VALIDACIN DE AEROBIOS MESFILOS

Karem Vera, Nadia Gaitn, Laura Castellanos.

Universidad de Pamplona; Facultad de Ciencias Bsicas; Departamento de Microbiologa
Aseguramiento de la Calidad

1. MARCO TERICO

La validacin de un mtodo microbiolgico es un proceso importante para la
implementacin de una tcnica analtica microbiolgica, ya que por medio de la validacin
de dicho mtodo se logra establecer de forma experimental que las caractersticas del
mtodo cumplen con los requisitos para la aplicacin prevista.

Los aerobios mesfilos o tambin denominados viables totales. Este indicador
microbiolgico se emplea con el objetivo de estimar el nivel de microorganismos de un
producto alimenticio y determinar su estado higinico general. Se trata de
microorganismos que crecen en presencia de oxgeno y cuya temperatura ptima de
crecimiento est entre 15-35C. Dentro de los aerobios mesfilos se incluyen tanto
bacterias como hongos y levaduras. (1)

El concepto de validacin se puede definir como: proceso de evaluacin de las
caractersticas de un procedimiento de medida, y comprobacin de que dichas
caractersticas cumplen una serie de requisitos preestablecidos para el uso especfico
previsto, es decir, el objetivo de la validacin es confirmar que el mtodo analtico o de
medida empleado es adecuado para el uso previsto que se le va a dar. La validacin,
incluye la especificacin de los requisitos que han de cumplir el mtodo a validar, la
determinacin de las caractersticas del mtodo y la declaracin sobre la validez del
mtodo, llevando en todo momento un registro de validacin que recoja los pasos
seguidos y los resultados obtenidos. Para demostrar la validez de un mtodo existen una
serie de parmetros cuyo cumplimiento es preciso determinar durante el proceso de
validacin; dichos parmetros dependern del tipo de mtodo que se valida, siendo los
establecidos en el caso de mtodos microbiolgicos los siguientes:

Exactitud: se entiende por tal al grado de concordancia entre el resultado de la medicin y
el valor de referencia aceptado. En microbiologa, teniendo en cuenta la dificultad para
obtener el valor de referencia, se emplea el trmino de exactitud relativa: grado de
correspondencia entre la respuesta obtenida por el mtodo de referencia y la respuesta
obtenida por un mtodo alternativo en muestras similares.

Precisin: se trata del grado de concordancia entre los resultados obtenidos al aplicar el
procedimiento experimental repetidas veces bajo las condiciones establecidas. Dentro de
este parmetro se engloban la repetibilidad y reproducibilidad. La repetibilidad es el grado
de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mensurado
realizadas en las mismas condiciones de medicin (mismo mtodo, mismo analista, mismo
instrumento de medida); la reproducibilidad es el grado de concordancia entre los
resultados de mediciones del mismo mensurado realizadas bajo diferentes condiciones de
medicin (diferentes analistas, diferentes das, bajo diferentes condiciones, etc). (2)

Incertidumbre: es la estimacin que caracteriza el intervalo de valores en el que se sita,
generalmente con una alta probabilidad, el valor verdadero de la magnitud medida. La
incertidumbre de la medida incluye, en general, varias componentes. Algunas pueden
estimarse a partir de la distribucin estadstica de los resultados de series de medicin y
pueden caracterizarse por la deviacin tpica muestral, las estimaciones de los otros
componentes solamente pueden basarse en la experiencia o en otras informaciones. El
clculo de la incertidumbre se obtiene como resultado del propio proceso de validacin.

2. PROCEDIMIENTO

Control de ambientes





se colocaron abiertas 2 cajas de petri con agar
SPC (Standar Plate Count) en las incubadoras
de 30 C y 37C durante un periodo de 15
minutos , transcurrido este tiempo se
incubaron las cajas invertidas a 37 C/48 hrs.
este procedimiento se realizo antes de la
realizacion de cada protocolo con el fin de
hacer un recuento de aerobios mesofilos que
se encontraban en el ambiente.
Estandarizacin del inoculo

