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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN

QUÍMICA ORGANICA INGENIERÍA BIOMÉDICA
TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: AISLAMIENTO DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO
Objetivos:
-Ais!" e #o$%ejo &eso'i""ibo()#eo%"otei#o *ADN-%"ote+(!, ! %!"ti" &e ti$o &e
te"(e"!
-Diso#i!" e #o$%ejo e( s)s &os #o$%o(e(tes: DNA - %"ote+(!s
-P"e#i%it!" &eso'i""ibo()#e!to &e so&io.
-Disove" &eso'i""ibo()#e!to &e so&io obte(i&o.
I(t"o&)##i/(
ELECCION DEL TEJIDO
Con el objeto de elegir tejido biológico adecuado ara la obtención del ADN! "e deben
con"iderar alguno" re#ui"ito"! entre lo" #ue "e uede $encionar lo" "iguiente"%
&' Ele(ada concentración de ADN)
*' M+ni$a relación ARN,ADN
-' Baja acti(idad de ADNa"a)
.' Ele(ado contenido ADN,órgano)
/' 01cil di"onibilidad)
2' Bajo co"to)
0, Eev!&! #o(#e(t"!#i/( &e ADN)
Ca"i toda" la" c3lula" contienen ADN4 e5cecional$ente! alguna" de ella" carecen de
n6cleo 7 ta$bi3n de ADN! co$o en el ca"o de lo" glóbulo" rojo" de lo" $a$+8ero")
En la" c3lula" nucleada"! la cantidad de ADN (ar+a notable$ente en lo" di8erente"
tejido") Co$o eje$lo! con"idere$o" el contenido de ADN de lo" di8erente" tejido" de una
rata adulta%
TEJIDO 12 &e ADN3044 $2 &e teji&o 5"es#o
$6"culo e"#uel3tico /9
cerebro &*-
te"t+culo *-:
;+gado *.:
(e"+cula "e$inal */.
cora<ón -:2
ri=ón -*.
1ncrea" .>:
ul$ón 9&:
inte"tino delgado &*?:
ba<o &.::
$3dula ó"ea &/-:
ti$o *92:
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En e"ta tabla "e ob"er(a #ue! en la rata adulta el órgano $1" rico en ADN e" el ti$o
@concentracione" algo $enore" "e encuentran en la $3dula ó"ea! el ba<o 7 el inte"tino
delgado)')
6, M+(i$! "e!#i/( ARN3ADN%
Aa re"encia de ele(ada" concentracione" de ARN di8iculta el ai"la$iento del ADN or
tratar"e de co$ue"to" e"trec;a$ente relacionado" de"de el unto de (i"ta #u+$ico)
En general la" c3lula" (i(a" contienen una cantidad de ARN con"iderable$ente $a7or #ue
la de ADN) Un ca"o e5tre$o lo con"titu7e el o(ocito de lo" an8ibio" en el #ue la relación
ARN,ADN e" -&!924 en el e5tre$o oue"to ode$o" ubicar a la" c3lula" e"er$1tica" #ue
e"t1n ca"i e5clu"i(a$ente con"tituida" or ADN) En la "iguiente tabla (e$o" co$o (ar+a
e"ta relación en lo" di8erente" tejido" de la rata adulta%
TEJIDO ARN3ADN
;+gado -!2>
gl1ndula "ubB$a5ilar &!9-
ri=ón &!:>
ba<o :!--/
tejido lin8oide :!*>/
ti$o :!&?/
Bajo e"te a"ecto! ta$bi3n el ti$o "e encuentra en la" $ejore" condicione")
7, B!j! !#tivi&!& &e ADN!s!
