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ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE SALUD PBLICA


ESCUELA DE MEDICINA
CARRERA MEDICINA

PRACTICA # AISLAMIENTO EN CULTIVOS COCOS GRAM POSITIVOS

1 DATOS GENERALES:

NOMBRE: CODIGO:
Dipaola Pino Vaca 26283


GRUPO N#: 1


FECHA DE REALIZACION: FECHA DE ENTREGA:
2014/05/07 2014/05/15

2 INTRODUCCION
Los microorganismos se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza y en muchos
casos, varias especies se encuentran juntas, por lo que es necesario realizar siembras para separar
(aislar) los microorganismos y luego identificarlos. Los medios de cultivo slidos son
indispensables para el aislamiento y separacin de bacterias. Si una mezcla de bacterias se estra
sobre una superficie, se lograr separar colonias. Colonia, es el conjunto microscpico de
grmenes con idnticas caractersticas hereditarias, tintoriales y metablicas, que se desarrollan
generalmente en un medio slido. La morfologa de las colonias es caracterstica particular de
cada especie bacteriana, por lo tanto es muy importante determinar el color, densidad,
consistencia, forma y tamao para tener una pauta de la identificacin de un microorganismo. Al
trabajar con cultivos bacteriolgicos es importante que estos sean manejados aspticamente
evitando contaminacin tanto de la muestra para las personas como tambin la presencia de
microorganismos extraos en el cultivo. En el organismo existen muchos microorganismos que
constituyen la flora normal, y que cumplen funciones importantes, en la siguiente prctica se
aislar e identificarn microorganismos presentes en la faringe.
3 OBJETIVOS

3.1 GENERAL
Aislar cocos gram positivos y gram negativos a partir de una muestra de secrecin farngea, y
aplicacin de pruebas enzimticas para su identificacin.
4 METODOS
Se tomar una muestra de secrecin farngea de un compaero y se cultivar en agar sangre,
luego se identificar el tipo de microorganismo, basndose en la morfologa de la colonia, tipo de
hemlisis, coloracin gram y pruebas enzimticas.
5 MATERIALES Y REACTIVOS
Hisopos
Cajas petri con agar sangre
Mecheros
Placas portaobjetos
Incubador
Microscopio
Colorantes para gram
Perxido de hidrgeno
Sangre con EDTA
Tubos de ensayo
Palillos
Aceite de inmersin
gua destilada o suero fisiolgico estriles
Lpiz graso
6 MARCO TEORICO
6.1 Medios de cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en
condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son
esenciales en el Laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin,
preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los
resultados obtenidos.
6.2 Clasificacin de los medios de cultivo
En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden
ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente para preparar un medio slido se
parte de un medio lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la
slicagel.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:
Medios naturales o complejos:
Constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente
complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no reconocen todos los
componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintticos:
Son los medios que tienen una composicin qumica definida cualitativa y cuantitativamente.
Generalmente se usan en trabajos de investigacin.
(Para bacteriascomo:Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum)
De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:
Medios de enriquecimiento:
son medios lquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular.
Permiten aumentar el nmero de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o ms
sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepcin de los que se
quieren cultivar.
Medios selectivos:
Son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios slidos y estn diseados
para el aislamiento de microorganismos especficos.
(Para bacterias como Salmonella typhi y Clostridium botulinum)
Medios diferenciales:
Son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los
microorganismos. No contienen ningn tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten
revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos.
( Para bacterias como: Streptococcus pyogenes y Escherichia coli)
6.3 Por su composicin los medios de cultivo se clasifican en:
Lquidos:
Conocidos como caldos, estos son especialmente tiles para hacer diluciones, para homogenizar
mezclas de microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas.
Slidos:
Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que es
posible observar las caractersticas tpicas de un solo tipo de microorganismo.
Semislidos:
Son aquellos medios lquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a 0.8%. Estos
se emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaeroflicos. Los medios
de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos
o por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo
deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque,
adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados
reproducibles. Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que
suministren productos de calidad.
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y fisicoqumica
adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o
desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin.
Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.
Almacenamiento de los medios de cultivo:
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las
condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y
25_), con poca humedad y protegidos de la luz solar di recta. Nunca se deben almacenar cerca de
autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se deben
descartar cuando se hidraten o decoloren. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y
esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8_C, a menos que el medio requiera alguna condicin
diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratacin. Cuando
se usa tapn de algodn se debe colocar por encima una envoltura de papel.

