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AISLAMIENTO, DESCRIPCION E IDENTIFICACION BIOLOGICA DE UNA

BACTERIA AMBIENTAL
ISOLATION, IDENTIFICATION AND DESCRIPTION OF ENVIRONMENTAL BIOLOGICAL
BACTERIA

Norea Moreno Ubielly, Snchez Gmez Maria Camila, Vlez Snchez Laura Natalia
Programa De Biologa, Facultad De Ciencias Bsicas Y Tecnologas, Universidad Del
Quindo, Armenia, Quindo

RESUMEN

En el campo de la microbiologia y en otras disciplinas las bacterias son constante
objeto de estudio, estas pueden ser encontradas en cualquier parte ya que son los
organismos ms abundantes del planeta y se encuentran tanto en hbitats terrestres
como en los acuticos adems tambin poseen una gran variedad de formas,
tamaos y grupos a los que pertenecen es por eso que en el siguiente informe de
laboratorio llevaremos a cabo una serie de diferentes pruebas que nos permitirn
aislar, describir e identificar un tipo de bacteria ambiental seleccionada de la cavidad
bucal, para esto se realiz diferentes tipos de pruebas tales como las tinciones
diferenciales las cuales sirvieron para determinar si las bacterias eran Grampositivas
o Gramnegativas, pruebas bioqumicas, antibiogramas entre otros. Esta serie de
pruebas nos llevaron a identificar una bacteria especfica, la cual fue encontrada
acorde con las diferentes pruebas realizadas Todo esto tiene como objetivo
principalmente adquirir conocimientos acerca de las bacterias ya que es de vital
importancia en la formacin de un bilogo ya que estas son objeto de gran cantidad
de estudios y aplicaciones.

PALABRAS CLAVE: Bacterias Ambientales, Pruebas bioqumicas, Microbiologia,
Estudio, identificar.

ABSTRACT

In the field of microbiology and other disciplines bacteria are constantly under review,
these can be found anywhere and they are the most abundant organisms on the
planet and are both terrestrial and aquatic hbitats also have a great addition variety of
shapes, sizes and groups to which they belong is why in the next lab report will
conduct a series of different tests that will allow us to isolate, describe and identify
some types of environmental bacteria,for this different types of tests such as
differential stains which were used to determine if the bacteria were Gram-positive or
Gram-negative, biochemical tests, antimicrobial susceptibility testing was performed
among others. Having knowledge about bacteria is vital in the formation of a biologist
as these are the subject of many studies and applications.


KEY WORDS: Environmental Bacteria, Testing biochemestry, Microbiology, Studio,
identify.


INTRODUCCION
Las bacterias son microorganismos unicelulares que se reproducen por divisin
simple, es decir, fisin binaria. Presentan un tamao de algunos micrmetros de largo
(entre 0,5 y 5 m, por lo general) y diversas formas incluyendo esferas, barras y
hlices. Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, no tienen ncleo ni orgnulos
internos; Las actividades fundamentales de tipo metablico y biosinttico de la
bacteria se efectan dentro del citoplasma y cubierta celular. (Stuart Walker et al,
2000) Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglucanos. La
naturaleza qumica de los componentes y estructuras de la envoltura les confiere
caractersticas tiles de tincin que permite dividir las bacterias de manera arbitraria
en microorganismos Gram positivos, Gram negativos y acidorresistentes. (Joklik, W.,
Willett, P., Amos, B. & Wilfert, C. et al.1998) Muchas bacterias disponen de flagelos o
de otros sistemas de desplazamiento y mviles. Son los organismos ms abundantes
del planeta. Son ubicuas, encontrndose en todos los hbitat de la tierra.
Los medios de cultivo son indispensables para que los microorganismos se
multipliquen en el laboratorio, y para la relacin de tcnicas especializadas como la
identificacin microbiana, el anlisis de agua y de alimentos, y el aislamiento de
microorganismos especficos. Los cultivos puros son necesarios para el estudio
detallado de las especies microbianas individuales, y pueden ser obtenidos mediante
tres mtodos de siembra en placa: por extensin, en estras y profundidad.
Cuando se cultivan microorganismos en un sistema cerrado, el crecimiento de la
poblacin es exponencial durante unas pocas generaciones, y luego entra en una
fase estacionaria debido a factores como la escasez de nutrientes y la acumulacin
de desechos. En un sistema abierto con adicin continua de nutrientes y eliminacin
de residuos, la fase exponencial puede mantenerse durante largos periodos.
El crecimiento microbiano se ve influido por varios factores ambientales, como la
disponibilidad de agua, el pH, la temperatura, la concentracin de oxgeno, la presin
y la radiacin. Sin embargo, muchos microorganismos (especialmente los procariotas)
se las han arreglado para adaptarse y prosperar en ambientes extremos que
destruiran a la mayora de los organismos superiores. (Willey,J. Sherwood,L. &
Woolverton,C. et al, 2009).


