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MÓDULO DE PROYECTO

CFGS DE DIRECCIÓN EN SERVICIOS EN
RESTAURACIÓN
Cultura Biotecnológica
DEPARTAMENTO DE HOSTELERÍA Y TURISMO
Autor: Rafael Cánovas Ruiz
Tutor: Luis
MÓDULO DE PROYECTO
CFGS DE DIRECCIÓN EN SERVICIOS EN
RESTAURACIÓN
Cultura Biotecnológica del Cultivo de la Vid
DEPARTAMENTO DE HOSTELERÍA Y TURISMO
Autor: Rafael Cánovas Ruiz
Tutor: Luis Emilio Carmona Ruano
Murcia, junio 2014
CFGS DE DIRECCIÓN EN SERVICIOS EN
2
Índice
1. Introducción ............................................................................................... 4
1.1. La Biotecnología .............................................................................................. 4
1.2. Historia.............................................................................................................. 4
1.3. Importancia de la Biotecnología...................................................................... 5
1.4. Ventajas ............................................................................................................ 6
1.5. Inconvenientes ................................................................................................. 6
2. Cómo influye la biotecnología sobre la viticultura ................................. 7
2.1. Introducción.................................................................................................. 7
2.2. El Vino y su Producción................................................................................... 8
2.3. Barreras en la Implantación de Nuevas Tecnologías .................................. 11
3. Agentes biológicos que intervienen en la vinificación......................... 13
4. Las Bacterias: definición y tipos ............................................................ 14
5. Principales Bacterias que intervienen en la vinificación ..................... 15
5.1. Clasificación y Características de las Bacterias Acéticas........................... 15
5.1.1. Evolución en el vino.................................................................................................................16
5.1.2. Métodos de detección.............................................................................................................18
5.1.3. Sistemas de Prevención...........................................................................................................19
5.1.4. Conclusiones............................................................................................................................21
5.2. Clasificación y características de las bacterias lácticas ............................. 21
5.2.1. Bioquímica de la fermentación maloláctica.............................................................................22
5.2.2. Otros aspectos beneficiosos del metabolismo de las bacterias lácticas en el vino.................23
5.2.3. Posibles perjuicios de las bacterias lácticas en los vinos.........................................................23
5.2.4. Carbamato de etilo..................................................................................................................24
5.2.5. Causas de no realización o retrasos de la fermentación maloláctica......................................25
6. Hongos: definición y tipos...................................................................... 26
7. Levaduras y fermentación ...................................................................... 27
7.1 Fisiología de la fermentación ......................................................................... 29
7.1.1 Saccharomyces cerevisiae, la estrella.......................................................................................29
7.1.2 Contribución al color ................................................................................................................30
7.1.3. Parámetros básicos para una mejor gestión...........................................................................30
7.2. Una levadura para cada tipo de vino ............................................................ 31
7.2.1. La huella genética....................................................................................................................31
7.2.2. La evolución de la Saccharomyces: hibridación.......................................................................32
7.2.3. Como se trabaja.......................................................................................................................33
7.3. Modificación genética de levaduras vínicas................................................. 33
7.3.1. Utilización de levaduras seleccionadas en la vinificación........................................................34
7.3.2. Mejora genética de levaduras vínicas......................................................................................35
3
7.4 Desarrollo de nuevas levaduras más eficientes ........................................... 37
7.4.1. Mejoras para las denominaciones de origen...........................................................................39
8. Conclusiones finales ............................................................................... 39
Anexo I ............................................................................................................ 41
Anexo II ........................................................................................................... 43
Anexo III .......................................................................................................... 45
Anexo IV.......................................................................................................... 48
Anexo V........................................................................................................... 49
Bibliografía...................................................................................................... 50
Webgrafía........................................................................................................ 52
4
1. Introducción
Antes de empezar a hablar sobre la biotecnología aplicada a la viticultura,
explicaremos que es la biotecnología como concepto general, veremos cuáles
son las ventajas y desventajas que tiene su aplicación, y analizaremos la
importancia y la repercusión que tiene hoy en día. Entender primero que es la
biotecnología nos ayudará a entender mejor las aplicaciones que tiene dentro
del mundo de la viticultura y por qué es tan necesaria.
1.1. La Biotecnología
La biotecnología es una tecnología utilizada por el hombre desde hace miles de
años y consiste principalmente en estudiar y aprovechar los mecanismos e
interacciones de los seres vivos, en especial los unicelulares. La biología y la
microbiología son las dos ciencias que conforman la base en la que se asienta
la biotecnología ya que son las herramientas esenciales con las que trabaja
pero no son las únicas. Veterinaria, medicina, química, física, ingeniería,
ecología, agronomía, virología y genética entre otras también son disciplinas de
la ciencia a las que recurre la biotecnología. La biotecnología hoy en día tiene
multitud de usos, pero donde se emplea ampliamente es en agricultura,
farmacia, ciencia de los alimentos, medio ambiente y medicina.
La Organización para la Cooperación y Desarrollo Económicos (OCDE) define
la biotecnología como la “aplicación de principios de la ciencia y la ingeniería
para tratamientos de materiales orgánicos e inorgánicos por sistemas
biológicos para producir bienes y servicios”.
El ingeniero húngaro Károli Ereki fue el primero en acuñar este término en
1989, al cual hizo referencia en su libro Biotecnología en la producción cárnica
y láctea de una gran explotación agropecuaria.
1.2. Historia
El uso de la biotecnología tiene su origen en el período del Neolítico cuando los
seres humanos empiezan a formar asentamientos sedentarios, criar ganado y
cultivar. A lo largo de todo este proceso que se prolongó durante miles de años,
los humanos modificaron las características genéticas de los cultivos y de los
animales que criaban. Para ello creaban o buscaban entornos que reuniesen
una serie de características especiales en los cuáles las plantas o los animales
que crecían y se desarrollaban en estos ambientes artificiales se veían
obligados a adaptarse modificándose así su propio ADN. Más tarde, se
seleccionaban a los mejores especímenes para crear una nueva generación de
plantas o animales con el fin de acercarse un poco más al producto final que se
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deseaba conseguir. En el caso de las plantas estas fueron modificadas para
incrementar su rendimiento, mejorar su sabor y alargar la campaña de cultivo.
Mucho más tarde, en 1830, Friedrich Theodor Schwann y Matthias Jakob
Schleiden formularon juntos la teoría celular. Esta estipulaba que todo ser vivo
está compuesto por células y en su interior se encuentran los cromosomas que
contienen a su vez el material genético hereditario (ADN).
En el siglo XX, se hicieron descubrimientos de gran importancia en cuanto a
genética se refiere. Las leyes de la herencia de Mendel junto con el estudio de
la biología vegetal han permitido una gran evolución y mejora de las plantas.
Los descubrimientos de Louis Pasteur en los campos de la medicina y
microbiología industrial también supusieron un aporte importante.
El 90% de las especies vegetales destinadas al consumo humano que se
producen en la actualidad en todo el mundo, han sufrido modificaciones
genéticas y pasado por procesos de hibridación a lo largo de miles de años por
parte de innumerables generaciones de agricultores decididos a obtener
cosechas de la manera más eficaz y eficiente posible.
En definitiva, el objetivo que busca alcanzar la biotecnología no es otro que el
de satisfacer las necesidades de los consumidores que demandan productos
de más calidad, seguridad y sabor; satisfacer las necesidades de los
agricultores que buscan nuevas formas de incrementar la productividad y
aumentar el margen de beneficios; y satisfacer también las necesidades de los
gobiernos o instituciones privadas que tratan de acabar con el hambre en el
mundo, asegurar el futuro del medio ambiente, preservar la biodiversidad y
garantizar la salubridad y la seguridad de los alimentos.
1.3. Importancia de la Biotecnología
El bienestar humano y la estabilidad social están directamente relacionados
con los procesos naturales de la Tierra que sustentan la vida. Es indispensable
asegurar la calidad del aire y del agua, disponer de suelos productivos y una
biodiversidad rica en flora y en fauna para asegurar nuestra calidad de vida
actual y la de nuestros descendientes en el futuro.
Por desgracia, nos encontramos en una situación en la que la población ya
está sobre explotando los recursos de la Tierra. Si a este hecho le sumamos
que para el año 2030 la población mundial se habrá duplicado para alcanzar
cerca de los diez mil millones de habitantes, llegaremos a la conclusión de que
nos encontramos ante un problema al que hay que buscarle soluciones con
carácter de urgencia. La humanidad debe responder a las crecientes presiones
que se ejercen sobre los recursos naturales de la Tierra para poder alimentar a
una población que se encuentra en una continua expansión.
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Por tanto y teniendo en cuenta que se estima que las innovaciones
biotecnológicas van a triplicar el rendimiento de las cosechas sin requerir
tierras de cultivo adicionales, diremos que la biotecnología se convertirá en la
herramienta que nos permitirá salvar los bosques naturales y el hábitat de los
animales. Además otras innovaciones podrían reducir o eliminar la
dependencia en agroquímicos que contribuyen a la degradación del medio
ambiente, mientras que otras nos ayudarán a preservar el suelo y los recursos
hídricos.
En conclusión, la importancia que tiene la investigación y el desarrollo de la
biotecnología y su aplicación en la agricultura es totalmente innegable. La
mayoría de los expertos están de acuerdo en que el mundo no se puede
permitir el lujo de esperar más. Si actuamos ahora podremos cubrir las
necesidades futuras de la humanidad, podremos alimentar al mundo durante
los siglos venideros y mejorar la calidad de vida de la población mundial.
1.4. Ventajas
 Se obtiene un rendimiento superior. Los cultivos de plantas transgénicas
proporcionan más alimento utilizando menos recursos, se reduce el
número de cosechas perdidas por enfermedad o plagas, así como por
factores ambientales.
 Se reduce el empleo de plaguicidas. Los cultivos de plantas
transgénicas son más resistentes a las plagas contribuyendo así a
reducir el uso de plaguicidas que suelen ser causantes de grandes
daños a la salud y al medio ambiente.
 Se consigue un mayor aporte de nutrientes en nuestra alimentación. Los
productos obtenidos a partir de cultivos transgénicos pueden contener
niveles más altos de vitaminas o proteínas que los productos
convencionales, así como niveles menos elevados de alérgenos y
toxinas naturales. Además, su predisposición genética permite cultivar
este tipo de productos en lugares del planeta donde las condiciones
climáticas y del entorno son extremas, permitiendo así que países que
tienen menos recursos puedan abastecer a la población local.
 Permite mejorar el desarrollo de nuevos materiales.
1.5. Inconvenientes
 Disminución de la mano de obra a consecuencia de la mecanización;
esto genera desempleo y éxodo rural en muchas áreas.
 El acceso a las nuevas tecnologías supone una inversión de capital que
no está alcance de todo el mundo, excluyendo así a los agricultores más
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pobres que no pueden acceder a estos recursos impidiendo su
modernización y dejándolos en peores condiciones para competir con
las producciones modernas.
 Los cultivos transgénicos, aunque existen diferencias de opiniones entre
los expertos, pueden suponer un grave riesgo medioambiental y para la
salud.
2. Cómo influye la biotecnología sobre la
viticultura
Una vez que ya sabemos en qué consiste la biotecnología y comprendemos la
gran relevancia que tiene a la hora de ser aplicada en el sector agrario, nos
encontramos en disposición de estudiar cual es la relación que tiene con la
viticultura y cómo influye en la misma.
2.1. Introducción
La elaboración de vino es un proceso muy antiguo y los restos arqueológicos
sumerios hallados en Mesopotamia que datan de hace unos 6.000 a 8.000
años así lo demuestran. Con lo cual, la implicación de la biotecnología, es
decir, la utilización de organismos vivos en procesos industriales, que tiene en
el vino, supuso un factor clave en el desarrollo de las primeras grandes
civilizaciones. Aunque durante la mayor parte de la historia, la base de estas
prácticas biotecnológicas fuera puramente empírica.
Casi todos los pueblos de la Tierra hicieron en la antigüedad descubrimientos
similares a los de los sumerios. El vino se inventó seguramente hace 6.000
años en la zona del monte Ararat. Sin embargo, los más recientes hallazgos
remiten a los chinos como los descubridores del vino hace 9.000 años (véase
anexo I), en la Edad de Piedra. Los antiguos griegos y romanos sentían una
gran predilección por el jugo fermentado de las uvas, el vino. Los romanos
fueron, pues, lo que llevaron el desarrollo y la fabricación del vino al Rhin y
Mosel.
Hasta hoy, la forma de producir vino no ha cambiado demasiado (véase anexo
II): de uvas rojas y blancas, tras la vendimia, se obtiene por aplastamiento y
presión (prensas de vino) el mosto de la uva. Este jugo filtrado fermenta en
barriles cerrados. Antes eran barriles de madera, hoy se utilizan tanques de
acero inoxidable con capacidad de hasta 250.000 litros. Mundialmente se
producen cada año alrededor de quinientos millones de hectolitros.
Durante el proceso de elaboración del vino, el azúcar se transforma en alcohol
a través de la fermentación (véase anexo III) que es el resultado final del
metabolismo de las levaduras. Un 2 o un 3% de alcohol cambia la
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permeabilidad (fluidez) de la membrana citoplasmática de las bacterias e inhibe
con ello su crecimiento. En los climas calurosos de Oriente, el medio de
fermentación inhibidor de microbios es una ventajosa, si no decisiva, cualidad
higiénica. Gracias a la agricultura la población creció enormemente. El agua
potable limpia resultó de repente un problema, como también sucedió en el
siglo XIX en Europa. Los productos de la fermentación, cerveza, vino y vinagre,
estaban, sin embargo, exentos de gérmenes peligrosos. Incluso se podían
elaborar con agua potable ligeramente contaminada, porque no solo el alcohol
sino también los ácidos orgánicos inhibían a los patógenos existentes. El agua
no colmó, pues la sed de nuestros antepasados, sino la cerveza, el vino y el
vinagre. La biotecnología más antigua del mundo era nutritiva, estimulante y
también segura –un avance revolucionario, que debió ser sencillamente
favorable.
En la actualidad y en consecuencia de los avances científicos de los últimos
150 años principalmente, el conocimiento empírico está siendo sustituido por
un adecuado conocimiento de los procesos que rigen estas transformaciones
biotecnológicas. La importancia de la biotecnología en la industria vitivinícola se
ve reflejada en el creciente número de países que han creado centros
específicos de biotecnología aplicados a la industria del vino: España, Francia,
Italia, Australia, Nueva Zelanda, Sudáfrica, Canadá, EEUU, etc. La creación de
estas infraestructuras es un claro reflejo de la importancia que esta área del
conocimiento tendrá, a medio y largo plazo, en la industria.
