INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

BIOQUÍMICA MICROBIANA
1
HIPÓTESIS

Se sabe que E. coli es capaz de utilizar lactosa como fuente de carbono y energía. Su
enzima β-galactosidasa responsable del metabolismo, se sintetiza más rápido en presencia
de lactosa y con una concentración pequeña de glucosa (1).
Si ponemos a crecer E. coli en un medio con glicerol y después de un tiempo agregamos
lactosa podremos ver una inducción en la síntesis de β-galactosidasa, en cambio si a esta
misma después de un tiempo y la lactosa se le adiciona glucosa se esperara provocar un
efecto represor en la síntesis.

DISEÑO EXPERIMENTAL.

a) Obtención de cultivo
Para el desarrollo de la práctica se obtuvo un cultivo de Escherichia coli en un matraz que
contenía 50 ml de medio de cultivo adicionado de glicerol para una concentración final de
0.5%. El cultivo se incubo a 37
o
C en agitación durante 18 horas, se adicionó con glicerol y
se utilizó posteriormente para la determinación la actividad de la β-galactosidasa.

Del cultivo anterior se inocularon con 10ml dos matraces Erlenmeyer que contenían 200 ml
del mismo medio sintético, uno adicionado de glicerol para observar la actividad basal de la
cepa con una concentración final de 0.5 % y otro de lactosa con una concentración final del
1% se incubaron a 37
o
C en agitación durante 6 horas. Las células se cosecharon por
centrifugación, se lavaron dos veces con regulador de fosfatos y el paquete celular se
resuspendió en regulador. La lactosa adicionada permitió la inducción de la síntesis de la β-
galactosidasa al ser transformada en alolactosa por la misma enzima que se encuentra en
niveles basales y esta alolactosa actuará a manera de inductor para la expresión de los
genes contenidos en el operón lac.

b) Determinación de la actividad de la β-galactosidasa
Cada una de las dos suspensiones de células obtenidas, se ajustó a 1.0 de absorbencia a
600 nm para igualar concentraciones y a 10ml de cada suspensión se le agrego 1 ml de
tolueno. El tolueno solubiliza la membrana de la célula ayudando a la permeabilidad y
liberación de la β-galactosidasa al medio, se agito en vortex para homogenizar y se colocó
en baño de hielo. Posteriormente en una celda espectrofotométrica se colocó 3.8 ml de
regulador de fosfatos, 0.1 ml de ONPG (ortonitro fenil galactopiranósido) y 0.1 ml de la
suspensión celular, se agitó y se leyó inmediatamente a 420 nm. Las lecturas se registraron
desde el tiempo cero y cada minuto durante 10 minutos.

El ONPG es un sustrato de la β-galactosidasa que al ser hidrolizado produce un compuesto
(ortonitrofenol) que presenta un intenso color amarillo con el que se puede medir la
concentración de β-galactosidasa en función de la intensidad del color. El tolueno ayuda al
contacto de la β-galactosidasa y el ONPG.

El aparato se ajustó a cero de absorbancia con una celda que contenía solamente 3.9 ml de
regulador de fosfatos y 0.1 ml de ONPG.

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c) Velocidad de inducción y represión catabólica
Se inoculó con 20 ml de cultivo de 18 horas (inciso a) a un matraz Erlenmeyer que contenía
200 ml de medio sintético adicionado de glicerol y fueron incubados a 37
o
C en agitación
durante 3 horas.
Durante el inicio del experimento se retiró una alícuota de 10 ml (tiempo 0) y se adicionó al
cultivo que quedaba en el matraz un volumen de lactosa estéril para una concentración final
de 1.2 % para producir la inducción de los genes contenidos en el operón lac, ya que la
alolactosa reconocería su sitio de afinidad en la proteína represora ubicada sobre la región
promotora del operador ocasionando la perdida de afinidad por la región promotora
dejándola libre para ser reconocida por la RNA polimerasa y llevar a cabo la síntesis
(expresión) de los genes estructurales del operón, entre ellos a la β- galactosidasa, dicha
expresión de estos genes irá aumentando en función del tiempo teniendo así un aumento en
la cantidad de dicha enzima en las células. Se incubó a 37
o
C en agitación y se siguió
retirando alícuotas de 10 ml a los 2.5, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos para observar la actividad.

