Travaux Pratiques de Biologie et Physiologie Végétales – 1ère année Génie Biologique.

NUTRITION, CARENCES et TOXICITES MINERALES chez les végétaux supérieurs. Buts : mettre en évidence les symptômes de carence et de toxicité minérales chez les végétaux. Méthode : expérimentation, observation, interprétation de résultats. Matériel expérimental : orge, cresson alénois. Matériel personnel à apporter : calculette, trousse à dissection, chiffon, blouse. A - Manipulation 1 : étude des carences minérales sur la plante entière. Principe expérimental :: Les plantes expérimentées sont mises en culture hydroponique sur milieu support inerte (solution nutritive synthétique et vermiculite). Tous les éléments sont apportés sous forme de sels solubles qui se dissocient en ions dans la solution aqueuse globale. La concentration totale en sels doit être comprise entre 1 et 3 g/l. La solution nutritive synthétique est obtenue, au moment de l’emploi, en mélangeant et en diluant dans de l’eau distillée, des volumes définis de solutions mères bien plus concentrées que la solution de culture. Cette solution nutritive apporte les macroéléments ou éléments plastiques, N, P, K, Ca, Mg, S, Na, Cl et les oligoéléments, Fe, Mn, Zn, Cu, B, ; (les autres oligoéléments, Al, Ni, Co, Mo, I, Br, F, Li, Pb, Ti, Rb, Cr, nécessaires en très faibles quantités (de l’ordre du 10-6 à 10-9 g/g) sont apportés par les impuretés contenues dans les autres sels, dans l’eau ou par les réserves tégumentaires et des cotylédons de la graine). La variation de composition de la solution de culture fera apparaître des variations dans le développement des plantes (carences ou toxicités), renseignant ainsi sur les besoins des végétaux en tel ou tel élément. Composition de la solution nutritive : La composition en macroéléments d’une solution complète répond à la formule de HOAGLAND suivante : g/L Sels Ca(NO3)2, 4H2O KNO3 KH2PO4 Mg SO4, 7H2O MM 236 101 13 6 246 1,18 0,505 0,136 0,246 mM/L 5 5 1 1 Concentration de la solution : c. moles de charge / L * Ca++ Mg++ K+ SO4-- H2PO41 0,5 0,1 0,1 0,2 0,2

NO31 0,5

* 1 mole de charge = quantité de matière qui apporte 1 charge + /-

Le Fer est apporté à raison de 10 ppm ** sous forme de sulfate de fer. Les oligoéléments sont apportés par une solution unique qui fournit, selon la formule de ARNON : 0,5 ppm de B, 0,5 ppm de Mn, 0,05 ppm de Zn et 0,002 ppm de Cu.
** 1 ppm = 1 partie par millions soit 1 mg.L -1 par exemple

Préparation des solutions nutritives : Les solutions de culture sont préparées à partir de solutions mères très concentrées (1N * ou 0,1N * pour les macroéléments, 1000 ppm pour le fer et 1000 fois plus concentrées que la solution de culture pour les oligoéléments). Remplir au 1/2 une fiole jaugée de 250 mL avec de l’eau distillée ; ajouter les volumes des diverses solutions mères exprimés dans le tableau préparatoire, puis compléter à 250 mL avec de l’eau distillée.
* N pour Normale : 1 solution est dite normale quand elle contient 1 mole de charge par L.

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Contrôler le pH au pH-mètre ; amener si nécessaire à pH 6 à l’aide des solutions N/10 de NaOH ou de HCl (l’optimum d’absorption se situe à pH compris entre 5,5 et 6,5). La composition des milieux de culture est établie selon le tableau ci dessous. Les répétitions sont réparties entre les 6 groupes de TP ; chaque bloc effectuera les cultures selon le tableau suivant. Les résultats seront étudiés au niveau de l’ensemble de la promotion. Solutions nutritives Complète Carencée N Carencée P Carencée Ca Carencée Oligoéléts et Fe Carencée N 2 Carencée N 5 Carencée P 0,1 N 0 Carencée P 0,1 N 0,1 Carencée P 0,1 N 1 Carencée P 0,1 N 2 Carencée P 0,1 N 5 GROUPES PAIRS Bloc 1 Bloc 2 Bloc 3 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X GROUPES IMPAIRS Bloc 1 Bloc 2 Bloc 3 X X X X X X X X X X X X X X X

Chaque bloc prépare pour les milieux qui le concernent, 250 mL de chaque solution. Un solution complète doit apporter l’ensemble des éléments aux concentrations indiquées par les formules de HOAGLAND et de ARNON. Une solution carencée apporte en moindre quantité ou pas du tout un ou plusieurs éléments ; dans ce cas, il faut veiller à maintenir le bon apport des autres éléments en faisant appel à d’autres sels (par exemple, une solution carencée en N par suppression des ions NO3- doit fournir Ca++ et K+ apportés habituellement par les sels nitratés dans une solution complète) ; d’autre part il faut veiller à ce que la concentration de la solution se situe entre 1 et 3 g/L, sans quoi, les conditions d’absorption des éléments seraient perturbées. La détermination des volumes de solutions mères à prélever pour préparer les solutions de culture se fera à l’aide du tableau préparatoire fourni en annexe. ⇒ Calculer pour chaque milieu nutritif, le volume de solution mère à prélever et la concentration finale des solutions ; vérifier que cette concentration reste dans les limites définies et qu’elle engendre bien les carences ou les variations de concentration souhaitées.

