratos son reducidos a nitritos. Todas
fermentan la glucosa con o sin producción de gas, la diferencia de estas bacterias
se basan en el comportamiento bioquímico, tratamiento recomendado por
MOSSEL-QUEVEDO y llamado: Ox Ni G L U Mo C I S K A D
Oxidasa (Ox)
Llamada también Citrocromo Oxidasa; Es una enzima por la cual las bacterias que
la: poseen, oxidan al tetrametil-para-fenil-endiamina en Indol (azul).
Prueba: En una placa petri colocar un papel de nitro, humedecer este con el
reactivo de Kovacs (solución de tetrametil-parafenil-endiamina al 1% en agua
destilada). Preparar el reactivo inmediatamente antes de usarlo, debido a que se
oxida con el aire y la luz. En la parte humedecida hacer una estría de cultivo joven
(18 a 24 horas de incubación) de más o menos 5 mm de longitud considerar la
prueba como positiva, si en 5 segundos aparece un color azul intenso. Las
enterobacterias no deben dar esta reacción.
Reducción de Nitratos (Ni)
Las bacterias que poseen las enzimas nitrato-reductasa, tienen la propiedad de
reducir los nitratos a nitritos.
Prueba: Sembrar el germen a estudiar en agar o caldo nutritivo que contenga
además 1/1000 de Nitrato de Potasio. Después de incubar a 37°/24 horas, añadir
gotas de solución A y de solución B (Reactivo de Gries) o en su defecto reactivo
sólido formado por ácido sulfanílico, ácido tartárico, y alfa-naftil -amina.
La prueba es positiva sí aparece color rojizo en ambos casos. Sino aparece dicha
coloración agregar sobre el cultivo que contiene e! reactivo, Zn o Mg en polvo;
observar después de 10 minutos si la coloración es rojiza, considerarla como
negativa ya que en el caso, son el Zn, Mg, y no el germen el que se ha reducido
en nitratos.
Fermentación de Glucosa, Lactosa y Producción de H S(GLS)
El H
;
S es formado por determinadas Enterobacterias, ya sea por desanimación de
aminoácidos azufrados (tiosulfatos, sulfitos), En el medio, el H
2
S formado,
reacciona con la sal de Fe contenido en él y da sulfuro de fierro (FeS) de color
negro. La prueba en condiciones aerobias, es reversible.
Prueba y lectura: Se puede realizar en un sólo medio: Kligler (Hierro dos
azúcares), en el cual la siembra se realiza por picadura profunda, y una estría en
la superficie. Incubar a 37°C, por 18 a 24 Horas.
Parte inferior amarilla: Fermentación de Glucosa.
Parte superior amarilla: Fermentación de Lactosa.
Ruptura del medio: Producción gas (Glucosa)
Ennegrecimiento en la puntura de inoculación: H2S positivo, indicador del medio:
Rojo de fenol
Hidrólisis de Ia.Urea (U)
Las enterobacterias que poseen la enzima ureasa, hidrolizan la Urea,
alcalinizando en esta forma el medio de cultivo, haciendo virar con ello el rojo de
fenol, indicador de este, del anaranjado al grosella intenso (prueba positiva).
Medio de cultivo: Caldo úrea


