Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Tema : Aislamiento de bacterias lcticas

Integrantes Bocangel Rodrguez, Carmen
Cisneros Moscol, Jessica
Delgado Escalante, Abraham
Torres Santilln, Margaret
Mateo Tuesta, Claudia

Profesor(a) : Magister ELENA QUILLAMA POLO.

Grupo: 2 Mesa2

2013

INTRODUCCION

Las bacterias del cido lctico (BAL) tienen requerimientos nutricionales complejos debido a su
limitada habilidad para sintetizar aminocidos y vitamina B. La mayora de BAL producen
nicamente una forma isomrica de cido lctico. Las especies de los gneros Aerococcus,
Carnobacterium, producen nicamente ismeros L, mientras las especies del gnero Leuconostc
producen nicamente ismeros D. Sin embargo, algunas BAL producen formas racmicas donde el
ismero predominante depende de cambios en la aireacin, cantidad de NaCl, tipo de
fermentacin, incrementos en el pH y concentracin de sustrato.
Acorde con los productos finales de la fermentacin de los hidratos de carbono las BAL se dividen
en homofermentativas y heterofermentativas. En el metabolismo homofermentativo, se produce
predominantemente cido lctico y las bacterias usan la hexosa. En la fermentacin heterolctica
hay formacin de xilulosa-5 fosfato por el sistema de la glucosa-6 fosfato deshidrogenada.
El objetivo de este trabajo practico fue el aislamiento y seleccin de bacterias lcticas a partir de
leche agria y obtener un cultivo puro de un microorganismo de inters aislndolo de una mezcla
de microorganismos para finalmente caracterizarlo a travs de pruebas bioqumicas.

Generalmente, la seleccin de cepas lcticas autctonas ha ayudado a obtener productos lcteos
con caractersticas similares a los productos elaborados con leche cruda (Centeno et al. 1996;
Mndez et al.1998).







MARCO TERICO

Las bacterias acido lcticas (BAL) son utilizadas en
fermentaciones y estn recibiendo gran atencin al ser
empleadas por la industria farmacutica, de alimentos y
bebidas principalmente por la produccin de acido
lctico (producto de la fermentacin de los azcares),
componentes, saborizantes, espesantes y bacteriocinas.
Se encuentran en grandes cantidades en la naturaleza,
as como en nuestro aparato digestivo. Aunque se las conoce sobre todo por su labor de
fermentacin de productos lcteos, se emplean asimismo para encurtir vegetales en el
horneado, en la panificacin del vino, y para curar pescado, carne y embutidos.
Las bacterias lcticas estn conformada por gneros como: Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus y son usados en industria como agentes
biocontroladores y probiticos. Las BAL se clasifican en homofermentativas y
heterofermentativas dependiendo de los productos formados a partir de la glucosa. Las
bacterias homofermentativas sintetizan slo cido lctico sin liberar CO2. Entre ellas est
Lactobacillu splantarum, utilizado para fabricacin de masas cidas, leches cidas,
crnicos madurados y vegetales fermentados. Las bacterias heterofermentativas generan,
adems de cido lctico, una cantidad equimolar de etanol, acetato y CO
2
, como
Lactobacillus brevis y Leuconostoc sp.
Las bacterias lcticas se caracterizan por ser Gram positivas y tienen morfologa bacilar,
cocobacilar o esfrica inmviles.Son anaerobios facultativos. Sin embargo no son capaces
de sintetizar ATP en aerobiosis debido a que no posee citocromos y enzimas. Una prueba
la cual confirma esta incapacidad es la de la catalasa, estas bacterias lcticas son de
catalasa negativa por ende no pueden descomponer el H
2
O
2
, utilizando una peroxidasa
para catalizar la oxidacin del NADH a partir del H
2
O
2
que se reducir a H
2
O.
Estas bacterias se caracterizan por ser exigentes metablicamente, especialmente con
respecto a fuentes de nitrgeno, ha sido demostrado que el crecimiento es limitado por la
disponibilidad de nutrientes esenciales, por ello el crecimiento es estimulado
implementando al medio con extracto de levadura, peptona y aminocidos. Un medio
complejo que es ideal para el crecimiento de las bacterias acido lcticas es el Man Rogosa
Sharpe(MRS).