Ao" e5tracto" de di"tinto" tejido" co$o el ;+gado! ba<o 7 ti$o tienen la roiedad de licuar
lo" gele" de ADN debido a la re"encia de la de"o5irribonuclea"a! en<i$a #ue inter(iene
e"ec+8ica$ente en la degradación del ADN4 la ADNa"a e" una 8o"8odie"teara"a alta$ente
e"ec+8ica) Cara "u acción e"ta en<i$a re#uiere la re"encia de catione" bi(alente"4 lo"
acti(adore" $1" e"ec+8ico" "on lo" ione" $agne"io! $angane"o! ;ierro 7 cobalto4 todo"
ello" "on $u7 arecido" con re"ecto a la inten"idad de la acción #ue roducen)
Ao" incon(eniente" deri(ado" de la re"encia de de"o5irribonuclea"a en lo" tejido"
uede e(itar"e $ediante el e$leo de in;ibidore" de e"ta en<i$a) Entre ello" "e
encuentran la" "u"tancia" #ue e5traen lo" catione" co$o lo" anione" citrato 7 8luoruro! lo"
agente" #uelante" co$o el EDDA @etilen dia$ino tetraacetato' lo" ione" cobre 7 ar"eniato!
8uerte$ente in;ibidore" a una concentración de :!::& M 7 el borato a :!:* M)
8, Eev!&o #o(te(i&o e( ADN3/"2!(o)
E" $u7 i$ortante #ue la concentración del ADN en el tejido "ea ele(ada4 ero de"de el
unto de (i"ta r1ctico! el $aterial biológico "er1 $1" (entajo"o "i la cantidad total del
ADN en el órgano e" ta$bi3n alta) Dare$o" un eje$lo%
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Cor lo #ue "e ;a (i"to ;a"ta a;ora! el ti$o e" el órgano de la rata #ue re6ne la" $ejore"
condicione" ara la obtención de ADN4 ero 3"te e" un órgano e#ue=o% e"a
aro5i$ada$ente -- $g! or lo tanto "e obtiene $eno" de & $g de ADN) En el ti$o de
ternera la concentración del ADN e" aro5i$ada$ente la $i"$a @**/: Eg ADN,&:: $g de
tejido'! ero tiene un ta$a=o $uc;o $a7or% e"a aro5i$ada$ente /:: g 7 "e ueden
obtener de 3l $1" de &:: $g de ADN! cantidad ara la cual "e deber+an "acri8icar una"
&:: rata" adulta")
9, :;#i &is%o(ibii&!&%
No ba"ta con #ue el $aterial biológico re6na toda" la" caracter+"tica" #ue (i$o"
anterior$ente4 e" nece"ario ta$bi3n #ue "ea 81cil de obtener en el $o$ento #ue "e
nece"ite) Cor eje$lo! el e"er$a de "al$ón tiene ca"i e5clu"i(a$ente ADN 7 con"titu7e
una e5celente $ateria ri$a! ero no e" 81cil de con"eguir) A "u (e<! el ti$o de ternera "e
con"igue con $uc;a 8acilidad en nue"tro a+" #ue e" t+ica$ente ganadero! ero en
EEUU no ocurre lo $i"$o 7 re"ulta $1" "encillo de con"eguir el ba<o de cerdo) E" decir!
#ue la elección del tejido deende del lugar donde "e trabaja or la" o"ibilidade" #ue "e
o8recen de con"eguirlo con $a7or 8acilidad)
<, B!jo #osto%
En nue"tro a+" el ti$o de ternero uede con"eguir"e gratuita$ente en lo" $atadero"!
or#ue con"titu7e un $aterial de de"ec;o)
CONCAUFION% ara obtener ADN en nue"tro laboratorio elegi$o" el ti$o de ternera
(ulgar$ente lla$ado $olleja de cuello or#ue re6ne todo" lo" re#ui"ito" enu$erado")

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AISLAMIENTO DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO DEL TIMO DE TERNERA
El $3todo con"ta de lo" "iguiente" a"o"%
&' Ai"la$iento del co$lejo de"o5irribonucleoroteico @ADNBrote+na')
*' Di"ociación del co$lejo en "u" do" co$onente"% DNA 7 rote+na")
-' Eli$inación de la" rote+na")
.' Creciitación del de"o5irribonucleato de "odio)
/' Di"olución del de"o5irribonucleato de "odio obtenido)
:UNDAMENTO)
0, Ais!$ie(to &e #o$%ejo &eso'i""ibo()#eo%"otei#o *ADN-%"ote+(!,.