METODOLOGIA

PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
De acuerdo a su utilidad prctica y estado fsico, se prepararon dos medios de cultivo
slidos, donde se utiliz Agar Nutritivo y Agar Mac conkey; definidos como cultivos
enriquecidos, ya que potencia el cultivo y el crecimiento de los microorganismos
deseados. Se realiz una regla de tres, para verificar las cantidades a utilizar en la
preparacin de cada medio.

Se calent el agua antes de disolver los medios, y se disolvi poco a poco en un
matraz Erlenmeyer de doble capacidad; se tap con papel aluminio y se dej en la
autoclave durante 15minutos y 121c. Despus de enfriarse se sirvi en cajas de
Petri antes de que el medio se solidificara; ya en las cajas se dej enfriar y estas se
sellaron con cinta papel y se dejaron en un lugar seco.

SIEMBRA
Se tom una muestra bucal la cual fue sembrada por estra en el agar nutritivo, con un
hisopo luego se sell, se rotulo con fecha, hora, cdigo y lugar de la muestra, se
coloc en incubadora a una temperatura de entre 36.5 y 37 grados centgrados.
Despus de 8 das de incubacin, se observ crecimiento de microorganismos en el
medio. De este se aisl una sola colonia de las presentes all, para lo cual se prepar
el lugar de trabajo con las normas microbiolgicas adecuadas (superficie desinfectada
con alcohol y la tcnica asptica con mecheros encendidos en forma de tringulo);
luego se tom una pequea muestra con el asa bacteriolgica la que previamente se
calent en el mechero y se enfri en el agar antes de tomar la muestra de una colonia
del agar nutritivo la cual se describi con la tabla dada en el informe, esta se sembr
por agotamiento en el medio de Agar Macconkey el cual ya se haba preparado; de la
misma colonia se tom otras pequeas muestras teniendo en cuenta el mismo
procedimiento de la asa bacteriolgica las cuales se sembraron por estra en agar
nutritivo, en un medio semislido tubo inclinado de agar urea en estra, y por ltimo en
un medio liquido LB se inoculo la muestra. Todas estas siembras se incubaron a 37c y
se hicieron observaciones cada 24 horas durante 5 das.