Prueba: Como medio de cultivo se utiliza un medio semi-sólido (agar nitratado que
lleva 3% de agar) distribuidos en tubos de "U" la siembra se realiza por puntura,
introduciendo la aguja de Kolle 5 mm de profundidad, sólo en una de las ramas.
Lectura
Después de incubar a 37ºC por 24 horas, considerar la prueba positiva, si un
enturbiamiento
Se ertienJe desde la rama cultivada a la otra.
KNO
3
: Fuente de Oxígeno, necesaria para la movilidad de! germen aerobio.
Asimilación del Citrato (C)
Las enterobitcterias que utilizan el Citrato de Sodio como única fuente de Carbono,
alculinizun el medio agar Citrato de Simona, haciendo virar el indicador azul de
bromo timol, del verde al azul intenso. Para esta prueba hay que tener las
siguientes precauciones:
-Utilizar tubos nuevos, o bien los usados, esterilizado al calor seco para destruir
allí los posibles restos de materia orgánica que pudiera contener.
- Realizar siempre la siembra a partir de un medio sólido porque con medio
líquido se arrastraría restos de materia orgánica.
- Realizar la siembra en pequeña cantidad y trazando sólo una línea a lo largo
de la superficie de inclinación.
Producción de Indol(I)
Algunas enterobacterias, tienen la propiedades hidrolizar el aminoácido triptofano.
Uno de los productos finales de esta degradación es el Indol.
Prueba: Para detectarlo, a un cultivo de 18 a 24 Horas en caldo Peptona do,
adicionar el reactivo de Kovacs pura Indol. Prueba positiva: Anillo grosella en la
superficie.




Tolerancia al Cianuro de Potasio (K)
Prueba. Para determinar la resistencia de las diferentes enterobacterias frente al
OTK; se realiza la siembra del germen a estudiar, en medio base al que se le ha
colocado previamente 0.1 mi. De uní solución al 0.5%. Se usan tubos de 8 x 160
mm-, y se siembran tres usadas de más o menos 6 mm. De diámetro, a partir de
un cultivo de 18 a 24 horas Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas como máximo.
Lectura:
Prueba positiva: Disco blanco en la superficie del medio.
Prueba negativa: Turbidez en la parte inferior, con una superficie
completamente
Transparente, o ausencia total de desarrollo.
Prueba de Ácido Phenil Pirú vico (A)
La fenilalanina, es un aminoácido que determinadas enterobacterias pueden
transformar en ácido phenil pirúvico.
Prueba: Sembrar el germen a estudiar, en forma abundante (estrías) aminoácido
en estudio. Después de la incubación a 37ºC por 24 horas, investigar en el medio
la presencia de ácido fenil pirúvico, adicionando unas gotas de sal férrica (Cl2 Fe).
Prueba positiva: Aparición inmediata de color verde.
Descarboxilacion de la lisina (D)

Ciertas enterobacterias pueden transformar por desearboxilación la lisina en
Cadaverina, que por desanimación libera grupos amino (NH
3
), bajo la forma de
NH, alcalinizando e! medio de cultivo.

Prueba. Esta prueba se realiza en el medio de Taylor, que lleva glucosa, lisina y
púrpura de bromocresol como indicador del medio.

Lectura. Después de incubar a 37ºC por 24 horas, considerar la prueba como
positiva si el Violeta varía al color púrpura.
Prueba negativa: medio de color amarillo, por fermentación de la glucosa.
Prueb
a
Medio de
cultivo
Temperatura e
incubación
Reactivo a
añadirse
Prueba
positiva
Prueba
negativa
Ox --- ---- Tetrametil
parafenil
endiamina
Sin
coloración
Color azul
Ni Caldo
nitrato
31°C x 24 H Reactivo
grices
Color rojizo Después
de agregar
Zn sigue
rojizo
G Agar
glucosa
31°C x 24 H Color
amarillo
Sin
coloración
L Agar
lactosa
31°C x 24 H Color
amarillo
Sin
coloración
U Caldo urea 31°C x 24H Grosella
intenso
Rojo de
fenol
Mo Agar
movilidad
31°C x 24 H Turbidez Sin color
C Agar citrato
de
Simmons
31°C x 24 H Color azul Color verde
I Caldo
peptonado
31°C x 24H Reactivo de
kovacs
Anillo
grosella
Sin
presencia
de anillo
S Agar kligler 31°C x 24 Coloración
negra
Sin
coloración


V. RESULTADOS
Los resultados están basados en las características que presento cada caso en
el tratamiento recomendado por Mossel Quevedo y son las siguientes:
Tratamiento Resultado
Ox -
Ni +
G -
L +
U -
Mo -
C -
I -
S -

VI. DISCUCIONES
-Los resultados que se obtuvieron fueron positivos debido a la coincidencia
exacta de los datos en cuanto a respuesta del microorganismo, la shygela que
es el microorganismo con los datos más coincidentes a los resultados es una
enterobacteria gram positiva y se pudo encontrar en la mayoría de las
muestras.
-En la prueba de coloración Gram los resultados son correctos ya que la familia
de las Enterobacterias son gran negativos, nos esporulado y de forma bacilar.