Estandarizacin de la matriz




Se tom una colonia aislada de
cada microorganismo
(Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa).
Se sembr en 99 ml de
caldo BHI (cada cepa por
separado), se agit y se
llevara a incubacin
a 37C por 24 horas, sin
agitacin.
Se adicion 1 ml del
microorganismo en un tubo
de ensayo con 9 ml de agua
peptonada al 0,1 % para
obtener la dilucin inicial.
(esto se realizo para los tres
microorganismos)
Con ayuda de un vortex se
homogeniz el inculo. Se tom
1 ml de la suspensin
microbiana inicial y se transfiri
a un tubo con 9 ml de agua
peptona al 0,1 %, se
homogeniz y se repiti este
procedimiento hasta la dilucin
10
-10
. (esto se realizo para los
tres microorganismos)
Se sembr en cajas de Petri
por siembra en profundidad
1 ml de cada dilucin por
duplicado y se agregaron
aproximadamente 15-20 ml
de agar SPC. (esto se realizo
para los tres
microorganismos)
Se incubaron las cajas a
37C por 48 horas. Se
realizaron las lecturas
despus de los respectivos
tiempos de incubacin y se
registraran los datos. (esto
se realizo para los tres
microorganismos)
Se pesaron 10 gr de Skim Milk
(leche desnatada o descremada).
Se adiciono 100 mL de agua
destilada y se esteriliz durante
10 minutos a 121C a 15 psi. Este
procedimiento se realiz tres
veces para obtener tres muestras.
Se tom 1 ml del pool microbiano
y se trasfiri a 100 ml de Skim
Milk para obtener la dilucin
inicial. (este procedimiento se
realizara por triplicado para
obtener tres muestras del mismo
inoculo)
Anlisis repetitivo del inoculo en la matriz de Skim Milk

3. RESULTADOS
Tabla 1. Correlacin en trminos de recuento en placa y espectrofotometra de la estandarizacin
del inoculo para Klebsiella spp.
DILUCIN INVERSO RECUENTO 1 PROMEDIO RESULTADO ABS UFC/ML
1 1 ct1 ct2 0,0994 0
0,1 10 1600 1600 1600 16000 0,154 4,20411998
0,01 100 1600 1600 1600 160000 0,078 5,20411998
0,001 1000 1600 1600 1600 1600000 0,068 6,20411998
0,0001 10000 1936 1936 1936 19360000 0,065 7,28690535
0,00001 100000 536 624 580 58000000 0,060 7,76342799
0,000001 1000000 163 172 167,5 167500000 0,060 8,22401481
0,0000001 10000000 66 59 62,5 625000000 0,058 8,79588002
0,00000001 100000000 32 33 32,5 3250000000 0,033 9,51188336
1E-09 1000000000 7 12 9,5 9500000000 0,030 9,97772361
1E-10 1E+10 0 5 2,5 2,5E+10 0,005 10,39794
Tabla 2. Correlacin en trminos de recuento en placa y espectrofotometra de la estandarizacin
del inoculo para Escherichia coli
DILUCIN INVERSO RECUENTO 2 PROMEDIO RESULTADO ABS UFC/ML
1 1 ct1 ct2 1,478 0
0,1 10 1600 1600 1600 16000 0,323 4,20411998
0,01 100 1600 1600 1600 160000 0,06 7,20411998
0,001 1000 1600 1600 1600 1600000 0,059 5,20411998
0,0001 10000 1600 1600 1600 16000000 0,05 8,20411998
0,00001 100000 1600 1600 1600 160000000 0,049 9,20411998
0,000001 1000000 1600 1600 1600 1600000000 0,045 10,20412
0,0000001 10000000 1600 1600 1600 1,6E+10 0,043 6,20411998
0,00000001 100000000 1600 1600 1600 1,6E+11 0,043 11,20412
1E-09 1000000000 388 428 408 4,08E+11 0,040 11,6106602
1E-10 1E+10 388 212 300 3E+12 0,038 12,4771213
Se inoculo 1 ml de la dilucin
inicial en un tubo
conteniendo 9 ml de agua
peptona 0,1 % para
obtener la segunda dilucin
(10
-1
). Se homogeniz y se
repiti el procedimiento
hasta la dilucin 10
-10
.
Luego se transfiri 1 mL de
cada una de las diluciones
preparadas en cajas de Petri,
por
duplicado para cada dilucin
(para cada una de las
temperaturas evaluadas).
Se adiciono 15-20 mL de agar
SPC a una temperatura, en
cada caja de Petri. Se mezcl
cuidadosamente el inoculo
con el medio y se dej
solidificar.
Despus se invirtieron las
cajas y se incubaron a 30C y
35C durante 48-72
respectivamente.
Transcurrido el tiempo
especificado de incubacin se
contaron las colonias
caractersticas en
cada caja que contena entre
15-300 colonias.
Estos anlisis se realizaron por
duplicado para cada una de
las temperaturas
analizadas (30C y 37C).