TINCIN DIFERENCIAL
Se estableci el lugar de trabajo con todas las reglas de aspticas (superficie
desinfectada con alcohol y la tcnica asptica con mecheros encendidos en forma de
tringulo) para prevenir la contaminacin en las muestras. Se tom la caja de Petri
donde se hizo la siembra de Agar Nutritivo en estra.
TINCIN DE GRAM: en un porta objetos se coloca una gota de agua, luego con el asa
previamente esterilizada en el mechero se tom una muestra del inoculo a teir
haciendo un frotis en forma circular, posteriormente se someti a fuego para fijar y se
dej secar.
A continuacin se realiz la tincin de Gram, donde se debi usar la parrilla para evitar
derrames y exceso de colorante en la muestra. Se utiliz Violeta de Genciana como
primer colorante, con una gota y dejando actuar durante un minuto y se lav con agua
de la llave. Inmediatamente se agreg lugol, cubriendo totalmente el frotis, se dej
actuar durante tres minutos, posteriormente se lav con alcohol. Finalmente se agreg
Safranina, colorante q se dej actuar durante treinta segundos, se lav con agua de la
llave y se dej secar.
Despus de hecha la tincin esta muestra se observ al microscopio enfocando los
diferentes objetivos hasta llegar al objetivo de inmersin, el cual se prepar con una gota
de aceite de cedro en el cubre objetos.
TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN: se tom un porta objetos donde se realiz un frotis de la
misma colonia; se utiliz de igual manera la parrilla para hacer la tincin. El frotis se
cubri con Fuscina de Ziehl-Neelsen y se pas por el mechero continuas veces hasta
que se vaporizo la Fuscina, luego de enfriarse se lav con agua de la llave. Despus el
frotis se cubri con alcohol acido al 3% durante un minuto, se lav nuevamente con agua
de la llave y se dej secar.
Despus de hecha la tincin esta muestra se observ al microscopio enfocando los
diferentes objetivos hasta llegar al objetivo de inmersin, el cual se prepar con una gota
de aceite de cedro en el cubre objetos.
TINCIN DE GIEMSA: se utiliz una muestra de sangre el cual se tom de una de las
compaeras; la gota de sangre se coloc en un extremo del portaobjetos y se puso en
contacto con uno de los bordes menores de otro portaobjetos y se dej que la sangre se
extendiera por capilaridad, se desliz suavemente hasta que se obtuvo un extendido
uniforme, luego se dej secar. La muestra se fij con alcohol de metilo durante 3
minutos; para la coloracin el extendido se le agrego el colorante de Giemsa, el cual se
dej actuar durante diez minutos, luego se lav con agua destilada estril y se dej
secar.
Despus de hecha la tincin esta muestra se observ al microscopio enfocando los
diferentes objetivos hasta llegar al objetivo de inmersin, el cual se prepar con una gota
de aceite de cedro en el cubre objetos
PRUEBAS BIOQUMICAS

Se prepar el lugar de trabajo con las normas microbiolgicas adecuadas (superficie
desinfectada con alcohol y la tcnica asptica con mecheros encendidos en forma de
tringulo).

PRUEBA TSI (AGAR TRIPLE AZCAR HIERRO) esta prueba se utiliz para detectar el
desdoblamiento de carbohidratos y produccin de sulfuro de hidrgeno. En el campo
estril se dispuso el cultivo de agar nutritivo de donde se sac la muestra con el asa
bacteriolgica previamente esterilizada y finalmente se sembr en forma de zigzag en el
tubo de agar ya preparado.

PRUEBA LIA (AGAR HIERRO LISINA) se utiliz para detectar la produccin de
enzimas lisina descarboxilasa y lisina deamisina, adems de produccin de sulfuro de
hidrogeno; el procedimiento fue el mismo de la prueba anterior.

PRUEBA DE CITRATO DE SIMMONS prueba que se utiliz para determinar que el
citrato es la nica fuente de carbono para metabolizar; la inoculacin fue de igual
manera que las dos primeras.

PRUEBA DE INDOL (CALDO TRIPTONA) medio lquido que se utiliz para determinar
la capacidad de desdoblar el Indol de la molcula Triptfano; se inocul el agua
Peptonada ligeramente, la cual se incubo durante 24 horas a 37C, pasadas las 24 horas
se le agreg 0.3-0,5mL del reactivo de Kovacs por las paredes del tubo, se dej
reposar y se observ el color del anillo.

PRUEBA DE AGAR DE UREA se utiliz para determinar la capacidad de
desdoblamiento de la urea; se inoculo el tendido y se incubo durante 24 horas a 37C.

