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PROCESO DE CRIOPRESERVACION DE LA SPIRULINA
Grupo Bioprocesos 2014-2, Universidad del Atlántico


INTRODUCCIÓN

La SpirulinaPlatensises es una cianobacteria filamentosa que crece en aguas alcalinas y se
caracteriza por tener largas cadenas espiraladas, tiene un pigmento azul llamado ficocianina, la cual
junto a la clorofila les ayudan al proceso de la fotosíntesis, son procariotas debido a que carecen de
membrana nuclear y por consiguiente su material genético se encuentra disperso en el citoplasma.
Posee una alta concentración de nutrientes, por esta razón se cultiva en diversos países
industrializados para la producción de suplementos alimenticios y podría convertirse en un alimento
para aliviar la situación de hambruna en aquellos lugares donde se encuentren fuentes de aguas
alcalinas.
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Debido a los múltiples problemas originados por la contaminación de cepas de spirulina en
laboratorios, la criopreservación ha sido una opción muy confiable para el mantenimiento de las
cepas, debido a que es un proceso en el cual las células son congeladas a muy bajas temperaturas,
con lo cual se disminuyen las funciones vitales del organismo y se puede mantener en condiciones
de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas
las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente
detenidas.
Normalmente en los procesos de criopreservación, para que una muestra biológica esté durante
mucho tiempo sin perder sus propiedades, debido al congelamiento, se utiliza nitrógeno y helio, los
cuales tiene puntos de ebullición por debajo de los -80 °C.
Los problemas principales de proceso de criopreservacion están dados en las etapas iniciales y
finales del proceso (congelación y descongelación), en los cuales se afecta gravemente a la célula
por formación de cristales en la etapa de congelación, los cuales actúan como cuchillas y cortan las
estructuras internas de las células. El hielo que evidentemente va a estar presente en la
conformación del medio, está en constante movimiento en el rango entre los 0 y -30 °C por lo que
el efecto cuchilla tiene un periodo largo, lo que atenta contra la vida de la microalga. Además, para
realizar la descongelación de la microalgas a diferentes composiciones, se debe eliminar
rápidamente la presencia intra y extracelular de los crioprotectores, en este caso el glicerol, el cual
suele volverse tóxico a elevadas concentraciones.
La utilización de crioprotectores como el glicerol, el cual es un agente penetrante en la membrana y
de bajo peso molecular que sirve para preservar las microalgas alrededor de 0 °C, tiene como
principal función desplazar el agua intracelular evitando la formación de cristales de hielo.
Sin duda alguna es un gran desafío criopreservar algas como la spirulina con un agente como el
glicerol, debido a que se facilitarán muchos procesos para mejores prácticas en cuanto a cultivos de
microalgas, y posterior aplicabilidad en esta industria.

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ANTECEDENTES

Muchas han sido las investigaciones realizadas a lo largo de la historia de la humanidad con el fin
de desarrollar los procedimientos y nuevas investigaciones acerca de la criopreservacion de
diferentes especies teniendo en cuenta los grandes beneficios que se obtienen. Se han utilizado
medios de criopresevacion variantes dependiendo de las capacidades económicas y de la
infraestructura disponible para la realización de estos procedimientos.

Se han realizado en la Universidad de Texas procedimientos mediante el cual se han criopreservado
un total de aproximadamente 200 cepas de cianobacterias en la colección UTEX de algas que se
encuentra en el departamento de Botánica de la Universidad de Texas en Austin. Esto incluye
organismos unicelulares, ramificación y especies filamentosas unbranching, especies marinas y de
agua dulce, y los que tienen heterocistos y akinetes. También se han almacenado con éxito varios
mutantes de fotosíntesis de las especies de cianobacterias. Los procedimientos requeridos son
sencillos y de bajo costo, pero requieren una atención a algunos detalles. El cien por ciento de
viabilidad nunca se espera, pero viabilidades más de 50% son típicos. Altas viabilidades (es decir,>
10%) son especialmente deseables para las cepas mutantes
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.

También se ha evaluado la crioconservación de la Plasmodium juxtanucleare, el cual es un parásito,
a cuatro concentraciones de glicerol (GC) a 20%, 16%, 12% y 8%, en donde se inocularon con
sangre caliente después de almacenamiento a -196 ° C durante seis meses. El parámetro biológico
mostró que la parasitemia fue directamente proporcional a la concentración de glicerol.

También han sido realizados estudios para el aislamiento y caracterización de bacterias diazotrofas
del genero Azotobacter para lo cual se realizó un muestreo de suelo en cultivos de hortalizas
ubicados en el departamento de Boyacá, el aislamiento se realizó en medio Ashby-Sacarosa libre
de nitrógeno. Posteriormente, los aislamientos fueron criopresevados utilizando glicerol al 50%
puro y estéril
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.

