You are on page 1of 13

Cromatografia de afinitate

Cuprins:
1. Ce este cromatografia de afinitate?
2. Mecanismul de separare in cromatografia de afinitate
3. Experiment in cromatografia de afinitate
4. Tipuri de proprietăţi moleculare ţintă
5. Tipuri de cromatografia de afinitate cu liganzi
6. Potrivit condiţii obligatorii pentru / elution
7. Cromatografia de afinitate aplicat pentru recombinarea proteinelor
8. Cromatografia de afinitate, în practică
9. Cromatografia de afinitate profil

1. Ce este cromatografia de afinitate?
Cromatografia de afinitate este o tehnică de purificare, care de obicei oferă
puritate> 95% într-un singur pas.

Se face uz de un anumit nativ de proprietate sau de adăugat-ţintă pentru a izola-o
moleculă de la toate contaminanţi din probă.

Obligatorii de site-uri de anticorpi anti-receptori şi de activ sau de site-uri de enzime
sunt exemple de proprietăţi foarte specifice, care pot fi utilizate pentru
cromatografia de afinitate. Protetice ca grupuri de polizaharide sunt, de asemenea,
folosit, dar apoi pentru grupul de separare. Grupul de separare poate fi, de
asemenea, realizat prin utilizarea liganzilor cu specificitatea largă.

Comune pentru toate tipurile de cromatografie de afinitate este că un ligand (ligand
afinitate) de legare specific pentru site-ul ţintă moleculă, este cuplat la o matrice
inerta de cromatografie.
În conformitate cu condiţiile obligatorii această matrice cromatografia va lega
moleculelor în funcţie de specificul său numai. Toate celelalte componente eşantion
va trece prin cromatografia de mediu neadsorbit. După o spălare pas de adsorbit
molecule sunt supuse elutiei şi de condiţiile în schimbare faţă de disociere sau prin
adăugarea unui exces de o substanţă care deplasează moleculă ţintă de la afinitate
ligand.

Produsul recombinarii de proteinele un tip special de cromatografie de afinitate pot
fi aplicate datorită tehnicilor de gene de fuziune.
Speciale de vectorii sunt utilizate pentru a introduce o afinitate în tag-ul ţintă, de
proteine de gene de fuziune. Foarte des acleavage recunoaştere site-ul este
introdus, de asemenea, între nivelul proteinei ţintă şi de afinitate tag-ul. Când este
necesar de afinitate tag-ul poate fi apoi eliminat de protează, a unui ajutor specific
pentru acest site după purificare.

Gradientul de elutie în mod normal nu este necesar în cromatografia de afinitate şi
de echipament foarte simplu ca o seringă sau o pompă de peristaltic pot fi folosite.

2. Mecanismul de separare in cromatografia de afinitate
Comune pentru toate tipurile de cromatografia de afinitate care este o afinitate
pentru un ligand specifice obligatorii de pe site-ul ţintă moleculă, este cuplat la o
matrice inerte cromatografia.

În conformitate cu condiţiile obligatorii potrivit afinitate această matrice va lega
moleculelor în funcţie de specificul său numai. Toate celelalte componente eşantion
va trece prin mediu neadsorbite(Fig.1.1).

Fig 1.1 cromatografia de afinitate reversibile se bazează pe o reacţie foarte
specifica, obligatorie

După o spălare pas de adsorbit molecule sunt puse elutiei şi de condiţiile în
schimbare faţă de disociere sau prin adăugarea unui exces de o substanţă care
deplasează ţintă moleculă de la afinitate ligand.

Ca pentru toate reversibile obligatoriu în toate elementele cromatografie,
desorption curbe (fig. 1.2) poate fi folosit pentru a descrie partiţionarea din eşantion
între faza mobilă (de "tampon") de staţionare şi de fază (matrice de afinitate).
Fig 1.2 Deoarece numai ţintă se leagă de proteine, pas va elution
nu de co-elute eşantion alte componente.
Cu toate acestea, deoarece nu a eşantion alte componente lega în termen de de
partiţionare în zonă, un simplu "pe-afara" modului de cromatografie pot fi aplicate
de către brusc trecerea de la obligatoriu complet pentru a finaliza condiţiile de
eliberare.

Astfel, cromatografia de afinitate mare a moleculei ţintă, prin înaltă specifice, cu
caracter obligatoriu şi de eliberare, mai degrabă decât scoate de contaminanţi de
bine reglate-isocratic sau elution tehnici de gradient.