El roó"ito de e"ta ri$era etaa e" ai"lar! en 8raccione" di8erente"! lo" co$lejo"
nucleorot3ico" #ue "e encuentran re"ente" en el ti$o de la ternera% la
ribonucleorote+na @RNC' 7 la de"o5irribonucleorote+na @dRNC')
E"ta "earación "e con"igue ;o$ogenei<1ndo el tejido en una "olución "alina de baja
8uer<a iónica @NaCl% :!:/ a :!*/ $ole",litro'! #ue 8a(orece la e"tabilidad de a$bo"
co$lejo" 7 di"uel(e a la $a7or arte de la" $ol3cula" #ue "e encuentran re"ente" en el
ti$o @inclu"o la RNC' ero no di"uel(e a la" dRNC) En el $3todo elegido "e utili <a una
"olución i"otónica @NaCl :!&/ M G :!? H')
Ao" $3todo" de baja 8uer<a iónica "on adecuado" ara el ai"la$i ento de la" dRNC4 "in
e$bargo re"entan una gran de"(entaja% 8a(orecen la liberación de la" nuclea"a"4 e"ta"
en<i$a" roducen la degradación en<i$1tica arcial de lo" 1cido" nucleico" 7 re#uieren!
ara "u acti(idad la re"encia de cierto" catione" bi(alente" @Mg
II
! Mn
II
! 0e
II
7 Co
II
') Cara
e(itar e"te incon(eniente! la ;o$ogenei<ación "e reali<a en re"encia de agente"
#uelante" co$o el EDDA! o de cierto" anione" co$o el 8luoruro o el citrato! #ue e5traen del
$edio lo" catione" bi(alente" #ue "on nece"ario" ara la acti(idad de e"ta" en<i$a") En el
$3todo #ue elegi$o" "e utili<a el citrato ara co$lejar lo" catione" @citrato de "odio :!:&/
M')
Fi "e #uiere $antener la integridad de la $ol3cula de ADN e" nece"ario (eri8icar #ue la"
"olucione" #ue "e e$lean en "u ai"la$iento "e encuentren a J 9) E" ta$bi3n "abido
#ue lo" 1cido"! a J in8erior a * roducen la rutura del enlace NBgluco"+dico de la"
urina" dando or+gen al 1cido aur+nico) A J alcalino "e roduce la de"naturali<ación del
ADN o "ea la rutura de lo" uente" ;idrógeno #ue $antienen unida" la" do" cadena"
olinucleot+dica")
Da$bi3n "e reco$ienda agregar alguna" gota" de alco;ol oct+lico nor$al! or#ue e(ita
la 8or$ación de e"u$a 7 roduce ;e$óli"i" con lo cual "e 8acilita la eli$inación de la
;e$oglobina del tejido)
Otro 8actor $u7 i$ortante e" la te$eratura4 a baja" te$eratura" @: a /KC' "e in;ibe la
ADNa"a 7 otra" en<i$a" #ue "e roducen en el $etaboli"$o de la gl1ndula 7 #ue act6an
"obre el DNA roduciendo la degradación de "u $ol3cula) Cor e"e $oti(o en e"ta ri$era
etaa todo" lo" a"o" deben reali<ar"e en 8r+o @: a /KC'! aun#ue "e trabaje en re"encia
de in;ibidore")
Ao" do" tio" de nucleorote+na" @RNC 7 dRNC' #ue "e encuentran re"ente" en el
;o$ogenato! di8erenciable" or "u di"tinta "olubilidad! ueden "earar"e or
centri8ugación en 8r+o4 "e obtiene un reciitado 8or$ado or el $aterial in"oluble en la
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"olución "alina @dRNC' 7 un "obrenadante #ue contiene el $aterial "oluble en e"a "olución
@RNC')
En conclu"ión%
@FFCB&L'
Di$o MMMMMMMMMMMMMMJo$ogenato MMMMMMMMMMMMMMMMMMMM Centri8ugado

@RNC 7 dRNC' RNC @"ol)' dRNC @in"ol)'

"u") 7 ;o$ogeni<ación

FFCB&L G @Folución de ClNa :!&/ MB Citrato de Na :!:&/ M a J 9')
6, Diso#i!#i/( &e #o$%ejo e( s)s &os #o$%o(e(tes : DNA - %"ote+(!s)
Aa ;o$ogeni<ación del tejido con "olución FFCB&L 7 la centri8ugación o"terior