Sin embargo, los productos vitivinícolas, así como el resto de alimentos
destinados al consumo humano, están sujetos a las exigencias y desafíos
actuales de calidad, seguridad y sostenibilidad medioambiental. Es por esta
razón por la que la gestión planificada, proactiva y centrada en los
requerimientos, cada vez más exigentes de clientes y países, se ha convertido
en imprescindible. Sin embargo, el sector de la industria alimentaria abarca una
serie de características especiales, tanto sociales, culturales, turísticas,
técnicas, científicas y culinarias, que comprenden prácticamente todas los
estratos de la sociedad y el grueso de la mayor parte de la historia de la
humanidad. Son precisamente estas características especiales las que hacen
que la aplicación de los avances tecnológicos o de gestión, entre otros, sean
muy específicos.
2.2. El Vino y su Producción
Desde mi punto de vista, el empleo de la biotecnología en el proceso de
elaboración del vino da como resultado una de sus manifestaciones más
hermosas. La agricultura de la vid y el cuidado de las condiciones para que las
fermentaciones se lleven a cabo adecuadamente durante la elaboración del
vino son procesos biotecnológicos muy antiguos.
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Existe un gran abismo entre la tecnología disponible y la tecnología empleada
en el sector vitivinícola, la ausencia de control microbiológico en el proceso de
elaboración y producción del vino es un claro ejemplo de ello. Y aunque es
cierto que en los últimos veinte años se han producido avances en el sector
vitivinícola relacionados con la biotecnología, la transferencia de conocimientos
y tecnología no se ha llevado a cabo correctamente, los avances han sido
pocos y se han ido incorporando muy lentamente.
En el caso de las actividades vitivinícolas, ciertos trabajos estudian esta tensión
entre las nuevas tecnologías agronómicas adoptadas en la etapa agrícola y los
saberes tácitos de los productores (Bocco, y cols, 2007; Bell y Giuliani, 2007).
Un aspecto que refuerza esta tensión es el rol que han jugado los avances
recientes en la biología molecular en las tecnologías de fermentación.
En la industria vitivinícola, el cambio tecnológico venía determinado por su
incorporación en bienes de capital y por los saberes artesanales de los
enólogos en la selección de las cepas de levaduras utilizadas en la
fermentación. No obstante, la acumulación de capital exige avanzar en la
industrialización de estos procesos a fin de asegurar, por un lado, la producción
a gran escala y por el otro, reducir los tiempos de rotación del capital. La
biotecnología abre nuevas oportunidades en este sentido, a partir de la
identificación, selección y finalmente modificación de las levaduras y bacterias
que cumplan con estos objetivos. Esto requiere la ampliación de las
capacidades y de los conocimientos en biología molecular que no todas las
industrias (y empresas) tienen posibilidad de integrar.
El 90%, aproximadamente, de las bodegas españolas son susceptibles a los
avances biotecnológicos que aportan las investigaciones tanto de las empresas
dedicadas a este tipo de desarrollo como los centros públicos. Por el contrario,
únicamente el 25% de las bodegas mantienen líneas para mejorar sus vinos a
partir de biotecnología enológica.
Aunque pueda sonar extraño, la biotecnología enológica tiene aplicaciones
reales en el sector. Gracias a la biotecnología, las bodegas pueden trabajar con
levaduras que optimicen la calidad de los vinos (por ejemplo, que trabajen en
frío, eliminen problemas de reducción o defectos del vino); se cuenta también
con enzimas que lleven a la extracción de color y que sea estable; o con
técnicas de biología molecular para ver cómo actúan las levaduras.
Uno de los temas “candentes” en la actualidad es la producción de
manoproteínas, que ayudan a mejorar el volumen y la estabilidad de los vinos.
Son moléculas naturales de las que se conoce ya su eficacia por parte de los
enólogos. Otra línea actual en los laboratorios biotecnológicos dedicados a la
enología es la selección de levaduras para eliminar defectos o que marquen
más la fruta, con capacidades enzimáticas potentes.
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La industria de la viticultura destina una cuarta parte de sus recursos
económicos a la investigación y desarrollo. Sin embargo, el reparto de recursos
es diferente. El 90% de las bodegas utilizan la biotecnología como recurso pero
solo un 25% tienen líneas propias de investigación.
Durante la realización de este estudio se pudo observar como algunas bodegas
dejan fermentar el mosto de forma espontánea para que sean las levaduras
autóctonas las que hagan el trabajo. Se les deja actuar sin tener el más mínimo
conocimiento de su naturaleza y en ocasiones surgen problemas; menos
graves como la aparición de aromas no deseados o la ausencia de aromas o
sabores positivos que se podían encontrar en vinos de otros años, o problemas
realmente graves como paradas o ralentizaciones de la fermentación.
Por lo general, no suelen haber paradas, pero los resultados de los análisis
científicos revelan que la presencia y la concentración de levaduras
comerciales en el proceso de fermentación del vino varía enormemente de una
bodega a otra o de un año a otro. Con concentraciones altas de levaduras
comerciales se obtienen vinos bastante más homogéneos pero se pierde
tipicidad. Además no se potencian los aromas que residen escondidos en las
levaduras autóctonas de la propia viña.
El sostenimiento de calidades homogéneas de una campaña agrícola a otra, la
reducción de tiempos de fermentación y el control de desarrollos microbianos
no deseados constituyen problemas técno-económicos cruciales en este tipo
de industrias.
Por ello, las innovaciones en levaduras, bacterias y enzimas posibilitan mejorar
la calidad sostenida en el tiempo y responder a las crecientes exigencias de
diferenciación. Las innovaciones en nuevas levaduras posibilitan controlar la
acción de procesos de fermentación espontánea, con efectos sobre la calidad
que son altamente impredecibles. No obstante, existen segmentos industriales
cuya estrategia se basa en la renovación de sabores bajo condiciones
espontáneas de desarrollo de microorganismos durante la fermentación. Este
es el caso de las bodegas boutique que optan por tecnologías artesanales,
asumiendo los riesgos de la viabilidad del producto. En los segmentos
industriales intensivos a gran escala, la lógica de acumulación exige procesos
rápidos y confiables de fermentación, esenciales para lograr vinos con gustos
consistentes y calidad predecible, reduciendo al mismo tiempo, los tiempos de
rotación de capital. En estos casos se recurre a cepas de levaduras
comerciales seleccionadas (levaduras de la especie Saccharomyces
cerevisiae) y al desarrollo de enzimas (Véase anexo IV).
De esta forma, se asiste a una tensión entre la trayectoria tecnológica
preexistente, asociada a una base estrictamente empírica limitada por el
desconocimiento de las características a nivel molecular de los
microorganismos y de su metabolismo, y los avances de la biología molecular,
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con el mayor conocimiento de los procesos que rigen las transformaciones en
el proceso de fermentación.
Existen técnicas diferentes a las basadas en el ADN recombinante que utilizan
la biología molecular para la identificación, diferenciación y seguimiento de los
microorganismos involucrados en los procesos fermentativos, apoyadas en
técnicas convencionales de selección (Anexo IV).
Cambiando ligeramente de contexto, observamos que en las bodegas donde
se elaboran vinos mediante crianza biológica, finos o manzanillas, se sabe que
las levaduras que forman el velo de flor son distintas en cada bota. Por esta
razón, como bien saben ya los profesionales de las bodegas de Jerez o
Sanlúcar de Barrameda, hay botas que desprenden mejores aromas que otras.
Botas donde el vino envejece de manera distinta, mejor, con más cuerpo,
inevitablemente este vino acabará mezclándose con el resto de botas, donde
no se encuentran estas características. Sería interesante conocer qué clase de
levaduras son las responsables de las características distintivas de la bota
buena y de esta manera conseguir que el resto de botas cuenten con la
presencia de estas mismas levaduras para obtener un mejor producto más
uniforme o acelerar la crianza y conseguir así una mayor calidad en un tiempo
más reducido.
Un mayor control microbiológico permitiría a las bodegas identificar y
diferenciar las distintas clases de levaduras que confluyen en la fermentación
del vino. Hoy en día contamos con un extenso catálogo de técnicas de biología
molecular que sirven a este efecto y que solo falta que las bodegas empiecen a
aplicar.
2.3. Barreras en la Implantación de Nuevas Tecnologías
El sector bodeguero y vitivinícola es un sector muy tradicional que aún no es
plenamente consciente de la importancia que tiene la aplicación de la
biotecnología en sus sistemas de producción. La administración pública ha
hecho un gran esfuerzo en las últimas décadas para implantar un modelo de
transferencia tecnológica destinado a la innovación y aumento de la
competitividad de las empresas. Sin embargo, la falta de inercia que este
modelo tiene en nuestro país se debe fundamentalmente al poco calado que ha
tenido entre sus destinatarios. La ausencia de una comunicación adecuada
entre investigadores y empresas ha ayudado a que esto sea posible. No
obstante, la administración pública considera que los investigadores y las
empresas se deben reunir para abordar estrategias conjuntas que permitan
acelerar el proceso de llevar el conocimiento y las innovaciones tecnológicas a
los usuarios. Lamentablemente, son pocas las ocasiones en las que esto
sucede impidiendo de esta forma desarrollar proyectos conjuntos que puedan
llevarse a una fase de explotación de resultados exitosa.
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Ambas partes se siguen viendo como agentes totalmente independientes.
Cuando los investigadores consideran a las empresas como entidades
totalmente ajenas que alivian la falta de personal científico en el sistema
español de I+D+i a cambio de unos cuantos análisis, los proyectos de
desarrollo tecnológico y transferencia de conocimientos acaban fracasando.
Por otro lado, cuando son las empresas las que ven a los investigadores como
instrumentos para conseguir subvenciones de I+D+i y justificar departamentos
de I+D+i formados por una habitación vacía, entonces los proyectos de
desarrollo tecnológico y transferencia de conocimientos terminan fracasando.
Si hasta el momento la mayoría de los proyectos de desarrollo tecnológico y
transferencia de conocimientos en el sector vitivinícola no han cuajado en la
innovación de las bodegas, habrá que empezar a preguntarse en cuantos
casos se partió de la premisa adecuada y en cuantos casos se partió de las
absurdas concepciones de cada agente anteriormente citadas.
A pesar de que las capacidades y el nivel en general de nuestros científicos es
bastante bueno, son muchos los factores que quedan fuera de este estudio y
que han dado lugar a que la cultura científica no haya calado en nuestra
sociedad al mismo nivel que en otras que viven más pendientes de la ciencia y
los descubrimientos que se hacen en este campo. Y al igual que los
ciudadanos, las empresas no tienen una relación fluida con el mundo científico.
Esta situación supone un importante obstáculo para que las empresas
depositen su confianza en los científicos como fuente de soluciones efectivas.
También impide que las empresas maduren aspectos clave de la planificación
de estrategias para solucionar problemas de carácter financiero, como
evaluación de casos de éxito, gastos asociados, tiempo estimado de
recuperación del dinero invertido, adecuado seguimiento de las actividades,
etc. Por tanto, para eliminar esta barrera es necesario que exista un mayor
acercamiento entre el mundo empresarial y la ciencia, y que se creen iniciativas
que fomenten el contacto entre estos dos mundos. Para alcanzar este objetivo
podrían crearse centros tecnológicos que sirvan como lugar de encuentro y
nexo permanente de empresarios, en este caso del sector agroalimentario, y
científicos. En este tipo de centros las empresas tendrían la posibilidad de
acceder a los últimos avances tecnológicos y acceder a toda la información
relacionada con su sector. Del mismo modo, los científicos tendrían la
posibilidad de entender y analizar junto a las empresas cuales son los
problemas sobre los que se debe actuar para dar con soluciones más efectivas
y acordes con su magnitud.
La Asociación Española de Bioempresas (ASEBIO) llevó a cabo hace unos
años, durante la última legislatura Socialista, una iniciativa que recibió fondos
del Ministerio de Industria, Comercio y Turismo, y que consistía en la
realización de diagnósticos tecnológicos y desarrollo de planes de implantación
de soluciones biotecnológicas en sectores consolidados.
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Las conclusiones que se obtuvieron de esta iniciativa, denominada
Innoempresa, fueron de lo más interesantes. Se pudo apreciar, por ejemplo,
que el sector más activo en cuanto a participación fue el agroalimentario, lo que
indica que este sector está especialmente necesitado de biosoluciones. Más
concretamente, el sector bodeguero tuvo una participación muy activa en las
jornadas sectoriales organizadas por ASEBIO y algunas bodegas participaron
también en las jornadas como receptoras de diagnósticos y planes de
implementación durante el desarrollo del programa. Y aunque las bodegas
tenían claras sus necesidades, fue realmente complicado hacer que
comprendiesen los conceptos científicos básicos que apoyaban las
biosoluciones planteadas. Debían entender que la ciencia y la tecnología
cambian a un ritmo vertiginoso, lo que hace que sea vital para el futuro de las
empresas estar pendientes de las últimas novedades y actualizar tanto sus
equipos como los conceptos de trabajo.
La formación continua y el reciclaje de los profesionales del sector vitivinícola
facilitaría la apertura de debates y la creación de mesas de negociación entre
los centros productores de conocimiento y las empresas con el fin de impulsar
un mayor número de iniciativas innovadoras de transferencia de tecnología.
Las universidades, por ejemplo, podrían hacerse eco de esta necesidad e
implantar cursos de formación continua destinados a profesionales de
empresas de su entorno en sectores clave.
Las bodegas, tanto las que ya están consolidadas como los pequeños
productores que necesiten innovar o resolver problemas para adaptarse a
nuevas situaciones pueden acudir a cualquiera de las empresas de base
tecnológica especializadas en el sector que han proliferado durante los últimos
años. Donde además podrán exponer sus problemas y recibir soluciones en un
lenguaje entendible, o reflexionar sobre temas concernientes al sector con
técnicos especializados en la materia.
3.Agentes biológicos que intervienen en la
vinificación
A continuación y después de haber explicado cual es la relación que vincula la
biotecnología con el mundo del vino, nos centraremos y hablaremos de los
principales protagonistas responsables directos de la vinificación que no son ni
más ni menos que un grupo de fungidos y de bacterias.
Los hongos que encontramos en este proceso pertenecen al grupo de las
levaduras que son las que se encargan de la fermentación alcohólica. Y dentro
del grupo de las bacterias encontramos que son las bacterias lácticas las que
se encargan de la fermentación maloláctica. Así mismo, también contamos con
un grupo de bacterias llamadas acéticas que se encargan de estropear el vino.