Cu toate acestea, deoarece nu a eşantion alte componente lega în termen de
partiţionare în zonă, un simplu "pe-afara" modului de cromatografia de dezvoltare a
unui cromatografia de afinitate metoda se reduce la:
1. Găsirea unui ligand destul de specific pentru a permite elution pas.
2. Găsirea condiţiilor de punere în siguranţă cu caracter obligatoriu şi, în
fereastra de stabilitate a moleculei ţintă şi de ligand.

3. Experiment in cromatografia de afinitate
Cromatografie de afinitate tipic de experiment constă în trei faze ca ilustrat mai jos:
Explicarea de simboluri
Simbolic de reprezentare: o
secţiune a unui colier locuibil
cromatografia de afinitate.

Exemple de molecule cu nici o Ţintă eşantion
Afinitate ligand afinitate pentru ligand moleculă cu deplină
afinitate pentru ligand

1. Equilibration 2. Exemplu de aplicare şi de 3. Elution
Coloana este spălare Ţintă moleculă este
conditionata de a Eşantionul este aplicat în desorbed şi eluted de
promova adsorbţie a conformitate cu condiţiile trecerea toelution
ţintă equilibrating-o obligatorii. tampon.
moleculă de withbinding Ţintă moleculă se leagă specific
tampon. de afinitate liganzilor, în timp ce
toate celelalte componente sunt
spălate prin eşantion.

4. Tipuri de proprietăţi moleculare ţintă
Trei grupuri de proprietăţi ale moleculei ţintă sunt utilizate in cromatografia de
afinitate:
1. Specifice obligatorii bazată pe proprietăţi biologice de activitate, cum ar fi:
- Enzimatic activ site-uri
- Receptor obligatorii site-uri
- Legarea anticorpilor site-uri etc
Acestea sunt utilizate împreună cu naturale ligand sau un analog de ea. Uneori
analog are o specificitate mai larg şi poate fi utilizat pentru grupul de separations.
2. Naturală, protetice grupuri, cum ar fi: polizaharide etc
Astfel de proprietăţi în mod normal permite grup separations numai.
3. Molecule echipat cu o afinitate ca tag-ul:
- Glutathione-S-transferazei (GST)
- Oligo histidină etc
Acest grup de proprietăţi este folosit aproape exclusiv pentru recombinant, proteine
de fuziune.
Mono-specifice separations Grupul specifice separations
• Antigenii • glicoproteine
• Anticorpii • anticorpilor IgG
• Hormoni • Enzime
• receptori • Proteins / peptide cu accesibile
• Enzime histidines
• Tagged recombinants

5. Tipuri de cromatografia de afinitate cu liganzi
Liganzilor utilizate pentru mono-specifice, cromatografia de afinitate sunt structural
şi biologic strâns legată de ţintă moleculă de a fi purificat. Acest lucru face de
selecţie a ligand specifice pentru fiecare caz. Aceasta, de asemenea, o face dificil
de a produce comercial afinitate pentru mass-media mono-specifice separations. Cu
toate acestea, mass-media gata pentru o varietate de cuplare biochimice (a se
vedea tabelul de mai jos) sunt disponibile comercial pentru dreptul de a beneficia
de utilizator, care intenţionează să rulaţi mono-specifice, cromatografia de afinitate.
Cu mici liganzilor (<1000) există un risc pentru steric ca interferenţe cu caracter
obligatoriu între matrice şi ţintă moleculă mică de accesibilitate sau de ligand. De
introducere a unui spacer braţul va minimiza aceste riscuri (Fig 3.2).
Principiul de pregătirea cromatografia de afinitate mass-media

Fig 3.1 Succesiunea evenimentelor folosite pentru a pregăti
cromatografia de afinitate mass-media. Pre-activarea mass-media sunt
disponibile în comerţ.

Spacer braţul principiu

Fig 3.2. Un spacer este uneori utilizat pentru a
asigure deplina accesibilitate a
afinitatii ligandului.
Liganzilor utilizate pentru grup-cromatografia de afinitate specifice au o
aplicabilitate mult mai larga şi afinitate mass-media, în acest scop, în consecinţă,
sunt disponibile comercial.
Tabelul de mai jos enumeră exemple de liganzilor de acest tip frecvent utilizati.
6. Potrivit condiţii obligatorii pentru / elution
Problema de a găsi un loc corespunzător ligand în cromatografia de afinitate nu
este limitat doar la specificitatea, dar se referă, de asemenea, obligatorii tărie şi
cinetică a ligand-ţintă moleculă de reacţie.
În mod ideal ar trebui să fie obligatoriu de semnal suficient de puternic pentru a
evita pierderile de eşantion în timpul fazei de spălare şi aplicare, în timp ce
obiectivul ar trebui să fie complet eliberat în timpul elution fază.

