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ENZIMAS INMOVILIZADAS

I. ITRODUCCION
Enzima
Enzima es cualquiera de las numerosas sustancias orgnicas especializadas compuestas por polmeros
de aminocidos, que actan como catalizadores en el metabolismo de los seres vivos. Con su accin,
regulan la velocidad de muchas reacciones qumicas implicadas en este proceso.
Catalizador biolgico (en su gran mayora protenas). En general, trabajan mejor en condiciones
ptimas para los seres vivos. La palabra en griego significa en la levadura y fue usada por primera
vez por W. Khne en 1877 para describir la actividad que Pasteur observ en las fermentaciones.
Inmovilizacin
La inmovilizacin de enzimas permite una mejora significativa de su estabilidad, lo que hace posible su
empleo en la produccin industrial de productos qumicos, farmacuticos, alimentos; en el tratamiento
de residuos; en el diagnstico y tratamiento de enfermedades, y otras muchas aplicaciones. En esta
revisin se analizan los diferentes mtodos de inmovilizacin de enzimas, y el efecto sobre las
propiedades catalticas y la estabilidad de los biocatalizadores.
La cintica de las reacciones enzimticas difiere de las reacciones inorgnicas simples. Cada enzima es
especfica de forma selectiva para la sustancia sobre la que causa la reaccin, y es ms eficaz a una
temperatura determinada. Aunque un aumento de la temperatura puede acelerar una reaccin, las
enzimas son inestables cuando se calientan. La actividad cataltica de una enzima est determinada
sobre todo por su secuencia de aminocidos y por la estructura terciaria, es decir, la estructura de
plegamiento tridimensional de la macromolcula.
II. INMOVILIZACION DE ENZIMAS
Debido a que la mayora de los enzimas son protenas globulares, estas son solubles en agua. Por lo
tanto, es muy difcil o inviable su separacin de la corriente de proceso para su reutilizacin.
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:
1.- El aumento de la estabilidad de la enzima;
2.- La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costos del proceso.
3.- La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a la
aplicacin de la enzima inmovilizada.
4.- Algunos mtodos de inmovilizacin pueden incrementar la actividad.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son:
1.- La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo.
2.- La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de
protenas inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al soporte.
3.- Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la movilizacin
4.- El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.
5.- Pueden ser ms costosos que las enzimas libres.
6.- Puede existir reduccin en la actividad debido a la transferencia de materia.
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III. MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS


Adsorcin (fsico o qumico)
En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones inicas, fuerzas
de Van der Waals y por puentes de hidrgeno.
Los principales factores que influyen en la adsorcin, son:
1. El pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de
la protena y del slido;
2. La fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la desorcin de la enzima, ya que los
iones inorgnicos se unen con ms fuerza al soporte que la protena;
3. El dimetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamao del eje mayor de la
enzima;
4. La presencia de iones que acten como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementar la
carga enzimtica del derivado.

Como principales ventajas de este mtodo destacan:
1. Su preparacin sencilla,
2. Su bajo coste,
3. No hay cambios de especificidad enzimtica,
4. Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua.

Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente:
1. La optimizacin de las variables que controlan la adsorcin
2. Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecnico,
3. La unin al soporte es dbil.

Una variante dentro de la tcnica de la adsorcin consiste en emplear resinas de intercambio inico, las
cuales contienen grupos funcionales y contraiones mviles. Estos contraiones se pueden intercambiar
reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz
insoluble.

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Mtodos fsicos
Entrampamiento
En matriz: La solucin que contiene el enzima se mezcla con un fluido polimrico que
solidifica en varias formas (usualmente en pequeas partculas). El material polimrico es
semipermeable provocando que los enzimas con alto peso molecular no difundan hacia el
exterior pero permitiendo que los sustratos pequeos difundan. Las matrices usadas son:
Alginato de calcio, agar, polyacrilamida, colgeno.
En membrana: Las soluciones enzimticas pueden ser entrampadas entre finas membranas
semipermeables: Nylon, polisulfonas, celulosa, poliacrilato.

Microencapsulacin
En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de
molculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser
permanentes (originadas por polimerizacin interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes,
tambin llamadas micelas reversas). Las microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos
comprendidos entre 1 y 100 mm de dimetro. Mediante este mtodo se pueden encapsular
simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a
cabo determinadas reacciones que suceden en mltiples pasos.

Atrapamiento
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa
constituida generalmente por prepolmeros fotoentrecruzables o polmeros del tipo poliacrilamida,
colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo
mediante la suspensin de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la
polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El
atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer
caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se
encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento, de gran
sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener
derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura. De
todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as
como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la
protena.

