E.A.P TECNOLOGA MDICA EN ANATOMA PATOLGICA Y LABORATORIO CLNICO
INMUNOLOGA II
SECCIN: LC7M1
PRCTICA N 6
PRUEBAS DE ELISA
Docente: LIC. TM. PUNCHIN GARCIA, ELSA.
Alumno(s):
DAMIAN SALAZAR, JUAN JOS. PASTOR MATIAS, HANNZ ALEXIS. SAAVEDRA MOSCOL, DANIEL.
LIMA-PER
2014 INTRODUCCIN
El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro. Tipos de ELISA Anticuerpos marcados: ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA sndwich Doble (DAS) Heterlogo (HADAS) Antgeno marcado ELISA competitivo ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas: 1. Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: 1. Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 3. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti- anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 5. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Sndwich DAS (Double Antibody Sandwich). Consta de las siguientes etapas: 1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. 3. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 5. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Sndwich HADAS. Consta de las siguientes etapas: 1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. 3. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado. 4. Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 5. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 6. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Competitivo. Consta de las siguientes etapas: 1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado. 3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra.
OBJETIVOS El alumno aprendi a familiarizarse con el mtodo ELISA, desde los conocimientos tericos bsicos hasta la observacin de las pruebas. Se conoci las diferentes tipos de ELISA en la bsqueda del antgeno y anticuerpo. Se entendi los usos del ELISA y su aplicacin en las diferentes pruebas. MATERIALES Y EQUIPOS Pocillos de ELISA para hepatitis B y C Equipo automatizado de pruebas ELISA Reactivos de pruebas ELISA para hepatitis B y C Pipetas automticas Insertos de las diferentes pruebas ELISA
Procedimiento en el laboratorio: Hepatitis B: Para realizar el procedimiento de ELISA para hepatitis B, utilizamos los insertos facilitados por la docente en los cules se detallaron los pasos que se explicarn a continuacin: Se prepar el buffer de lavado haciendo una dilucin 1/20 entre ste y agua desionizada, para un volumen final de 100 ml.
- 5 ml de buffer de lavado concentrado + 95 ml de agua desionizada
A continuacin se prepararon microplacas rotuladas como: A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1 y H1; donde: A1 es el blanco; B1, C1 y D1 son los controles negativos; E1 y F1 son los controles positivos; G1 y H1 son muestras problema. Estas microplacas se colocaron en un soporte para poder movilizarlas a todas al mismo tiempo.
Se agregaron 50 ul. de reactivo control positivo, control negativo y las muestras problema en sus respectivas microplacas.
A continuacin se agreg el conjugado a cada recipiente (excepto al blanco A1). Con parafilm se cubrieron todos los contenedores y se llevaron a incubar durante 1 hora a una temperatura de 37 grados.
Una vez finalizada la incubacin, se procedi a realizar el lavado utilizando el buffer preparado al inicio de la prctica. Para llevar a cabo dicho lavado se hizo lo siguiente: - Con una micropipeta se retir el contenido de todos los recipientes y se elimin (cambiando de punta en cada recipiente para evitar la contaminacin de los mismos). - Se agreg el buffer de lavado (aproximadamente 400 ul. entre el total de recipientes) y se mantuvo en las microplacas durante 40 segundos aproximadamente. - Una vez transcurridos los 40 segundos, se retir con una micropipeta el contenido de todas las microplacas. - Luego se agreg nuevamente el buffer de lavado hasta completar 5 ciclos. Al finalizar el ltimo lavado, las microplacas se voltearon y golpearon contra papel absorbente utilizando la fuerza para eliminar los residuos lquidos del buffer de lavado. NO HAY RIESGO DE ESTROPEAR LA MUESTRA DEBIDO A QUE UNA VEZ PRODUCIDA LA UNIN ANTGENO CON LOS ANTICUERPOS ADHERIDOS A LAS MICROPLACAS, RESULTA DIFICULTOSO DESHACER DICHO COMPLEJO QUE SE HA FORMADO.
Se agregaron los cromgenos A y B a todos los recipientes (incluido el blanco A1) y se incubaron las microplacas nuevamente a 37 grados durante 15 minutos.
Transcurrido el tiempo de incubacin, se agreg 50 ul. de la solucin de parada o solucin Stop a cada microplaca. Los controles positivos y las muestras positivas se tornaron de azul a amarillas.
Finalmente, una vez detenida la reaccin en las microplacas, proseguimos con la lectura de los recipientes utilizando el espectrofotmetro a 450 nm. de longitud de onda.