Cu alte cuvinte, una a de a găsi un ligand suficient de specifice, obligatorii, dar cu o
putere care permite elution în condiţii de siguranţă.

Ideal cromatografia de afinitate condiţii impun, de asemenea, cinetica a desorption
obligatorii şi reacţii care urmează să fie suficient de repede pentru a se asigura
complet reacţie în condiţii normale de debite.
Rezultatele aşteptate în condiţii ideale

Fig 4.1. Nu eşantion de scurgere în timpul aplicării şi spălare.
Target moleculă elutes ca o îngustă de vârf.
Obligatorii
Reacţii reversibile, cum ar fi reacţii de
între ţintă şi moleculă de ligand afinitate lor sunt caracterizate de disociere
constantelor de echilibru (KD).
Cele mai mici în valoare de la KD mai puternice de legare.
KD valorile obligatorii pentru bune sunt, de obicei, în intervalul 10-4 - 10-6 M.
Fig 4.2. KD valorile obligatorii pentru bune sunt, de obicei, în intervalul 10-4 - 10-6
M.

KD de valoare pot fi influenţate de schimbarea condiţiilor ca pH-ului, ionice puterea,
temperatura, etc proprietăţi polare

KD valori> 10-4 oferi prea slab şi a unei cote obligatorii de ţintă moleculă mai
"scurgere" ca o zonă largă în timpul diluat mostră de aplicare şi de spălare.

Figura 4.3 Scurgeri de ţintă din cauza prea mare o KD: Cu prea mici KD, ţintă
moleculă elutes spontan şi diluat în timpul mostră de aplicare.

Dacă un ligand se leagă prea puternic, va fi dificil să eluat de molecula ţintă fără a
introduce condiţii dure. În aceste condiţii, există întotdeauna un risc de abolire a
activităţii biologice a moleculei ţintă sau de a găsi-o "în mod ireversibil" adsorbit la
afinitate mediu.

Elutia
Elutia ideala necesită moleculă ţintă de a desorbi complet de la ligandul afinitate în
tamponul eluat.
Există două posibilităţi:
1. Aplicarea condiţiilor (pH, concentraţie ionică, temperatura, polare proprietăţi etc),
care se schimbă de la KD scăzut la mare.
KD valori adecvate pentru elution sunt, de obicei, în intervalul 10-1 - 10-2.

Fig 4.4. Elution (desorption): KD valori adecvate pentru elution sunt, de obicei, în
intervalul 10-1 - 10-2.
Pentru valori KD <10-2 de o întârziere la ţintă moleculă poate să apară în timpul
elution severă, cu vârf a extinde probabil ca un rezultat.
Fig 4.5. Retardat elution din cauza prea mici KD valoare: prea puternic, a unei cote
obligatorii poate duce la elution retardat.
2a. Adăugaţi un ligand liber (sau analog) de a se deplasa la ţintă moleculă de
competitiv obligatorii la ţintă. Exemplu: Elution de NADP dependente de enzime de
la Blue Sepharose prin adăugarea de NADPH.

Fig 4.6. Elution de deplasare, gratuit ligand: Libera ligand se adaugă pentru a se
deplasa la ţintă de la matrice obligat-ligand.
2b. Adăugaţi un concurent pentru a se deplasa la ţintă moleculă de competitiv
obligatorii la matrice obligat-ligand.
Exemplu: Elution LUI etichetat de proteine de la
HiTrap de chelatare prin adăugarea de imidazole.

Fig 4.7. Elution de deplasare, fără ţintă analog: un analog, se adaugă pentru a se
deplasa la ţintă de la matrice obligat-ligand.
Obligatorii / desorption cinetică
În mod ideal cromatografia de afinitate prevede distinct şi rapidă desorption
obligatorii şi a moleculei ţintă şi rezultatele aşteptate ar trebui să arate ca cele
prezentate în Fig 5.1.

Fig 5.1. Asteptate de comportament, repede pe / de pe rapid: Cu suficient de
repede elution obligatorii şi cinetică a moleculei ţintă elutes ca un vârf ascuţit.
Dacă lent, cu caracter obligatoriu şi / sau cu experienţă desorption este cea mai
bună cale de ieşire este de a transforma într-un alt sistem de furnizarea de afinitate
"repede pe / de pe repede" cinetică, dacă sunt disponibile.
Uneori, cu toate acestea, lent cinetică nu pot fi evitate şi speciale de moduri de a
lega şi elute ţintă moleculă trebuie să fie adoptate de recuperare sau pot suferi.