14
4. Las Bacterias: definición y tipos
Antes de centrarnos en las bacterias acéticas que son unos de los organismos
principalmente responsables de intervenir de forma negativa en el proceso de
elaboración del vino, o de las bacterias lácticas que por el contrario resultan
beneficiosas y hacen una gran aportación positiva, repasaremos el concepto de
bacteria de una forma general para así comprender mejor su interacción con el
mosto de la uva.
El primer concepto que hay que saber y tener en cuenta sobre las bacterias es
que son procariotas, es decir, su información genética no está localizada en un
núcleo celular sino que se encuentra libre en el citoplasma como ADN de doble
hebra en forma de anillo.
Les faltan los típicos orgánulos subcelulares de las eucariotas (levaduras,
células de plantas y animales superiores), como las mitocondrias (para la
respiración celular) o los cloroplastos (para la fotosíntesis) y el retículo
endoplasmático.
Las bacterias viven predominantemente de modo heterótrofo, es decir, captan
su energía de la materia orgánica. Sin embargo, también existen algunos tipos
que pueden captar energía fotosintéticamente o de enlaces inorgánicos (por
ejemplo azufre) mediante quimiosíntesis.
Entre las bacterias hay unicelulares móviles e inmóviles (por ejemplo pequeños
bacilos), pero también pluricelulares, por ejemplo asociaciones celulares del
género Nocardia y redes similares a hilos de hongos (micelios) del tipo de
Streptomyces.
A los bacilos y cocos gramnegativos aeróbicos pertenecen Pseudomonas
(utilización de hidrocarburos, oxidación de esteroides) y Acetobacter (formación
de ácido acético), Rhizobium (oxidación del nitrógeno) y Methylophilus
(proteína unicelular, oxidación de metanol).
Los bacilos gramnegativos anaeróbicos facultativos son, por el contrario, las
bacterias intestinales Escherichia coli, los “animales de compañía” del ingeniero
genético.
Bacilus (producción de enzimas) y Clostridium (producción de acetona y
butanol) pertenecen a los bacilos y cocos grampositivos formadores de
esporas.
Los cocos grampositivos son los formadores de ácido láctico, como
Streptococcus, Staphylococcus (intoxicación de alimentos), Propionibacterium
(vitamina B12, preparación de queso), Nocardia (oxidación de hidrocarburos) y
estreptomicetos (antibióticos, enzimas).
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Lactobacillus (formación de ácido láctico) se encuentra entre las bacterias
grampositivas no formadoras de esporas.
Las bacterias producen un gran daño al causar enfermedades y estropear
alimentos, pero sin embargo también tienen un enorme significado económico
en los procesos biotecnológicos.
5. Principales Bacterias que intervienen en
la vinificación
5.1. Clasificación y Características de las Bacterias Acéticas
En primer lugar hay que señalar que en los últimos tiempos la clasificación de
las bacterias acéticas ha variado enormemente. Esto se debe a la constante
modernización de los equipos que emplean los científicos en los laboratorios y
que obligan a revisar esta clasificación periódicamente. Actualmente podemos
encontrar bajo el nombre de bacterias acéticas al grupo de bacterias
pertenecientes a los siguientes géneros: Acetobacter, Acidicaldus, Acidiphilium,
Acidisphaera, Acidocella, Acidomonas, Asaia, Belnapia, Craurococcus,
Gluconacetobacter, Gluconobacter, Kozakia, Leahibacter, Muricoccus,
Neoasaia, Oleomonas, Paracraurococcus, Rhudopila, Roseococcus,
Rubritepida, Saccharibacter, Stella, Swaminathania, Teichococcus y Zavarzinia.
Dentro del mundo enológico, las especies más conocidas son Acetobacteraceti,
Acetobacter pasteurianus y Gluconobacter oxydans. Otras especies que
también han sido asociadas a las uvas y al mosto son Gluconacetobacter
hanseni (Du Toit y Lambrechts 2002; Du Toit y Pretorius 2002).
Para entender cómo actúan estas bacterias en el vino y saber por qué afectan
tan negativamente al resultado final, es importante que sepamos primero que
son. Las bacterias acéticas son un grupo de microorganismos presentes de
forma natural en el mosto y que pueden causar problemas durante la
elaboración y el envejecimiento del vino. Las BA son metabólicamente activas
desde el momento en que se inicia el desarrollo de la uva en el campo hasta
que el vino llega al consumidor, generando una serie de compuestos no
deseados que tendrán consecuencias en la calidad del producto final. En un
proceso que se da sobre todo en las bayas, las bacterias acéticas pueden
convertir la glucosa y fructosa en ácido glucónico y oxofructosa,
respectivamente. De igual manera, las BA pueden metabolizar algunas
hexosas como manitol, manosa o ribosa.
A todo hay que sumar que su asociación con las levaduras de la uva, pueden
producir ácido acético y acetaldehído, lo que incrementa la acidez volátil del
mosto. La acumulación de estos metabolitos suele depender de la cepa, del
estado de la uva y de la concentración de los diferentes azúcares. Al igual que
16
en el caso de las levaduras, la población de las BA es mayor cuando la uva
está dañada, ya que las bacterias pueden acceder fácilmente al interior de la
uva, rica en nutrientes.
Por otro lado tenemos que en la bodega, la consecuencia más conocida de la
actividad de las BA es el picado acético del vino. Este proceso se caracteriza
por la oxidación del etanol en ácido acético, lo que puede elevar la acidez
volátil del vino hasta valores de 0,8 g acético/l. Esto tiene consecuencias
organolépticas de sobra conocidas por todos los enólogos. La velocidad de
este proceso está determinada por la especie, la cantidad de BA presentes en
el vino y por las características del vino. En las BA, este proceso metabólico se
favorece cuando la concentración en oxígeno es baja.
Durante el proceso de transformación del etanol a ácido acético se puede
obtener un metabolito intermedio llamado acetaldehído y que se puede
encontrar libre en el medio. La concentración de este compuesto varía mucho
entre los diferentes tipos de vinos, pero puede llegar a valores de 200 mg/l.
Como norma general, podemos decir que se produce acetaldehído cuando hay
poco oxígeno disuelto en el medio y cuando la concentración de etanol es alta;
justo las condiciones que se dan en el vino. Sensorialmente, el acetaldehído da
un carácter oxidado al vino a partir de 50 mg/l.
Hay que tener en cuenta que las BA pueden utilizar también el glicerol como
fuente de carbono, generando principalmente dihidroxiacetona. De esta
manera, se reduce en el vino la concentración de glicerol obtenido durante la
fermentación alcohólica. También se pueden incrementar los niveles de acetato
de etilo y de acetoína, lo que aporta al vino aromas similares a la mantequilla.
Sin embargo, los efectos negativos en el sabor no son los únicos efectos que
causados por los compuestos resultantes del metabolismo de las BA. Algunos
compuestos, como la dihidroxiacetona, el acetaldehído y la 5-oxofructosa,
actúan como compuestos quelantes (secuestrantes) del dióxido de azufre,
reduciendo la concentración de SO2 libre en el medio y debilitando el poder de
acción antimicrobiana y antioxidante de este aditivo. Las bacterias del género
Gluconobacter son grandes productores de este tipo de compuestos (Barbe y
cols., 2001). Y para terminar mencionaremos que algunas BA tienen la
capacidad de liberar en el vino cadenas de polisacáridos, lo que incrementa su
viscosidad y filtración del mosto y del vino.
5.1.1. Evolución en el vino
A continuación estudiaremos brevemente cuál es la evolución que sufren las
BA a lo largo del proceso de elaboración del vino ya que es muy importante
tener una serie de conceptos claros para entender cómo podemos actuar sobre
estos pequeños microorganismos y evitar así defectos en el producto final.
17
En primer lugar hay que saber que las bacterias acéticas representan
aproximadamente más del 68% del total de las bacterias presentes en la uva
en el momento de la recogida, dependiendo del estado sanitario general de
ésta (Barbe y cols., 2001). Actualmente no existe un consenso entre los
investigadores y no se ponen de acuerdo en cómo se desarrolla la evolución de
las diferentes poblaciones de bacterias acéticas durante los primeros días de la
vinificación. Para González y cols. (2004), el número de BA crecía nada más
comenzar la vinificación, mientras que para Joyeux y cols. (1984) este
descendería (Ver tabla 1). Sin embargo, ambas investigaciones coinciden en
que la concentración de BA desciende drásticamente durante la fermentación
alcohólica. Pero finalmente, la concentración de BA se mantiene estable y por
debajo de los 1.000 CFU/ml a lo largo de la fermentación maloláctica y la
crianza en barrica.
Las bacterias acéticas son aerobias
obligadas, lo que significa que necesitan
oxígeno en el medio para su crecimiento y su
actividad metabólica. Durante la fermentación
alcohólica, el oxígeno presente en el mosto
se agota a gran velocidad, lo que mantiene a
la población de BA bajo control. Sin embargo,
cualquier tratamiento que incluya agitación u
oxigenación favorecerá el crecimiento de las
BA. En la tabla 1, hay un ejemplo del efecto
de las operaciones de vinificación sobre las
poblaciones de bacterias acéticas. Tras el
trasiego, cuando el vino se oxigena, se
observa que el número de células capaces
de formar colonias se multiplica por 1.000.
Al comenzar la fermentación maloláctica
pueden superar los 105 CFU/ml, lo que
conlleva a un aumento en los niveles de
concentración de ácido acético (Gonzáles y
cols., 2005). Datos similares se han obtenido
en experimentos a escala de laboratorio
(Joyeux y cols., 1984). Con respecto a la
guarda, los mismos autores han propuesto que la tasa de penetración del
oxígeno en la barrica (unos30 mg/l por año) es suficiente para mantener
poblaciones pequeñas de bacterias acéticas.
A lo largo de la vinificación se puede observar como la especie de BA
predominante en el medio es una u otra dependiendo de la fase en la que se
encuentre o de las características del mismo entorno. En las uvas sanas, por
ejemplo, la población de bacterias acéticas inicial estaría compuesta
CFU/ml
Mosto 16.000
Fermentación alcohólica
Tras 3 días 3.000
Tras 7 días 100
En el día 10
Antes del trasiego 20
Tras el trasiego 30.000
Fermentación maloláctica
Al comienzo 400
Al final (3 meses) 120
Envejecimiento en barrica
Tras 4 meses 160
Tras 6 meses 900
Tras 9 meses 600
Tras 11 meses 600
TABLA 1. Evolución de la
población de bacterias acéticas
durante la elaboración de vino
tinto (adaptado de Joyeux y cols,
1984).
18
fundamentalmente por G.oxydans, mientras que las uvas con botrytis también
acogen cepas de A. aceti y A. pasteurianus (González y cols., 2005; joyeux y
cols., 1984). En el mosto, al principio de la fermentación, predominan cepas de
G. oxydans, pero desaparece tras la fermentación alcohólica debido a la poca
resistencia al etanol de esta bacteria (Gonzáles y cols., 2004; Drysdale y Fleet,
1989). Al final en la fermentación contamos con la presencia de cepas de A.
aceti y de A. pasteurianus, ya que presentan gran resistencia al etanol y a las
condiciones de microaerobiosis.
5.1.2. Métodos de detección
En este apartado veremos algunos de los métodos más conocidos que existen
para detectar la presencia de bacterias acéticas en el vino que se esté
produciendo. Algunos de estos métodos de detección son el sistema GYC, el
sistema Manitol o el sistema Agar carbonato. Sin embargo, el empleo de estos
sistemas clásicos de detección pueden acarrear una serie de inconvenientes,
sobre todo en muestras procedentes de vinagres. Cuando Bartwosky y cols.
(2003) intentaron aislar bacterias acéticas a partir de vino embotellado,
comprobaron que no se reproducían en los medios más comunes para las
bacterias. Es por ello que se han desarrollado técnicas de doble capa de agar y
ácido acético que presentan unas condiciones generales en el medio
favorables para su reproducción (Entani y cols., 1985).
Hasta no hace mucho, la clasificación de las bacterias acéticas se hacía en
función de sus características fenotípicas, como la apariencia y la fisiología. Sin
embargo estas características pueden variar entre cepas de la misma especie
de BA, lo que complica su identificación y obliga a realizar muchas pruebas.
Actualmente, la mayoría de las especies bacterianas se clasifican de acuerdo a
la secuencia del gen 16S. Este gen, como ya sabemos, se encuentra junto con
el resto de genes presente en el ADN de las bacterias. Otras zonas que se
suelen estudiar son las comprendidas entre los genes 16S y 23S.
Es curioso ver como en el caso de las bacterias acéticas, se da una situación
especial. El gen 16S es una zona que conserva muy bien los rasgos a nivel de
especie, lo que permite de una forma eficaz la identificación de las BA para
Poblet y cols. (2000) y para Ruiz y cols. (2000), mientras que para Trcek y cols.
(2000) esta zona estaría excesivamente conservada. Por otra parte la zona
16S-23S presenta una secuencia muy variable, demasiado variable para Ruiz y
cols. (2000) pero sin embargo, para Trcek y cols. (2002), esta zona es la
apropiada.
También existen otros genes como el gen adhA que se han investigado como
posibles objetivos para discriminar las especies pero los resultados obtenidos
no han mejorado con respecto a los obtenidos en los fragmentos 16S y 23S
(Trcek, 2005). Recientemente, se han desarrollado métodos de real-time PCR
para cuantificar bacterias acéticas que, según los investigadores, pueden
19
detectar niveles de 10 células/ml (Gammon y cols., 2007; González y cols.,
2007). Estas investigaciones han permitido a los laboratorios de análisis
desarrollar técnicas de detección e identificación rápida para las bacterias
acéticas presentes en el vino, ayudando a los enólogos a evaluar el riesgo de
picado acético de sus vinos.
5.1.3. Sistemas de Prevención
Como ya hemos visto anteriormente, las condiciones que se dan en el vino no
impiden el desarrollo y proliferación de las bacterias acéticas. Estas bacterias
resisten altas concentraciones de etanol, se desarrollan adecuadamente en
temperaturas de entre 18 y 30 ºC, a partir de los 10 ºC inician su actividad
metabólica, y ni el pH del vino ni las concentraciones de dióxido de azufre
(SO2) habitualmente utilizadas en bodega impiden su proliferación.
