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PROCESO DE CRIOPRESERVACION DE LA SPIRULINA


Grupo Bioprocesos 2014-2, Universidad del Atlntico


INTRODUCCIN

La SpirulinaPlatensises es una cianobacteria filamentosa que crece en aguas alcalinas y se
caracteriza por tener largas cadenas espiraladas, tiene un pigmento azul llamado ficocianina, la cual
junto a la clorofila les ayudan al proceso de la fotosntesis, son procariotas debido a que carecen de
membrana nuclear y por consiguiente su material gentico se encuentra disperso en el citoplasma.
Posee una alta concentracin de nutrientes, por esta razn se cultiva en diversos pases
industrializados para la produccin de suplementos alimenticios y podra convertirse en un alimento
para aliviar la situacin de hambruna en aquellos lugares donde se encuentren fuentes de aguas
alcalinas.
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Debido a los mltiples problemas originados por la contaminacin de cepas de spirulina en
laboratorios, la criopreservacin ha sido una opcin muy confiable para el mantenimiento de las
cepas, debido a que es un proceso en el cual las clulas son congeladas a muy bajas temperaturas,
con lo cual se disminuyen las funciones vitales del organismo y se puede mantener en condiciones
de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biolgica, incluidas
las reacciones bioqumicas que produciran la muerte de una clula, quedan efectivamente
detenidas.
Normalmente en los procesos de criopreservacin, para que una muestra biolgica est durante
mucho tiempo sin perder sus propiedades, debido al congelamiento, se utiliza nitrgeno y helio, los
cuales tiene puntos de ebullicin por debajo de los -80 C.
Los problemas principales de proceso de criopreservacion estn dados en las etapas iniciales y
finales del proceso (congelacin y descongelacin), en los cuales se afecta gravemente a la clula
por formacin de cristales en la etapa de congelacin, los cuales actan como cuchillas y cortan las
estructuras internas de las clulas. El hielo que evidentemente va a estar presente en la
conformacin del medio, est en constante movimiento en el rango entre los 0 y -30 C por lo que
el efecto cuchilla tiene un periodo largo, lo que atenta contra la vida de la microalga. Adems, para
realizar la descongelacin de la microalgas a diferentes composiciones, se debe eliminar
rpidamente la presencia intra y extracelular de los crioprotectores, en este caso el glicerol, el cual
suele volverse txico a elevadas concentraciones.
La utilizacin de crioprotectores como el glicerol, el cual es un agente penetrante en la membrana y
de bajo peso molecular que sirve para preservar las microalgas alrededor de 0 C, tiene como
principal funcin desplazar el agua intracelular evitando la formacin de cristales de hielo.
Sin duda alguna es un gran desafo criopreservar algas como la spirulina con un agente como el
glicerol, debido a que se facilitarn muchos procesos para mejores prcticas en cuanto a cultivos de
microalgas, y posterior aplicabilidad en esta industria.

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ANTECEDENTES

Muchas han sido las investigaciones realizadas a lo largo de la historia de la humanidad con el fin
de desarrollar los procedimientos y nuevas investigaciones acerca de la criopreservacion de
diferentes especies teniendo en cuenta los grandes beneficios que se obtienen. Se han utilizado
medios de criopresevacion variantes dependiendo de las capacidades econmicas y de la
infraestructura disponible para la realizacin de estos procedimientos.

Se han realizado en la Universidad de Texas procedimientos mediante el cual se han criopreservado
un total de aproximadamente 200 cepas de cianobacterias en la coleccin UTEX de algas que se
encuentra en el departamento de Botnica de la Universidad de Texas en Austin. Esto incluye
organismos unicelulares, ramificacin y especies filamentosas unbranching, especies marinas y de
agua dulce, y los que tienen heterocistos y akinetes. Tambin se han almacenado con xito varios
mutantes de fotosntesis de las especies de cianobacterias. Los procedimientos requeridos son
sencillos y de bajo costo, pero requieren una atencin a algunos detalles. El cien por ciento de
viabilidad nunca se espera, pero viabilidades ms de 50% son tpicos. Altas viabilidades (es decir,>
10%) son especialmente deseables para las cepas mutantes
2
.

Tambin se ha evaluado la crioconservacin de la Plasmodium juxtanucleare, el cual es un parsito,
a cuatro concentraciones de glicerol (GC) a 20%, 16%, 12% y 8%, en donde se inocularon con
sangre caliente despus de almacenamiento a -196 C durante seis meses. El parmetro biolgico
mostr que la parasitemia fue directamente proporcional a la concentracin de glicerol.

Tambin han sido realizados estudios para el aislamiento y caracterizacin de bacterias diazotrofas
del genero Azotobacter para lo cual se realiz un muestreo de suelo en cultivos de hortalizas
ubicados en el departamento de Boyac, el aislamiento se realiz en medio Ashby-Sacarosa libre
de nitrgeno. Posteriormente, los aislamientos fueron criopresevados utilizando glicerol al 50%
puro y estril
4
.