PRUEBA DE LA CATALASA con esta prueba se comprob la presencia de la enzima
catalasa; en un portaobjetos limpio se realiz un frotis de la colonia a el cual se le agreg
una gota de perxido de hidrgeno al 30% y se observ la reaccin.

PRUEBA DE OXIDASA prueba que se utiliz para determinar la presencia de enzimas
oxidasas; en un porta objetos se realiz un frotis del inoculo y se aadieron 3 gotas del
reactivo de Kovacs.

PRUEBA DE LA COAGULASA prueba realizada para observar la presencia de la
enzima que causa la coagulacin del plasma sanguneo; en un tubo de ensayo ya
preparado con plasma, con un asa esterilizada previamente se le aadi un cultivo puro,
se incubo por pocos minutos a 37C y se observ.

PRUEBA DE MOTILIDAD (AGAR SIM) se utiliz esta para observar la presencia o
ausencia de flagelos en los microorganismos; en un tubo de agar semislido por mtodo
de puncin central con una aguja previamente esterilizada se inoculo la bacteria.

AGAR SANGRE se utiliz para identificar el tipo de hemolisis; en una caja de Petri con
agar sangre ya preparado se inoculo con un asa bacteriolgica previamente esterilizada.

PRUEBA PARA GRAM-POSITIVAS

PROTOCOLO BBL CRYSTAL en el tubo con la suspensin BBL Crystal ANR, GP,
RGP, N/H ID se depositaron las colonias, se tap y agito hasta lograr una turbidez dicha
en la gua; se verti todo el contenido del tubo de fluido de inoculo en el rea demarcada
de la base, con ambas manos se balanceo suavemente hasta que los pocillo se llenaron
del lquido, se alineo la tapa de modo que el extremo donde se encuentra la inscripcin
este sobre el rea demarcada de la base, por ltimo se presion hacia abajo hasta que
se sinti una leve resistencia, con los pulgares a cada lado del borde de la tapa del panel
se presion hacia abajo simultneamente hasta que la tapa asiente en su lugar.

ACTIVIDAD DE LOS ANTIBITICOS EN EL CRECIMIENTO BACTERIANO

SUSPENSIN MICROBIANA en agua destilada se diluyo parte de la cepa bacteriana
hasta lograr una turbidez del 10%.

PREPARACIN DEL MEDIO en cajas de Petri con agar Muller-Hinton se sembraron
con ayuda de un hisopo sin dejar espacio por toda la caja, se quem el hisopo despus
de usado y se desech, se colocaron los sensidiscos de. individuales sobre el agar
ya sembrado, estas placas se incubaron durante 24 horas a 37C. Se realizaron
observaciones durante 2 das y se midieron el dimetro de los halos de inhibicin de
crecimiento producidos por cada antibitico.

CURVA DE CRECIMIENTO
Por medio del agar sangre en el cual se inocula la bacteria se realiz una grfica de
crecimiento y se observ las diferentes fases.





RESULTADOS

Los clculos realizados para obtener las cantidades necesarias para la realizacin de los
medios de cultivo (agar nutritivo, agar Mac conkey) fueron los siguientes




En un medio de cultivo artificial se inoculo la muestra extrada de la cavidad bucal de
uno de los integrantes del grupo, de la cual se obtuvo una colonia con las siguientes
caractersticas morfolgicas:


Fig. 1. Colonia inicial en agar nutritivo








TABLA 1. Caractersticas morfolgicas de la colonia


Despus de realizada la siembra inicial, se escogi una colonia con la cual se trabaj,
con esta se realiz una siembra en agar nutritivo y agar mac conkey, las cuales se
realizaron por estra y por agotamiento respectivamente. Se observ crecimiento de la
colonia en ambos medios.