Actualmente, no se conoce ningún sistema que permita, a nivel industrial,
eliminar las BA de una bodega, y mucho menos de la uva. Pero podemos
frenar su proliferación hasta niveles peligrosos, evitando las consecuencias
negativas que repercuten en el vino. Los puntos clave que hay que tener en
cuenta para tener bajo control la actividad de las BA son:
- El oxígeno. Este es el auténtico factor que delimita su crecimiento. La
ausencia de oxígeno no acaba con las bacterias, pero impide su normal
desarrollo y afecta de manera importante a su metabolismo. Así pues, el
riesgo de contaminación crece con los tratamientos que oxigenan el
vino, los que retrasan la fermentación y los que permiten al mosto entrar
en contacto con el aire. Por esta razón, es de gran importancia iniciar la
fermentación alcohólica con prontitud, terminarla de la forma correcta y
ser cuidadoso con los tratamientos que recibe el vino durante la
fermentación y la guarda.
- La limpieza y desinfección de las instalaciones, incluyendo
maquinaria, depósitos, barricas, botellas y demás elementos de las
bodegas. De esta manera, reduciremos la concentración de BA inicial y
la presencia de cepas resistentes. Llevar a cabo este proceso en
superficies porosas, como pueden ser el interior de las barricas, entraña
mayor dificultad.
- Las uvas suelen estar contaminadas con BA. Sin embargo, la
concentración de BA es mayor en uvas dañadas que en uvas sanas, por
lo que la utilización en el proceso de vinificación de uvas en buenas
condiciones higiénicas permite reducir los niveles iniciales de BA.
- Los ni veles de azúcar residual deben estar bajo control en los vinos,
ya que con niveles altos de azúcar residual se aumenta la probabilidad
20
de que aparezcan bacterias perjudiciales capaces de alterar al producto
dando como resultado un producto de poca calidad.
- El embotellado es uno de los momentos clave para evitar la
proliferación de bacterias acéticas durante el envejecimiento del vino ya
que la transmisión de oxígeno, y con ello la actividad de las bacterias
acéticas, va a depender del tipo de material en el que envasemos
nuestro vino. Así pues, el uso de materiales plásticos (PET o formatos
tipo Bag-in box) se ha visto limitado por su alta transmisión de oxígeno a
través de este material pero actualmente se está investigando para
mejorar este aspecto.
- El tipo de corcho que se emplee en el embotellado afectará en gran
medida a la calidad del vino. El corcho natural presenta unos niveles
bajos de porosidad frente al oxígeno, lo que favorece la conservación del
vino. Sin embargo permite la entrada de cantidades justas de aire para
que respire el vino y consiga un mejor sabor de envejecimiento. Por otro
lado, los tapones sintéticos flojos pueden hacer que el oxígeno se filtre
en el vino y, como resultado, que la bebida se avinagre. El corcho
convencional, además, es un material que no se expande. Las botellas
de vidrio suelen contraerse o expandirse dependiendo de la temperatura
y los únicos que se adaptan a estos mínimos movimientos son los
corchos naturales.
- El almacenamiento y el transporte. Un espacio excesivo entre el
corcho y el vino, tras el embotellado, puede estimular la actividad de las
bacterias acéticas. Así mismo, almacenar la botella verticalmente y con
el tapón hacia arriba, o almacenarla a temperaturas inadecuadas, puede
favorecer el picado del vino. Diversas investigaciones apuntan a que las
BA son muy poco activas a temperaturas por debajo de 10ºC.
Una vez ha comenzado, el picado acético echará a perder casi con total
seguridad el vino dejándonos un escaso margen de actuación para revertir la
situación. En el caso de que la contaminación se encuentre en fase inicial, se
puede intentar una filtración esterilizante, seguida de una sulfitación adecuada
y la guarda del vino en botellas perfectamente limpias. Si la contaminación está
en un grado avanzado, donde la concentración de acético es alta y se percibe
con facilidad, el vino es difícilmente recuperable y deberíamos pensar en
destinarlo a la elaboración de vinagre o destilación.
Por último, me gustaría llamar la atención sobre ciertas prácticas tecnológicas
que se dan en el mundo del vino y que favorecen el crecimiento y la actividad
de estas bacterias. Entre ellas, están la baja sulfitación del mosto, el abuso de
los trasiegos, la falta de filtración, el uso de corchos de mala calidad, los
retrasos en el rellenado de cubas y todos los tratamientos que implican un
retraso en la fermentación alcohólica o la oxigenación excesiva del vino. Un
21
claro ejemplo es la aireación, que aunque es una práctica que facilita el
correcto desarrollo del color del vino, también posibilita la proliferación de
bacterias acéticas. Es labor de cada enólogo por tanto, analizar los pros y
contras de estas prácticas de acuerdo al vino que quiere obtener, apoyándose
en las técnicas actuales disponibles para detectar y cuantificar el desarrollo de
las bacterias que pueden echar a perder un buen vino.
5.1.4. Conclusiones
Nuestros vinos no están a salvo ni en las barricas ni en las botellas. Visto de
forma general, las BA están presentes desde el momento en que se recoge la
uva, pueden sobrevivir durante la vinificación y aguantan el embotellado y la
guarda del vino. Pero contamos con la ventaja de que necesitan oxígeno para
desarrollarse y reproducirse. Así pues, una correcta selección de la uva, un
proceso de vinificación correcto y el cuidado durante el embotellado ayudarán a
reducir el nivel de concentración inicial de bacterias acéticas e impedirán su
crecimiento. Para evitar el picado acético del vino, debemos prestar especial
atención a la limpieza e higiene en nuestras bodegas, a los tratamientos que
pueden oxigenar el vino y al mantenimiento de las condiciones de anoxia
durante la vinificación. Al tratar con las BA y haciendo alusión al refranero
español, prevenir es primordial ya que curar es casi imposible.
5.2. Clasificación y características de las bacterias lácticas
La principal fermentación del vino es la alcohólica, producida por las levaduras.
Ahora bien, como el mosto y los recipientes donde tiene lugar la vinificación no
son estériles, aparte de las levaduras (autóctonas o comerciales) también hay
otros microorganismos, como las bacterias acéticas y las bacterias lácticas. El
papel beneficioso más conocido de las bacterias lácticas en los vinos es la
fermentación maloláctica, que da lugar a una desacidificación del vino.
Las bacterias lácticas o bacterias del ácido láctico son bacterias grampositivas
de bajo contenido en G+C. Tienen en común el hecho de producir ácido láctico
a partir de azúcares, debido a su metabolismo exclusivamente fermentativo,
sobre todo la fermentación láctica. Por eso son anaerobias, aunque también
toleran la presencia de oxígeno. Son, por tanto, anaerobias aerotolerantes.
Desde el punto de vista metabólico, tienen unos requerimientos nutritivos
complejos (aminoácidos, vitaminas, etc.)
El número de bacterias lácticas presentes durante la fermentación alcohólica
normalmente es muy bajo, como mucho 100 por ml, ya que la mayoría son
inhibidas por el etanol y por el SO2 añadido al mosto para controlar la población
bacteriana, especialmente las acéticas. Cuando la alcohólica termina y las
levaduras mueren, algunas bacterias lácticas pueden prosperar y conseguir un
cierto crecimiento, en ocasiones, hasta 10 millones por ml. Estas bacterias
lácticas producen algunas transformaciones en el vino, de las cuales la más
22
interesante es la llamada fermentación maloláctica (FML). Las bacterias
lácticas que se pueden aislar en muestras de mostos y vinos son de los
géneros Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Weisella y, sobre todo, de
Oenococcus oeni (véase anexo V).
5.2.1. Bioquímica de la fermentación maloláctica
El papel más beneficioso conocido de las bacterias lácticas en los vinos es la
FML, que da lugar a una desadificación del vino. El mosto de la mayoría de las
uvas, excepto los de climas muy cálidos, contienen una cierta cantidad de
ácido L-málico (1-5 g/l), que tiene un sabor fuerte y áspero. Normalmente,
después de la fermentación alcohólica, si bien muy ocasionalmente de forma
simultánea a esta, las bacterias lácticas como O.oeni pueden realizar esta
FML, que es la descarboxilación de L-málico en L-láctico, con desprendimiento
de CO2 que aparece como pequeñas burbujas en el vino. Esta reacción es
llevada a cabo porque dichas bacterias tienen la enzima maloláctica, que
requiere MN++ y NAD+. Como el málico es dicarboxílico y el láctico es
monocarboxílico, esto conlleva una reducción de la acidez, de 0,1 a 0,5
unidades de pH.
Desde el punto de vista metabólico, la FML no es una fermentación clásica
como la misma láctica donde se utilizan azúcares como sustratos y obtienen
ATP por fosforilación a nivel de sustrato en las reacciones de la glucólisis. La
FML solamente es una descarboxilación que no parece que conlleve, en
principio, ningún beneficio energético a las células que la realizan, y donde el
único beneficio aparente sería la subida del pH externo. Sin embargo, se ha
descubierto que la FML es una de las fermentaciones peculiares con ATP
sintasa, ya que la salida del L-láctico de las células se efectúa mediante un
simport con protones, y que paralelamente hay una entrada de protones a favor
de gradiente (el pH externo es 3-4 y el interior es superior a 6), mediante una
ATP sintasa, que lo acopla a la síntesis de ATP.
Así pues, O.oeni puede obtener algunos ATP por la descarboxilación del málico
en un medio como el vino donde prácticamente no hay azúcares. Estos ATP,
junto con algunos nutrientes remanentes de los restos de las levaduras,
pueden permitir un ligero crecimiento de estas bacterias en el vino.
Desde el punto de vista enológico, esta desadificación del vino conlleva al
mismo tiempo una mejora en su calidad, al reducir la sensación de aspereza
del málico. Además, el ácido L-láctico que aparece es más agradable y suave
al gusto de cualquier paladar.
23
5.2.2. Otros aspectos beneficiosos del metabolismo de las bacterias
lácticas en el vino
Un aspecto interesante desde el punto de vista enológico consecuencia de la
pequeña subida de pH de la FML es que el color del vino tinto, debido sobre
todo a los antocianos como la malvidina, evoluciona hacia tonalidades menos
intensas y no tan rojas, lo que los hace más interesantes visualmente.
Desde el punto de vista organoléptico, la FML conlleva una mejora del vino
porque además de la desacidificación, el desarrollo de las bacterias provoca
cambios en los contenidos de los diversos compuestos orgánicos del vino.
Aparte del L-málico, el cítrico es otro importante ácido orgánico metabolizado
por las bacterias lácticas del vino. Se ha comprobado que O.oeni, al igual que
muchas otras bacterias, capta el citrato y lo metaboliza dando lugar a diversos
compuestos. De todos estos, el diacetilo se considera el más importante por su
aroma a mantequilla o nata (aromas lácteos) que caracteriza a muchos vinos
que han realizado FML. Aparece en pequeñas concentraciones (hasta 2mg/l)
aunque tiene un umbral de detección sensorial muy bajo. El diacetilo se forma
químicamente por descarboxilación oxidativa del alfa-acetolactato, un
intermediario inestable. Por otro lado, en función de las condiciones, el diacetilo
puede ser utilizado por las mismas bacterias convirtiéndolo en acetoína y 2,3-
butanodiol, mucho menos aromáticos.
Las bacterias lácticas del vino también pueden producir pequeñas cantidades
de exopolisacáridos, que se unen con los taninos, responsables de la
astringencia de los vinos jóvenes, con lo cual baja la astringencia y el vino se
vuelve más agradable.
Otro beneficio muy importante es la estabilidad microbiológica que se consigue
con la FML. Los vinos donde esta ha tenido lugar pueden ser embotellados sin
el riesgo de un posible desarrollo bacteriano posterior, que podría dar lugar a la
formación de CO2. Las bacterias lácticas agotan el málico y otros nutrientes
como los azúcares, con lo cual es mucho más difícil el crecimiento posterior de
otras bacterias.
5.2.3. Posibles perjuicios de las bacterias lácticas en los vinos
En algunas ocasiones, el desarrollo de las bacterias lácticas puede tener
consecuencias negativas para la calidad de los vinos. Afortunadamente, la
mayoría de estos casos se producen de forma muy esporádica, sobre todo
cuando ha habido otros problemas previos a la fermentación o de poco control
de la vinificación.
De estos posibles perjuicios, el más frecuente es el picado láctico, debido a la
producción bacteriana de una cierta cantidad de láctico y también de acético.
Cuando en el vino hay azúcares residuales que las levaduras no hayan
24
consumido por diversos problemas de paradas de la fermentación alcohólica,
las bacterias pueden consumirlos y proliferar, haciendo la fermentación láctica
y, por tanto, produciendo láctico. En este caso se produce D-láctico, mientras
que en la FML a partir de L-málico aparece L-láctico. Dado que Oenococcus,
Leuconostoc y algunos Lactobacillus (como L.brevis y L. hilgardil) hacen la
fermentación heteroláctica, además de láctico producen ácido acético a partir
de azúcares. Sin embargo, las especies homofermentativas como Pediococcus
y otros lactobacillus también pueden producir ácido acético a partir de
pentosas.
En algunos vinos poco ácidos, la FML llevada a cabo por las bacterias lácticas
puede dar lugar a una desacidificación excesiva, lo que no es conveniente
porque parte del carácter del vino se pierde si es poco ácido y, además, el pH
más alto puede favorecer el crecimiento de otras bacterias prejudiciales.
Solo hay dos compuestos en el vino que puedan ser tóxicos para los humanos
y sean debidos a las bacterias lácticas: las aminas biógenas y el carbamato de
etilo. Las aminas biógenas pueden llegar ocasionalmente en algunos vinos a
más de 10 mg/l y su consumo puede comportar varias patologías, desde
migrañas hasta trastornos cardíacos. Las principales aminas biógenas
asociadas al vino son la putrescina, histamina, tiramina y cadaverina. Son el
producto de la descarboxilación de diferentes aminoácidos presentes en el
vino. Se han caracterizado diversas especies de bacterias lácticas como
productoras de aminas biógenas, que incluyen L. hilgardii, L. brevis, L. buchneri
y Pediococcus parvulus. Dichas especies son consideradas como
contaminantes durante el proceso de vinificación, por lo que generalmente la
aparición de aminas biógenas se asocia a falta de higiene en las prácticas
enológicas. Algunas cepas de O. oeni también pueden producir ciertas
cantidades de aminas biógenas como histamina y, en menor grado, putrescina,
aunque las especies mayoritariamente responsables de elevados contenidos
de estas aminas biógenas en vino son L. hilgardii y P. parvulus. La detección
de los genes que codifican los enzimas responsables de la producción de
aminas biógenas, como el de la histidina descarboxilasa (hdc) en el caso de la
histaminas, puede ser una herramienta para la selección de cepas de O. oeni
que carezcan de estos genes.