Han surgido nuevas necesidades en los temas referentes a la criopreservacion, porque se est
tratando de mejorar los procesos, hacindolos ms eficientes y con medios de ms bajo costo pero
de igual rendimiento. De ah la gran variedad de investigaciones relacionadas con todo lo referente
a criopreservacion de organismos vivos.


OBJETIVOS

Determinar la concentracin de glicerol adecuada para la criogenizacin del cultivo de
SpirulinaPlatensis.
Determinar el tiempo mximo de criogenizacin de la SpirulinaPlatensis en glicerol.
Plantear las posibles razones de muertes de la SpirulinaPlatensis


MEDIO BG-11

Hay muchos cultivos para el crecimiento de las cianobacterias, los ms frecuentes son los
encontrados la tabla 1, el medio que prepararemos ser el BG-11, el cual se caracteriza por manejar
concentraciones de nitrgeno muy altas y concentraciones de fsforo muy baja. La preparacin de
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este medio da como resultado una concentracin de nitrgeno de 17.6481mM la SpirulinaPlatensis
necesita un medio el cual tenga una concentracin de aproximadamente 8mM por lo cual es
necesario una disolucin de este medio. Por lo cual para una preparacin de un mililitro de cultivo
se realizar la disolucin de este hasta su concentracin de nitrgeno deseada.








MEDIO DE CULTIVO
BG-11
1
ZARROUK
2
NUTRIFOLIAR
3

COMPONENTE Concentracin en g/L
NaNO
3
1,5 2,5
K
2
HPO
4
.7H
2
0 0,04 0,5 50
MgSO4*7H
2
0 0,075 0,2
CaCl
2
.2H
2
O 0,036 0,04
HNO
3
0,006 0,08
Citrato Amnico Frrico 0,006
Na
2
CO
3
0,02
EDTA(Sal de Na
2
Mg) 0,001 0,08
K
2
SO
4
1
NaCl 1
FeSO
4
.7H
2
O 0,01 1
NaHCO
3
16,8
H
3
BO
3
0,00284 2,86 1,5
MnCl
2
.4H
2
O 0,00180 1,81 1
ZnSO
4
.4H
2
O 0,00022 0,222 5
Na
2
MoO
4
0,00033 0,0177 0,03
CuSO
4
.5H
2
O 0,00008 0,079 2,5
Nitrgeno Amoniacal 40
Nitrgeno ureico 160
P
2
O
5
100
MgO 10
Azufre total 14
Fitohormona (ANA) 0,5
CoSO
4
.7H
2
O 0,00005
Tabla 1: Composiciones de varios medios de cultivo de SpirulinaPlatensis
4

El volumen de BG-11 para el cultivo de microalga conservada en 5% de glicerol ser el siguiente:
la muestra es de 1ml, por lo cual la microalga se centrifugar y se retirar el glicerol, por tanto, el
volumen de microalga que se pondr a cultivar ser de 0.95 ml.




Esta cantidad de medio se le adicionara, a cada uno de los das, cuyas muestras de microalgas
provenga al 5% de glicerol. Estos respectivo clculos se empelarn a cada una de las
concentraciones restantes.
Para un volumen de 0.90ml





Para un volumen de 0.85ml




Para un volumen de 0.80ml





Para un volumen de 0.75ml




Para un volumen de 0.70ml








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METODOLOGIA.

Ubicacin.

Este proyecto de investigacin preliminar fue desarrollado en la Universidad del Atlntico, en la
ciudad de Puerto Colombia -Colombia.

Materiales y reactivos.
Equipos
Cmara de Neubauer
Balanza analtica
Esterilizador


Materiales
Estante metlico
Tubos de ensayo
Tubos eppendorf
Dos lmparas de luz blanca
Pipetas
Erlenmeyers
Vidrio reloj
Frascos pequeos para toma de muestras
Mangueras
Beakers
Papel aluminio

Reactivos
NaNO3
K2HPO4
MgSO4*7H2O
CaCl2*2H2O
HNO3
Citrato Frrico de Amonio
EDTA
Na2CO3
Agua destilada
H3BO3
6

MnCl2* 4H2O
ZnSO4* 7H2O
Na2MoO4* 2H2O
Cu2SO4* 5H2O
Co(NO3)2* 6H2O
NaOH
Nota: todos los materiales fueron esterilizados antes de ser usados
CRIOGENIZACIN
Sacar muestras del cultivo de Spirulina Platensises con una pipeta esterilizada y llenar los tubos
eppendorf con los diferentes porcentajes de muestra que se van a utilizar, ya sean 95%, 90%, 85%,
80%, 75% y 70% v/v y posteriormente aadirle los diferentes porcentajes de glicerol a cada tubo
hasta completar el 100%. Todo esto se debe hacer en un medio estril, el cual se crea por medio del
calor que genera un mechero encendido. Luego estas muestras se guardarn en diferentes bolsas,
clasificndolas de acuerdo al porcentaje de muestra de cultivo y se guardarn en un congelador.