Tabla 3. Correlacin en trminos de recuento en placa y espectrofotometra de la estandarizacin
del inoculo para Pseudomonas spp.
DILUCIN INVERSO RECUENTO 3 PROMEDIO RESULTADO ABS UFC/ML
1 1 ct1 ct2 x x
0,1 10 1600 1600 1600 16000 0,186 4,20411998
0,01 100 1600 1600 1600 160000 0,078 5,20411998
0,001 1000 800 800 800 800000 0,062 5,90308999
0,0001 10000 600 600 600 6000000 0,059 6,77815125
0,00001 100000 58 110 84 8400000 0,054 6,92427929
0,000001 1000000 80 47 63,5 63500000 0,050 7,80277373
0,0000001 10000000 32 21 26,5 265000000 0,046 8,42324587
0,00000001 100000000 4 19 11,5 1150000000 0,032 9,06069784
1E-09 1000000000 2 3 2,5 2500000000 0,039 9,39794001
1E-10 1E+10 1 1 1 1E+10 0,032 10
Grafica 1. Curva patrn para la estandarizacin del inoculo de Klebsiella spp en trminos de ufc/ml
y ABS.

Grafica 2. Curva patrn para la estandarizacin del inoculo de Escherichia coli en trminos de
ufc/ml y ABS.

y = 4.0613ln(x) + 0.5898
R = 0.9873
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15
U
f
c
/
m
l

abs
Estandarizacion del inoculo I1
Crecimiento de Klebsiella
Log. (Crecimiento de
Klebsiella)
y = 0.7897x + 4.2286
R = 0.7096
0
5
10
15
0 2 4 6 8 10 12
U
f
c
/
m
l

ABS
Estandarizacion del inoculo I2
Crecimiento "E.coli"
Linear (Crecimiento
"E.coli")
Grafica 3. Curva patrn para la estandarizacin del inoculo de Pseudomonas spp en trminos
de ufc/ml y ABS.


Tabla 4. Resumen Estadstico sobre la comparacin de muestras (I1, I2, I3) segn su promedio,
Desviacin Estndar y Coeficiente de Variacin.


Muestras Recuento Promedio Desviacin
Estndar
Coeficiente de Variacin
I1 10 7,75701 1,05631 26,5091%
I2 10 8,57207 2,83841 33,1123%
I3 10 7,36984 1,90319 25,824%
Total 30 7,89964 2,27956 28,8566%

Grafica 4. Comparacin de los (3) recuentos (I1, I2, I3)
y = -0.0191x
2
+ 0.8353x + 3.5118
R = 0.9944
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12
u
f
c
/
m
l

ABS
Estandarizacion del inoculo I3
Crecimiento de
Pseudomonas
Poly. (Crecimiento de
Pseudomonas)
R1
R2
R3
Grfico Caja y Bigotes
4,2 6,2 8,2 10,2 12,2 14,2
respuesta
Tabla 5. Recuento de Aerobios mesofilos en (3) pulls a 30C en Caldo Skim Milk

Tabla 6. Recuento de Aerobios mesofilos en (3) pulls a 37C en Caldo Skim Milk
DILUCIN INVERSO RECUENTO 1 RECUENTO 2 RECUENTO 3
37C PROMEDIO RESULTADO LOG 37C RESULTADO LOG ABS

37C RESULTADO LOG ABS
1 1 ct1 ct2 ct1 ct1
0,1 10 1600 1600 1600 16000 4,20411998 1600 16000 4,20411998 0,752 1600 25600000 7,40823997 o,190
0,01 100 1600 1600 1600 160000 5,20411998 1600 160000 5,20411998 0,163 1600 256000000 8,40823997 0,100
0,001 1000 1600 1600 1600 1600000 6,20411998 1600 1600000 6,20411998 0,83 1600 2560000000 9,40823997 0,098
0,0001 10000 1600 1600 1600 16000000 7,20411998 1600 16000000 7,20411998 0,78 1600 2,56E+10 10,40824 0,080
0,00001 100000 768 724 746 74600000 7,87273883 77 7700000 6,88649073 0,75 600 4,476E+10 10,6508901 0,086
0,000001 1000000 150 160 155 155000000 8,1903317 74 74000000 7,86923172 0,67 316 4,898E+10 10,6900188 0,070
0,0000001 10000000 44 47 45,5 455000000 8,6580114 56 560000000 8,74818803 0,55 90 4,095E+10 10,6122539 0,072
0,00000001 100000000 10 7 8,5 850000000 8,92941893 51 5100000000 9,70757018 0,51 10 8500000000 9,92941893 0,065
1E-09 1000000000 0 0 0 0 #NUM! 59 5,9E+10 10,770852 0,48 5 0 #NUM! 0,058
1E-10 1E+10 0 0 0 0 #NUM! 45 4,5E+11 11,6532125 0,42 cont #VALOR! #VALOR! 0,045