Cuando se retiró la alícuota al tiempo 30 se adiciono el volumen de glucosa lo cual produjo
el fenómeno de represión catabólica gracias a que la glucosa al ser un mejor sustrato como
fuente de carbono y pasar directamente hacia glicólisis sin necesidad de invertir enzimas
como es el caso de la lactosa para producir glucosa y galactosa, entonces las enzimas
involucradas en su catabolismo (lactosa) serán reprimidas para evitar gastos energéticos
innecesarios en la célula y se retiraron las alícuotas de los tiempos 35, 40 y 50 minutos.
Todas las alícuotas tomadas se reciben en tubos cónicos de polipropileno para centrífuga
que contenían 0.1 ml de cloranfenicol.

Después de que se retiró la última alícuota se centrifuga a 3000 rpm/10 min, se lavan las
células con regulador de fosfatos y posteriormente se ajusta a 1.0 ml de absorbancia a 600
nm. Se trataron con tolueno y posteriormente se midió la actividad de la β-galactosidasa
conforme fue descrito en el inciso (b) efectuando dos lecturas de absorbencia, una a los 0
minutos y otra a los 10 minutos de incubación.

La determinación de la cantidad de β-galactosidasa durante la adición de lactosa y
posteriormente con glucosa se determinó de igual forma que en el inciso (b) es decir que la
β-galactosidasa actuaría sobre el sustrato ONPG el cual como se observa en la siguiente
figura al ser hidrolizado por la enzima libera galactosa y libero el o-nitro-fenol, compuesto
de color amarillo, la intensidad de color será directamente proporcional a la cantidad de β-
galactosidasa sintetizada a durante el experimento. Para tener una idea de la cantidad
contenida en cada alícuota de los diferentes tiempos los tubos cónicos estuvieron
adicionados con cloranfenicol, un antibiótico que inhibe la síntesis de proteínas bloqueando
la actividad de la enzima peptidil transferasa al unirse a la subunidad 50S
del ribosoma, evitando la formación del enlace peptídico deteniendo así la síntesis de
proteínas y por lo tanto de la β-galactosidasa, en cuanto al tolueno este es nuevamente
utilizado para la perforación de las células y la liberación de la β-galactosidasa.


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Figura 1.- Hidrólisis del ONPG por acción de la β-galactosidasa y la liberación del o-nitro-fenol, de coloración
amarilla


OBJETIVOS.

 Analizar y discutir la actividad de la β-galactosidasa en Escherichia coli, a partir de
suspensiones de células crecidas en glicerol y lactosa con y sin tolueno.
 Demostrar el papel de la lactosa sobre la inducción del operón lactosa en
Escherichia coli.
 Demostrar el papel de la glucosa sobre la represión del operón lactosa en
Escherichia coli.

REGISTRO DE DATOS

Tabla 1.- Actividad de la β-galactosidasa en E. coli

Tiempo de incubación
Suspensión de la células de E. coli crecidas en:
Glicerol
Lactosa
ΔAbs
Glicerol
Lactosa
Con
Tolueno
Sin
tolueno
ΔAbs
Con
Tolueno
ΔAbs
Sin
tolueno
Absorbencia a 420 nm
0 0.299 0.336 0.334 0 0 0
1 0.296 0.456 0.367 0 0.12 0.033
2 0.295 0.551 0.382 0 0.215 0.048
3 0.299 0.666 0.400 0 0.33 0.066
4 0.305 0.774 0.419 0.006 0.438 0.085
5 0.307 0.869 0.440 0.008 0.533 0.106
6 0.312 0.958 0.453 0.013 0.622 0.119
7 0.315 1.046 0.479 0.016 0.71 0.145
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4
8 0.318 1.128 0.501 0.019 0.792 0.167
9 0.324 1.202 0.518 0.025 0.866 0.184
10 0.328 1.272 0.537 0.029 0.936 0.203



Tabla 2.- Abs obtenidas en la determinación de la a velocidad de inducción y represión
catabólica de β- galactosidasa en E.coli

Tiempo de
incubación
Determinación de la actividad de la β-
galactosidasa
Abs. a 420 nm ΔAbs

t0' t10' (t0'-t10')
0 0.119 0.097 0.022 0.1483
10 0.147 0.155 0.008 0.0894
20 0.215 0.323 0.108 0.3285
30 0.265 0.513 0.348 0.5899
35 0.179 0.600 0.421 0.6488
40 0.161 0.438 0.277 0.5263
50 0.149 0.447 0.298 0.5458
60 0.152 0.424 0.272 0.5215