5.2.4. Carbamato de etilo
Otro compuesto tóxico, el carbamato de etilo, cancerígeno de carácter
genotóxico, es detectado en algunos vinos en concentraciones muy bajas
(unos 20 μg/l). Aunque el principal precursor del carbamato de etilo en vino por
reacción con el etanol es la urea excretada por las levaduras, otros precursores
del carbamato de etilo que también reaccionan con el mismo son los productos
de degradación de la arginina (como la citrulina) por parte de diversas especies
de bacterias lácticas mediante la vía de la arginina deiminasa (ADI). O. oeni
25
presenta una capacidad variable de degradación de arginina y los genes de la
ruta ADI se encuentran en gran cantidad de sus cepas. Sin embargo, algunas
cepas de especies consideradas contaminantes, como L. brevis y L. buchneri,
acumulan mayores cantidades de citrulina que O.oeni.
Por otra parte, se ha comprobado que el ácido L-málico inhibe el consumo de
arginina. Así pues, un buen control del momento de finalización de la FML e
inmediata estabilización del vino es clave para evitar el consumo de arginina y
la posible acumulación de precursores de carbamato de etilo.
5.2.5. Causas de no realización o retrasos de la fermentación maloláctica
El vino es un medio hostil para los microorganismos, en general, y para las
bacterias lácticas en particular. A diferencia del mosto que es un medio rico en
componentes nutritivos (fundamentalmente azúcares), el vino es un medio
mínimo, y con los problemas agravantes de contener etanol, que es un buen
antimicrobiano, tener un pH relativamente ácido, y con una cierta concentración
de sulfuroso añadido durante la vinificación.
El pH del vino es uno de los principales factores que afectan al comportamiento
de las bacterias lácticas. Si bien su pH óptimo es alrededor de 4,5, pueden
efectuar la FML a pH normales de los vinos (alrededor de 3,5), pero tienen
muchas dificultades a pH inferiores a 3,2. En cuanto el etanol, por encima del
10%, la reducción de la actividad de la FML ya empieza a ser manifiesta, dando
lugar a retrasos en su finalización cuanto más etanol tiene el vino, si bien esta
influencia depende mucho de las cepas. Así pues, O. oeni se caracteriza por
ser más resistente, a diferencia de varios Lactobacillus que resultan más
afectados. En cualquier caso, la concentración máxima de etanol que permite
la realización de la FML es del 15% (v/v).
En los últimos años, se han realizado numerosos estudios sobre la respuesta
de O. oeni a los factores de estrés asociados al vino, como el elevado
contenido en etanol o el bajo pH. En este sentido, han sido caracterizadas
diversas proteínas de estrés, como Hsp18, y reguladoras como CtsR. Han sido
también descritos otros mecanismo que ayudan a O. oeni a sobrevivir en
condiciones desfavorables en función de las condiciones del medio y del
estado de crecimiento. Respecto a la respuesta al pH ácido, los genes
involucrados serían los relacionados con la degradación de ácidos presentes
en el vino, como el málico y el cítrico, asociados a bombas de protones que
ayudan a mantener la homeostasis del pH interno. El sistema ATPasa de
membrana responde a la demanda de transporte de protones acoplada al
catabolismo de sustratos, con la consiguiente producción de energía para la
célula. Así pues, la actividad ATPasa y los mecanismos asociados a esta,
como la propia FML, contribuirían a evitar la acidificación del medio interno
favoreciendo el crecimiento celular.
26
Respecto a la toxicidad del etanol, esta se asocia al aumento de permeabilidad
de la membrana celular a modificaciones en la composición lipídica. El
aumento de la permeabilidad supone un incremento del transporte pasivo hacia
el interior de la célula, provocando una acidificación del medio interno. Así
pues, los mecanismos que contribuyen a la respuesta al pH ácido estarían
también relacionados con la tolerancia al etanol. Por otra parte, los cambios
físicos y de composición en la membrana celular son cruciales para la defensa
contra agentes de estrés externos.
La respuesta asociada al estrés es variable dependiendo de la cepa de O. oeni
y se ha observado que los niveles de transcripción de determinados genes
puede ser un indicador del comportamiento metabólico durante la FML de
dichas cepas.
6. Hongos: definición y tipos
Antes de empezar a hablar de las levaduras que son las responsables de la
fermentación del azúcar del mosto de la uva en alcohol, primero hablaremos de
los hongos para entender mejor el comportamiento y el funcionamiento de las
mismas.
Los hongos desempeñan un papel destacado en los ciclos de la naturaleza,
sobre todo en los procesos de descomposición de la materia orgánica. Se han
clasificado hasta ahora aproximadamente 70.000 hongos. Las levaduras
pertenecen, como todos los hongos, a las células eucariotas, es decir, su
material genético está concentrado en un núcleo celular. Son hongos
productores de esporas (endomicetos).
A partir de las levaduras salvajes se obtienen cultivos de levaduras que tienen
un gran significado industrial, como las levaduras de cerveza (por ejemplo
Saccharomyces carlsbergensis), levaduras de vino y de pan (S. cerevisiae) y
levaduras del forraje (Candida). Candida utilis crece sobre las aguas residuales
de sulfito de las fábricas de celulosa como levadura de forraje. Candida
maltosa se alimenta de alcanos (parafinas) del petróleo y puede generar
forraje. Trichosporon cutaneum es un importante aeróbico que se encuentra en
aguas residuales, que incluso puede degradar fenol –un veneno para otros
hongos. Trichosporon y las levaduras Arxula adeninivorans se utilizan como
sensores microbianos en aguas residuales.
Los mohos pertenecen a los mohos con sacos esporales o esporangios en
forma de manguera (ascomicetos), que con 20.000 tipos es el grupo
mayoritario de los hongos. Tienen, en contraste con las levaduras
redondeadas, largas células estiradas, y viven principalmente estrictamente
aeróbicos. Los mohos forman esporas asexualmente mediante división de los
núcleos celulares de los sacos esporales, que en general se expanden en el
27
aire del micelio. Las esporas maduras se propagan con facilidad con el viento.
Si caen en un sustrato apropiado, germinan y forman nuevos micelios.
Muchos hongos se clasifican según su apariencia (morfología) y el color de sus
sacos esporales (esporangios), porque el micelio generalmente es difícil de
distinguir, pues es incoloro y representa un desorden en forma de tubo. Puesto
que los hongos más importantes industrialmente se introducen (sumergen)
principalmente en tanques como grumos móviles de micelios, no forman
esporas.
En cuanto a la alimentación, los mohos son similares a las levaduras, aunque
se tratan más versátilmente. Así, algunos pueden –en contraste con las
levaduras– crecer también sobre celulosa (Trichoderma reesi) o lignina
(Phanaerochaete chrysosporium).
Los mohos del género Asperggillus (mohos con esporangios en forma de
regadera) y Penicillium (mohos con esporangio en forma de pincel) son la base
para muchas fermentaciones, particularmente para la degradación del almidón
y las proteínas en la cebada, el arroz, y las habas de soja.
Otros mohos con esporangio en forma de pincel ayudan a producir quesos
como el camembert y el roquefort. Las amilasas y proteasas generadas por
hongos se obtienen también como preparados enzimáticos industriales.
7. Levaduras y fermentación
Las levaduras se encuentran entre los hongos (fungi), en concreto pertenecen
a la clase de los hongos con micelio tabicado (Ascomycetes), el tipo más
abundante de la clasificación de los hongos.
En contraste con las bacterias procariotas, las eucariotas tienen una estructura
celular compleja (comportamientos como mitocondrias) y un auténtico núcleo
celular. Se denominan también hongos productores de esporas, porque se
multiplican sobre todo asexualmente (vegetativos) mediante esporulación. Sin
embargo, también se pueden reproducir sexualmente por copulación de dos
células esporas haploides, Éstos tienen una composición cromosómica
completa simple. Las levaduras se clasifican según el tipo de reproducción de
los diferentes tipos de hongos.
Las levaduras constan de una única célula. Esta célula madre forma en la
esporulación varias protuberancias, brotes hijos, que se separan, son a su vez
viables y pueden formar nuevas células. Crecen de modo heterótrofo (a partir
de nutrientes, sin fotosíntesis) preferentemente a valores de pH ácidos. Su
pared celular consta, como la sustancia del esqueleto de los insectos, de
quitina, y además de hemicelulosa.
28
Pasemos ahora a la bioquímica, para responder a una “pregunta vital” de las
células de levadura. Las levaduras pueden vivir como respiradores (aeróbicos)
o fermentadores (aneróbicos), y por lo tanto son aeróbicos facultativos. En
presencia de oxígeno las levaduras crecen espléndidamente, con la respiración
convierten el azúcar en CO2 y agua, y producen con ello energía, que utilizan
para el crecimiento y la producción de nuevas células.
Si se detiene el suministro de aire a las levaduras, los microbios interrumpen su
metabolismo de fermentación en la medida de la necesidad. La fermentación
les ayuda a sobrevivir en tiempos hostiles, a pesar de ser energéticamente
desfavorable. Louis Pasteur descubrió en 1861 que una levadura sin oxígeno
utilizaba más glucosa. Esto se denominó efecto Pasteur. Las levaduras en
condiciones anaeróbicas procesan más moléculas de azúcar para compensar
las pérdidas de energía. Puesto que no hay más oxígeno para utilizar, tampoco
puede quemarse en la cadena de respiración con el cofactor NADH + H+
acumulado. La transformación de glucosa permanece, por lo tanto, en la fase
de piruvato.
La célula transforma piruvato en acetaldehído. Con ello se libera CO2. El ciclo
de Krebs ya no puede ser utilizado. Para utilizar el NADH + H+ acumulado, que
no puede reoxidarse a NAD+ en la “combustión fría” debido a la deficiencia de
O2, a la célula le queda solamente un camino: utiliza la alcoholdeshidrigenasa y
forma, a partir de acetaldehído, con la utilización de NADH + H+, etano y
NAD+.
La glucosa se “quema” finalmente de modo incompleto a alcohol y CO2. En la
fermentación de una molécula de glucosa se originan solo de una a cuatro
moléculas de “moneda de cambio energético” ATP (en lugar de un máximo de
38 en la respiración con oxígeno); esto es suficiente para sobrevivir.
El alcohol no es, por lo tanto, un placer para la levadura, más bien una
necesidad, pero muere si el contenido de alcohol supera un determinado valor.
Contrariamente a la opinión clásica, el etanol también puede producirse
aeróbicamente (efecto Crabtree) si el medio de alimentación contiene más de
100 mg de glucosa por litro, En esta “reacción en exceso” el piruvato no se
oxida siguiendo el ciclo de Krebs, sino que se reduce a etanol.
Con la ayuda de los modernos chips gnéticos para ARNm de levadura (un
ácido nucleico de una única hebra, que desde el ADN del núcleo celular
alcanza los ribosomas con las instrucciones de construcción para las proteínas,
se observa que cuando hay deficiencia de oxígeno las levaduras anaeróbicas
producen otras enzimas diferentes a las de las levaduras aeróbicas. Es decir,
los genes (ADN) se escogen de manera diferente y expresan diferentes
proteínas, según la situación oxígeno de la célula de levadura.
29
Otros fermentadores, las bacterias, forman ácido láctico (Lactobacillus), ácido
butírico (Clostridium butyricum), ácido propiónico (Propionibacterium), acetona
y butanol (Clostridium acetobutylicum), así como otros productos con gasto de
ATP, y los secretan.
Los productos de la fermentación se forman, pues, en grandes cantidades, ya
que solo la transformación libera mucha más cantidad de alimentos en
ausencia de oxígeno que energía requerida en forma de ATP de las células.
Ahora está claro por qué los primeros procesos de biotecnología que utilizaron
los humanos fueron la fermentación del alcohol y del ácido láctico: las
fermentaciones liberan grandes cantidades de producto en un período de
tiempo muy corto y son, por lo tanto, altamente efectivas.
7.1 Fisiología de la fermentación
Andrew Markides es Doctorado en Microbiología y Director General del
laboratorio de investigación de Lallemand en Australia. Durante un seminario
organizado por Lallemand en Burdeos (Francia), Markides acabó con la
discusión “cultivos seleccionados versus indígenas”, explicando las diferencias
en la fermentación.
“No es una versus la otra”, respondió a la pregunta de los periodistas presentes
en el seminario. “El problema con las levaduras indígenas es su
impredecibilidad, en términos del comienzo y la finalización de la fermentación.
Las levaduras seleccionadas, en cambio, tienen características y
comportamientos de fermentación conocidos. Se pueden variar los niveles de
inoculación para conseguir distintos tipos de fermentación. Ésta es la
diferencia”, detalló.
La vieja disputa que enfrenta a las levaduras seleccionadas con las indígenas,
pierde todo su sentido cuando se tiene en cuenta que ni si quiera las levaduras
seleccionadas son capaces de crear un vino uniforme que tenga el mismo
sabor o estilo en todo el mundo. “La regionalidad del mosto de la uva en
combinación con cualquier levadura, será lo que de la característica al vino”,
recalcó Markides.
No obstante, estudios realizados indican que las levaduras seleccionadas,
como las cerevisiae o las bayannus, aportan carácter, complejidad y peso en el
paladar. Las bayannus, además, tienen el potencial de producir un cóctel de
componentes aromáticos que parecen aportar carácter al vino.
7.1.1 Saccharomyces cerevisiae, la estrella
A la hora de elaborar un vino, los enólogos se enfrentan a un elemento de
conflicto y a una pregunta: ¿debemos intervenir o dejar que la naturaleza
actúe? Ante esta cuestión, “lo más importante” – anota el investigador – “es el
30
conocimiento práctico, de esta manera podemos identificar y manejar los
riesgos”.
“Cuando se trata de la fermentación, el enólogo se permite una expresión
artística, minimizando los niveles de riesgo y decide si usar levaduras
indígenas o levaduras seleccionadas. Cuando se utiliza un 100% de levaduras
indígenas, si la fermentación se desvía hacia otros metabolismos no deseados,
muchas veces es necesaria una intervención. En este caso se introducen
levaduras seleccionadas.”
Markides explicó que hoy se conocen 700 especies de levaduras para vinos, de
las cuales solamente 70 crecen en viñedos y la más difícil de encontrar es la
Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura, según se ha observado en
laboratorio, permanece activa hasta el final de la fermentación alcohólica,
permitiendo predecir que llegará exitosamente a buen término, lo cual ayuda a
minimizar los riesgos.
La S. cerevisiae permite, además, equilibrar los sabores sobre-maduros o
verdes de los varietales y los fenoles. “Para una cosecha con mucha madurez,
en la fermentación se usan levaduras que no extraen tantos fenoles, que
reducen la percepción de lo verde y si tiene mucha azúcar por gran madurez,
son capaces de metabolizar esa cantidad”, detalló.