Mai încet obligatorii
Scurgere a moleculei ţintă eşantion în timpul aplicării şi spăla (Fig 5.2) indică faptul
că în exemplul de rezidenţă timp este prea scurt pentru completă obligatorii. Dacă o
astfel de scurgere scapă atenţiei rezultatele ar putea fi greşit interpretat ca oferind
mici de recuperare.

Fig 5.2. Mai încet obligatorii necesită timp suficient de şedere pentru completă
obligatorii.
Un mod de a prelungi perioada de timp de rezidenţă este de a injecta eşantion în
porţiuni mici şi de oprire a fluxului de după fiecare injectare (Fig 5.3). Durata
perioadei de oprire a fluxului de a fi stabilită de către judecată şi de eroare.

Fig 5.3. "Opriti flux" obligatoriu: Creşterea reşedinţă de timp poate fi creat prin
injectarea de eşantion în porţiuni mici şi de oprire a fluxului între preparate
injectabile.
Mai încet desorption
Problema aici nu este de gradul de purificare a obţinut, dar mai degrabă, că eluted
ţintă moleculă mai elute ca o zonă destul de mult diluat (Fig 5.4).

Fig 5.4. Mai încet desorption pot rezulta în larg şi se diluează varfuri.
Chiar şi în acest caz, o tehnică de elution bazate pe "oprit fluxul" poate ajuta.
Un volum de coloana eluent este pompat în coloana şi fluxul este oprit atunci.
Aceasta va permite desorbed ţintă moleculă de a acumula într-un volum limitat de
eluent, înainte de a pleca de coloana elute şi, astfel, în formularul de mai
concentrat. A oprit fluxul de elution este apoi repetat până când toate ţintă a fost
eluted (Fig 5.5.).
Fig 5.5. "Opriti flux" elution: "Mai încet de pe" cinetică necesită timp suplimentar
pentru desorption complet.

7. Cromatografia de afinitate aplicat pentru recombinarea proteinelor
De purificare a proteinelor recombinante poate fi drastic simplificate de tipul de
aprindere a genei o afinitate pentru tag-ul (sau trata) cu recombinare a genei
pentru.
Gazdă, atunci va exprima recombinant, etichetat de proteine cu afinitate descurc
cromatografia de afinitate şi tehnici pot fi aplicate pentru a izola şi a purifica
această aşa-numita proteină de fuziune (Fig 6.1.). Deşi nu întotdeauna este
necesar, pot fi tag-ul afinitate înlăturat de către speciale despica-off după purificare
a enzimelor.

Fig 6.1. Producţie şi de purificare a proteinelor de fuziune.
În acest fond de proteină de fuziune tehnică sunt:
• de ligand / afinitate tag-ul de sistem, în principiu, pot fi aplicate la orice proteină
recombinantă.
• de purificare de protocol se reduce la un singur pas.
• Condiţii de utilizat deveni standardizate.
• Foarte puţine (dacă există) de optimizare lucru este necesar.
Figurile 6.2 şi 6.3 de mai jos arată de flux de lucru pentru purificare a etichetat-şi
GST (lui) 6-proteine de fuziune cu tag-uri:
Fig 6.2. Schematic vedere de ansamblu asupra GST proteină de fuziune purificare
folosind GSTrap ™.

Fig 6.3. Schematic imagine de ansamblu a (lui) 6 proteină de fuziune purificare
folosind HiTrap ™ de chelatare HP
8. Cromatografia de afinitate, în practică
Utilizaţi cromatografia de afinitate
Mono-specifice, cromatografia Specifice de grup- Proteină de fuziune
de afinitate cromatografia de afinitate cromatografia de afinitate
Un pas-purificare a enzimelor, -Un pas de purificare Un pas-purificare a afinitate
receptori, anticorpi etc proteine, care conţine un etichetat recombinant,
angajarea activă direcţionată generale obligatorii, mai proteine. De afinitate tag-ul
pe site-liganzilor. multe site-ului, cum ar fi este introdus prin tehnici de
unele clase de anticorpi, gene de fuziune.
glycoprotens, şi NADP
dependente de enzime.

