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T 11 MICROORGANISMOS MARCADORES
1. Causas de la contaminación del agua con microorganismos enteropatógenos. 2. Causas de la contaminación de los alimentos con microorganismos enteropatógenos. 3. Consecuencias de la contaminación fecal de las aguas. 4. Justificación del empleo de microorganismos marcadores de contaminación fecal en el control sanitario de aguas y alimentos. 5. Tipos de microorganismos marcadores existentes: microorganismos índice y microorganismos indicadores.

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José María Espinosa Bernal

1 CAUSAS DE LA CONTAMINACIÓN DEL AGUA CON MICROORGANISMOS ENTEROPATÓGENOS
El agua de las redes municipales de abastecimiento se obtiene de ríos, lagos y también de fuentes subterráneas. Es usada para beber, para el aseo personal y para la limpieza de alimentos, vajilla y prendas de vestir. De las mismas fuentes naturales se obtiene el agua usada en riegos agrícolas. Las fuentes naturales de donde se obtiene esta agua pueden contaminarse con aguas negras. Definición de aguas negras: entendemos por aguas negras aquellas aguas que entran en los sistemas urbanos de drenaje (desagües sanitarios y alcantarillado). Las aguas negras incluyen: • Aguas de origen natural que han entrado en los sistemas de drenaje (procedentes de ríos, lagos, pozos y agua de lluvia). • Aguas que han sido usadas por una comunidad humana. Estas aguas pueden estar formadas por aguas residuales domésticas (portadoras de excrementos, orina y residuos de lavado de piel, ropa y vajillas) y aguas residuales industriales y agropecuarias (ácidos, aceites, grasas, residuos orgánicos de mataderos, excrementos de vaquerías y granjas de pollos o cerdos, etc.). Estas aguas negras, hayan sido o no suficientemente purificadas, son vertidas finalmente en ríos y lagos o en el mar. De estos ríos y lagos (o embalses) que han recibido aportaciones de aguas negras se realizan tomas de agua para abastecer los municipios situados río abajo. Por otra parte, los agentes causantes de las enfermedades gastrointestinales se encuentran en las heces y en la orina de las personas y animales enfermos o portadores y al ser eliminados llegan a los sistemas de drenaje de aguas negras. Si la depuración es insuficiente o inexistente, estos microorganismos patógenos alcanzarán los ríos y lagos y después las redes de abastecimiento urbano y agrícola. De hecho, la contaminación fecal de aguas y alimentos es, con diferencia, la forma más importante de transmisión de enfermedades gastrointestinales.

2 CAUSAS DE LA CONTAMINACIÓN DE LOS ALIMENTOS CON MICROORGANISMOS ENTEROPATÓGENOS.

La contaminación de alimentos por estos microorganismos depende de causas relacionadas con la forma de elaboración o de limpieza de los mismos. En el caso de verduras y hortalizas, las aguas de riego contaminadas suelen ser la causa. Otros alimentos pueden haberse contaminado

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por haber entrado en contacto con aguas contaminadas durante su lavado o elaboración. Otros incluso, como es el caso de la mayonesa y otros derivados del huevo, pueden haber entrado directamente en contacto con materias fecales: varias especies de Salmonella forman parte de la flora intestinal normal de las aves de corral.

3. CONSECUENCIAS DE LA CONTAMINACIÓN FECAL DE LAS AGUAS.

En el pasado hubo graves infecciones gastrointestinales que azotaron a casi todas las zonas pobladas de nuestro planeta. Entre ellas podemos destacar la fiebre tifoidea (causada por Salmonella typhi) y el cólera (Vibrio cholerae), aunque hubo muchas otras, tales como la fiebre paratifoidea (Salmonella paratyphi)y la disentería bacilar (especies de Shigella). En la actualidad estas enfermedades están prácticamente erradicadas en los países desarrollados, a pesar de que el cólera haya reaparecido en países ribereños del Mediterráneo. Su erradicación se consiguió gracias a determinadas actuaciones sanitarias, tales como la depuración y cloración de aguas, etc. Una parte esencial del control sanitario de los suministros de agua ha sido el desarrollo de métodos microbiológicos que permiten detectar la existencia de contaminación fecal en aguas y alimentos.