7.1.2 Contribución al color
Consultado sobre este punto, Markides respondió que la contribución de la
levadura a las características del vino es significante. “La respuesta, sin
embargo, es difícil, porque el proceso de hacer el vino es realmente complejo.
La fruta importa, si no importara tendríamos azúcar, agua y levaduras, pero eso
no daría estructura al vino. Sin embargo, estamos en condiciones de asegurar
que las levaduras pueden demorar la desaparición del color en el vino, la
oxidación. También existe al menos un 5% de levaduras en la fermentación
que ayuda a estabilizar el color de los vinos tintos, aunque no tiene la habilidad
de corregir un error en el origen del color”, explicó.
7.1.3. Parámetros básicos para una mejor gestión
Parámetros básicos para optimizar el rendimiento de las levaduras
seleccionadas: concentración acuosa más azúcar significa menos agua,
amenazando el estado del microbio, su vitalidad y viabilidad.
 PH. Las levaduras prefieren pH más elevados. Un pH bajo con alcohol
es malo para los microbios.
 Temperatura. Afecta a la energía de biomoléculas.
 Oxígeno. Es bueno para las levaduras.
31
 Tipo de alimento y concentración. Apoya el crecimiento microbiológico,
la vitalidad y el mantenimiento de la célula.
Para obtener los mejores resultados posibles, el enólogo debe manejar su
sinergia entre el mosto de uva y el ambiente de fermentación, con el
comportamiento de la levadura. Aumentar los niveles de azúcar reduce las
posibilidades de sobrevivir de las células. “La levadura tiene la capacidad de
mejorar su pH cuando el pH del mosto de uva es muy alto o bajo. En cuanto al
oxígeno, si en alguna etapa de la fermentación se puede introducir, esto
ayudará a la levadura a producir elementos dentro de la membrana, que son
vitales para su salud. Está demostrado que la introducción de un poco de
oxígeno en las últimas etapas del desarrollo de la levadura es vital para su
sanidad y estimulación”.
Otro punto a tener en cuenta es que la falta de oxígeno durante la fermentación
alcohólica resulta en la reducción de la síntesis de proteína, llegándole a la
célula menos azúcar y aumentando la posibilidad de incidencias de
fermentación incompleta.
“La inclusión de nitrógeno inorgánico está siendo estudiada”, explicó Markides.
“En cuanto a los tiempos de fermentación es necesario evitar que sean rápidos.
También es imperioso evitar los demasiado largos. Con levaduras indígenas, la
S. cerevisiae domina la fermentación en el jugo de uva una vez que el alcohol
excede 3º 4% en volumen”, detalló.
7.2. Una levadura para cada tipo de vino
El doctor Sakkie Pretorius, Director General del Instituto Australiano de
Investigación vinícola (AWRI por sus siglas en inglés de “Australian Wine
Research Institute) fue invitado a disertar en el seminario sobre Levaduras
Seleccionadas, organizado por la empresa Lallemand en Burdeos (Francia) a
mediados de junio pasado, al que asistió prensa especializada de todo el
mundo.
La conferencia de Pretorius se basó en las nuevas investigaciones llevadas a
cabo por el AWRI en base a las conjunciones de componentes de levaduras
seleccionadas que permiten incorporar modificaciones a los vinos durante la
fermentación, para lograr los resultados deseados por el enólogo.
Esto, teniendo en cuenta que son combinaciones de componentes de
levaduras, y no levaduras modificadas genéticamente.
7.2.1. La huella genética
El material genético básico, la huella genética (genómics) es el foco de
investigación en fermentación en estos días. “Los metabolitos – explicó
Pretorius – abarcan todo lo metabólico que un organismo es capaz de producir.
32
Cuando bebemos un vino, lo que bebemos es la conjunción del metabolismo
de la uva y de la levadura”
Los estudios científicos sobre los “metabolitos” o diferentes conjunciones
metabólicas, han llevado al AWRI a desarrollar diferentes caminos para ayudar
a “dar forma a un vino” en cuanto a calidad, aromas y sabores, mediante la
correcta utilización de determinadas levaduras seleccionadas (Saccharomyces
cerevisiae).
Cuando hablamos de “carácter” aromático en un vino nos referimos a esto que
en la jerga normal llamamos aromas “frutales”, “tropicales”, etcétera.
“Las levaduras le dan carácter a un vino, pero es la uva la que aporta la
estructura básica”, aclara Pretorius. Partiendo de aquí, puntualiza que las
últimas investigaciones sostienen que lo que genera pequeñas diferencias
entre un vino y otro es el aporte de los metabolitos (compuestos generados por
el metabolismo de los seres vivos), pequeñas partes que vienen tanto de la uva
como de las levaduras.
“Existen cientos de componentes que generan diferentes características en el
vino, de hecho si bien conocemos algunos de los componentes aromáticos en
los blancos – se han caracterizado 14 compuestos con impacto en el aroma –
prácticamente no sabemos nada acerca de los componentes aromáticos en los
vinos tintos”.
7.2.2. La evolución de la Saccharomyces: hibridación
El trabajo con combinaciones de levaduras, o desarrollo de cepas, ha llevado a
los investigadores a obtener grandes avances en la utilización de determinados
componentes para obtener mejores aromas en un vino.
El doctor Sakkie Pretorius explicó el proceso. La célula madre de una levadura
tiene como función transformar el azúcar, el nitrógeno, el fosfato, el sulfuro, el
oxígeno y los minerales en etanol y CO2. A través de un proceso denominado
glucólisis también se descomponen los precursores de los sabores,
denominados terpenos.
La levadura convierte los compuestos no volátiles (no aromáticos) en
componentes que podemos percibir mediante el olfato. Todo el proceso se
explica a fin de llegar a la conclusión de que en este punto la levadura ha
producido más glicerol que alcohol, logrando un efecto contrario al que se
espera, ya que el glicerol es positivo para los aromas del vino. Pretorius
puntualiza en este sentido que la fisiología de la levadura para obtener lo que
se quiere de un vino puede ser manipulada por el hombre.
Con este fin se han desarrollado varios métodos para desarrollar diferentes
cepas de levaduras: selección de cepas, evolución direccionada, mitogénesis
33
(mutar componentes), hibridación (técnica que se emplea para cruzar
diferentes especies de levaduras) e ingeniería genética (la única técnica
utilizada para modificar genéticamente el ADN y lograr los OMGs).
7.2.3. Como se trabaja
El cruce o mezcla de levaduras ha logrado excelente resultados en laboratorio.
“Cruzando levaduras podemos satisfacer ciertas preferencias del mercado”,
explicó el doctor Pretorius. Por ejemplo, si se quiere obtener un vino con menos
alcohol y más afrutado, se pueden realizar “cruces de cepas” de levaduras que
le brindan al enólogo las herramientas para lograr lo que desea. Las levaduras
así desarrolladas permiten, además, proteger a los vinos del exceso de sulfuro
de hidrógeno, el H2S, responsable del olor a podredumbre o humedad.
Mediante la inoculación con mezclas de levaduras es posible además, sumar al
vino componentes que permitan la aparición de aromas a frutos frescos. En el
laboratorio han logrado, además, que tres mezclas de levaduras redujeran un
2,7% el nivel total de alcohol de un vino. “Estas combinaciones de levaduras no
son mágicas, pero mejoran mucho el producto en la dirección deseada”,
aseguran los investigadores de AWRI.
7.3. Modificación genética de levaduras vínicas
La fermentación del mosto en vino es una reacción microbiológica compleja en
la que se produce un desarrollo secuencial de levaduras y bacterias lácticas.
Tradicionalmente, el vino se produce por la fermentación natural llevada a cabo
por las levaduras. El origen de estas levaduras puede estar en la superficie de
los hollejos de las uvas o el ambiente de la bodega (maquinaria,
fermentadores, etc.). La dinámica de la flora responsable del proceso
fermentativo del mosto ha sido objeto de numerosos estudios.
La microflora presente en la superficie de la piel de la uva se ve afectada por
un gran número de factores que influyen en la proporción de las diferentes
especies presentes. Entre estos factores se incluyen la temperatura, la
pluviosidad y otras influencias climáticas, el grado de madurez de la cosecha,
el uso de fungicidas, el daño físico debido a hongos, insectos, y la variedad de
uva. Por otro lado, cuando la superficie de la maquinaria de la bodega, como
prensas, tanques, fermentadores y bombas, entre otros elementos, entra en
contacto con el mosto de uva constituye otra fuente de aporte de levaduras.
Esta flora residente en el ambiente de la bodega está formada
mayoritariamente por S. cervisiae, aunque también se han aislado especies de
los géneros Candida, Pichia, Hansenula, y Brettanomyces. Sin embargo, la
especie Saccharomyces Cerevisiae es la responsable de la fermentación
alcohólica a pesar de que sus niveles en la uva son bajos, alrededor de 50
células/ml, durante la fermentación se multiplica rápidamente y desplaza a
otros microorganismos que eventualmente invaden el mosto. No obstante,
34
variaciones en la flora inicial pueden influir en la calidad del vino y dar lugar a
cambios en la acidez volátil y a sabores y olores desagradables.
7.3.1. Utilización de levaduras seleccionadas en la vinificación
Desde el punto de vista microbiológico, la variabilidad en la flora levaduriforme
de los mostos puede solventarse adicionando en cada campaña de vendimia
un inóculo microbiano que, al ser mayoritario, normalice la flora inicial y, de
esta forma, dé lugar a una fermentación homogénea año tras año. Aunque
cultivos líquidos de levadura vínica han sido utilizados desde 1930 (Instituto
Laclaire, Francia), las levaduras vínicas secas no aparecieron hasta mediados
de los años cincuenta, cuando de forma independiente varios laboratorios
europeos, canadienses y estadounidenses llevaron a cabo una selección de
levaduras vínicas que posteriormente utilizaron como inóculo en
fermentaciones dirigidas. Todos ellos concluyeron que las levaduras vínicas
seleccionadas crecían bien en una fermentación de mosto y que producían un
buen vino. Desde entonces, en varias zonas de Europa, Estados Unidos,
Canadá y Australia se realizan fermentaciones utilizando cultivos iniciadores.
Hoy se comercializan más de cien cepas diferentes pertenecientes
principalmente a seis casas comerciales.
Aunque pueden producirse diferencias en la diversidad microbiana del mosto
inicial, ya no solo entre regiones vitivinícolas distintas, sino también dentro de la
misma bodega en diferentes vendimias, la utilización de levaduras
seleccionadas produce fermentaciones controladas y, como consecuencia de
esta práctica, el vino mantiene sus características sensoriales típicas en cada
región. Según Cuinier, la utilización de levaduras seleccionadas puede evitar
alteraciones químicas y microbiológicas en las primeras fases de la
fermentación, como paradas espontáneas, o mejorar la composición química e
influir en la calidad, tanto gustativa como aromática del vino. Por esta razón, en
los últimos años, se ha extendido el uso de levaduras autóctonas de cada
región.
Los estudios de identificación y caracterización de las diferentes especies de
levaduras, así como de las cepas que pertenecen a una misma especie han
estado basados en criterios morfológicos y fisiológicos. Estas características
pueden variar en función de las condiciones de cultivo y, en ocasiones, las
especies han sido delimitadas por una única característica fisiológica, que en
algunos casos estaba controlada por un solo gen. Más recientemente se han
desarrollado técnicas de biología molecular que se presentan como una
alternativa a los métodos tradicionales para la caracterización e identificación
de levaduras.
Por otra parte, también resulta interesante la caracterización de cepas de
levaduras con dos fines: en primer lugar, para controlar el proceso de
elaboración de levaduras secas activas y, en segundo lugar, para comprobar la
35
implantación de las levaduras comerciales durante la fermentación alcohólica
en la bodega. Se han desarrollado diversas técnicas moleculares para la
caracterización de cepas vínicas. Querol y cols. han desarrollado un método de
análisis del ADN mitocondrial (mtADN) que evita la utilización de gradiantes en
cloruro de cesio y el uso de una ultracentrífuga, factor limitante para su
utilización en la industria. Esta técnica rápida permite el análisis de un mayor
número de cepas en menos tiempo, y su aplicación resulta ideal en la industria
por su rapidez, seguridad y economía, y por no requerir material sofisticado ni
personal muy especializado. Mediante esta técnica Querol y cols. han mostrado
la implantación y el papel de una levadura seca activa (LSA) que había sido
inoculada en las fermentaciones de dos bodegas distintas. Se demostró que la
cepa inoculada competía con las cepas naturales pero no suprimía
completamente su crecimiento hasta varios días después de haber sido
inoculada. Sin embargo, el predominio de la cepa inoculada era evidente en
ambas bodegas y representó el 68,09% y el 89,46% de las colonias aisladas en
la fase final de la fermentación.
El uso de levaduras inoculadas y la demostración formal mediante técnicas
moleculares de su imposición, junto con los avances en biotecnología, abren la
puerta a la modificación genética de las levaduras vínicas.
7.3.2. Mejora genética de levaduras vínicas
Las características genéticas de una levadura vínica pueden ser modificadas
según las necesidades de la industria vitivinícola. Se han desarrollado diversas
levaduras utilizando técnicas clásicas como la inducción y selección de
mutantes, y la hibridación y fusión de protoplastos. Sin embargo, la aplicación
de las técnicas de ADN recombinante se presenta como un enfoque más
sencillo y preciso, tal como veremos a continuación.
Los pasos básicos para clonar un gen y transformar una levadura vínica son:
a) Identificación del gen que le va a conferir una característica nueva a la
levadura y aislamiento del fragmento de ADN foráneo.
b) Identificación y linearización mediante el uso de enzimas de restricción
del vector (plásmido) que va a servir para introducir el nuevo gen en la
levadura (dicho plásmido posee sistemas de selección para las
levaduras transformadas o modificadas genéticamente)
c) Transformación de la levadura, es decir, introducción del vector con el
gen en el interior celular
d) Selección de las levaduras transformadas, aquellas que han incorporado
el plásmido con el nuevo gen.
36
Estos sistemas están basados mayoritariamente en resistencias a antibióticos.
Estos plásmidos pueden permanecer de forma independiente en la célula o
pueden ser <<integrativos>>, o sea que el nuevo gen se integra en una zona
concreta del genoma de la levadura eliminando el ADN no necesario del vector
y los genes responsables de las resistencias a antibióticos.