o"terior! reali<ada" en la ri$era etaa! ;an er$itido ai"lar el DNA del ti$o de ternera
co$binado or rote+na" en 8or$a de un co$lejo% De"o5irribonucleorote+na" @dRNC')
El roó"ito de e"ta "egunda etaa e" di"ociar el co$lejo ai"lado! liberando el DNA
@co$o de"o5irribonucleato de "odio' de la" rote+na" #ue lo aco$a=an)
E"ta di"ociación "e con"igue $ediante el e$leo de FDF @Aauril "ul8ato de "odio o
dodecil "ul8ato de "odio' reacti(o #ue en re"encia de clorurode "odio! di"ocia el co$lejo
de"o5irribonucleorot3ico 7 reciita la" rote+na" liberada" "in roducir la
deoli$eri<ación del nucleato)
7, Ei$i(!#i/( &e !s %"ote+(!s)
Aa" rote+na" #ue #uedan en el "obrenadante luego del trata$iento con FDF "e
eli$inan con una $e<cla de cloro8or$o 7 alco;ol i"oa$+lico @*.%&'! #ue la" de"naturali<a 7
coagula)
Aa rearación cruda de ADN "e agita (igoro"a$ente con cloro8or$oBalco;ol i"oa$+lico)
Aa e$ul"ión re"ultante "e centri8uga en 8r+o ara acelerar la "earación de la" 8a"e") Fe
"earan do" 8ace" bien de8inida" "earada" or una inter8a"e "ólida4 ella" "on%

0-:!se O"2;(i#!% @Cloro8or$o B alco;ol i"oa$+lico' "e "earan en el 8ondo del tubo
7 contiene lo" co$ue"to" li+dico")
6-:!se !#)os!% "obrenada en la arte "uerior del tubo 7 contiene la "al de "odio
del ADN 7 nucleorote+na)
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Creci @dRNC'
Fobrenad @RNC'
Re"u"ender 7
trabajar a (olu$en
total

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7-I(te"5!se s/i&!% e" de color blanco 7 "e interone entre la" do" anteriore"4 e"t1
con"titu+da or el gel #ue "e 8or$a entre el clor;idrato de rote+na 7 la $e<cla de
cloro8or$o B alco;ol i"oa$+lico)
8, P"e#i%it!#i/( &e &eso'i""ibo()#e!to &e so&io)
El etanol al ?/ H reciita al ADN bajo la 8or$a de un $aterial 8ibro"o #ue uede
o(illar"e alrededor de una (arilla de (idrio) E"ta roiedad er$ite "earar el ADN de otra"
$acro$ol3cula" #ue coagulan de una $anera no 8ibro"a! co$o or eje$lo el RNA 7 la"
rote+na")
9, Diso)#i/( &e &eso'i""ibo()#e!to &e so&io obte(i&o)
Aa "al de "odio del ADN e" 81cil$ente "oluble en agua de"tilada 7 en "olucione" de
baja 8uer<a iónica)
ACIDOS NUCLEICOS II: ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO *ADN,
OBNEDIOOF%
&' Fearar el 1cido de"o5irribonucleico del 1cido ribonucleico a artir de un tejido ani$al! a
tra(3" de "u" roiedade" di8erenciale" de "olubilidad)
*' Obtener el ADN uro or reciitación)
I- AISLAMIENTO DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO
Ce"ar &/ gr) de ti$o en una c1"ula de Cetri 7 cortar con un cuc;illo o na(aja en
l1$ina" delgada"4 colocar el tejido de"$enu<ado en un (a"o ;o$ogenei<ador de &:: $l
de caacidad 7 "e le agregar ./ c)c) de citrato de "odio :!:&/ M 7 ./ c)c) de cloruro de
"odio :!&/ M) Do$ar el J 7 ele(ar a J 9 con Dri") Enro"car el (a"o en la taa #ue lle(a la
cuc;illa @(er 8igura' ;aci3ndola girar en "entido contrario a la" aguja" del reloj) Dodo el
e#uio "e ;ace de"cender @a8lojando el tornillo *' ;a"ta #ue el (a"o #ueda bien "u$ergido
en ;ielo icado)