4. JUSTIFICACIÓN DEL EMPLEO DE MICROORGANISMOS MARCADORES DE CONTAMINACIÓN FECAL EN EL CONTROL SANITARIO DE AGUAS Y ALIMENTOS.

Se podría suponer que las pruebas de calidad bacteriológica del agua y de algunos alimentos deben consistir principalmente en investigar la presencia o ausencia de microorganismos patógenos o sus toxinas. Sin embargo, esto no siempre es cierto, debido a que la mayoría de estos microorganismos patógenos son difíciles de detectar en el agua y alimentos. Las razones que hacen difícil su detección son las siguientes: a) Aislar bacterias enteropatógenas directamente de aguas contaminadas es difícil y costoso en tiempo y dinero. Cuando están presentes su proporción es escasa en términos absolutos, a menos que la contaminación a partir de individuos infectados haya sido reciente y masiva. Incluso en este caso pueden ser mucho menos abundantes que otras bacterias intestinales habitualmente no consideradas como patógenos. Como ejemplo citaremos que en las heces de un individuo afectado de salmonelosis es normal que por cada célula de Salmonella haya cientos

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o miles de células de otras bacterias que forman parte de la flora intestinal normal, tales como Escherichia coli, estreptocos fecales o Clostridum perfringens. En otras palabras, las células de microorganismos patógenos normalmente están acompañadas de una numerosa flora no patógena. b) Los patógenos llegan al agua de modo esporádico y normalmente no sobreviven mucho en ella, por lo que pueden no estar presentes en una muestra que llegue al laboratorio a pesar de que estén saliendo por el grifo de las viviendas. c) Identificar definitivamente a una única bacteria es laborioso y costoso, y incluye, en la mayor parte de los casos multitud de pruebas bioquímicas serológicas, etc. Antes se ha afirmado que la contaminación fecal de aguas y alimentos es, con diferencia, la forma más importante de transmisión de enfermedades gastrointestinales. Teniendo en cuenta esto y la citada dificultad de detectar directamente la presencia de microorganismos patógenos en agua y alimentos, se ha adoptado el criterio de considerar toda contaminación fecal como potencialmente peligrosa. La detección de la contaminación fecal del agua y alimentos es mucho más fácil que la detección directa de patógenos. La estrategia elegida de modo universal es el empleo de los llamados microorganismos marcadores.

5. TIPOS DE MICROORGANISMOS MARCADORES EXISTENTES:
MICROORGANISMOS ÍNDICE Y MICROORGANISMOS INDICADORES.
Llamamos microorganismo marcador a aquel cuya simple presencia o su abundancia superior a ciertos límites es signo de falta de salubridad del alimento analizado. Hay dos tipos de microorganismos marcadores: a) Microorganismos índice: son aquellos cuya presencia indica la posible existencia de patógenos ecológicamente relacionados (es decir, que suelan compartir el mismo ecosistema con el microorganismo utilizado como índice). Los más usados son los microorganismos índice de contaminación fecal, que son microorganismos cuya detección o recuento elevado permite afirmar que ha habido contaminación fecal en la muestra analizada. Para ser utilizado como marcador fecal un microorganismo tiene que cumplir estas condiciones: i. Tiene que ser un componente habitual y abundante de la flora normal intestinal.

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ii.

Debe sobrevivir fuera del intestino mejor que la mayoría de los patógenos (esto facilita su detección).

iii.

Su detección y recuento en el laboratorio no debe ser muy costosa en términos de tiempo, dinero y complejidad técnica.