Han surgido nuevas necesidades en los temas referentes a la criopreservacion, porque se está
tratando de mejorar los procesos, haciéndolos más eficientes y con medios de más bajo costo pero
de igual rendimiento. De ahí la gran variedad de investigaciones relacionadas con todo lo referente
a criopreservacion de organismos vivos.


OBJETIVOS

 Determinar la concentración de glicerol adecuada para la criogenización del cultivo de
SpirulinaPlatensis.
 Determinar el tiempo máximo de criogenización de la SpirulinaPlatensis en glicerol.
 Plantear las posibles razones de muertes de la SpirulinaPlatensis


MEDIO BG-11

Hay muchos cultivos para el crecimiento de las cianobacterias, los más frecuentes son los
encontrados la tabla 1, el medio que prepararemos será el BG-11, el cual se caracteriza por manejar
concentraciones de nitrógeno muy altas y concentraciones de fósforo muy baja. La preparación de
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este medio da como resultado una concentración de nitrógeno de 17.6481mM la SpirulinaPlatensis
necesita un medio el cual tenga una concentración de aproximadamente 8mM por lo cual es
necesario una disolución de este medio. Por lo cual para una preparación de un mililitro de cultivo
se realizará la disolución de este hasta su concentración de nitrógeno deseada.








MEDIO DE CULTIVO
BG-11
1
ZARROUK
2
NUTRIFOLIAR
3

COMPONENTE Concentración en g/L
NaNO
3
1,5 2,5
K
2
HPO
4
.7H
2
0 0,04 0,5 50
MgSO4*7H
2
0 0,075 0,2
CaCl
2
.2H
2
O 0,036 0,04
HNO
3
0,006 0,08
Citrato Amónico Férrico 0,006
Na
2
CO
3
0,02
EDTA(Sal de Na
2
Mg) 0,001 0,08
K
2
SO
4
1
NaCl 1
FeSO
4
.7H
2
O 0,01 1
NaHCO
3
16,8
H
3
BO
3
0,00284 2,86 1,5
MnCl
2
.4H
2
O 0,00180 1,81 1
ZnSO
4
.4H
2
O 0,00022 0,222 5
Na
2
MoO
4
0,00033 0,0177 0,03
CuSO
4
.5H
2
O 0,00008 0,079 2,5
Nitrógeno Amoniacal 40
Nitrógeno ureico 160
P
2
O
5
100
MgO 10
Azufre total 14
Fitohormona (ANA) 0,5
CoSO
4
.7H
2
O 0,00005
Tabla 1: Composiciones de varios medios de cultivo de SpirulinaPlatensis
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El volumen de BG-11 para el cultivo de microalga conservada en 5% de glicerol será el siguiente:
la muestra es de 1ml, por lo cual la microalga se centrifugará y se retirará el glicerol, por tanto, el
volumen de microalga que se pondrá a cultivar será de 0.95 ml.

Esta cantidad de medio se le adicionara, a cada uno de los días, cuyas muestras de microalgas
provenga al 5% de glicerol. Estos respectivo cálculos se empelarán a cada una de las
concentraciones restantes.
Para un volumen de 0.90ml

Para un volumen de 0.85ml

Para un volumen de 0.80ml

Para un volumen de 0.75ml

Para un volumen de 0.70ml

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METODOLOGIA.

Ubicación.

Este proyecto de investigación preliminar fue desarrollado en la Universidad del Atlántico, en la
ciudad de Puerto Colombia -Colombia.

Materiales y reactivos.
Equipos
 Cámara de Neubauer
 Balanza analítica
 Esterilizador


Materiales
 Estante metálico
 Tubos de ensayo
 Tubos eppendorf
 Dos lámparas de luz blanca
 Pipetas
 Erlenmeyers
 Vidrio reloj
 Frascos pequeños para toma de muestras
 Mangueras
 Beakers
 Papel aluminio

Reactivos
 NaNO3
 K2HPO4
 MgSO4*7H2O
 CaCl2*2H2O
 HNO3
 Citrato Férrico de Amonio
 EDTA
 Na2CO3
 Agua destilada
 H3BO3
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 MnCl2* 4H2O
 ZnSO4* 7H2O
 Na2MoO4* 2H2O
 Cu2SO4* 5H2O
 Co(NO3)2* 6H2O
 NaOH
Nota: todos los materiales fueron esterilizados antes de ser usados
CRIOGENIZACIÓN
Sacar muestras del cultivo de Spirulina Platensises con una pipeta esterilizada y llenar los tubos
eppendorf con los diferentes porcentajes de muestra que se van a utilizar, ya sean 95%, 90%, 85%,
80%, 75% y 70% v/v y posteriormente añadirle los diferentes porcentajes de glicerol a cada tubo
hasta completar el 100%. Todo esto se debe hacer en un medio estéril, el cual se crea por medio del
calor que genera un mechero encendido. Luego estas muestras se guardarán en diferentes bolsas,
clasificándolas de acuerdo al porcentaje de muestra de cultivo y se guardarán en un congelador.