Cita bibliografa:
ToodSanford y Davidshon, El laboratorio de diagnstico clnico, Ed Marban, 20 Ed,
Espaa 2005
7 PROCEDIMIENTO
1. Permitir que los medios de cultivo adquieran la temperatura ambiente. Medios fros pueden
inhibir el crecimiento de algunos tipos de bacterias.
2. Tomar una muestra de secrecin farngea de su compaero con un hisopo estril
3. Junto al mechero encendido, abra la caja e inocule la muestra en un lado superior de la caja
petri con el medio de cultivo agar sangre. No inocule en reas grandes, se necesita espacio para
estriar y aislar colonias.
4. Con otro hisopo o con el asa esterilizada, estre sobre el inculo de extremo a extremo hasta
1/3 de la caja.
5. Si utiliza asa esterilice y enfre, o con otro hisopo, a partir de la estriacin anterior, estre parte
del medio de cultivo, tenga cuidado y solamente topo 2 a 3 veces la primera inoculacin.
6. Repetir el paso anterior usando la parte que queda del agar y realizando estras ms separadas,
as se aislarn mejor las colonias.
7. Realice cortes en el agar, as se observa mejor la hemlisis.
8. Al estriar en tres planos se puede cuantificar a groso modo los microorganismos presentes.
a. Si crecen solamente en la 1 estriacin.. Escasos
b. Si crecen hasta la 2 estriacin . Moderado
c. Si crecen hasta la 3 estriacin Abundantes

8 OBSERVACIONES
Despus de realizar las tareas, estaremos en la capacidad de diferenciar e identificar
los diferentes materiales del laboratorio, para seleccionar de manera adecuada los
distintos instrumentos para una determinada experiencia.
9 CONCLUSIONES

10 RECOMENDACIONES
d. Al estriar utilice toda la superficie del medio de cultivo, no realice nicamente lneas.
e. No es necesario esterilizar el asa (o un nuevo hisopo) en cada estriacin si se trabaja con
muestras que contienen pocas bacterias o con cultivos puros.
f. Las estras deben estar juntas excepto en la 3 estriacin donde se trata de separar las colonias.
g. Nunca estre sobre una estriacin previa

9. Incubar las cajas petri invertidas a 37 C, durante 24 horas a 48 horas
10. Tomar las cajas de incubadora y observar el crecimiento bacteriano.