b) Microorganismos indicadores: son aquellos cuya presencia en número anormalmente elevado en un alimento indica que ha habido al menos un fallo en el proceso de elaboración y manipulación. Entre estos fallos podemos citar: -tratamiento térmico insuficiente. -contaminación posterior al tratamiento térmico. -almacenamiento del alimento a temperatura demasiado elevada. Los siguientes microorganismos se utilizan como marcadores de contaminación fecal: Escherichia coli, estreptococos fecales (entre los que destacan los enterococos, uno de los cuales es el Streptococcus faecalis) y Clostridium sulfito-reductores (entre los que destaca el Clostridium perfringens). En lugar de investigar y hacer recuento específicamente de E. coli (coliformes fecales) pueden usarse las enterobacterias lactosa positivas (llamadas coliformes totales) o, de modo aún más general, las enterobacterias totales. Hay que tener en cuenta que cada índice tiene ventajas e inconvenientes distintos para cada tipo de muestra (agua potable de la red pública, agua minero-medicinal envasada, carnes, vegetales frescos o envasados, etc.) y que la legislación además suele obligar a analizar dos o más índices diferentes en una misma muestra. Un mismo microorganismo puede actuar como índice e indicador 5.1 Famila Enterobacteriaceae. Empleo de las enterobacterias totales como marcador. Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son gérmenes de forma bacilar, gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados y que crecen en medios que contienen sales biliares. De los integrantes de la familia, unos fermentan la lactosa y otros no. No fermentan lactosa Salmonella Shigella Proteus Yersinia Si fermentan Escherichia Enterobacter Serratia Kebsiella

Las enterobacterias totales son un indicador de contaminación fecal. Su recuento ha adquirido gran aceptación en Europa para evaluar la calidad sanitaria preferentemente de alimentos

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procesados. Su presencia a niveles altos en estos productos indica elaboración poco higiénica, contaminación posterior a su elaboración o ambas cosas. Con respecto a su poder patógeno, tenemos dos grupos. Enterobacterias de elevado poder patógeno. • • • • Salmonella Shigella (S. dysenteriae) Yersinia Alguna cepas de E. coli.

Enterobacterias oportunistas. • • • • Proteus Enterobacter Serratia Kebsiella

En productos frescos (no procesados) o con tratamiento insuficiente para eliminar la mayoría de las formas vegetativas es preferible el empleo de los coliformes totales o de E. coli como indicadores de contaminación fecal. Medios de cultivo empleados Entre los medios que se pueden utilizar tenemos: Para recuento, caldo EE Mossel, cuya característica principal es contener bilis de buey y verde brillante, que hacen que el medio sea selectivo. Además, el hidrato de carbono es la glucosa (no la lactosa), para que pueda se utilizado por todos los integrantes de la familia. • Para identificación: Agar biliado rojo violeta glucosa (VRBG): Que contiene, además de sales biliares y cristal violeta, un indicador de ph, el rojo neutro, que permite identificar las colonias. Estas tendrán un color rojo por la formación de ácido al fermentar la glucosa. También se puede utilizar como medio sólido para recuento. • Agar Hierro Kliger (KIA): Que permite, a partir de los diferentes resultados que se pueden obtener, identificar el tipo de microorganismo que tenemos. La temperatura utilizada en todos los casos es 37 ºC.

5.2 Empleo de las enterobacterias lactosa positivas totales como marcador. A un recuento de enterobacterias lactosa positivas se le llama también recuento de bacterias coliformes totales. Esto incluye los géneros:

Escherichia

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• • •

Enterobacter Klebsiella Citrobacter.

Hay miembros de este grupo que además de en el intestino de hombres y animales se encuentran también en suelo, plantas y otros ambientes. Su especificidad como indicador de contaminación fecal no es buena. Suelen usarse, sin embargo, como indicadores de contaminación fecal debido a: Su frecuencia en heces. Su fácil detección y recuento en el laboratorio. De hecho, el primer paso en el recuento de E. coli es un recuento de enterobacterias lactosa positivas. En determinados tipos de aguas y de alimentos sustituye o complementa al análisis de Escherichia coli. Medios de cultivo empleados Para recuento, caldo lactosado verde brillante, cuya característica principal es contener bilis de buey y verde brillante, que hacen que el medio sea selectivo. Además, contiene lactosa, lo que permite diferenciar a la bacteria que la fermentan mediante una campana de Durham. La temperatura utilizada será 37 ºC • Para identificación: Utilizamos EMB Levine, que contiene lactosa e indicadores que van a dar un color característico al microorganismo.