Mise en culture des plantes : Les graines sont désinfectées par trempage pendant 15 minutes dans une solution d’hypochlorite de Na à 3% ; elles sont ensuite rincées soigneusement 3 fois à l’eau distillée. Les cultures se font en conteneurs en aluminium pouvant contenir 250 mL de solutions nutritives. Les conteneurs sont remplis de vermiculite (milieu support), puis de solutions nutritives et reçoivent les graines désinfectées, régulièrement réparties. Avant le remplissage, couvrir les parois du conteneur avec un film alimentaire afin d’éviter l’altération du métal.

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On porte sur chaque conteneur la date du début de culture, la nature de la solution étudiée et la masse en début de manipulation. Les cultures sont suivies pendant 4 semaines ; on complète les pertes d’eau par pesée des pots; on note le développement des plantes. Résultats : Après 1 mois de culture, les résultats sont étudiés de la manière suivante : 1 - Pour chaque milieu nutritif, noter toutes les observations concernant les symptômes de carences : • la couleur, les nécroses, les déformations ; • la taille de l’appareil aérien, le nombre et les dimensions des feuilles ; 2 - Etablir pour chaque conteneur la masse de matière fraîche et la masse de matière sèche des parties aériennes ; une moyenne est établie à partir des valeurs des différents groupes de TP. 3 – Les données quantitatives sont interprétées sous forme de graphes en fonction de la nature des solutions utilisées. 4 – Conclure quant au rôle de la composition minérale du milieu de culture sur le développement de la plante et sur le rôle des différents nutriments. B - Manipulation 2 : étude d’une toxicité minérale sur la croissance racinaire. Principe expérimental : Des semences prégermées d’orge sont mises en culture, en pot contenant de la vermiculite comme support et un milieu de culture apportant un élément trace métallique pouvant être présent en quantité toxique dans la solution du sol. Les éléments choisis, pour cette manipulation, sont le Cu et le Zn ; les solutions testées sont aux concentrations de 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 600 et 800 ppm. Après une période de croissance de 7 jours, les longueurs des racines sont mesurées afin de juger de l’effet de l’élément trace testé. Les appareils végétatifs aériens et racinaires sont séchés et minéralisés afin de doser l’accumulation de métaux dans les tissus. Préparation des solutions : Les solutions sont préparées à partir de solutions mères de Zn Cl2, et de Cu Cl2, 2 H2O à 5000 ppm d’élément métallique, dans de l’eau distillée ; on apporte les autres éléments à partir d’une solution complète de HOAGLAND diluée au 1/4 Chaque groupe de TP réalisera une série de traitement, soit 2 cultures de 5 semences dans des gobelets de 250 mL pour chaque concentration de 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 600 et 800 ppm, réparties selon le tableau suivant : NB : les blocs 1, 3 et 5 feront deux répétitions de témoins en plus de leurs essais. Concentration en ppm Répétition 1 Répétition 2 Préparation des semences : Les graines sont mises à germer, 36 à 48 heures avant l’essai, sur du papier filtre humidifié, dans un récipient à fond plat et désinfecté, à 20°C et à l’obscurité ; une désinfection des téguments aura été réalisée auparavant. Les semences prégermées doivent présenter une radicule de moins de 2 mm et sont enfoncées, radicule vers le bas, à 10 mm sous la surface du milieu de culture.
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6.25 X X

Bloc 1 12.5 X X

25 X X

50 X X

Bloc 2 100 X X

200 X X

600 X X

Bloc 3 400 X X

800 X X

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Résultats : Après 7 jours de culture, les pots sont découpés délicatement, afin de ne pas léser l’appareil racinaire ; le milieu de culture est extrait du gobelet et placé dans une cuvette contenant 5 cm d’eau ; les racines sont lavées précautionneusement de toutes particules de support.  Lecture des résultats : o observations des nécroses et déformations sur les racines et sur les feuilles ; o mesures des longueurs de l’appareil racinaire et de l’appareil aérien : elles se font à partir de la sortie de la graine.

Dosage de la teneur en CU ou Zn dans les tissus de la plante : Après observations et mesures des allongements, les tissus foliaires et racinaires sont récoltés, séchés à l’étuve à 105° C pendant 24 heures (détermination de la masse de matière fraîche et de la masse de matière sèche), puis minéralisés par attaque acide à chaud (mélange acide chlorhydrique et acide nitrique). Le minéralisa est filtré en vue du dosage par Spectrométrie d’Absorption Atomique des éléments métalliques absorbés.

Les résultats sont interprétés graphiquement. On déterminera à partir de quelle valeur la concentration en éléments métalliques peut être considérée comme affectant la croissance de la radicule ou le bon développement des plantes. On interprétera les résultats afin de caractériser le comportement de l’espèce (espèce accumulatrice, indicatrice ou exclusive). Sécurité : lors de ces manipulations, des règles de sécurité et de bonnes pratiques de laboratoires doivent être observées afin d’éviter :  la contamination des manipulateurs par les solutions minérales concentrées ;  la contamination des différentes solutions de culture par les espèces non désirées. Lors de l’extraction des milieux de culture et du mesurage des plantules contaminées par les métaux, on travaillera sur une paillasse protégée par un film plastique ; le manipulateur portera des gants ; les déchets (vermiculite) seront évacués dans des sacs spéciaux. Bibliographie

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Heller et al. : Physiologie végétale Tome 1 Nutrition - Masson Richter : Métabolisme des végétaux - Presses Polytechniques et Universitaires Romandes AFNOR : Détermination des effets des polluants dur le flore du sol – Partie 1 : Méthode de mesurage de l’inhibition de la croissance des racines (X 31-203). _________________________________

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