Siguiendo esta metodología es posible construir cepas que expresen
actividades metabólicas de interés o que ejerzan efectos beneficiosos en las
características organolépticas de los vinos. Se han desarrollado diversas
levaduras vínicas recombinantes. Por ejemplo, se han diseñado levaduras
vínicas que, al contener los genes que codifican los factores killer K1 y K2,
presentan una ventaja ecológica evidente, ya que las levaduras vínicas solo
expresan el factor K1 y, por tanto, son resistentes únicamente a este factor
killer. Otro ejemplo es la construcción de cepas de laboratorio de
Saccharomyces cerevisiae que, al expresar el gen de la L(+)- lactato
deshidrogenasa de Lactobacillus casei, pueden llevar a cabo una fermentación
mixta (lactoalcohólica) y por ello solventar el problema de baja acidez de los
vinos de regiones cálidas. Aparte de la fermentación alcohólica, la fermentación
maloláctica es un proceso tecnológico de gran importancia en enología.
Mediante su uso se logra desacidificar los vinos tintos y algunos vinos blancos
en regiones frías. Esta fermentación la llevan a cabo bacterias ácido lácticas,
sobre todo Oenococcus oeni, y rebaja la acidez de los vinos al descarboxilar el
ácido L-málico a ácido L-láctico. La reacción está catalizada por el llamado
enzima málico que ha sido purificado de varias bacterias ácido lácticas. Los
genes correspondientes han sido clonados a partir de aislados de Lactobacillus
delbruecki, lactobacillus lactis y Oenococcus oeni. Las cepas de S. cerevisiae
no pueden metabolizar el melato del mosto, por lo que la idea de expresar el
gen que codifica el enzima málico en la levadura vínica ha sido un objetivo
prioritario de la biotecnología enológica. De hecho, durante los últimos años
varios grupos han informado sobre la construcción de levaduras vínicas que, si
bien expresaban eficazmente genes bacterianos que codifican la enzima
málica, no daban lugar a la desadificación. Recientemente se ha conseguido
una vía eficaz de degradación de málico en S. cerevisiae. Para ello se ha
construido una levadura recombinante que porta un gen de la levadura
Schizosaccharomyces pombe, que codifica un malato permeasa y el gen de L.
lactis que codifica la enzima málica. Esta levadura es capaz de fermentar 4,5
g/L de malato en mostos artificiales en tan solo cuatro días.
Otro ejemplo interesante del uso de las técnicas de ingeniería genética en
enología lo constituye la construcción de levaduras vínicas recombinantes que
expresan genes que codifican celulasas y hemicelulasas. Es una práctica
habitual en las bodegas la adición de estas enzimas para solventar problemas
de filtración o incrementar aromas afrutados, pero la heterogeneidad de las
preparaciones comerciales (una mezcla de enzimas que varía según el lote) h
37
ha hecho de su uso algo imprescindible. En el laboratorio del Instituto de
Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA) se han construido diversas
levaduras vínicas recombinantes que contienen genes de hongos filamentosos
que codifican beta-(1,4)-endoglucanasa, alfa-L-arabinofuranosidasa, beta-
glucosidasa, endoxilanasas y alfa-ramniosidasas. Todas estas levaduras son
capaces de secretar las enzimas correspondientes al mosto en cantidades
suficientes para llevar a cabo el proceso tecnológico y producir vino en
cantidades suficientes para llevar a cabo el proceso tecnológico y producir vino
con adecuadas características organolépticas. También se ha desarrollado una
levadura recombinante que contiene un gen fúngico que codifica una pectato
liasa útil para solventar problemas de filtración. Todas estas cepas se pueden
usar como herramientas para investigar el papel individual que desempeña
cada enzima en el proceso de vinificación. En la actualidad se está investigado
sobre la utilidad de enzimas puras y la combinación de enzimas más adecuada,
dependiendo de las variedades de uva. Otra de las líneas de investigación del
grupo, recientemente iniciada, consiste en aumentar la producción de los
aromas secundarios mediante el incremento de la capacidad de síntesis de
estrés por parte de la levadura durante la fermentación alcohólica.
La modificación genética de las levaduras vínicas exige conocer promotores de
genes de levaduras que se expresen específicamente durante determinados
tiempos de fermentación. Estos promotores se pueden comparar con los
interruptores de la luz que encienden o apagan, es decir, que permiten que el
gen codifique o no lo haga para la proteína de interés. Por ello, diversos
trabajos de investigación tienen como objetivo entender la regulación de la
expresión génica en S.cerevisiae durante la vinificación. En la actualidad se
dispone de varios promotores que se inducen específicamente durante la
prefermentación, fermentación tumultuosa o posfermentación. Por otra parte,
estos estudios nos han permitido constatar que a nivel de expresión génica, las
levaduras se comportan de forma muy distinta en condiciones de laboratorio o
en vinificación, incluso se pueden observar diferencias según la variedad de
mosto que se vaya a fermentar.
Por último, merece una mención especial el reciente desarrollo de protocolos
de transformación para levaduras vínicas que rinden levaduras recombinantes
GRAS (de Generally Recognized As Safe) mediante sistemas de integración en
el genoma de las levaduras evitando el uso de resistencias a antibióticos, uno
de los mayores problemas en el uso de microorganismos modificados
genéticamente.
7.4 Desarrollo de nuevas levaduras más eficientes
Investigadores del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la
Universitat de València han logrado obtener, mediante procesos de
modificación genética, levaduras industriales más eficientes para mejorar y
38
agilizar la fermentación de los vinos. El Grupo de Biotecnología de Levaduras
Vínicas, dirigido por la profesora Emilia Matallana, investiga la levadura
Saccharomyces cerevisiae, un microorganismo imprescindible para la
fermentación, pues es el responsable directo de la transformación de los
azúcares presentes en el mosto del uva en alcohol.
Matallana argumenta que el papel de esta levadura es esencial, porque “sin
ella no hay fermentación, ni vino, pero además, contribuye a las propiedades
del vino mediante productos que vierte durante su crecimiento”.
Saccharomyces cerevisiae aporta, por ejemplo, el glicerol, el alcohol, un
alcohol que determina el cuerpo del caldo, además de multitud de compuestos
aromáticos que se suman a los procedentes por la variedad de uva.
Estas líneas de investigación lideradas por la UV son vitales para la industria
enológica actual, ya que las empresas del sector apenas realizan
fermentaciones espontáneas, dependientes de la flora microbiana natural
presente en las uvas y en la maquinaria de las bodegas, como antiguamente.
“Hoy en día la producción de vino se basa en fermentaciones inoculadas, es
decir, llevadas a cabo por levaduras vínicas naturales que han sido purificadas,
producidas industrialmente y comercializadas. La ventaja de esta práctica es la
garantía de una fermentación rápida, con menos riesgos de paradas y
contaminaciones microbianas indeseadas, como también una mayor
reproducibilidad en la calidad de los vinos”, destaca Matallana.
Paralelamente, esta práctica permite el uso de levaduras concretas, distintas y
adecuadas para la producción de distintos tipos de vinos o en función de las
características de cada cosecha. De esta forma, pueden escogerse levaduras
comerciales óptimas para la fermentación de mostos procedentes de cosechas
con un alto grado de maduración y, por tanto, muy ricos en azúcares. También
es posible identificar levaduras adecuadas para llevar a cabo las vinificaciones
en frío, práctica muy innovadora en la enología actual, o levaduras que
producen vinos de propiedades organolépticas deseables y, al mismo tiempo,
apreciadas por el consumidor.
El grupo de la UV, en el que también participa el profesor Agustín Aranda,
investiga, desde hace más de una década, los mecanismos que permiten a las
levaduras del vino adaptarse a las condiciones adversas a las que se enfrentan
durante las diferentes fases de uso industrial. Mediante estos avances,
“estamos mejorando la eficiencia de las levaduras vínicas en la industria
enológica, a través de dos vías: la selección de levaduras naturales con mejor
adaptación tecnológica o su manipulación genética para adaptarlas al estrés”,
apunta Aranda. De hecho, recientemente, estos científicos han conseguido
datos interesantes sobre la implicación de ciertos genes en la adaptación al
estrés que sufren durante la vinificación debido, por ejemplo, a la alta
concentración de alcohol o el agotamiento de nutrientes del mosto. Además,
39
han logrado mejoras en la fermentación de las levaduras, gracias a la
manipulación de genes implicados en la adaptación a condiciones de estrés
oxidativo. Sus resultados han sido publicados este año en la revista Applied
Microbiology and Biotechnology.
7.4.1. Mejoras para las denominaciones de origen
Otra de las iniciativas de este grupo de científicos de la UV es abordar una
caracterización de diferentes levaduras vínicas, tanto comerciales como no,
desde el punto de vista de su capacidad de adaptación al estrés. Con ello, “se
podrían identificar y escoger levaduras de cada denominación de origen, que
presentarán una óptima adecuación tecnológica, tanto para la producción de
las levaduras a escala industrial como para la elaboración del vino”, añade
Emilia Matallana. En consecuencia, las bodegas podrían utilizar estas
levaduras para llevar a cabo fermentaciones con mayor estabilidad
microbiológica y, por tanto, más seguras, mientras usan levaduras autóctonas
que contribuyen a garantizar las continuidad de las propiedades y de la calidad
típicas de cada vino.
8. Conclusiones finales
En los últimos años se ha ido conformando una industria vitivinícola a nivel
global. Como consecuencia, la industria de vinos local enfrenta un proceso de
intensa restructuración. La mayor presión competitiva da lugar a estrategias
tecnológicas heterogéneas, en las que las empresas responden con distinto
grado de esfuerzo tecnológico y vinculación con instituciones científicas, en
función de sus capacidades tecnológicas acumuladas.
La biología molecular abre oportunidades mayores para aumentar la calidad,
consistencia y diferenciación de los productos finales a partir de innovaciones
en los procesos de fermentación. La realización de estudio nos ha permitido
apreciar que las empresas se caracterizan por adoptar las nuevas técnicas a
partir de la compra de estos ingredientes, reproduciendo el patrón de
comportamiento tecnológico “determinado por los proveedores” en el cual las
empresas usuarias no controlan ni la dirección ni el ritmo del cambio
tecnológico.
Por su parte las capacidades tecnológicas de las empresas locales, ya sea en
el desarrollo o en la adaptación de estos ingredientes, son limitadas. A
excepción de las casas matrices de las grandes multinacionales, no intervienen
en procesos de aprendizaje junto a los proveedores. En los casos
excepcionales en los cuales existieron desarrollos puntuales, las empresas
debieron recurrir a capacidades externas en microbiología, como lo evidencia
una de las principales empresas locales con estrategias de innovación de
40
productos orientadas a nichos de diferenciación. En estos casos las empresas
de consultoría con científicos extranjeros o con instituciones locales.
Como resultado de las limitaciones de economías de escala en activos críticos
para la fabricación de levaduras y otros ingredientes, no hay un segmento de
empresas locales que produzca levaduras ni bacterias adaptadas a
condiciones locales. De esta forma, si bien existe un fuerte potencial para
desarrollar levaduras asociado a la existencia de una infraestructura de Ciencia
y Técnica con capacidades en estas áreas y con desarrollos autóctonos a
escala de laboratorio, no se ha conformado un sistema nacional de innovación.
La ausencia de vinculaciones proveedor-usuario en la etapa de escalado y
fabricación de ingredientes, y un débil desarrollo institucional que asegure un
reparto de excedentes consistente con la innovación de los institutos públicos.
En este contexto, estos desarrollos con en gran parte impulsados a partir de
contratos de vinculación con empresas multinacionales que absorben los
desarrollos locales de cepas, ampliando sus bibliotecas de microorganismos en
el marco de su estrategia global.
41
Anexo I
Patrick McGovern, de la Universidad de Pennsylvania, trabaja combinando la
química analítica con la arqueología e investiga las pistas del vino. En estos
momentos se está realizando una investigación detectivesca-histórica sobre la
púrpura de los emperadores obtenida del molusco Murex trunculus. MaGovern
defiende la “hipótesis de Noé”: el bíblico Noé llegó a la tierra en el monte
Ararat, actualmente al este de Turquía, y empezó el cultivo de la vid. La
agricultura se estableció en realidad en Ararat, con la domesticación del trigo.
El vino eurasiático natural (Vitis vinífera sylvestris) se encuentra desde España
hasta Asia Central. La elaboración de vino procede de estos vinos naturales.
McGovern busca en las montañas turcas Taurus (donde nace el Tigris) el lugar
donde pudo tener su origen el vino natural. José Vouillamoz, del Instituto
Italiano Agrario di San Michele all’Adige, en Trento, y Ali Ergül de la
Universidad de Ankara, están en el equipo de ADN. El equipo colecciona todas
las posibilidades de cultivadores de vino locales. Se quieres seguir el origen de
la formación del vino.
Los investigadores buscan también fragmentos de arcilla con restos de vino.
Un indicio potente corresponde al tartrato (ácido tartárico), investigado en su
tiempo por Louis Pasteur, que se encuentra en el vino. Hace diez años, Patrick
McGovern creía ya que las pistas más antigua del vino y de la cerveza de
cebada son de hace 7400 años, en el pueblo iraní Hajii Firuz Tepe.
Sin embargo, ahora se han encontrado en Jiahu, en la provincia Henan de
China, los más antiguos “huesos oraculares”, con caracteres chinos, y flautas
de huesos de ave y fragmentos de arcilla. Se tomaron 16 fragmentos de arcilla
de 9000 años de antigüedad con restos de vino del Museo de Pennsylvania de
Arqueología y Antropología, en Filadelfia. Además, 90 recipientes de bronce
cerrados de la Dinastía Shang.
Combinando la cromatografía de gas y de líquido, la espectometría de
infrarrojos y el análisis de isótopos, se observó que el vino contenía una mezcla
compleja de arroz fermentado, cera de abejas, frutas de espino 8 que
mostraron un alto contenido de azúcar y posiblemente las levaduras para la
fermentación) y vino natural.
6000 años más tarde, en la Dinastía Shang, la enología había hecho avances
considerables. El vino del emperador Shang de los recipientes de bronce
contiene restos de flores (crisantemos), resina de pino (que recuerda la
moderna resina griega), restos de alcanfor, aceitunas, taninos ácidos y también
ajenjo (que más tarde tomaron fatalmente los bebedores de absenta de la Belle
Époque parisina de Toulouse-Lautrec).
42
McGovern no probó el vino de Shang aromático, pues los recipientes contienen
hasta un 20% de plomo… ¡Interesante! El vino, como se sabe, es ácido, y por
ello disuelve los metales de modo sobresaliente. Como los romanos de clase
alta con sus tazas de plomo, los emperadores chinos también debieron
envenenarse: con síntomas de calambres hasta locura. El plomo es, como
todos los metales pesados, un potente inhibidor para las enzimas, pues los
metales pesados atacan los puentes disulfuro de las proteínas.