Mtodos qumicos
Unin a soportes.
Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una mayor informacin.
La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del
biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato,
disminuya la inhibicin, ample el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones
microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de
operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se
han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas
enzimas. Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos
los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y ms corrientemente en forma de esferas.
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Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
Soportes inorgnicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que
pueden ser:
Naturales (arcillas como la bentonita, piedra pmez, slice, etc.) o materiales manufacturados
(xidos de metales y vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no poroso, almina,
cermicas, gel de slice, etc.)
Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en:
Polmeros naturales: a su vez divididos en:
Polisacridos (celulosa, almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc.).
Protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc.).
Polmeros sintticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno)
Polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol
polivinlico, poliamidas, etc.).

Unin o enlace covalente.
La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de inmovilizacin ms interesante
desde el punto de vista industrial. La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de
grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas. De entre los 20
aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la
formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y
en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. El resto de
aminocidos, debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la
superficie proteica, y no pueden intervenir en la unin covalente.
Este mtodo presenta las siguientes ventajas:
1.- La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla;
2.- La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin;
3.- Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho
fluidizado o tanque agitado.
4.- Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de los disolventes
orgnicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.

En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de inconvenientes:
1.- Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que
condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su geometra, que puede ser distorsionante y
conducir a derivados inactivos.
2.- El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta
posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia de un inhibidor que bloquee el
centro activo.
3.- La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios
de pH, fuerza inica, etc.

Reticulado.
Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha sido ampliamente
utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas. El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos
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bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas de enzima. Como reactivos
bifuncionales se pueden emplear dialdehdos, diaminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e,
incluso, diaminas si estn activadas con carbodiamida. El resultado del reticulado son enzimas con
enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. El
co-reticulado, permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica debidas a efectos difusionales,
mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una protena sin actividad enzimtica y rica en
residuos de lisina (por ejemplo, la albmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilizacin muy
comn consiste en inmovilizar la enzima por adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un
soporte polimrico (con lo que se consigue una elevada carga enzimtica) y posteriormente aadir el
reactivo bifuncional.

EFECTO DE LA TRANSFERENCIA DE MATERIA
La inmovilizacin de enzimas puede introducir un
nuevo problema, el cual est ausente en las
enzimas solubles libres. Este problema se debe al
gran tamao de la enzima inmovilizada o debido a
la inclusin de la enzima en la matriz polimrica.
El trayecto hipottico del sustrato desde el fluido
hasta el sitio de reaccin de una enzima
inmovilizada:
1. Transferencia desde el seno del lquido hasta la
capa relativamente no mezclada que rodea la
enzima inmovilizada.
2. Difusin a travs de la capa relativamente no
mezclada.
3. Difusin desde la superficie de la partcula hacia
el sitio activo de la enzima en el interior del
soporte.


Resistencia externa
La transferencia de masa de la interface incluye todos los pasos de la transferencia de masa de los
sustratos y nutrientes hacia adentro de la matriz y la de productos a la superficie externa de la matriz de
la clula inmovilizada (MCI). La MCI es la entidad que incluye el soporte y las clulas inmovilizadas.
Los puntos donde se presenta resistencia a la transferencia de masa estn en la capa gaseosa, en la
interface gas lquido, en la capa liquida adyacente a esa interface, en la masa lquida, en la capa liquida
alrededor de la MCI y en la interface lquid0"CI.
Si una enzima es inmovilizada en la superficie de la partcula de soporte insoluble, la trayectoria del
sustrato solo se compone de las dos primeras etapas.
La velocidad de transferencia de materia ser proporcional a la diferencia de concentracin (fuerza
impulsora):
N
s
= k
s
A (C
Sb
C
S
) (1.1)

CSb y CS: concentraciones de sustrato en la mayor parte de la solucin del lquido y en la superficie de
la partcula, respectivamente.
ks: coeficiente de transferencia de materia, (longitud / tiempo).
A: superficie de una partcula de soporte.
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Durante la reaccin, la velocidad de transferencia de sustrato es igual a la velocidad de consumo del
mismo. Por lo tanto, si la velocidad de reaccin puede ser descripta por Michaelis-Menten:


(1.2)



(1.3)



(1.4)



N
Da
: Nmero de Damkhler: es la relacin entre la mxima velocidad de reaccin y la mxima
velocidad de transferencia de materia:

N
Da
<< 1: la transferencia de materia es mucho mayor que la velocidad de reaccin. Por lo tanto, la
velocidad global de reaccin es controlada por la reaccin enzimtica:
(1.5)
N
Da
>> 1: la velocidad de reaccin es mucho mayor que la transferencia de materia. Por lo tanto, la
velocidad global de reaccin es controlada por la transferencia de materia, la cual se puede describir
como una reaccin de primer orden:
(1.6)
Para medir la extensin en la cual la velocidad de reaccin es alterada debido a la transferencia de
materia, se define el factor de efectividad de un enzima inmovilizado como:
(1.7)
Teniendo en cuenta el modelo planteado:


(1.8)





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Resistencia interna
Si la enzima es inmovilizada por copolimerizacin o encapsulacin, la resistencia intrapartcula a la
transferencia de materia puede afectar la velocidad de reaccin enzimtica.
Para poder encarar el problema matemtico es necesario plantear una serie de suposiciones:
1. La reaccin ocurre en todas las posiciones dentro de la enzima inmovilizada y la cintica de la
reaccin es de la misma forma que la observada para la enzima libre.
2. La transferencia de materia a travs de la enzima inmovilizada ocurre por difusin molecular.
3. No hay limitacin por transferencia de materia en la regin externa de la enzima inmovilizada.
4. La enzima inmovilizada es esfrica.

El conjunto de suposiciones generan un modelo denominado modelo distribuido.
Aplicando un balance de materia para el sustrato para una cascara esfrica de espesor dr:


(1.9)













(1.10)

Para la condicin de estado estacionario, el cambio en la concentracin de sustrato dC
S
/ dt = 0.
Simplificando el balance:
(1.11)
Esta ecuacin puede ser resuelta utilizando una expresin para r
s
.
Algunos valores del coeficiente efectivo de difusin (D
S
) se presentan en la siguiente tabla.










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En la ecuacin de balance, slo es necesario reemplazar el trmino r
s
por una expresin cintica
adecuada.
En el caso de una reaccin enzimtica, son tiles las siguientes expresiones:

A continuacin se tratarn los casos por separado para obtener las expresiones de los parmetros ms
importantes.

Cintica de orden cero
Asumiendo que el consumo de sustrato sigue una cintica de orden cero:
(1.12)
Esta es una buena aproximacin cuando K
M
<< C
S
en la cintica de Michaelis. Es ese caso k
0
= r
max
.
Sustituyendo esta cintica (1.12) en el balance (1.11):
(1.13)
Usando las condiciones de contorno:
(1.14)
Reordenando:
(1.15), (1.16)
Se obtiene:
(1.20)
Finalmente, el factor de efectividad para esta cintica es:
(1.22)
Cintica de primer orden:
Si la tasa de consumo de sustrato es una reaccin de primer orden con respecto a la funcin de la
concentracin de sustrato.
(1.23)
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Sustituyendo la ecuacin (3.23) en la ecuacin (3.11) y convirtindola a dimensin menos forma,
obtenemos.

(1.24)
Dnde:









(1.25)

Y se conoce como mdulo de Thiele, que es una medida de la velocidad de reaccin en relacin a la
tasa de difusin. EQ (3.24) junto con las condiciones de lmite.



(1.26)

Determina la funcin

Con el fin de convertir la ecuacin (3. 24) a una forma que puede ser fcilmente resuelto, establecemos

0
=r
0
x
s
, para que la ecuacin diferencial se convierta.

(1.27)

Ahora la solucin general de esta ecuacin diferencial es:

(1.28)
(1.29)


Puesto que X
s
debe ser delimitado como r
0
cuando tiende a cero segn la primera condicin lmite,
debemos elegir C
1
= 0. La segunda condicin lmite requiere que C2 = 1/sinh3, dejando.

(1.30)
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Que demuestra cmo la concentracin del substrato cambia en funcin de la distancia radial en una
enzima inmovilizada.

Figura 3.4 muestra el perfil de la concentracin de sustrato con respecto a la distancia radial segn lo
predicho por la ecuacin (3,30). Para un valor bajo de mdulo de Thiele (1) la tasa de reaccin de la
enzima es lenta en comparacin con la tasa de difusin.

Fig. 3.4: Perfil de la concentracin de sustrato con respecto a la distancia radial por: cintica de primer
orden (lneas slidas) y cintica de Michaelis-Menten con = 5 (lneas segmentadas) para diferentes
valores de mdulo de Thiele ().

Por lo tanto, el sustrato se difunde en el ncleo de la partcula, que se traduce en una distribucin de
concentracin bastante plana en la posicin radial de una partcula. Por otro lado, para los valores ms
altos de los mdulos ( 5), la velocidad de reaccin es ms rpida que la tasa de difusin, as que la
mayor parte del sustrato se consume cerca de la superficie de la partcula. Cuando = 5, la
concentracin del substrato en r
.
0.6 es casi cero.
La tarifa de la reaccin real con la limitacin de difusin sera igual a la tasa de transferencia de masa
en la superficie de una enzima inmovilizada, mientras que el ndice si no ralentizado por la difusin del
poro es kC
Sb
por lo tanto.
(1.31)

Donde A
p
y V
p
son el rea de superficie y volumen de una partcula de enzima inmovilizada,
respectivamente. Por lo tanto, diferenciando EQ (3,30) con respecto a la r
0
y la sustitucin de la
ecuacin resultante en la ecuacin (3.31), tenemos.