VII. CONCLUSIONES
- En la práctica se pudo comprobar, de acuerdo a los procedimientos realizados la
presencia de shygela en las muestras debido a la coincidencia de los datos
obtenidos con los de la tabla de diferenciación que nos sirve para la comparación
de los resultados.
VIII. BIBLIOGRAFIA
-http://es.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae
-http://dianayjulian.galeon.com/enterobacte.htm
-http://www.slideshare.net/miranda_col/eta-causadas-por-enterobacterias
-EPIFANIO MARTINEZ MENA 2000. “Manual de Practicas de Microbiología
Aplicada”.Primera reimpresión Tarapoto-Perú


IX. ANEXOS
Cuestionario
1) ¿Por qué las bacterias Gram negativas retienen el colorante de
contraste, durante la coloración Gram?
La razón por la cual se da esta característica es porque el yodo forma con el cristal
una molécula soluble por lo que se da una fijación a las bacterias gram negativas
por la permeabilidad de la membrana celular y debido al punto isoeléctrico menos
acido por lo que se demuestra la poca afinidad con los colorantes básicos.




2) Mencione diferencias entre bacterias Gram negativas y bacterias gram
positivas.

Gram negativas:

- Retiene el colorante de contraste
-Su coloración es roja
-Sus proteínas tienen un punto
isoeléctrico menos acido
-Complejo CVI se forma dentro de las
bacterias y permanecen violetas
-Presenta capa lipídica
Gram positivas

-Complejo CVI se forman dentro de
las bacterias y estas permanecen
violetas
-Sus proteínas presentan un punto
isoeléctrico más ácido
-No presentan capa lipídica

3) Describa a las bacterias entéricas y nombre a los géneros más
representativos, dando características de cada uno de ellos.

Son parásitos de animales y de algunas plantas que son gram negativos y todas
las especies atacan a los carbohidratos ya que en su mayoría reducen nitrato o
nitrito.
Echerichia: Se encuentra en el tracto intestinal de los mamíferos y utiliza como
única fuente de carbono el ácido cítrico. Las especies de Escherichia coli
oportunistas producen infecciones sólo si abandonan el colon. Otros grupos
producen hasta el 90% de las diarreas infantiles y la denominada diarrea del
viajero. Se desarrollan entre 15ºC y 45ºC pero optima de 22ºC con un pH óptimo
de 1, son gram negativos y suelen morir a 60ºC en 30 minutos




4) Mencione las enfermedades que ocasionan algunos géneros de la familia
Enterobacteriaceae.

 Salmonella: Gastro enteritis por salmonella más conocida como
salmonelosis.

 Salmonella thipy: Produce la fiebre tifoidea.


 Shigella: Produce disentería que es una enfermedad aguda o crónica del
intestino grueso del humano.

 Vibrio Cholerae: Produce cólera.


 Echerichia coli: Produce gastro enteritis.











“AÑO DE LA INVERSION PARA EL
DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD
ALIMENTARIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTIN

FACULTAD: Ingeniería Agroindustrial
ESCUELA ACADÉMICA: Ingeniería Agroindustrial
ASIGNATURA: Microbiología Agroindustrial
PRÁCTICA Nª1: Familia enterobacteriaceae, coloración gram y la galería bioquímica
OxNiGLUMoCISKAD
DOCENTE: Ing. Nelson García Garay
ESTUDIANTE: Diego Ramírez Fatama
CICLO: IV
FECHA DE PRESENTACIÓN: 29/10/2013

MORALES – 2013