Fig. 2 a) agar nutritivo con la colonia seleccionada en la cual se realiz una siembra
por estra, b) agar mac conkey con la misma colonia en el cual se realiz una siembra
por agotamiento






FORMA BORDE ELEVACION SUPERFICIE

Circular

Entero

Convexa
Cremosa
invasiva
brillante
A
B
TINCION DIFERENCIAL
Por medio de la tincin de Gram se identific las bacterias de la colonia seleccionada,
como grampositivas, las cuales presentaban forma de cocos. En la figura nmero 3
se muestra la tincin realizada a las bacterias de la colonia seleccionada. Esta tincin
de Gram se fundamenta en que las bacterias grampositivas en su pared tienen una
capa de peptidoglucanos el cual tiene gran afinidad con el violeta de genciana. Aparte
de esta tincin de Gram se realiz tambin tincin de Ziehl-Neelsen para determinar
la presencia de micobacterias o bacterias asociadas a hongos la cual dio coloracin
azul para un resultado negativo para presencia de micobacterias. Se realiz un
extendido de sangre para identificar clulas sanguneas al cual se le realizo la tincin
de Giemsa, en el que se observ como resultado neutrfilos, eosinofilos y linfocitos.

Fig. 3 Tincin de Gram positiva para bacterias vista al microscopio en 100X.

Fig. 4 Tincin de Ziehl-Neelsen negativa para presencia de micobacterias vista al
microscopio en 40X

Fig. 5 Tincin de Giemsa para identificar clulas sanguneas en la cual se observan
neutrfilos y linfocitos, vistos al microscopio en 100X

PRUEBAS BIOQUIMICAS
Estas pruebas fueron realizadas con el objetivo principal de identificar una enzima
determinada presente en la bacteria en estudio, para estas pruebas los resultados
fueron los siguientes:
Prueba de motilidad o del agar SIM, la cual dio positiva para motilidad bacteriana
ya que se observ crecimiento extendido alrededor y debajo de la puncin realizada
en el medio de cultivo.
Prueba del Indol o caldo Triptona con esta prueba se determin la capacidad de la
bacteria de asimilar el triptfano, en esta prueba se observ un resultado negativo ya
que se form un anillo incoloro en el tubo de ensayo.
Prueba de la urea o agar urea se observ un resultado positivo para metabolismo de
la urea ya que se present un cambio de color de amarillo a rosado fucsia.
Prueba de la coagulasa, negativa al no observar presencia de coagulo. Prueba de la
catalasa positiva ya que se observ salida de oxgeno al momento de agregar el
perxido de hidrogeno.
Prueba de la oxidasa, en esta prueba no se produjo cambio de color alguno, lo cual
indica una reaccin negativa para presencia de enzimas oxidasas.
Prueba de la catalasa, prueba positiva ya que se formaron burbujas, lo cual afirma la
presencia de catalasa.


Fig. 6 prueba de motilidad o del agar SIM negativa


Fig. 7 Prueba del Indol o caldo Triptona



Fig. 8 Prueba de la urea o agar urea

Fig.9 Prueba de la coagulasa


AGAR SANGRE

Se realiz un cultivo puro de la bacteria en agar sangre, en el cual se determin si
la bacteria en estudio realizaba o no hemolisis de los glbulos rojos, esta prueba
arrojo como resultado una hemolisis beta la cual es observada como



Fig. 9 cultivo puro en agar sangre de la colonia seleccionada mostrando resultado
positivo para hemolisis beta.

ANTIBIOGRAMA

En la prueba de antibiograma se determin sensibilidad de la bacteria para los
siguientes antibiticos, gentamicina, eritromicina y ampicilina se tom medidas
diarias del halo de sensibilidad presente en cada sensidisco, para gentamicina el
halo de sensibilidad el da 1 fue de 0.4 mm, el da 2 fue de 0,9 mm, y el da 3 de
0.10 mm. Los dems sensidiscos que contenan eritromicina y ampicilina no
presentaron halo de sensibilidad lo que indico claramente que la bacteria en
estudio tiene una alta sensibilidad al antibitico gentamicina.




Fig. 11 cultivos en agar nutritivo con tres antibiticos diferentes de los cuales solo el
de gentamicina muestra un halo de sensibilidad.