(1.32)
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Figura 3.5 muestra cmo el mdulo de Thiele afecta el factor de eficacia para partculas esfricas
inmovilizadas. Cuando 0.1, el factor de efectividad es casi igual a uno, que es el caso cuando la
velocidad de reaccin no es frenada por la difusin. Por otra parte, cuando 0.1, el factor de
efectividad es inversamente proporcional al mdulo de la Thiele.


Efecto de mdulo de Thiele sobre el factor de efectividad para partculas esfricas inmovilizados para
la cintica de primer orden y cintica de Michaelis-Menten con = 5. Mdulo de Thiele para la
cintica de primer-orden es (R/3) (K/D
s
) y para la cintica de Michaelis-Menten (R/3)
(r
max
/D
s
*K
M
).

Cintica de Michaelis-Menten:

Si la tasa de consumo de substrato puede expresarse por la ecuacin de Michaelis-Menten.

(1.33)
Por la sustitucin de EQ (3.33) en EQ (3.11) y cambiarlo de forma adimensional, obtenemos.

(1.34)
Donde es C
sb
/K
M
y el mdulo de Thiele se definen de forma ligeramente diferente de la cintica de
primer orden como.

(1.35)
EQ (3,34) no puede resolverse analticamente porque es una ecuacin diferencial no lineal. Se puede
resolver por diversos mtodos numricos. Nueva Simulacin de Lenguaje Continuo Avanzado (ACSL,
1975) puede utilizarse para resolver el problema. EQ (3,34) es una ecuacin diferencial de segundo
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orden, tiene que ser cambiado a dos ecuaciones simultneas de diferencial de primer orden a
solucionarse con ACSL como.


(1.36)


(1.37)
Las condiciones de lmite para las ecuaciones anteriores son:
(1.38)
Uno de los algoritmos ms simples para resolver un problema de valor lmite es el "mtodo de tiro". En
este mtodo, asumimos los valores iniciales necesarios para que un problema de valor lmite en un
problema de valor inicial. Repetimos este proceso hasta que la solucin del problema de valor inicial
satisfaga las condiciones de lmite. Por lo tanto, son las condiciones iniciales adecuadas para la
solucin del problema anterior:
(1.39)
Donde tenemos que suponer los valores de R
C
y X
SO
. Cuando los valores de R
C
y X
SO
supuestos
podemos pensar en dos casos diferentes:

1. Cuando R
C
= 0, asumir el valor de X
SO
en r
0
= O. Este es el caso cuando la velocidad de
reaccin enzimtica es lenta comparado con el de transferencia de masa que est representada
por el bajo valor de phi. Como resultado, el sustrato alcanza el centro de la esfera.
2. Cuando Rc > 0, X
SO
es igual a cero en R = R
C
/R. Por lo tanto, asumir el valor de R
C
. Este es el
caso cuando la velocidad de reaccin enzimtica es rpida comparado con que de transferencia
de masa que est representada por el alto valor de . Como resultado, el sustrato se consume
antes de que alcance el centro de la esfera.

Difusividad efectiva en geles biolgicos.
El anlisis de la resistencia de transferencia de masa intra-partculas requiere el conocimiento de la
difusividad efectiva D
s
de un substrato en una matriz de inmovilizado, como gelatina, agar o agarosa.
Los geles son materiales porosos semislidos, que se componen de macromolculas y agua. La
estructura del gel aumenta la longitud del camino para difusin y consecuentemente disminuye la tasa
de difusin.
Varias tcnicas estn disponibles para la determinacin de la difusividad efectiva del soluto en gel
(Itamunoala, 1988). Una de las tcnicas ms fiables es el mtodo de disco delgado que utiliza una celda
de difusin con dos compartimentos divididos por un gel fino. Cada compartimento contiene una
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solucin bien revuelta con diferentes concentraciones de soluto.
Difusividad efectiva puede ser calculada de la medida del tiempo flujo total versos (Hannoun y
Stephanopoulos, 1986). Algunos valores tpicos de difusividades eficaces se enumeran en la tabla 3.2.



BIBLIOGRAFIA
Inmovilized Enzymes. R.M. Twyman, University of York. 2005 Elsevier.
Inmovilation of enzymes: A literature survey. Beatriz M.Breno and Francisco Batista-Viera
http://biorreactores.tripod.com/C6BPECI.htm
http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/No.%206/5.html
Enzimas Inmovilizadas\enzimas\39(2) - arroyo.pdf.htm
Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications.DR. MIGUEL ARROYO
Apuntes del tema Bioreactores Encimaticos - Dr. Juan Manuel Peralta
Fundamentals of Biochemical Engineering Rajiv Dutta