Para poder evaluar los resultados, se debe hallar un dato llamado Cut-off que nos permitir establecer parmetros para poder decir si el resultado es positivo, negativo o indeterminado. El Cut-off se halla de la siguiente manera:
Cut-off (C.O.) = Promedio de controles negativos + 0.100
- En primer lugar hallamos el promedio de los controles negativos:
Promedio = (0.001 + 0.000 + 0.004)/3 = 0.00166 = 0.002 - Ahora hallamos el Cut-off utilizando la frmula:
C.O = 0.002 + 0.100 = 0.102
Una vez hallado el Cut-off realizaremos una recta en donde indicaremos de donde a donde se extender la zona gris que toda prueba debe tener.
Los resultados que se ubiquen dentro de la zona gris se reportarn como indeterminados
Se evalan los resultados de las muestras problema G1 y H1.
- Ambos sueros muestran absorbancias muy por encima del Cut-off y de la zona gris, por ende se puede decir que las muestras G1 y H1 son REACTIVAS para Hepatitis B.
Descripcin del frasco de muestra Cdigo Resultado Tapa verde 514304000 REACTIVO Tubo largo 11186 REACTIVO
Qu hubiera pasado si la absorbancia de una de las muestras hubiera estado dentro de la zona gris? La muestra se habra reportado como indeterminada. Incluso, si la absorbancia est fuera de la zona gris pero con un valor extremadamente cercano a esta, tambin debe reportarse como indeterminado.
Hepatitis C: Para realizar el procedimiento de ELISA para hepatitis C, utilizamos los insertos facilitados por la docente en los cules se detallaron los pasos que se explicarn a continuacin: Se prepar el buffer de lavado haciendo una dilucin 1/20 entre ste y agua desionizada, para un volumen final de 100 ml.
- 5 ml de buffer de lavado concentrado + 95 ml de agua desionizada
A continuacin se prepararon microplacas rotuladas como: A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1 y H1; donde: A1 es el blanco; B1, C1 y D1 son los controles negativos; E1 y F1 son los controles positivos; G1 y H1 son muestras problema. Estas microplacas se colocaron en un soporte para poder movilizarlas a todas al mismo tiempo.
Se agregaron 100 ul. del diluyente de muestra a cada microplaca (excepto al blanco).
Se agregaron 10 ul. de reactivo control positivo, control negativo y las muestras problema en sus respectivas microplacas.
Con parafilm se cubrieron todos los contenedores y se llevaron a incubar durante media hora a una temperatura de 37 grados.
Una vez finalizada la incubacin, se procedi a realizar el lavado utilizando el buffer preparado al inicio de la prctica. Para llevar a cabo dicho lavado se hizo lo siguiente:
- Con una micropipeta se retir el contenido de todos los recipientes y se elimin (cambiando de punta en cada recipiente para evitar la contaminacin de los mismos). - Se agreg el buffer de lavado (aproximadamente 400 ul. entre el total de recipientes) y se mantuvo en las microplacas durante 40 segundos aproximadamente. - Una vez transcurridos los 40 segundos, se retir con una micropipeta el contenido de todas las microplacas. - Luego se agreg nuevamente el buffer de lavado hasta completar 5 ciclos. Al finalizar el ltimo lavado, las microplacas se voltearon y golpearon contra papel absorbente utilizando la fuerza para eliminar los residuos lquidos del buffer de lavado. NO HAY RIESGO DE ESTROPEAR LA MUESTRA DEBIDO A QUE UNA VEZ PRODUCIDA LA UNIN ANTGENO CON LOS ANTICUERPOS ADHERIDOS A LAS MICROPLACAS, RESULTA DIFICULTOSO DESHACER DICHO COMPLEJO QUE SE HA FORMADO.
A continuacin se agreg 100 ul. del conjugado a cada recipiente (excepto al blanco A1). Con parafilm se cubrieron todos los contenedores y se llevaron a incubar durante 30 minutos a una temperatura de 37 grados.
Se realiz un segundo lavado siguiendo el mismo procedimiento del primer lavado.
Se agregaron 50 ul. de los cromgenos A y B a todos los recipientes (incluido el blanco A1) y se incubaron las microplacas nuevamente a 37 grados durante 10 minutos.
Transcurrido el tiempo de incubacin, se agreg 50 ul. de la solucin de parada o solucin Stop a cada microplaca. Los controles positivos y las muestras positivas se tornaron de azul a amarillas.
Finalmente, una vez detenida la reaccin en las microplacas, proseguimos con la lectura de los recipientes utilizando el espectrofotmetro a 450 nm. de longitud de onda.