Despus de investigar y analizar los resultados obtenidos a partir de todas las
pruebas realizadas para la identificacin de la bacteria con la cual se estaba
trabajando, se realiz una comparacin de las caractersticas morfolgicas
observadas, de los resultados de las tinciones, de las pruebas bioqumicas y del
antibiograma. Se logr identificar un gnero y a una especie, partiendo de las
caractersticas ms cercanas fue el gnero Micrococcus.

CURVA DE CRECIMIENTO

DISCUSIN

En un cultivo de agar nutritivo se sembr una muestra bucal, en el cual se obtuvo
un crecimiento optimo ya que se tuvieron en cuenta las propiedades fsicas y
qumicas, siendo las fsicas la temperatura, el pH y la presin osmtica y los
requerimientos qumicos incluyen las fuentes de carbono, nitrgeno, azufre, fosforo,
oligoelementos, oxgeno y factores de crecimiento orgnicos (Tortora, 2007).
La bacteria pertenece al gnero Micrococcus, es una bacteria ambiental que habita
en el suelo y agua. Se presenta en una colonia de color blanco grisceo en forma
redonda. Se caracteriza por tener forma de cocos gram positivos en pares, ttradas
y racimos pequeos. Son mviles, aerobios y presentan catalasa positivos.
Segn (Garca, 1998) su metabolismo es estrictamente respiratorio, donde la
glucosa es oxidada a acetato o es oxidada completamente a bixido de carbono y
agua.
Estas bacterias crecen en una temperatura de 25 a 30, por ello se clasifican en
mesofilos. En agar sangre crecen entre 24-48 horas tras la inoculacin, en colonias
de color grisceo.

Los mtodos utilizados para identificar la bacteria segn la literatura son llamados
mtodos fenotpicos ya que estn basados en las caractersticas fenotpicas, es
decir se basan en las caractersticas observables de las bacterias, como su
morfologa, crecimiento, y las propiedades bioqumicas y metablicas. El cultivo
fue la parte ms importante del proceso de identificacin ya que permiti el
aislamiento del microorganismo a estudiar, tambin fue muy importante la correcta
eleccin del medio de crecimiento y las condiciones de incubacin. Puesto que su
correcta realizacin permiti el aislamiento del microorganismo. La primer parte del
proceso de identificacin se dio con las tinciones las cuales mostraron la forma y la
manera de agruparse del microorganismo, la estructura del mismo y su tamao.
Por esta razn la tincin es el primer paso para la identificacin bacteriana. En
este caso las tinciones utilizadas fueron la tincin de gram y la de Ziehl-Neelsen. La
primera permiti clasificar los microorganismos seleccionados como grampositivos
y la segunda contribuyo a reconocer la ausencia de micobacterias o bacterias
asociadas a hongos las cuales no se encontraban presentes en nuestro cultivo.
Las pruebas bioqumicas contribuyeron con la identificacin de manera que
permitieron determinar las caractersticas metablicas de las bacterias objeto de
identificacin. Se evalu la presencia de una enzima ya que las pruebas que se
realizaron detectaron componentes metablicos o la sensibilidad de un
microorganismo a una Sustancia determinada. En este caso el microorganismo
mostro metabolismo de la urea y una reaccin positiva a la presencia de la
catalasa, adems en el cultivo realizado en el agar sangre se observ Hemolisis
beta, esto debido a que algunas bacterias producen hemolisinas que causan la lisis
de los hemates en medios que contienen sangre. Esta hemolisis puede ser beta
(zona clara alrededor de la colonia) o alfa (halo de color verdoso alrededor de la
colonia). El estudio de sensibilidad a los antimicrobianos fue el paso final en la
identificacin de la bacteria presente, ya que basados en esta informacin tambin
fue posible determinar la bacteria segn la sensibilidad a la gentamicina.


BIBLIOGRAFA


Joklik, W., Willett, P., Amos, B. & Wilfert, C. (1998) Zinsser Microbiologia. 20.
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