DILUCIN INVERSO RECUENTO 1

RECUENTO 2 RECUENTO 3
30C PROMEDIO RESULTADO LOG 30C RESULTADO LOG ABS 30C RESULTADO LOG ABS
1 1 ct1 ct2 ct1 ct1
0,1 10 1600 1600 1600 16000 4,20411998 1600 16000 4,20411998 0,752 1600 25600000 7,40823997 o,190
0,01 100 1600 1600 1600 160000 5,20411998 1600 160000 5,20411998 0,163 1600 256000000 8,40823997 0,100
0,001 1000 1600 1600 1600 1600000 6,20411998 1600 1600000 6,20411998 0,83 1600 2560000000 9,40823997 0,098
0,0001 10000 1600 1600 1600 16000000 7,20411998 112 1120000 6,04921802 0,78 1600 2,56E+10 10,40824 0,080
0,00001 100000 368 388 378 37800000 7,5774918 96 9600000 6,98227123 0,75 480 1,8144E+10 10,258733 0,086
0,000001 1000000 138 158 148 148000000 8,17026172 76 76000000 7,88081359 0,67 360 5,328E+10 10,7265642 0,070
0,0000001 10000000 32 49 40,5 405000000 8,60745502 50 500000000 8,69897 0,55 47 1,9035E+10 10,2795529 0,072
0,00000001 100000000 5 8 6,5 650000000 8,81291336 22 2200000000 9,34242268 0,51 1 650000000 8,81291336 0,065
1E-09 1000000000 0 0 0 0 #NUM! 20 2E+10 10,30103 0,48 0 0 #NUM! 0,058
1E-10 1E+10 0 0 0 0 #NUM! 4 4E+10 10,60206 0,42 0 0 #NUM! 0,045
Tabla 5.1 Comparacin de concentraciones en Ufc/ml de los (3) PULLs a 30C en Caldo Skim Milk
PULLs 30C
ufc/ml
R1 R2 R2
4,20411998 4,20411998 7,40823997
5,20411998 5,20411998 8,40823997
6,20411998 6,20411998 9,40823997
7,20411998 6,04921802 10,40824
7,5774918 6,98227123 10,258733
8,17026172 7,88081359 10,7265642
8,60745502 8,69897 10,2795529
8,81291336 9,34242268 8,81291336
#NUM! 10,30103 #NUM!
#NUM! 10,60206 #NUM!

Tabla 5.2 Resumen Estadstico
Recuento Promedio Desviacin
Estndar
Coeficiente de
Variacin
Mnimo Mximo Rango
R1 8 6,99808 1,66007 23,7218% 4,20412 8,81291 4,60879
R2 10 7,54691 2,17587 28,8312% 4,20412 10,6021 6,39794
R3 8 9,46384 1,16804 12,3421% 7,40824 10,7266 3,31832
Total 26 7,96786 1,98645 24,9308% 4,20412 10,7266 6,52244

Tabla 6.1 Comparacin de concentracin en Ufc/ml de los (3) PULLs a 37C en Caldo Skim Milk
PULL 37C
ufc/ml
R1 R2 R3
4,20411998 4,20411998 7,40823997
5,20411998 5,20411998 8,40823997
6,20411998 6,20411998 9,40823997
7,20411998 7,20411998 10,40824
7,87273883 6,88649073 10,6508901
8,1903317 7,86923172 10,6900188
8,6580114 8,74818803 10,6122539
8,92941893 9,70757018 9,92941893
#NUM! 10,770852 #NUM!
#NUM! 11,6532125 #VALOR!




Tabla 6. 2 Resumen Estadstico
Recuento Promedio Desviacin
Estndar
Coeficiente de
Variacin
Mnimo Mximo Rango
R1 8 7,05837 1,70462 24,1504% 4,20412 8,92942 4,7253
R2 10 7,8452 2,39446 30,5213% 4,20412 11,6532 7,44909
R3 8 9,68944 1,2116 12,5043% 7,40824 10,69 3,28178
Total 26 8,17056 2,11307 25,8621% 4,20412 11,6532 7,44909