• •

5.3 Empleo de E. coli como marcador. E. coli es el microorganismo más abundante en el intestino humano y de muchos de los animales de sangre caliente. Como se reproduce con dificultad en otros ambientes distintos del intestinal, es suficientemente específico como para ser considerado un buen índice de contaminación fecal. Tiene el inconveniente de sobrevivir relativamente poco tiempo fuera del ambiente extraintestinal, por lo que su presencia indica contaminación fecal reciente. Estas son sus ventajas. A continuación estudiaremos sus inconvenientes. E. coli muere a temperatura de pasteurización y también al almacenarlo en frío, sobre todo a temperatura de congelación. Su escasa resistencia hace que no sea un buen indicador de la posible presencia de flora patógena: Salmonella es más resistente que Escherichia coli a las condiciones ambientales adversas (también al frío). Es por ello que en una muestra de un alimento contaminado con heces de ave puede haber Salmonella viables aunque en el análisis no se detecten Escherichia coli. Esto hace que a veces (alimentos congelados o con tratamientos térmicos, etc.) sea conveniente emplear otros marcadores, como estreptococos, clostridios

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sulfito-reductores (Clostridium perfringens y otros) o enterobacterias totales, donde aparecerán las Escherichia coli que puedan haber sobrevivido y también las Salmonella y todas las demás enterobacterias presentes. Otro inconveniente es su relativamente largo proceso de identificación y recuento. La E. coli suele usarse como microorganismo marcador en aguas, carnes, pescados, frutas y hortalizas, preferentemente frescos o refrigerados. Hay que tener en cuenta que no en todos estos alimentos está legislada la obligatoriedad de la investigación y recuento de E. coli, aunque es sanitariamente recomendable. Medios de cultivo empleados Para recuento, caldo lactosado verde brillante, cuya característica principal es contener bilis de buey y verde brillante, que hacen que el medio sea selectivo. Además, contiene lactosa, lo que permite diferenciar a la bacteria que la fermentan mediante una campana de Durham. Primero se suele realizar la técnica de enterobacterias lactosa positivas y de los tubos positivos se resiembra en otros con el mismo caldo pero en este caso la temperatura utilizada será 44 ºC, que es selectica para E. Coli • Para identificación: Utilizamos EMB Levine, que contiene lactosa e indicadores que van a dar un color característico al microorganismo. • Para confirmar se pueden hacer las pruebas INVC

5.4 Empleo de los Clostridium sulfito-reductores como marcador. Suelen emplearse para evaluar la calidad higiénica del agua y de productos animales o de origen animal. Su número es escaso en productos frescos. La capacidad de formar endosporas les da a estos microorganismos una gran resistencia. Uno de estos clostridios es el C. perfringens, que puede ocasionar intoxicaciones alimentarias y enteritis necrótica.

5.5 Empleo de los estreptococos fecales. Se llama estreptococos fecales a un grupo de especies de estreptococos clasificados serológicamente como estreptococos del grupo D (clasificación de Lancefield). Todas las especies de estreptocos fecales tienen en común el vivir en el intestino del hombre o de otros animales y estar presentes, por consiguiente, en las heces. A los estreptocos fecales humanos se les llama enterococos, de los cuales hay varias especies entre las que destaca el Streptococcus faecalis. Son un buen índice de contaminación fecal. Su utilidad en aguas está admitida desde hace tiempo. Por otra parte, su presencia en alimentos en cantidades elevadas indica falta de higiene o condiciones de conservación defectuosas. Los estreptocos fecales son muy resistentes a las

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condiciones adversas (congelación, desecación, tratamientos térmicos, etc.), por lo que, en general, se consideran adecuados para valorar las condiciones sanitarias y de conservación de alimentos sometidos a estos tratamientos. Sin embargo, aún hay algunas dudas sobre su utilidad en alimentos. Hay que indicar, sin embargo, que otras especies de estreptocos, tales como S. lactis, intervienen en fermentaciones usadas para producir alimentos, como el yogur. Medios de cultivo empleados Para el recuento se utiliza caldo de Rothe, que contiene azida sódica como agente inhibidor de la flora acompañante. • Para la identificación se utiliza el agar Slanetz y Bartley, que también contiene azida.

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