12. Realizar coloracin gram de las colonias que se desarrollan en el agar.
13. Con los cocos gram positivos realizar las prueba de catalasa.
Catalasa: la catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en
oxgeno y agua. El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo o aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido de
hidrgeno es letal para las clulas bacterianas. 2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas)
La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy comnmente
utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos). a. Coloque 1
gota de H2O2 al 3% a cada lado del portatobjetos b. Con el asa o con un palillo tome una colonia
y emulsiones en el perxido c. Observe en la placa si se forma o no burbujas d. Resultados: en la
prueba se observar burbujas cuando la bacteria produce la enzima catalasa. Lectura: burbujas:
catalasa +, no burbujas: catalasa Observe los resultados y antelos.
14. Si identifica Staphilococcus, realizar la prueba de coagulasa, que es utilizada para distinguir
Staphilococcus patgenos de los no patgenos.
Coagulasa: las bacterias que tienen la enzima coagulasa son capaces de coagular el plasma,
transformando el fibringeno en fibrina. Existen 2 tipos de coagulasa, la libre que se la detecta en
la prueba en tubo y la ligada que se la detecta en la prueba en placa.
Prueba en placa:
a. Ponga una gota de agua estril sobre un portaobjetos limpio
b. Tome con el asa o con un palillo la colonia que va a examinar y emulsifquela en el agua
uniformemente
c. Aada una gota de plasma humano con EDTA y mezcle por 5 segundos
d. Si aparecen unos grumos visibles dentro de 15 segundos, la prueba es positiva. Todas las
reacciones negativas deben ser chequeadas con la prueba en tubo.
Prueba en tubo
e. Coloque 0,5 ml de plasma fresco humano con EDTA en un tubo estril
f. Con el asa o palillo tome 1 a 3 colonias y emulsifique en el plasma
g. Coloque el tubo en un bao mara a 37 C o en un incubadora a la misma temperatura
h. Examine el tubo y observe la aparicin de un coagulo en 4 hora. Observe cada hora. Si es
negativo chequelo en 8 a 12 horas. Resultados: en placa, presencia de grumos: coagulasa +,
ausencia de grumos: coagulasa En tubo: cogulo: coagulasa +, ausencia de cogulo:
coagulasa Observe los resultados y antelos.
15. Si identifica Streptococcus, realizar la prueba de Bacitracina y Optoquina.
Bacitracina: Las pruebas presuntivas en la identificacin del EbHGA (Estreptococo beta
hemoltico del grupo A) se basan en la susceptibilidad e inhibicin del crecimiento en una placa
de agar sangre, y que tienen la mayor parte (95%) de las cepas al ponerlas en contacto con discos
que contienen dosis bajas (0.04U) de bacitracina.
a. Se toma un agar sangre y en un lado de la placa se estra con el asa o con hisopo en forma
continua la cepa de estreptococo
b. Con una pinza estril se coloca el disco de bacitracina en el centro del estriado realizado.
c. La placa de agar sangre es incubada a 35-37 C durante toda la noche.
d. Los resultados son cualitativos y es positiva para estreptococo beta hemoltico del grupo A si
se encuentra cualquier halo de inhibicin alrededor del disco. Anotar los resultados
Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae (sensibles) y otras
especies de estreptococos a hemolticos (resistentes). La sensibilidad a la optoquina es una
medida de la fragilidad de la membrana celular bacteriana. La optoquina, que es el clorhidrato de
etilhidrocuprena. a. se toma una suspensin de colonias puras en caldo Mueller Hinton o
tioglicolato y con un hisopo se estra una placa de agar sangre de carnero al 5 %. b. Sobre la
estra se coloca el disco de optoquina. c. Se incuba con atmsfera de CO2 al 5 % (jarra con
vela). durante 24 hs. a 35 C. d. Interpretacin: Sensible, cuando hay inhibicin alrededor del
disco. Se considera como punto de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm).
Resistente, cuando el crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de halos
intermedios deben resolverse por acumulacin de pruebas a favor o en contra. Anotar los
resultados.


Con todos los resultados obtenidos identificar el germen.
11 BIBLIOGRAFIA

Diagnstico microbiolgico, 11 edicin, Editorial Panamericana, Buenos Aires Argentina, 2
004.
Salazar Wilson, Guas de prctica de Laboratorio de Microbiologa, Departamento de
publicaciones de la Facultad de Ciencias Mdicas, Quito CLARE, George. Stains
and staining (microscopy). 4ta edition Williams and Williams.
Prcticas de Microbiologa. Departamento de Microbiologa y Gentica Universidad de
Salamanca

12 ANEXOS

Observamos las indicaciones de nuestra profesora

Alistandonos para realizar bien nuestra practica


Observamos a nuestro paciente y a nuestra profesora realizando la practica

Haciendo el frotis en los medios de cultivo agar sangre

Datos de nuestros compaeros

Datos de nuestros compaeros

Datos de nuestros compaeros
12.1 CUESTIONARIO DE EVALUACION
12.1.1 Defina enzima, sustrato, qu valor tienen las pruebas enzimticas en el diagnstico
microbiolgico?
Enzima.- Una enzima es una protena que cataliza las reacciones bioqumicas del metabolismo. Las
enzimas actan sobre las molculas conocidas como sustratos y permiten el desarrollo de los diversos
procesos celulares.
Sustrato.- En la biologa, el concepto de sustrato est vinculado a la superficie en la que vive un animal o
una planta, que est formada tanto por factores biticos como abiticos
El sustrato tambin puede ser una especie qumica que se considera como objeto de la accin de
uno o ms reactivos; por ejemplo, un compuesto transformado por la accin de un catalizador.


12.1.2 Cul es el sustrato de la reaccin de catalasa y coagulasa? Por qu produce burbujas
en la reaccin de catalasa positiva?
12.1.3 Por qu se forma el cogulo en la prueba de coagulasa? Que puede inhibir la
actividad de la catalasa?

Cita bibliogrfica: Charles, K. Microbiology Review. Sixth Edition. Medical Examination
Publishing Company. INC. USA.1977.