Experimentale cromatografia de afinitate
Mono-specifice Grupul-specifice Proteină de fuziune
Cromatografia de Media pentru Mass-media sunt Mass-media sunt
afinitate mediu cromatografia de disponibile comercial disponibile comercial
afinitate trebuie să în coloane şi kituri de în coloane şi kituri de
fie extrem de poros preambalate pentru preambalate pentru
pentru a garanta a garanta buna func. a garanta buna func.
randamente ridicate
de cuplare şi acces
complet la afinitate
ligand.
Coloana Cromatografia de Cromatografia de Coloanele sunt, de
afinitate este eluted- afinitate este eluted- obicei, "scurt şi gras"
pas. Coloanele sunt, pas. Coloanele sunt, şi în format HiTrap
prin urmare, de prin urmare, de ™. Pentru utilizarea
obicei, "scurt şi obicei, "scurt şi paralelă de purificare
gras". gras". roti coloane.
Coloana de Unele afinitate Unele afinitate Unele afinitate
regenerare şi de liganzilor sunt liganzilor sunt liganzilor sunt
depozitare sensibile la proteaze. sensibile la proteaze. sensibile la proteaze.
Urmaţi recomandate Urmaţi recomandate Urmaţi recomandate
de depozitare şi de de depozitare şi de de depozitare şi de
proceduri de proceduri de proceduri de
regenerare pentru a regenerare pentru a regenerare pentru a
se asigura coloana se asigura coloana se asigura coloana
plin de viaţă. plin de viaţă. de viaţă.
Re-utilizarea de
coloane trebuie să fie
limitată la proteine
de fuziune identice
pentru a preveni
contaminarea
încrucişată.
Eluents Elution condiţii dure, Elution condiţii dure, Coloane destinate lui
care pot influenţa care pot influenţa etichetat-proteine
ligand de viaţă sunt ligand de viaţă sunt pot solicita pentru a
uneori necesare. uneori necesare. fi re-încărcate cu ioni
Întotdeauna coloana Întotdeauna coloana de metal folosit.
de spălare după de spălare după
utilizare. utilizare.
Debite Obligatorii / Obligatorii / Pentru buna func
desorption cinetică desorption cinetică urmaţi procedura
pot limita aplicabilă pot limita aplicabilă recomandată.
debitului. debitului.
Exemplu de volum Exemplu de volum Exemplu de volum Exemplu este, în
este, în general, mai este, în general, mai general, mai puţin de
puţin de importanţa, puţin de importanţa, importanţa, atât timp
atât timp cât atât timp cât cât capacitate
capacitate maximă capacitate maximă maximă de încărcare
de încărcare de gel de încărcare de gel de gel nu este
nu este voilated nu este voilated. voilated.
Mostre prea dilua ar
putea limita
obligatorii KD dacă
este mai mare decât
optime.
Exemplu de sfaturi de preparare
! Asiguraţi-vă că componentele de cunoscut pentru a interfera cu caracter
obligatoriu sunt absente.
• Filtru de roti sau pentru a elimina eşantion de particule.
• Utilizaţi o desalting coloana, pentru a se potrivi condiţiilor de exemplu de la cele
obligatorii din tampon.
Exemplu de sfaturi de siguranţă
! Eluting la extreme, pH-ul Valorile pot pune în pericol funcţia biologică a proteinei
ţintă.
• Colectaţi eluted fracţii în cantităţi mici de tampon concentrat al unui pH-ului în
fereastra de stabilitate nivelul proteinei ţintă.
• Imediat după ocolire, utilizaţi o desalting coloana de a transfera eluted ţintă de
proteine la condiţiile de blând.

9. Cromatografia de afinitate profil
Principiul de funcţionare • conformitate cu separă moleculele specifice de bio-
afinitate.
Utilizat pentru • un pas de purificare ţintă de la complexe de molecule
de eşantioane.
• purificare a etichetat recombinant, proteine
• grupul de separations
• eliminarea specifice de contaminanţi
Adecvat într-o etapă de • captură: ***
purificare de protocol • intermediar: ***
• şlefuire: **
(Numarul de stele indice de adecvare.)
Separarea caracteristici • rezoluţie foarte ridicată
• capacitate de încărcare mare
• viteza moderat
• blândeţea mare
• mass-randament inalt
Principalele parametru de • alegerea afinitate ligand
optimizare
Special features • foarte simplu protocoale de purificare
• necesită echipament simplu
• foarte potrivite pentru etichetat recombinant,
proteine
Mai multe de lectură - Aplicaţii
- Media de selecţie ghid
- Protocoale de Lustratiei
- Strategii de Lustratiei
- (Manualele etc)

Bibliografie
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/4a0f132842ea4d354a25685d0011fa04/ad01
8c9e293f99bec1256e92003e865a/$FILE/GE_Affinity.swf
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~ACB
as
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~ACB
as~ACTheSepM
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~ACB
as~ACTheACexp
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~ACB
as~ACTypesOf
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~ACB
as~ACTypesOfALig
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~ACB
as~ACSuitableC
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~ACB
as~ACappliedToRec
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~ACpr
ac
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~ACT
echP
• http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_EduC~LC_tech~AC~AC
What
• http://en.wikibooks.org/wiki/Proteomics/Protein_Separations_-_Chromatography/Affinity