-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 2 4 6 8 10 12
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

a

4
2
0

n
m

Tiempo (min)
Grafica 1.- Actividad de la β-galactosidasa en E. coli
ΔAbs Glicerol
Δabs Lactosa Con Tolueno
ΔAbs Lactosa Sin Tolueno
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DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En la grafica1 se observa el comportamiento de la β-galactosidasa en un cultivo de
Escherichia coli el cual se hizo crecer en 2 medios diferentes, uno con lactosa y otro con
glicerol, a los cuales se les realizo un tratamiento con tolueno. Se observó que el cultivo
crecido en lactosa que se trató con tolueno presento una alta actividad de la enzima β-
galactosidasa, mientras que el medio crecido en glicerol también presento una pequeña
cantidad de la enzima que se encuentra en estado basal, en cuanto al medio crecido en
lactosa al cual no se le realizo un tratamiento con tolueno presento una actividad del 20%
(comprando las pendientes ) con respecto al que se le realizo el tratamiento con tolueno,
quedando demostrado su efectividad para su uso como un medio que facilita la
permeabilidad de las membranas celulares. Con lo dicho anteriormente comprobamos quela
enzima β-galactosidasa que es sintetizada por el operon lactosa es inducible cuando en el
medio de crecimiento se encuentra presente la lactosa, y en caso de no estar presente solo
se sintetizara la enzima β-galactosidasa en su estado basal.
En la gráfica 2 (cinética de inducción y represión catabólica) notamos que al adicionar la
lactosa la enzima β-galactosidasa no se sintetizara inmediatamente, esta requerirá de un
tiempo de adaptación el cual al observar la gráfica fue de 10 minutos, tras los cuales la
síntesis y actividad dela enzima fue aumentando, al cabo de 30 minutos se adiciono glucosa,
observando también que tardo 5 minustos en detener la síntesis de β-galactosidasa,
después de este tiempo se observó una disminución de la actividad enzimática para
después estabilizarse ya que la enzima nunca se reprimirá totalmente. Con lo anterior
comprobamos que la glucosa es un represor catabólico del operon lactosa debido a que
Escherichia coli en el operon lactosa se presenta cuando la proteína CRP se encuentra en
forma de dímero y solo es activa cuando lleva unido AMPc para poder sintetizar la enzima β-
galactosidasa. El alto contenido de AMPc es debido a que en ausencia de transporte de
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 10 20 30 40 50 60 70
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

a

4
2
0

n
m

Tiempo (min)
Grafica 2.- Cinética de Induccion y Represion catabólica de β-
galactosidasa en E. coli
Δ Abs
Series2
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glucosa al interior celular se aumenta la actividad de la adelinato ciclasa (enzima encargada
de la síntesis de AMPc) y empieza a consumir lactosa para poder obtener energía para su
metabolismo. Por lo tanto, sin CRP o sin AMPc el sistema permanecería cerrado. Esto unido
al hecho de que la glucosa disminuía los niveles de AMPc daba la explicación por la cual la
glucosa ejercía una represión por catabolito.


CONCLUSIONES

 Se comprobó experimentalmente la actividad de la β-galactosidasa en Escherichia
coli, a partir de suspensiones de células crecidas en diferentes medios, dando como
resultado la mayor actividad al medio con lactosa toluenizada, y menor en el de
glicerol, esto indica que existe la síntesis de β-galactosidasa, el operón lactosa
también está sujeto a un control de tipo positivo, de manera que existe una proteína
que estimula la transcripción de los genes estructurales.

 Se demostró que la lactosa es un inductor del operón lactosa y la glucosa es un
represor en Escherichia coli. Se trata. por tanto de un sistema general de control
positivo que se denomina represión catabólica. Cuando E. coli crece en un medio
con glucosa, los niveles de AMPc son muy bajos y como consecuencia no se
transcriben los operones de otros azúcares.
.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

 “BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA” Smith y Wood. Editorial Addison-Wesley
Iberoamericana. Universiada Panamericana México. pp 112-132.

 http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Operon/Operon.htm