Mo(er el control de (elocidad @tornillo &' lenta$ente ;a"ta llegar a /)::: r))$) 7 en e"e
unto dejar durante - $inuto") Una (e< cu$lido el tie$o! lle(ar el control a cero! ele(ar
todo el e#uio! ;a"ta #ue el (a"o #ueda 8uera del ;ielo 7 de"enro"car el (a"o) Fe obtiene
una "u"en"ión de color ro"ado con re"to de tejido de a"ecto 8ibro"o)
Ce(t"i5)2!#i/(%
Oerter el ;o$ogenei<ado en tubo" de centr+8uga 7 centri8ugar en 8r+o @/PC' durante /
$inuto" a /)::: r))$)) Fe obtiene un reciitado ad;erente blan#uecino @dRNC' 7 un
"obrenadante de color ro"ado @RNC') De"ec;ar el "obrenadante 7 trabajar con el
reciitado)
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II-DISOCIACION DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO:
Colocar en un Erlen$e7er de *:: $l el reciitado obtenido 7 agregar -:!9/ $l de
Citrato de Fodio :!:&/ M 7 di"er"ar con (arilla de (idrio a te$eratura a$biente) Agregar
:!99 $l) de "olución de FDF @dodecil "ul8ato de "odio' al /H en etanol al ./H)
Fuce"i(a$ente agregar "iguiendo el orden #ue "e indica 7 $e<clar bien de"u3" de cada
adición! ?!9* $l de FDF al ./H en etanol al ./H! /*!/: $l) de ClNa * M 7 -!9> $l de
Citrato de Fodio :!:&/ M @ara co$letar &:/ $l)'
III-ELIMINACION DE LAS PROTEINAS:
En una a$olla de decantación colocar la "u"en"ión obtenida 7 agregar el $i"$o
(olu$en de cloro8or$oBalco;ol i"oa$+lico @*.%&'! agitar (igoro"a$ente durante -:
"egundo") Di"tribuir la e$ul"ión re"ultante en tubo" de centr+8uga 7 "e centri8uga en 8r+o
@/PC' durante &: $inuto" a /::: r))$)) Retirar lo" tubo" "ua(e$ente de la centr+8uga ara
$antener la "earación de la" 8a"e") Con una ieta
cailar retirar la caa acuo"a "uerior #ue contiene la "al de "odio del DNA tratando de no
erturbar la 8a"e roteica)
I=-PRECIPITACION DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO:
En un reciiente de telgoor colocar ;ielo icado 7 "obre el $i"$o! un (a"o de
reciitación #ue contiene la caa acuo"a de"roteini<ada) Medir do" (ol6$ene" de etanol
al ?/H 8r+o 7 (ertir lenta$ente "obre la" arede" del (a"o tratando de 8or$ar una caa
alco;ólica "obre la 8a"e acuo"a (i"co"a) Con una (arilla de (idrio grue"a agitar la "olución
de ADN con un $o(i$iento de rotación "ua(e 7 cont+nuo ;a"ta #ue la" do" 8a"e" "e
$e<clen 7 toda" la" 8ibra" del $aterial gelatino"o rico en ADN "e ;allan enro"cado "obre la
(arilla)
Cuando el etanol "e (uel(e l+$ido! "igno de #ue 7a "e ;a enro"cado todo el ADN!
retirar la (arilla del l+#uido 7 re"ionar la" 8ibra" de ADN "obre la" arede" del (a"o de
reciitación ara e5ri$ir el e5ce"o de "ol(ente)
Eli$inar el l+#uido re"idual ao7ando la (arilla "obre un ael de 8iltro) Aa(ar el
reciitado introduciendo la (arilla #ue contiene el ADN en un tubo #ue contenga etanol al
?/H 7 luego en otro #ue contenga 3ter et+lico) Retirar el ADN de la (arilla 7 colocar en un
(idrio de reloj dejar "ecar &: $inuto" ara eli$inar or co$leto el "ol(ente)
BIBLIOGRAFIA
QUIMICA ORGANICA DE FINAR, VOL II.
BIOQUIMICA DE LEHNINGER.
BIOQUIMICA DE STRYER, VOL I.
BIOQUIMICA DE NIEMEYER, VOL I.-
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