Para poder evaluar los resultados, se debe hallar un dato llamado Cut-off que nos permitir establecer parmetros para poder decir si el resultado es positivo, negativo o indeterminado. El Cut-off se halla de la siguiente manera:
Cut-off (C.O.) = Promedio de controles negativos + 0.120
- En primer lugar hallamos el promedio de los controles negativos:
Una vez hallado el Cut-off realizaremos una recta en donde indicaremos de donde a donde se extender la zona gris que toda prueba debe tener.
Los resultados que se ubiquen dentro de la zona gris se reportarn como indeterminados
Se evalan los resultados de las muestras problema G1 y H1.
- Ambos sueros muestran absorbancias muy por debajo del Cut-off y de la zona gris, por ende se puede decir que las muestras G1 y H1 son NO REACTIVAS para Hepatitis C.
Descripcin del recipiente de muestra Cdigo Resultado Tapa verde 514304462 NO REACTIVO Tubo largo 11248 NO REACTIVO INTERPRETACIN DE RESULTADOS: En cuanto al ELISA para hepatitis B se obtuvo ambos resultados reactivos con densidades pticas sobre el valor de corte, por tal motivo nos est indicando que posiblemente los pacientes pueden tener la infeccin viral. En cuanto al control de calidad nos puede dar la seguridad que los reactivos y el trabajo de los analistas estuvieron bien y sin errores sistemticos ni aleatorios. En cuanto al ELISA para hepatitis C se obtuvo ambos resultados no reactivos con densidades pticas muy bajos, por tal motivo nos est indicando que los pacientes no tienen la infeccin viral. En cuanto al control de calidad nos puede dar la seguridad que los reactivos y el trabajo de los analistas estuvieron bien y sin errores sistemticos ni aleatorios. CUESTIONARIO 1) Los mtodos ELISA son usados actualmente en los laboratorio?
Los mtodos de Elisa s son utilizados en la actualidad en los laboratorios. Ya qu, en los centros de salud se utiliza principalmente para identificar antgenos o anticuerpos que se encuentran en la sangre, orina, esputos, etctera. Sin embargo, La tcnica se ha generalizado con el empleo de equipos simples y muy baratos que se utilizan todava hoy en muchos centros diagnsticos de todo el mundo.
2) Los mtodos ELISA se hicieron conocidos por el VIH?
Las Enzyme Linked Inmuno Ensayo Sorbent o pruebas de ELISA s se hicieron conocidos por el VIH, debido a que fueron en un momento el nico modo de su anlisis. Hoy en da es la prueba ms eficaz y sencilla que hay actualmente en el mercado para detectar en la sangre de las personas si son portadoras del virus VIH.
3) Los diferentes tipos de ELISA han permitido el avance en el diagnstico de enfermedades?
S, debido a que gracias a esta tcnica se han podido realizar estudios cientficos en campos como la biologa, la bioqumica y la medicina. Dentro de sus principales aplicaciones, se encuentra el diagnstico mdico, en estudios serolgicos, hematolgicos, endocrinos, oncolgicos, en la medicina forense y antropologa. Con el propsito mdico se han aplicado en la determinacin de hormonas y protenas plasmticas, antgenos tumorales, drogas, antgenos y anticuerpos de microorganismo (parsitos, hogos, bacterias).
4) Su uso es rutinario en los diferentes laboratorios?
Su uso si es rutinario en los diferentes laboratorios, ya qu su campo de aplicacin se ha amplificado en diferentes patologas. Por ejemplo, es una de las pruebas iniciales de deteccin ms comn para el VIH, y tambin abarca diagnstico de patologas causadas por parsitos, hongos, bacterias.
CONCLUSIONES
El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada por tanto ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro.
Existen diferentes criterios de clasificacin para estos ensayos: segn la naturaleza del sistema pueden ser competitivos o no, conforme a la naturaleza del conjugado se han identificado los ensayos con antgenos o anticuerpos marcados. Sin embargo, la clasificacin ms usada se basa en si se requiere o no de procedimientos para separar las fases del ensayo; de acuerdo con este criterio los inmunoensayos enzimticos se clasifican respectivamente en heterogneos homogneos. s preferible hablar de separacin de fases en lugar del empleo o no de lavados a que eisten otros mtodos como los basados en principios inmunocromatogrficos lo que nos puede llevar a un error de clasificacin.
BIBLIOGRAFA
1. choa . istemas LA en ensaos clnicos de vacunas estudios seroepidemiolgicos. (esis para optar por el rado de octor en iencias Mdicas). Instituto Superior de Ciencias Mdicas de La Habana; 2002.