Medio Man Rogosa Sharpe (MRS)

El Agar M.R.S. fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe donde se evidencia un buen
crecimiento de bacterias cidos lcticos como lactobacilos. Este medio permite un
abundante desarrollo de todas las especies de lactobacilos. La peptona y glucosa
constituyen la fuente de nitrgeno, carbono y de otros elementos necesarios para el
crecimiento bacteriano. El monoleato de sorbitn, magnesio, manganeso y acetato,
aportan cofactores y pueden inhibir el desarrollo de algunos microorganismos. El citrato
de amonio acta como agente inhibitorio del crecimiento de bacterias Gram negativas.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Proteosa peptona N 3 10.0
Suspender 64 g del medio en un litro
de agua destilada. Reposar 5
minutos y mezclar calentando a
ebullicin durante 1 2 minutos.
Esterilizar en autoclave durante 15
minutos a 121 C.
Extracto de carne 8.0
Extracto de levadura 4.0
Glucosa 20.0
Monoleato de sorbitn 1 ml
Fosfato dipotsico 2.0
Acetato de sodio 5.0
Citrato de amonio 2.0
Sulfato de magnesio 0.2
Sulfato de manganeso 0.05
Agar 13.0
pH final: 6.4 0.2


Para determinar si las bacterias acido lcticas son homofermentativas o
heterofermentativas se realizan pruebas bioqumicas como MR-VP, gluconato de potasio y
asimlacin de la ribosa. En esta ocasin se realizaron las pruebas de MR-VP y la de
gluconato de potasio.



Pueba Rojo Metilo- Voges Proskauer (MR-VP)

Esta reaccin depende de la produccin de acetil
metil carbinol (acetona) que se forma a partir del
acido pirvico donde se condensa una o dos
molculas de acido pirvico con una molcula de
acetaldehdo formndose como producto
intermediario el acido acetolctico que por
descarboxilacin forma un acetil metil carbinol.
Este compuesto al oxidarse forma diacetilo que en presencia de un lcali como KOH, da
positivo dando una coloracin rosada. Esta reaccin se realiza en presencia de oxgeno.
Para el caso de las bacterias lcticas debe resultar positiva para esta prueba lo que indica
que se trata de bacterias heterofermentativas.
Caldo Gluconato de Potasio

Prueba para determinar la capacidad metablica homofermentativa o heterofermentativa
de un organismo.

El gluconato es una sal cido glucnico que es usado por lo
microorganismos como su nica fuente de carbono. Producto de la degradacin de este
compuesto se forma una mezcla equimolar de lactosa, etanol o acetato y CO
2.
La prueba
resultar positiva si hay produccin de CO
2,
esto se evidencia debido a la formacin de gas
que levantar la capa de vaspar que se le adicion al caldo cultivado. La incubacin se
realiza en condiciones microaerofilia.

Los componentes del caldo son los siguientes:


Frmula (en gramos por litro)
Extracto de levadura 1.0
Peptona de carne 1.0
K
2
PO
4
1.0
Gluconato de potasio 40.0
Agua destilada 1000 ml

Cultivo puro
CALDO MRS pH 6.5
INCUBAR 30C x 24h
Observacin y lectura de
comportamiento bioqumico
INCUBAR: 30C x 72-96 horas
Condiciones de microaerofilia
0.1mL a cada
tubo
AGAR MAN ROGOSA SHARPE (MRS) + CICLOHEXIMIDA
0.05% a pH 6.5
Coloracin de
GRAM
MTODO DE
ESTRIADO
INCUBAR: 30C x 72 - 96 horas en
condiciones de microaerofilia
Cepa:LA.3

Centrifugado y lavado 2 veces
Adicin de KOH
0.2mL
-naftol 0.6mL

Leche agria
(LA.3)
MEDIO BASE + PURPURA DE BROMOCRESOL a pH 6.5
Adicin de
VASPAR
CALDO
GLUCONATO

CALDO
MR-VP
CELOBIOSA ARABINOSA RAFINOSA SACAROSA MALTOSA
GALACTOSA GLUCOSA LACTOSA
METODOLOGA






































RESULTADOS

RESULTADOS
Vista microscpica de la leche agria antes del cultivo









CARACTERISTICAS
Gram +
Bacilos
No esporulados




AISLAMIENTO PRIMARIO




















MRS 10
-4

MRS + Jugo
de tomate
10
-5

MRS 10
-5

M 17 10
-5

MRS 10
-4

MRS + Jugo
de tomate
10
-5

MRS 10
-5
M 17 10
-5


DIAGNSTICO PRESUNTIVO
MEDIO: MRS + jugo de tomate











DESCRIPCION DE LAS
COLONIAS
Colonias pequeas, redondas,
opacas, y lisa .


DIAGNSTICO DIFERENCIAL

Asimilacin de carbohidratos
Manitol Almidn Rafinosa Arabinosa Sacarosa Glucosa Galactosa Lactosa Malato Ribosa
- - - - + + + + + +

Gluconato de
potasio
Caldo MRS VP catalasa
- (No CO
2
) + (botn) - -
Caldo MRS Formacin de CO
2






Voges proskauer

CATALASA





Vista microscpica del caldo MRS


RESULTADO FINAL
A travs de las pruebas de asimilacin de carbohidrato, adems de observar que metaboliza la
ribosa, es decir es heterofermentativo, se puede determinar que la especie aislada se identifica a
partir del patrn de carbohidratos fermentados de especies heterofermentativas facultativas del
gnero Lactobacillus como Lactobacillus bavaricus.