DESCONGELAMIENTO
Para esta parte del proceso, se sacan las muestras del congelador que corresponden a los 15, 30, 45,
60,75 y 90 das segn la fecha que corresponda y se descongelan las muestras en agua calentada a
37C, luego se centrifugan las muestras para retirarles el crioprotector y el cultivo de algas se
agrega al medio ptimo para su crecimiento en tubos de ensayo. El cultivo estar expuesto a 12
horas de luz y otras doce sin ella. Se har el conteo de las algas utilizando una cmara de Neubauber
el da que se sacan del congelador y se colocan en el medio y posteriormente se har conteo una
semana despus con el fin de saber si las algas han sobrevivido.

PREPARACIN DEL MEDIO BG-11
Para el cultivo, posterior a la criogenizacin, se trabajar con el medio estndar BG11. Los
reactivos necesarios y la cantidad requerida para su preparacin se presentan en la tabla

N COMPONENTE CANTIDAD
1 NaNO3 1.5 g
2 K2HPO4 0,04 g
3 MgSO47H2O 0,075 g
4 CaCl2 2H2O 0,036 g
5 HNO3 0,006 g
6 Citrato Frrico de Amonio 0,006 g
7 EDTA 0,001 g
8 Na2CO3 0,02 g
7

9 Mezcla de trazas de metales 1 (mL)
10 Agua destilada 1 (L)

Tabla 2: Cantidad de cada reactivo para la preparacin del cultivo

La mezcla de trazas de metales se prepara utilizando los componentes mostrados en la tabla 3.
N COMPONENTE CANTIDAD
1 H3BO3 2,86 g
2 MnCl2 4H2O 1,81 g
3 ZnSO4 7H2O 0,222 g
4 Na2MoO4 2H2O 0,39 g
5 Cu2SO4 5H2O 0,079 g
6 Co(NO3)2 6H2O 0,049 g
7 Agua destilada 1 (L)
Tabla 3: trazas de metales para el medio BG-11
El procedimiento para la preparacin del medio BG11 se realizar de la siguiente manera:
1. Se prepara la solucin de mezcla de trazas de metales en un 1 L de agua destilada.
2. Se prepara el medio de cultivo BG11 en 600 mL de agua destilada y se agrega 1ml de la
solucin de mezcla de trazas de metales.
3. El volumen obtenido de medio de cultivo se afora hasta completar 1L con agua destilada.
4. Se esteriliza el medio y se refrigera.

DETERMINACIN TOTAL DEL VOLUMEN DE MICROALGA NECESARIO PARA
REALIZAR TODOS LOS EXPERIMENTOS
Para la criogenizacin en glicerol de la SpirulinaPlatensis, se trabajaran diferente concentracin de
glicerol la cuales sera al 5,10,15,20,25,30% de glicerol, tambin se tomara un intervalo de das que
sera de 15,30,45,60,75,90 das, se realizarn dos muestras por cada da y cada concentracin para
un total de 60 muestras (incluidas las repeticiones). Como se muestra en el diagrama que se
presenta a continuacin:
Da No.\ concentracin de
glicerol
5% 10% 20% 25% 30%
15 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
30 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
45 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
60 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
8

75 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
90 das 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras 2 muestras
Tabla 4: Cantidad de muestras a criogenizar con sus respectivos das de congelacin y concentracin de glicerol
Por lo cual la cantidad de microalga que necesitaremos se estimar de la siguiente manera: para
concentracin necesitamos dos muestras, para cada uno de los das. Entonces supondremos
volmenes aditivos para facilidad del clculo preliminar.

)
Donde:


: Sera el volumen al cual llenaremos los tubos que posteriormente congelaremos
Para una concentracin de 5%

( )

Concentracin al 10%

( )
Concentracin al 15%

( )
Concentracin al 20%

( )
Concentracin al 25%

( )
Concentracin al 30%

( )
Total volumen cultivo: 59.4mL aproximadamente


BIBLIOGRAFA

[1] Carlos Nio Martnez, David Londoo Martnez, Evaluacin del crecimiento de
Spirulinaplantesis sobre un efluente de suero de quesera. Universidad de la sabana, pagina 22,
2006, http://intellectum.unisabana.edu.co:8080/jspui/bitstream/10818/5088/1/130003.pdf

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[2] Cryopreservation of Cyanobacteria By Jerry J. Brand, Botany Dept., Univ. of Texas at Austin
Consultado el 31/08/14. Disponible en: http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/protocols/cryo.html

[3] CRYOPRESERVATION OF Plasmodium (Novyella) juxtanucleare WITH GLYCEROL. By
Aulo C. A. Souza, Carina Elisei, Cleber O. Soares y Carlos L. Massard. Citado el 31/08/14.
Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-07202000000100003

[4] Caracterizacin molculas de cepas nativas colombianas de Azotobacter spp. Mediante el
anlisis de restriccin del DNA Ribosomal 16s. Citado el 31/08/14. Disponible en:
http://hermes.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis14.pdf