4. DISCUSIN
Para la estandarizacin del inoculo fue necesario emplear valores de ufc/ml y Absorbancia
(Abs) con procesos de recuento en placa y espectrofotometra donde permiti la elaboracin
de cuervas patrones para los inculos I1, I2, I3. Es por ello que las grficas con mayor
coeficiente de correlacin fueron la I1 y I3 donde sus datos se ajustan a 1. Por lo que se puede
determinar que la inoculacin de ufc/ml fue consecuentemente buena con respecto a las
diluciones practicadas. Por otra parte la (Grafica 2) no es concluyente sus concentraciones
bacterianas por lo que se puede decir que su estandarizacin no fue optima ya que su R2 fue
de 0.7096 ms bajo que en las (Grafica1 = 0.98 y Grafica 2 =0.99)
Tambin se hizo referencia a las relaciones entre el tamao de las medias y la variabilidad de
las variables, por esto se utiliza el coeficiente de variacin como medida para determinar si un
conjunto de datos son estrechamente concluyentes o dispersos entre s y es la cual nos
permite medir el grado de repetitividad ; donde la (Tabla 4.) nos permite inducir que las
variables I1, I2y I3 son demasiadas bajas por lo que sus valores son heterogneos esto es
debido a que deben estar cercanos a 100%. Pero cabe rescatar que I2 es un poco ms alta.
Esto se puede ver tambin en la (Grafica 4.) donde el diagrama de cajas y bigotes es ms
dispersa entre el plano del diagrama.
Consecuentemente se us la desviacin estndar la cual presentan una incertidumbre alta
para I2 donde se sobrepasa de 1 con respecto a I1 y I3 las cuales estn dentro de este
parmetro estadstico. Por eso si la desviacin estndar es mayor es porque esta se aleja de la
media aritmtica.
Por lo que se se puede concluir que la estandarizacin del inoculo fue buena para R1 y R3
debido a su Desviacin Estndar ya que la medida de CV% no permiti marcar un ndice de
referencia para este anlisis. Por lo que se esperara trabajar con estos dos inculos en la
matriz o pull. Tal no fue el caso, y se emplearon los tres inculos para elaborar la matriz de
30C y la 37C. Esto se hizo por triplicado (Recuento1, Recuento2, Recuento3) donde a 30C
R1 y R2 fueron buenas debido a sus Desviaciones Estndar. Con lo que se compara con los
pulls a 37 C y tambin marcan igual resultado, con desviaciones de 1.
Los CV% siguen siendo bajos para los pulls a las dos temperaturas, por lo que esta medida
estadstica no es confiable tomar para determinar o identificar un buen crecimiento
exponencial de las matrices.
Sin embargo es preciso decir que las variables R1 y R2 tuvieron mejor crecimiento en cuanto a
unas dcimas ms despus del 1; con respecto a la influencia de la temperatura en los pull con
30C. Por lo que la validacin realizada puede ser un poco acertada debido a que si hubo
presencia de aerobios mesofilos pero se esperara haber obtenido alto desarrollo de carga
microbiana en las dos temperaturas por igual ya que son los rangos permitidos por este grupo
de microorganismos.
Estos errores pudieron ser debido a que las matrices se realizaron con los 3 inculos de los
cuales uno no estaba en buen estado de estandarizacin y que en la preparacin de ellas no se
conoca previamente la estandarizacin de estos.

5. CONCLUSIONES
La validacin de esta tcnica para aerobios mesofilo no fue la mejor debido a que las dos variables
de confirmacin la reproductividad, la cual se media con la desviacin estndar y la repetitividad
con el coeficiente de variacin no fueron definidas de buena manera ya que la repetitividad fue
muy baja con respecto a su medida estadstica, impidiendo un anlisis ms profundo y confiable
para la validacin.
Debido a que solo se tom en cuanta el anlisis de la Desviacin estndar es decir la
reproductividad se da por entendido que la validacin debe ser de nuevo hecha para obtener
valores ms confiables e idneos.
La eficiencia de este mtodo recae es en la buena elaboracin de la estandarizacin de los
inculos por lo que se esperara retomar el protocolo y repetir este paso para que no afectara la
matriz que se desea validar.
De todas las matrices elaboradas dos de ellas (R1 y R2) fueron las de mejor estndar estadstico y a
su vez correlacionaban con las temperaturas a las que se encontraba pero con ms significancia en
la de 30C.

BIBLIOGRAFIA
1. Larry Maturin and James T. Peeler (2001). Bacteriological Analytical Manual, Chapter 3:
Aerobic Plate Count. Disponible en web: www.fda.gov.
2. Gabinete de servicios para la calidad (GSC). Documentacin del curso sobre validacin y
clculo de incertidumbres en ensayos microbiolgicos.