DESCONGELAMIENTO
Para esta parte del proceso, se sacan las muestras del congelador que corresponden a los 15, 30, 45,
60,75 y 90 días según la fecha que corresponda y se descongelan las muestras en agua calentada a
37°C, luego se centrifugan las muestras para retirarles el crioprotector y el cultivo de algas se
agrega al medio óptimo para su crecimiento en tubos de ensayo. El cultivo estará expuesto a 12
horas de luz y otras doce sin ella. Se hará el conteo de las algas utilizando una cámara de Neubauber
el día que se sacan del congelador y se colocan en el medio y posteriormente se hará conteo una
semana después con el fin de saber si las algas han sobrevivido.

PREPARACIÓN DEL MEDIO BG-11
Para el cultivo, posterior a la criogenización, se trabajará con el medio estándar BG11. Los
reactivos necesarios y la cantidad requerida para su preparación se presentan en la tabla

N° COMPONENTE CANTIDAD
1 NaNO3 1.5 g
2 K2HPO4 0,04 g
3 MgSO47H2O 0,075 g
4 CaCl2 2H2O 0,036 g
5 HNO3 0,006 g
6 Citrato Férrico de Amonio 0,006 g
7 EDTA 0,001 g
8 Na2CO3 0,02 g
7

9 Mezcla de trazas de metales 1 (mL)
10 Agua destilada 1 (L)

Tabla 2: Cantidad de cada reactivo para la preparación del cultivo

La mezcla de trazas de metales se prepara utilizando los componentes mostrados en la tabla 3.
N° COMPONENTE CANTIDAD
1 H3BO3 2,86 g
2 MnCl2 4H2O 1,81 g
3 ZnSO4 7H2O 0,222 g
4 Na2MoO4 2H2O 0,39 g
5 Cu2SO4 5H2O 0,079 g
6 Co(NO3)2 6H2O 0,049 g
7 Agua destilada 1 (L)
Tabla 3: trazas de metales para el medio BG-11
El procedimiento para la preparación del medio BG11 se realizará de la siguiente manera:
1. Se prepara la solución de mezcla de trazas de metales en un 1 L de agua destilada.
2. Se prepara el medio de cultivo BG11 en 600 mL de agua destilada y se agrega 1ml de la
solución de mezcla de trazas de metales.
3. El volumen obtenido de medio de cultivo se afora hasta completar 1L con agua destilada.
4. Se esteriliza el medio y se refrigera.

DETERMINACIÓN TOTAL DEL VOLUMEN DE MICROALGA NECESARIO PARA
REALIZAR TODOS LOS EXPERIMENTOS
Para la criogenización en glicerol de la SpirulinaPlatensis, se trabajaran diferente concentración de
glicerol la cuales sera al 5,10,15,20,25,30% de glicerol, también se tomara un intervalo de días que
sera de 15,30,45,60,75,90 días, se realizarán dos muestras por cada día y cada concentración para
un total de 60 muestras (incluidas las repeticiones). Como se muestra en el diagrama que se
presenta a continuación:
Día No.\ concentración de
glicerol
5% 10% 20% 25% 30%
15 días 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
30 días 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
45 días 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
60 días 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
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75 días 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
90 días 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
Tabla 4: Cantidad de muestras a criogenizar con sus respectivos días de congelación y concentración de glicerol
Por lo cual la cantidad de microalga que necesitaremos se estimará de la siguiente manera: para
concentración necesitamos dos muestras, para cada uno de los días. Entonces supondremos
volúmenes aditivos para facilidad del cálculo preliminar.

(

)
Donde:

: Sera el volumen al cual llenaremos los tubos que posteriormente congelaremos
Para una concentración de 5%

( )

Concentración al 10%

( )
Concentración al 15%

( )
Concentración al 20%

( )
Concentración al 25%

( )
Concentración al 30%

( )
Total volumen cultivo: 59.4mL aproximadamente


BIBLIOGRAFÍA

[1] Carlos Niño Martínez, David Londoño Martínez, Evaluación del crecimiento de
Spirulinaplantesis sobre un efluente de suero de quesería. Universidad de la sabana, pagina 22,
2006, http://intellectum.unisabana.edu.co:8080/jspui/bitstream/10818/5088/1/130003.pdf

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[2] Cryopreservation of Cyanobacteria By Jerry J. Brand, Botany Dept., Univ. of Texas at Austin
Consultado el 31/08/14. Disponible en: http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/protocols/cryo.html

[3] CRYOPRESERVATION OF Plasmodium (Novyella) juxtanucleare WITH GLYCEROL. By
Aulo C. A. Souza, Carina Elisei, Cleber O. Soares y Carlos L. Massard. Citado el 31/08/14.
Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-07202000000100003

[4] Caracterización moléculas de cepas nativas colombianas de Azotobacter spp. Mediante el
análisis de restricción del DNA Ribosomal 16s. Citado el 31/08/14. Disponible en:
http://hermes.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis14.pdf