Algunas bebidas chinas de 9000 años de antigüedad se preparaban con mijo
de panícula, y esto es asombroso, pues las mismas trazas de mijo se
descubrieron también en los vinos iraníes de 7500 años de antigüedad. Parece
ser que se desarrolló un intercambio de ideas en Asia Central.
Para Patrick McGovern, el estudio del vino con todas sus conexiones sociales y
económicas es la puerta a las civilizaciones antigüas: “una botella de Merlot o
Shiraz nos puede ayudar hoy a entender los sentimientos de la historia”.
43
Anexo II
Para la preparación del vino primero se aplastan las uvas en las prensas. En la
fabricación del vino blanco sigue enseguida el prensado (prensas) o el pisado,
y el jugo (mosto) se separa del raspón, los hollejos y las semillas (como
residuo, denominado orujo). La adición de pectinasas incrementa el
rendimiento del jugo considerablemente y conduce a un mosto más claro. En la
producción de vino tinto se mantiene sin separar el prensado directo del
fermentado principal, pues el colorante de las antocianas está localizado
principalmente en los hollejos de las uvas rojas y azules, y pasan a la
disolución con la formación de alcohol. Por ello este prensado se separa tras 4
o 5 días en reposo.
La fermentación tiene lugar a través de la parte exterior de las semillas de la
uva por las bacterias de ello o por la inoculación y calidad tras una anterior
pasteurización mediante la adición de cultivos purificados de levadura (cepas
de Saccharomyces cerevisiae). El proceso transcurre con una enorme
formación de espuma. El “mosto del vino” así originado, que nubla las células
de levadura, en algunas zonas es apreciado como bebida. Durante los cuatro a
ocho días que dura la fermentación principal se utiliza casi el azúcar total. Las
proteínas y pectinas se segregan en forma insoluble y se unen con las
levaduras como almacenadoras de los restos descritos, que se separan del
vino. En el primer año, en una lenta posfermentación en las frías bodegas
fermentan aún el azúcar restante (crecimiento); entonces se origina un
segundo almacenamiento. Simultáneamente se forman en el vino los
materiales aromáticos que originan el bouquet (aroma, flores). El vino joven
disponible tras la terminación de la fermentación se tapa heméticamente, antes
de rellenar los barriles de almacenamiento ensulfatados, en los cuales (de vez
en cuando con aireación temporal) se consigue su maduración. Durante este
tiempo empieza también el tratamiento en la bodega. Éste sirve en primera
instancia para aumentar la durabilidad (por ejemplo mediante azufre, pues el
dióxido de azufre es más venenoso para las bacterias que para las levaduras) y
la clasificación. Los principales vinos tienen un contenido en etanol entre el 10
y el 12%.
Un proceso más importante es la transformación del ácido málico (malato),
mediante bacterias lácticas, a ácido láctico (lactato) esencialmente débil. Sin
esta fermentación malo-láctica los vinos alemanes, debido a su alto contenido
ácido (de 8 a 10 g/l), no podrían beberse.
La diferenciación de los vinos tiene lugar según el color (principalmente vino
blanco y tinto), el origen y el tipo de vid (por ejemplo Riesling, Trollinger,
Spätburgunder, Silvaner). El contenido restante de azúcar se produce
interrumpiendo la fermentación o la adición del mosto: seco (max. 9 g/l),
semiseco (max. 18 g/l) y dulce (más de 18 g/l) y dulce (más de 18 g/l). Los
44
vinos fortificados o generosos, como Madeira, Jerez, Oporto o Vermut, son
vinos a los cuales se añade azúcar, etanol y a veces hierbas. Los microbios no
intervienen de ninguna forma.
El champán y otros vinos espumosos requieren una fermentación doble. Se
incluye deliberadamente CO2 dentro de la botella. A una mezcla de vino blanco
se le añade jarabe de azúcar y se rellenan botellas tapándolas con fuertes
tapones de corcho. Las botellas se almacenan en un estante (púlpito), donde el
vino puede fermentar lentamente. Una levadura de champán especial crece en
el interior de la botella. Durante meses se dejan depositar lentamente, con las
botellas boca abajo. Las levaduras y los residuos se almacenan entonces sobre
el corcho. En ese momento se reemplaza rápidamente el corcho y se añade
jarabe de azúcar y brandy. Así se origina un vino noble duradero, que gotea
con lágrima fina durante largo tiempo después de abrirlo. En el vino espumoso,
en cambio, se añade CO2 bajo presión a un vino tranquilo.
El famoso coñac se descubrió a principios del siglo XV por los cultivadores de
vino en la Charante francesa, cuando debieron responder a la menor cantidad
de su vino frente a la calidad del vino de la vecina región de Burdeos. Tuvieron
la idea de destilar su vino. Más tarde el producto se destiló incluso dos veces,
una tras otra. También todavía hoy el coñac joven viene con un contenido de
alcohol del 70% en barriles de roble Limousin, donde madura parcialmente
durante años hasta alcanzar la grandeza completa, asumiendo el color del
tonel y el sabor. Solamente después se diluye a un 40%.
45
Anexo III
A mediados del siglo XIX, 200 años después de que Leeuwenhoek descubriese
los primeros microbios, prosiguió el desarrollo industrial de las grandes
fábricas. Tampoco el alcohol se producía ya en pequeñas familias
emprendedoras, sino al por mayor. Cada vez se necesitaban más
urgentemente, por lo tanto, conocimientos exactos sobre los procesos de
fermentación, para evitar fracasos costosos.
En la ciudad francesa de Lille, en el año 1856, un conocedor, Monsieur Bigo,
visitante de una fábrica de alcohol, habló con el profesor de química Louis
Pasteur sobre una rara enfermedad que atacaba a muchos de sus barriles de
alcohol. Del jugo de azúcar de remolacha no se formaba sino un líquido gris,
viscoso, con olor a ácido. Pasteur empaquetó su microscopio y se fue a la
fábrica. Allí tomó muestras de barriles “enfermos” y “sanos”. El alcohol “sano”
contiene, como se analizó mediante observación microscópica, pequeñas
esferas amarillas, las levaduras que formaban racimos. Como con los
gérmenes, brotaban semillas desde la parte lateral de las pequeñas bolas. Las
levaduras, pues, vivían. Su vida causaba la conversión de azúcar en el alcohol.
Después Pasteur investigó la masa viscosa. No descubrió en ella ninguna
levadura, pero sin embargo sí pequeños puntos grises. Cada punto contenía
una estructura tangible de palitos temblones, millones de palitos en cada punto
gris. La materia ácida, que producían los palitos, se demostró por análisis
químico que era ácido láctico (lactato).
Pasteur dejó caer unas gotas del líquido que contenía los palitos en una botella
con una disolución clara de levaduras y azúcar. Tras un tiempo breve también
habían desaparecido aquí las levaduras, y los palitos dominaban el campo. Se
creaba de nuevo ácido láctico en lugar de alcohol.
Los palitos descubiertos eran bacterias. Tomaron su nombre de su forma: la
palabra griega para palito es bakterion. Las bacterias producían obviamente
ácido láctico mediante la fermentación láctica del azúcar, mientras que las
levaduras fermentaban a alcohol y al gas dióxido de carbono.
Poco después del descubrimiento de las bacterias lácticas en los barriles de
alcohol, Louis Pasteur fue requerido por los viticultores en Arbois (el padre de
Pasteur había sido curtidor en Arbois). Ellos tenían problemas con la
fermentación del vino. Una y otra vez obtenían del jugo de las mejores uvas un
vino graso, denso, amargo. También aquí encontró Pasteur, en el caprichoso
vino, en lugar de levaduras pequeñas bacterias, que sin embargo formaban
estructuras como un collar de perlas. Pasteur descubrió en sus investigaciones
básicas los diferentes tipos de bacterias que arruinaban el vino. Finalmente
pudo pronosticar a los perplejos viticultores qué sabor tendría una muestra de
vino, ¡sin que tuviesen que pagar previamente! Para ello observó la muestra
46
bajo el microscopio y determinó el tipo de levadura o de bacteria. Pasteur
encontró que es suficiente calentar brevemente el vino para matar las
bacterias. La misma técnica también era apropiada para proteger la leche de
agriarse. Este proceso, con el cual se mata la mayoría de microorganismos
contenidos en una sustancia, se denomina hoy, en honor a Pasteur,
pasteurización.
La pregunta sobre la naturaleza de la fermentación no preocupó solamente a
Pasteur. En 1810 Joseph Louis Gay-Lussac (1778-1850) demostró que en la
fermentación de jugo de uva a partir de azúcar de uva (glucosa) se origina
alcohol etílico y el gas dióxido de carbono. A mediados del siglo XIX, el famoso
químico alemán Justus von Liebig (1803-1873) propuso una teoría. Alegó que
para la formación de alcohol intervenía un puro proceso químico y no un
proceso biológico. Liebig encontró sencillamente ridículo que la fermentación
fuera producida por pequeños seres microscópicos. Más bien deberían ser
“vibraciones” en la descomposición de la materia orgánica sobre la
transferencia de azúcar y su transformación a CO2 y a alcohol. En todas las
fermentaciones alcohólicas se encontraban sin embargo, levaduras, o sea
seres vivos.
Louis Pasteur, todavía al principio de su carrera científica, empezó una lucha
científica vehemente con la autoridad internacional Justus von Liebig: “¡Sin
levaduras vivas no hay alcohol!” insistía tercamente Pasteur. Liebig se burló por
otro lado: “Cierta gente que piensa que el proceso de fermentación se debe a
animalcules (animalitos), se parecen a los niños que creen que la circulación
del río Rhin la producen las palas de las ruedas de los molinos de agua que se
encuentran en su orilla”. La disputa se inclinó hacia un lado y hacia el otro
durante años. Finalmente se decidió tras la muerte de ambos.
Pasteur divulgó en 1876 los resultados de dos décadas en un libro de
envergadura. “La fermentación es la respiración sin oxígeno”, aclaró Pasteur.
Sirve como “impulso” de los seres vivos, para generar energía. Todos los seres
vivos requieren energía para la vida. Obtienen esta energía en su metabolismo
principalmente mediante la asimilación de azúcares, grasa y proteínas en sus
células corporales. El azúcar, por ejemplo, se quema en las células
produciendo dióxido de carbono y agua como desecho. Ambos productos
abandonan las células. La energía liberada entonces es utilizada por el cuerpo,
por ejemplo, para el movimiento de sus músculos. Para esta combustión “fría”
las células necesitan el oxígeno del aire, como es necesario en la combustión
“caliente” de la madera a ceniza. Sin oxígeno, los animales y las plantas
superiores no pueden generar energía y por consiguiente no viven. Los
microorganismos poseen, en cambio, un tipo de respiración de emergencia en
ausencia de oxígeno: la fermentación. Seguramente esta solución de
emergencia proviene de los inicios de la vida, pues en la Tierra aún no había
oxígeno. Se liberó más tarde por las plantas a partir de agua (fotosíntesis).
47
Antes, en una atmósfera pobre en oxígeno, la fermentación fue para los
microbios antiguos la forma normal de obtener energía.
¿Tenía razón Pasteur, pues, al decir que sin microbios no es posible la
fermentación? Moritz Traube (1826-1894), un estudiante de Liebig, dijo ya en
1858 que las fermentaciones no vienen necesariamente de la actividad de las
levaduras, sino que más bien constan de procesos químicos, que son
reductores. Traube caracterizó los fermentos por primera vez como materiales
proteicas que actúan catalíticamente, como moléculas químicas definidas, que
pueden actuar por su propia oxidación y reducción en los organismos, pero
también en reacciones de oxidación y reducción fuera de las células vivas.
Dividió los fermentos, en consecuencia, según el tipo de reacción. Más tarde
señaló la necesidad de contacto molecular directo entre la enzima y el sustrato
para la reacción. Has ahora no se menciona en la bibliografía de la historia de
la bioquímica que él ya formuló las consideraciones cualitativas para la cinética
de las reacciones, y por primera vez la dependencia del tiempo de reacción y la
cantidad de fermento.
En 1897. Eduard Buchner (1860-1917) realizó el experimento decisivo, que
acabó con la lucha entre Liebig y Pasteur.
48
Anexo IV
Durante los últimos 20 años, como resultado de la difusión del nuevo
paradigma tecnológico, el proceso de vinificación se han transformado, el
enólogo necesita herramientas eficaces para conseguir los vinos que ha
planificado. Los avances biotecnológicos en enología permiten resolver tres
tipos de problemas técnicos en el proceso de fermentación (Combina, 2007):
 La selección de levaduras y bacterias lácticas: la levadura es la
responsable de la mayor parte de la transformación del azúcar del mosto
de la uva en etanol durante la primera fermentación. La selección de
levaduras permite aumentar la calidad y consistencia del vino. Durante la
elaboración del vino, se realiza una segunda fermentación a partir de
bacterias lácticas. Por estos motivos las bodegas utilizan en forma
creciente levaduras y bacterias comerciales.
 El mejoramiento del proceso de fermentación a partir del desarrollo
de enzimas: la I+D en enzimas busca reducir los tiempos de producción
y lograr mejores características del producto final. Al acelerar los
procesos de clarificación durante la fermentación y la maduración, las
enzimas aumentan la rentabilidad, y al mejorar las características de
color y aroma durante la maceración permiten lograr una diferenciación
de producto consistente en el tiempo.
 Desarrollo de bio-controladores para evitar la formación de
compuestos tóxicos y defectos en los vinos: existen levaduras que
pueden inhibir el desarrollo de ciertos microorganismos en el mosto del
vino que generan defectos en el sabor del vino o que justifican la
aplicación de barreras para-arancelarias en la Unión Europea.
49
Anexo V
Oenococcus oeni es la principal especie de este género, nombre que fue
propuesto para la especie conocida hasta entonces como Leuconostoc eonos.
Ates se consideraban Leuconostoc porque son cocos y realizan la fermentación
heteroláctica, o sea, que fermentan los azúcares produciendo otros
compuestos además de ácido láctico, sobre todo CO2 y también ácido acético y
etanol en pequeñas cantidades. Sin embargo, Oenococcus tiene unas
características exclusivas, que lo hacen diferente de Leuconostoc: su hábitat es
exclusivamente el mosto y el vino, pueden crecer al pH del vino (entre 3 y 4), y
toleran el etanol, un 10% (v/v) y más. O.oeni es la especie predominante en la
FML de vinos, si bien en algunos casos se ha comprobado que esta
fermentación la realizan otras especies, como Lactobacillus plantarum.
El dato más relevante para proponer que Oenococcus era otro género distinto
fue la comprobación, por comparación de las secuencias del ARN ribosomal,
de que filognéticamente está bien separado de Leuconostoc y otras especies
de bacterias lácticas.
50
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