Negativo
CRECIMIENTO:
solo botn
Negativo


RESUMEN
Manitol Almidn Rafinosa Arabinosa Sacarosa Glucosa Galactosa Lactosa Malato Ribosa
- - - - + + + + + +

Gluconato de
potasio
Caldo MRS Caldo MRS VP catalasa
- (No CO
2
) + ( botn) + (botn) - -



DISCUSION DE RESULTADOS

Las bacterias cido lcticas presentan en la actualidad un inmenso potencial
biotecnolgico, dada su presencia en multitud de procesos fermentativos de alimentos
destinados al consumo humano y animal. Estas bacterias no slo contribuyen al desarrollo
de las caractersticas organolpticas de los alimentos, sino que generan en los mismos
ambientes poco favorables para el desarrollo de microorganismos patgenos debido a su
marcada capacidad antagonista, la cual favorece su proliferacin en el alimento, en
detrimento de cualquier otro grupo microbiano presente en la materia prima (alimento
crudo) o que contamine el producto posteriormente. Adems de este importante papel en
procesos de bioconservacin, se ha podido comprobar que algunas cepas de bacterias
lcticas, entre ellas las del gnero Lactobacillus, son beneficiosas para la salud, tanto
humana como animal (probiticos).
Las colonias de Lactobacillus en medios solidos son pequeas, convexas, suaves, con
mrgenes enteros, opacas sin pigmentacin. En el comportamiento en medio liquido por
su parte, se observo la presencia de botn y sin turbidez a diferencia de las levaduras cuyo
comportamiento es pulvurulento.
Al realizar la coloracin Gram, se observaron bacilos Gram positivos no esporulados, estos
organismos son los responsables de la formacin de acido lctico a partir de la
degradacin de azucares. Teniendo en cuenta que estos microorganismos crecern en
condiciones de microaeroflia y en un medio rico en nutrientes como es el caso del medio
MRS.
La identificacin bioqumica de una cepa elegida procedente de un cultivo activo se realiz
mediante las siguientes pruebas: fermentacin de carbohidratos, gluconato de potasio y
prueba de Vogues Proskauer. En la primera prueba; se obtuvo que la cepa elegida es capaz
de fermentar glucosa, galactosa, lactosa, maltosa y ribosa; por el contrario no fue capaz de
hacerlo para los carbohidratos como manitol, almidn, rafinosa y arabinosa. Mediante la
segunda prueba realizada se obtuvo que la va glucoltica tomada por esta cepa es la
homofermentativa., debido a que no se mostr produccin de gas. Al tomar esta va la
glucosa se convierte en cido lctico. En la ltima prueba de Vogues Proskauer se
determin que la cepa no produce acetilcarbinol o acetona como intermediario del
metabolismo de la glucosa en presencia de un Hidroxido de potasio KOH y del oxgeno
atmosfrico.
Mediante las caractersticas bioqumicas y la comparacin con la tabla (Anexo) se
determin que las bacterias lcticas probablemente presentes en la muestra de leche
agria procesada es Lactobacillus acidophilus.
Esto se justifica Investigadores como Zong y colaboradores, expresan en su artculo
Differentiation of Lactobacillus species by molecular typing que la caracterizacin de
bacterias cido lctico mediante morfologa celular, colonial y por pruebas bioqumicas
resulta poco exacta y con una alta probabilidad se pueden encontrar cepas que presentan
caractersticas intermedias o que son incapaces de expresar algunas de sus caractersticas
en determinados ambientes o condiciones de cultivo. Esto coincide con los resultados
obtenidos en general, ya que fueron poco exactos en la determinacin de si las bacterias
lcticas presentes en la leche agria eran homofermentativas o heterofermentativas, de
igual manera sucedi con la degradacin de la ribosa.





BIBLIOGRAFA

Zong W, Millsap K, Bialkowska H & Reid G. Differentiation of Lactobacillus species by
molecular typing. Appl Envirom Microbiol.1998;64: 2418- 2423
www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mrsagar.htm

Sedano, J. 2006. Seleccin de cepas nativas de Lactobacillus con actividad
inhibitoria y tolerantes al etanol aisladas del masato. Tesis para optar el ttulo de
bilogo con mencin en Microbiologa y Parasitologa

www.eufic.org/article/es/nutricion/alimentos-funcionales/artid/bacterias-acido-
lacticas/













ANEXO