PRCTICA No.

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Mtodos de cultivo y aislamiento de bacterias

Objeti vos. Que el alumno conozca las diferentes tcnicas de aislamiento en
medios de cultivo slido para la obtencin de cultivos puros de bacterias. Que el
estudiante prepare medios de cultivo de uso general, diferenciales y selectivos
para el cultivo de diferentes especies bacterianas.

Introduccin
Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio
para caracterizar su crecimiento, hacer su identificacin y determinar sus
actividades metablicas. Un medio de cultivo es una solucin acuosa de diferentes
compuestos que contiene todos los elementos indispensables que requieren los
microorganismos para crecer.

Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios
lquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagacin y/o conservacin,
as como para estudiar sus caractersticas de crecimiento. Es importante recordar
que la inoculacin de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre
debern realizarse en zona asptica (cerca del mechero o en campana de flujo
laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o
contaminantes.

Las tcnicas de aislamiento, permiten la obtencin de microorganismos a
partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una
gran diversidad microbiana, as como para comprobar la pureza de los cultivos
obtenidos. Los cultivos puros estn formados por un solo tipo de microorganismo;
y son indispensables para conocer las caractersticas morfolgicas, propiedades
de tincin, actividad bioqumica, patogenicidad, sensibilidad a antibiticos e
identificacin de las especies microbianas.

El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por mtodos de
dilucin, en medios slidos por estra en placa o en medios lquidos. En el primer
caso se considera que cada clula bacteriana que se separa dar origen a una
poblacin que formar una colonia caracterstica, visible a simple vista.

La limitacin principal de estas tcnicas de dilucin, es que no es
prctica para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de
inters se encuentra en pequeas cantidades, donde solamente se obtendrn las
bacterias dominantes.

Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja intensidad, se aplican
mtodos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que contienen
nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones
de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento de microorganismo de
inters y se conocen como selectivos o de enriquecimiento.

En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros
componentes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. Para distinguir especies
bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los sustratos que se
manifiesta por cambios en la apariencia o modificacin del pH del medio de
cultivo. Estos medios se conocen como medos diferenciales y son de gran utilidad
para la caracterizacin e identificacin de especies bacterianas.

Materiales
3 cajas de Petri con Agar nutritivo
3 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB
3 cajas de Petri con Agar papa-dextrosa
1 Mechero
1 Asa de siembra
1 Parrilla de agitacin
1 Autoclave

Procedimiento

El alumno recolectara muestras para ver el tipo de microorganismos que
estan presentes en estas muestras.


Tcnica de estra cruzada
a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro
cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y
fra, inocular la muestra haciendo 4-5 estras simples muy juntas de
lado a lado borde el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja
(Figura 4).
b) Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja de Petri un cuarto
de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra
tocando la superficie del medio lejos de la zona de estras recin
hechas.
c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estras
y hacer un segundo grupo de estras en el segundo cuadrante como
en el caso anterior.
d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la
siembra en el ltimo cuadrante, no se deber flamear el asa de
siembra y se har una estra ms abierta (simple).



Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos

1. Hacer grupos de 3 cajas, primer grupo medio nutritivo, segundo grupo y
tercer grupo agar papa-dextrosa. Sembrar en las cajas por estra

2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos,
sembrara por estra cruzada la muestra problema.

Condiciones de incubacin
1. Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24 horas






Resultados
A. Recopilar la informacin de la caracterizacin colonial de cada cepa
en los cuadros 4 y 5
B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes
en la muestra problema.

Cuadro 4
Morfologa colonial de cultivos bacterianos
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
Aislamiento por
Estra cruzaca

Forma:
Color:
Tamao (mm)
Borde:
Superficie:
Aspecto:
Elevacin:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Medio Nutriti vo Agar EMB Agar papa-DX

Siembra en
medios selectivos
y diferenciales:



Microorganismo
1:

Forma:
Color:
Tamao (mm)
Elevacin
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Nota: La descripcin colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios

Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide
Borde: entero, lobulado, aserrado
Superficie: lisa o rugosa
Aspecto de la colonia: hmeda, seca, butirosa
Elevacin: convexa, plana, hundida
Luz transmitida: translcida, opaca
Luz reflejada: brillante, mate
Consistencia: dura, blanda, mucoide



Cuestionario
1. Qu es el agar y de donde se obtiene? Cules son los nutrimentos que
proporciona a los microorganismos?




2. Cul es la composicin qumica de los medios: medio nutritivo, agar EMB,
Agar papa-dextrosa.? Cules son los componentes o propiedades
responsables de su funcin como medios selectivos o diferenciales?





3. Por qu el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de
bacterias? Proponga algunas sustancias que se le agregaran para hacerlo
selectivo para bacterias Gram negartivas?




4. Bibliografa consultada


Referencias Bibliogrficas
Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en
Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods (4th Edition). Edited by Frances Pouch Downes and Kelth Ito,
200
Practical Handbook of Microbiology.CRC Press, 1989. William M
OLeary, Cornell Medical College, New York, New York, USA.
Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9
th
edition, The
Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
American Public Health Associated (APHA), American Water Eorks
Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater Ed. (1991).